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Prof. STI~ V~IB~L, Technische Universit/~t, Org~nisch-chcmisches Laboratorium,

Kopenhagen, Solvgade 83 (D/inemark)

Aus den Farbwerken Hoechst AG. vormals Meister Lucius & Br/ining Frankfurt (Main)-ttSchst

Uber die Adsorption radioaktiv markierter Eiweiile an Papierelektropherogrammen

Yon ]~. N r E ~ A ~ und W. HOFFM~NN

Mit 4 Textabbildungen

(Eingegangen am 12. Dezember 1963)

J o d - ~ l J - m a r k i e r t e und Chrom-~lCr-marlder~e EiweiBe h a b e n in der b iochemischen und mediz inischen Forsehung eine wei t re iohende Anwen- dung gefunden und werden inzwisehen auch in de r inneren Medizin als d iagnost ische I tJ l fsmit te l eingesetzt . I n der L i t e r a t u r s ind verschiedene Methoden zur Hers te l lung dieser Pr/~parate beschriebenl,4,6,11,13,1G. I m Einzelfal l i s t das ffir ein bes t immtes Eiweil] un%er Ber i icks icht igung der biologischen A k t i v i t s schonendste Verfahren ffir die r ad ioak t i ve mar- k ie rung zu ws D a b e i lassen sich ffir Jod-131 spezifische Aktivi t /~ten bis zu 10 mC 131J/rag Subs tanz ohne Dena tu r i e rung der Pro te ine erreiehen. Die spezifisehen Aktivi t /~ten ffir Chrom-~Cr-mark ie r te EiweiBe l iegen niedriger, da Chrom-51 n ieh t als tr/~gerfreies Nuel id zur Verf/ igung s teht .

I m R a h m e n der m i t z~J- u n d 5~Cr-markierten EiweiBen ausgeff ihr ten Arbe i t en s ind e lekt rophore t i sehe Un te r suchungen yon groBem Were. Sowohl die Reinhei t spr / i fungen tier Pr/~parate als aueh die Auswer tung yon Versuehen kSnnen mi~ Hilfe der Pap ie re lek t rophorese erfolgen. t t i e rbe i mfissen die an den Pap ie ren auf t re tenden Adsorpt ionseffekte der EiweiBe besondere Beaeh tung finden. Sehon bei Unte r suehungen yon

444 E. I ~ A N N und W. I-Io]r~g~N~ Bd. 200

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1964 Adsorption radioaktiv markierter Eiweil]e 445

nicht radioaktiv markierten Eiweii~en in i~engen, die mit I-Iilfe yon Amldoschwarz 10 B oder Bromphenolblau auf Elektropherogrammen noch angef~rbt werden kSnnen, wird die auf der Laufstrecke an dem Pa. pier adsorbierte ~enge ~ls sehr stSrend empfunden, und es ist immer wie- der versucht worden, diese Menge photometrisch zu bestimmen~,7,1e,14,19. Auf Grund der erzielbaren hohen spezifisehen Aktivit~ten radioaktiv

3

3

2

3

xlO31pm

200,uq

YO0 r

I 2 # t; 8 10era G 8 10cm

(-) Star/ (+) (-J S'/ar/ (+)

4dtg o,,"

I [ I q

Abb. 3. Wanderung yon Jod-181J-markiertem Insulin auf l~apierelektropherogrammen in Abh~ngig- keit yon der aufgetragenen ~enge. Elektrophorese: 5 Std; 12 V/cm; 0,07 m Yeronalpuffer pH 8,6.

