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Travaux dirigés de Biologie Moléculaire
L3-BH01
S. Bourgerie
Bases puriques-pyrimidiques (1)
Cytosine : 2-oxy-4-amino-pyrimidineThymine : 2,4-dioxy-5-méthyl-pyrimidine ou 5-méthyl-uracileUracile : 2,4-dioxy-pyrimidine 2
Bases puriques-pyrimidiques (2)
Adénine : 6-amino-purineGuanine : 2-amino-6-oxy-purine
3
Équilibres tautomériques, 2 formules pour une même espèce
« un proton peut occuper des positions différentes sur un squelette donné sans que les propriétés des espèces soient modifiées »=> deux structures différentes sont en équilibre chimique.
soit pour l'hybride
Cétone/ alcool Imine/ amine
Amino-cétone :Lactame
Imino-alcool :Lactime
4
Tautomères de la thymine (et U) et de la guanine
5
Tautomères de la cytosine et de l’adénine
6
Tautomères de la cytosine et de l’adénine
7
Cas de l’uracile et de la thymine
lactame-lactimeDi-lactame Di-lactime
Les 3 formes tautomériques de l’uracile (et T)à pH 7,0 la forme lactame prédomine; les autres formes deviennent prééminentes lorsque le pH diminue
8
Équilibres tautomériques : pour RESUMER
R CH2 C R'
NH
R CH C R'
NH2
C NH2
O
R C NH
OH
R
amino-cétone(ou lactame)
imino-alcool(ou lactime)
forme céto forme énol
thymine, uracile & guanine
cytosine & adénineimino amino
R N C
NH2
R'
R NH
C
NH
R'
amino imino
9
Bases puriques et pyrimidiques : liaisons hydrogène
10
NN
O
O
CH3
N
N N
N
NH H
H
Ose
Ose
NN
N
O N
N N
N
O
N
H
H
H
H
HOse
Ose
T
A
C
G
Appariement des paires de basesselon Watson et Crick
11
Paires de bases
12
Appariement : cas des formes tautomères
13
TAUTOMERES
14
tautomères 2
15
Nomenclature des nucléosides et des désoxynucléosides
bases nucléosides désoxynucléosides
Adénine adénosine désoxyadénosine
Guanine guanosine désoxyguanosine
Cytosine cytidine désoxycytidine
Uracile Uridine -
Thymine - désoxythymidine
base Base + sucre
16
17
18
N
NNH
N
NH2N
NN
N
NH2
O
OHOH
HO
N
NN
N
NH2
O
OHOH
OP-O
O-
O
base
ribonucléoside
ribonucléotide
N
NN
N
NH2
O
OHOH
OPO
O-
O
PO
O
PO-
O-
O
O-
N
NN
N
NH2
O
OHOH
OPO
O-
O
PO-
O
O-
ADENOSINE
ADENINE
ADENOSINE-5’-MONOPHOSPHATE (ou AMP)
ADENOSINE-5’-diPHOSPHATE (ou ADP)
ADENOSINE-5’-triPHOSPHATE (ou ATP)
ATP
19
Spectres
Spectres d’absorption des bases puriques et pyrimidiques
Coefficient d’absorption molaire des nucléotides (ε260nm M-1.cm-1)
-AMP 15400
-GMP 11700
-CMP 7500
-UMP 9900
-dTMP 9200
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Structure
Structure d’une unité nucléotidique de l’ADN et de l’ARN
base
POH
3’
5’
base
POH
3’
5’
OH
2’
La base purique ou pyrimidique est schématisée en bleu, le désoxyribose ou le ribose par la barre verticale verte,la liaison phospho-diester par la barre en diagonale etle groupement phosphate par la lettre P inscrite dans un cercle
21
base
P3’
5’
P
base
3’
5’
3’
P
base
3’
5’
3’
P
base
3’
5’OH
3’
PP
Structure d’une chaîne nucléotidique d’ADN
22
dACG
23
P
3’
5’
3’
P
3’
5’
3’
P
3’
5’OH
3’
PP
5’ 3’
A
T
C
G
G
C
5’
P
3’
5’
3’
P
3’ 3’
P
3’
5’OH
3’
P P
3’ 5’
Schématisation de la disposition antiparallèle des brins de l’ADN24
25
Pentoses
O
OHOH
HH
HH
HOOH
β-D-ribose
1'
5'
4'2'3'
O
HOH
HH
HH
HOOH
β-2-désoxy-D-ribose
1'
5'
4'2'3'
26
27
28
Centrifugation en CsCl
L’ARN est sensible au traitement alcalin
Mécanisme de l’hydrolyse alcaline des ARNLa solution alcaline provoque la déprotonationdu groupe 2’-OH et facilite l’attaque nucléophile du noyau phosphore proche, ce qui entraîne le clivage de la chaîne de l’ARN. Il se forme un cycle phosphate lié aux C2’ et C3’ qui va être hydrolysé soit en 2’ soit en 3’ phosphate.
29
ARN (d=2) plus dense que l’ADN (d=1,7) qui est lui-même plus dense que les protéines (d=1,4)
A pH 7,0 on obtient 2 bandes : la bande supérieure correspond à l’ADN du phage T4, l’autre bande à l’ARN
A pH 12,0 on obtient 1 bande :uniquement celle correspondant à l’ADN : la bande d’ARN a disparu par suite de l’hydrolyse de ce dernier en milieu alcalin.
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Electrophorèse en gel d’agarose
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Matériel nécessaire :Tampon d’échantillonCuveSupport + scotchPeigneErlen (chauffage de l’agarose)
Dissolution de l’agarose à chaudLaisser refroidirAjouter BETPas de bulles !Cuve et agarose : mise en place du peigne.Prise en masse de l’agarose
Mise sous tensionCathode (-) et anode (+) Migration des molécules chargées positivement (cation) et négativement (anion).
ADN polyphosphatedonc polyanion donc du – au +
MigrationBleu clair : Xylène Cyanol, ADN grande tailleBleu foncé : Bleu de Bromophénol, ADN petite taille, front de migrationVariable selon % agar
Lecture sous UV : BET
Effet pH & action DNase sur ADN double brin
32
Espèces moléculaires en présence
33
pH 7,0 pH 12,0
(-)
(+)
(-)
(+)
Continuum/ Smear
incubation Brève Ménagée Brève Ménagée
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