Chromatographiepapier Schl. & Sch. 2043b ]ggl.

markierter Eiweil~e lassen sieh nun welt geringere Mengen erfassen. Diese werden oft schon so stark adsorbiert, dab sie sich elektrophore- tiseh nieht entsprechend den fibhchen Kenntnissen fiber die Mobiliti~t der Eiweil~e auf Chromatographiepapier verhalten z,s-l~ Dies wird einerseits in der klinisehen Forschung, z .B. bei Untersuchungen fiber die AntikSrperbindung yon Insulin, bereits ausgenutzt 3. Es be- steht aber andererseits die l~Sglichkeit zu Fehlsehlfissen, wenn man das

446 E. : N ~ . ~ und W. tto~,~_w~ Bd. 200

elektrophoretische Verhalten der radioaktiv markierten Eiweil~e nicht richtig interpretiert und auf Denaturierung des Praparates sehliel~t i~.

r I i I i I i

b

M o I - E ~ ~

/ ~ / Mol- 6'ew./04000

I I T I I I I I

Mol- E'ew 6000

q8 000

I I I T I I I I s 7J 5 ,~#~ 5 10 q 5 /~3

c [M0i/l]

A b b . 4 a - - c . Adsorpt ionsisothermen ffir die Adsorpt ion rad ioak t iv markier ter Eiweii~e an Papierelektrophero- grammen, a 5od-'aZJ-rnarkiertes Albumin; b Chrom- 5ZOr-markiertes Albumin ; c Jod-a~J-mal'kiertes Insul in

~8

5

F7

5

5

Es schien uns deshalb wiinsehenswert, die Adsorp- tion radioaktiv markierter Ei- weiBe an Chromatographie- papier unter definierten Bedin- gungen quantitativ zu unter- suchen. Wir w/~hlten fiir die Versuche i3ij. sowie 5iCr-Albu- rain und i3iJ-Insulin. Es wur- den steigende Mengen dieser Verbindungen auf Chromato- graphiepapier aufgetragen und ihr elektrophoretisehes Verhal- ten fiberpriift. Die Abb. l - - 3 zeigen die radiometrisehen Auswertungen dieser Elektro- pherograrame. Man erkennt hieraus die Zunab_me des adso~- bierten Eiwei~es mit der aufge- tragenen Menge und kann die fiir eine Wanderung erforder- lichen Mindestmengen ab- schitzen. Eine Absi~t~igung des Papiers t r i t t in dem yon uns untersuchten Bereichnicht ein. Es lag daher nahe, ein Adsorp- tionsgleichgewicht zwischen adsorbiertem und gelSstem Ei- weil~ anzunehmen 17. Wir haben deshalb die Versuchsergebnisse in die Gleichungen fiir die Ad- sorptionsisothermen nach

1

a - ~ B . c T ] ~ R E U I ~ D L I C / {

und nach C " Cc~

I~A~TGMUII~ 0~ - - b + c

eingesetzt.

Dabei bedeuten a adsorbiertes EiweiB/g Adsorbens [m~ol/g]; c freies Eiwei• [1V~ol/l]; B, b, n, coo sind Konst~nten.

1964 Adsorption radioaktiv markierter EiweiBe 447

Es zeigte sieh, daft die gemessenen W e r t e der Adsorp t ions i so the rme naeh F ~ u ~ D ~ c ~ gehorehen.

I n Abb. 4 is~ in doppe l t logari~hmischen Koordina~en a gegen c auf- ge~ragen. Dabe i s ind die Versuchsergebnisse yon Chrom-S~Cr-Albumin und Jod-13U-insul in fiir je zwei Molekulargewichte aus- gewer te t . Aus den Geraden lassen sich die Kons~anten B

1 er rechnen (Tabelle). a n d -~

1Vfan erkenn~, daft 1 in allen n

F~l len gleich is~. Auch fiir B e rha l t m~n un te r den folgen- d e n A n n a h m e n gle icheWerte : Be im Chrom-S~Cr-Albumin is~ wegen der Dre ib ind igke i t des Chroms das dreifache ~ o l e k u l a r g e w i c h t des Albu-

Tabclle. Konstanten der Adsorptionsisothermen nach .t~REU2~JOLIC'H

1 ]~iwei~ B n

Jod-~81J-Albumin (Molgew. 65 000) Chrom-51Cr-Albumin (Mo]gew. 195000) Jod-lalJ-Insulin (Molgew. 48 000)

Chrom-51Cr-Albumin (~olgew. 65000) Jod-131J-Insulin (1V[olgew. 6000)

3,1 �9 10 -4

3,4.10 - t

3,6- 10 -4

7,2 �9 10 -4

1,2 �9 10 -a

0,44

0,43

0,44

0,44

0,44

rains einzusetzen. Ff i r Jod-13U-Insul in gi l t im alkal ischen Bereich das ~ o l e k u l a r g e w i c h t eines Polymeren . Die Adsorp t ions i so the rme ffir unsere Versuohsbedingungen l au t e t :

a = 3,4 �9 10 -4 c ~

Experimentel ler Teil

Verwendete ]~iweil]e. Zur l:[erstellung der radioaktiv markierten Pri~parate wurde ttumanalbumin der Behringwerke and Schweineinsulin der Farbwerke ttoechst AG. verwendet. Die radioaktive ~arkierung der Substanzen erfolgte nach Verfahren der Farbwerke }toechst AG.

1. Jod-lalJ-marlciertes Albumin. Die spezifische Aktivit~t betrug 51 #C 131J/mg Albumin, dabei ist die Markierung so vorgenommen, dab durchschnittlich ein Atom Jod an ein Molekfil Albumin gebunden ist. Fiir die Elektrophorese wurde das Pr/~para$ ! :20 mit inaktivem Albumin verdfinnt.

2. Chrom-51Cr-marlciertes Albumin. Die spezifische Aktivit/~t betrug 3,2/zC 51Cr/mg Albumin.

3. Jod-lalJ-marlciertes Insulin. Die spezifische Aktivit~t war 8,9 mC 13~J/mg Insulin. Die Markierung wnrde so ausgefiihrt, daI] durchschni~tlich jedes Molekiil ein Jod enthielt. Ffir die Elektrophorese muBte das Pr/~parat 1 : 103 mit inaktivem Insulin verdiinnr werden.

Ausfithrung der Papierelektrophoresen. Es warde in Ab~nderung die yon WIELA~D U. Fisems~ TM angegebene Kammer verwendet und mit Chromatographie- papier Schl. & Sch. 2043b Mgl gearbeitet; wobei die Versuchsbedingtmgen wie folgt s waren: Elek~rolyt 0,07 m Veronal/NaOtt, pH 8,6, Feldst/~rke 12 V/cm, Dauer der Elektrophorese 5--6 Std, Auf~ragungsbreite f'tir die Substanz 2,5 cm. Die Konzentration der verwendeten EiweiB15sung war so gew~hlt, dal] die in Abb. 1--3 angegebenen Mengen in 10--30 #1 LSsung aufgetragen werden konnten.

448 NIE~ANN U. HOFY~-~N : A d s o r p t i o n r ad ioak t i v markier~er EiweiSe Bd. 200

Die radiometrisehe Auswertung der Pherogramme erfolgte im ~adiopapier- chromatographen mit Hifie yon zwei Geiger-Miiller-Zahlrohren unter konstant gehaltener Geometrie, so da$ die gemessenen Impulsraten miteinander direkt ver- gleiehbar sind.

Messung der Adsorptionsisothermen. Die zur Bestimmung der Adsorptionsiso- thermen erforderlichen Werte flit a (adsorbiertes EiweiB/g Adsorbens) undc (Kon- zentration an freiem Eiweilt) wurden aus den Versuchsdaten abgeleitet. Das Gewicht des Adsorbens (trockenes Chromatographiepapier Sehl. & Sch. 2043b Mgl) betrug 12,2 rag/era 2. Die adsorbierte Eiwefltmenge je Laufstrecke ergibt sich aus dem Radio- pherogramm. Der Feuchtigkeitsgehalt des Papiers wahrend der Elektrophorese stellt sich sehon naeh 30 rain auf einen konstanten Wert yon 21,8 rag/era 2 Papier ein. Als Differenz der bis zu einem bestimmten Punkt des Pherogramms adsor- bierten EiweiSmenge und der auf die Startlinie aufgetragenen Menge erhalt man die ffir die Bereehnung der freien Konzentration an diesem Punkt geltende nicht adsorbierte Eiweil3menge.

Zusammenfassung Die Adsorption yon Eiweifien auf Chromatographiepapier w/ihrend

tier Elektrophorese konnte mit Hilfe yon radioaktiven Nukliden quanti- tativ untersueht warden.

Es zeigte sieh in dem untersuchten Konzentrationsbereich, da$ die Adsorption mit der aufgetragenen Menge ansteigt und zwisehen adsor- biertem und gelSstem Eiwei$ sieh ein Gleichgewieht einstellt. Die fiir die Adsorption gemessenen Werte gehorehen der Adsorptionsisotherme nach F~EV~)LIC~. Die Versuche wurden mit Jod-~a~J- und Chrom-51Cr- markiertem Albumin und Jod-13XJ-markiertem Insulin ausgeffihrt.

Summary The adsorption of proteins on chromatographic paper during electro-

phoresis was investigated by help of proteins labelled with radioactive nuclides. In the range studied the adsorption increases with the ~mount of proteins app]ied. The amount adsorbed obeys a power function after F~EU~DL~C~ of the equilibrium concentration in the liquid phase. Results are presented on experiments using albumin labelled with iodine-131 or chrominm-51 and insulin labelled with iodine-131.

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Dr. E. NIE~A~N, Dr. W. I-IoFF~ANN, Farbwerke Hoechst A.G. vorm. Meister Lucius & Brfining, 6230 Frankfurt (M.)-

H6chst, Postfach 70

Bericht tiber die Fortschritte der analytischen Chemie

I. A l l g e m e i n e analytisehe Methoden, Apparate und Reagentien

Literatur. W. I-I. W~sTPE~I~, Physikalisches Praktikum. 9. Aufl. VII, 285 Seiten 126 Abbildungen und 6 graphischen Tabellen. Verlag Friedr. Vieweg & Sohn, mit Br~unsehweig 1959.1)reis Pl~stik DM 19,80.

Der Verf. des bekalmten Lehrbuches der Physik hat dem Studierenden, ins- besondere dem technischen Hochschiiler, einen neuen, kurzgefal~ten Leitfaden des physikalischen Praktikums in die I-Iand gegeben. Es werden einfache ]3bungs- aufgaben nebst den Grundlagen physikalischen Hessens besprochen und im ein- zelnen durchgerechnet; hierdurch wird der junge t)hysiker zu selbsti~ndigem Denken uncl Arbeiten angeregt. Nach einer kurzen Einffihrung in die Einheiten- systeme, Berechnung yon Messungen nebst Fehlerrechnung und praktische l~egeln werden Aufgaben aus der ~echanik, der W~rmelehre, G~stheorie, Akustik, Optik, Elektrik und Magnetik n~her erl~utert. Im Anhang des B~ndchens finder man Tabellen fiber physikalische Konst~nten, t~echenhilfen und transcendente Zahlen.

O. Fvc~s

I-I. M)-u~As, Tables pour le Calcul Direct des Constantes d'Equilibre des Syst~mes Chimiques aux Hautes Tempdratures, mit einem Vorwort yon P. P~tsc~. VII, 149 Seiten. Verlag H~sson & Cie., Paris 1959. Preis brosch. 16,50 nfrs.

Naeh einer Einleitung zu den thermodynamischen Beziehungen zwisehen den Gleichgewichtskonstanten einer chemischen l%eaktion, deren freier Energie, En- thalpie, Entropie und der Temperatur liefert der Verfi zaMreiche Diagramme und Tabellen unter Extrapolation jener Duten auf sehr hohe Temperaturen, n~mlieh welt fiber 2000~ Zum Schlul~ ffihrt der Verfi fiir die verschiedensten Re~ktions- typen Rechenbeispiele an, die besonders auf die Bediirfnisse des Hiitteningenieurs und -chemikers zugesehnitten sind. 0. Fucks

FRIEDI~ICtI CI~AlYIEI~, Papierchromatographie. Monographien zu ,,Angewandte Chemie" und ,,Chemie-Ingenieur-Technik" Nr. 64. Ffinfte, verbesserte Auflage, 218 Seiten mit 91 Abbildungen, 109 Tabellen und 8 Farbtafeln. Verlag Chemie, Gmbtt., Weinheim/Bergstr., 1962. Preis Ganzl. DH 21,--.

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z. aaaly~. Chem., Bd. 200 29