5{iller u. a. : Bedeutung des Sauerstoffs fiir die Sporulierung der I-lefe 417

Vor der tJbertragung in das Wachstumsmedium enthielten die Kulturen etwa 700/0 Sporen. Die Ergebnisse zeigen, dab die Zeit yon 4 Stdn. im Waehstumsmedium einen sehr deutliehen Anstieg des RQ bewirkt. Im gleiehen Zeitraum ist der IJbergang der Sporen in den vegetativen Zustand noeh reeht geringfiigig; sins mikroskopisehe Untersuehung ergab, daft nnter diesen Bedingungen in etwa 5 bis 10% dsr Sporen enthaltenden Zellen ein oder zwei Sporsn zu keimen begannen. Aueh bier sehen wir wieder, daft der biochemisehe Effekt vor den morphologisehen Ver/~n- derungen zu beobaehten ist.

In ether Arbeit yon Slonimski 3 wird beriehtet, dab der R Q von Hefe- zellen, welehe im Warburg-Apparat eine Glueosel6sung veratmeten, innerhalb yon 3 Stdn. yon Werten zwisehen 1,5 und 2 auf etwa 1 absank Es seheint sieh bier um dasselbe Phanomen zu handeln, das wir beobaehten. Slonimski hat offenbar die Sporulierung der Here nieht in seine Betraeh- tungen einbezogen; er gibt aueh keine Erkliirung ffir den Effekt. Aueh wit sind zur Zeit noeh nieht in der Lage, etwas fiber den zugrunde liegen- den Meehanismus auszusagen;_iwir glauben aber, z u r Annahme sines Zusammenhanges zwisehen den Ver~nderungen des I~Q in Aeecat- und GlueoselSsungen und der Sporulierung der Here unter dem Einfluft derselben Substanzen bereehtigt zu sein.

Eszter Scheiber dankt der Ungarn-Fliiehtlingshilfe der Rockefeller Foun- dation, O. Gabriel dem Theodor-K6rner-Stiftungsfonds und J. J. Miller

der Ontario Igeseareh Foundation und dem NationM I~eseareh Council of Canada fiir die ihnen gew~ihrte grogziigige Hilfe.

P. Slonimski, Aetualit~s bioehimiques No. 17, Liege 1953.

[lber die Bedeutung des Sauerstoffs fiir die Sporulierung der Hefe (Kurze M i t t e i h n g )

Von J. I. Miller, 0. Gabriel, Eszter Seheiber und 0. Hoffmann-0stenhof

Aus dem Department of Biology, Hamilton College, ~icMaster University, Hamilton, Ontario, und dem I. Chemischen Institut der Universit~t Wien

(Eingegangen am 20. Mat 1957)

Zahlreiche Hinweise deuten darauf bin, daft aerobe Bedingungen ffir die Sporulierung der t Iele erforderlich sind. Lindegren und Hamilton 1 fanden sporulierende Zellen nur in den ~uBeren Schichten yon zerschnitte- hen ttefekolonien und Maneval ~ konnte Aseosporen ausschlieglich an den Augenseiten yon Hefeziegeln beobachten. Der Erfolg der klassischen Gipsblocktechnik zur Induktion der Hefesporulierung k6nnte zumindest

1 C. C. Lindegren und E, Hamilton, Botan. Gaz. 105, 316 (1944). .z W . E . 2V1aneval, Botan. Gaz. 78, 122 (1924).

418 Miller, Gabriel, 8eheiber und l~offmann-Ostenhof: i~[h. Chem., Bd. 88

zum Teil der guten Belfif tung der Zellen un te r diesen Bedingungen zu ve rdanken sein. Beim S tud ium der eytologisehen Effekte des Nadi- g e a g e n s fund Bau t z s e i n e s ta rke oxydie rende A k t i v i t g t sporul ierender Hefezellen. Mil ler und Halpern 4 beobaeh te t en eine sehr deut l iehe H e m m u n g der Sporul ierung du tch Cyanid. Slator 5 erhiel t wohl Hefe- sporen in Anwesenhei t sehr geringer 1V[engen yon Sauerstoff , n ieb t aber in Anaerobiose. Es ist bekann~, dal? die Hefezelle auch noeh bei e inem Sauers to f f -Par t i a ld ruek yon 1 m m Hg ims tande ist, ak t iv Sauerstoff aufzunehmen 6. Zu allen diesen Befunden s teht al lerdings ein Ber ieh t yon Adam.s' und MigleF in e inem gewissen Gegensatz. Danaeh n a h m die Anzahl von Sl0oren, welehe yon di inn auf 0 ,14% wasserfreies Nat, r imn- aee ta t und 0,04~o Glucose en tha l t enden Sehrggagax ausgest r iehenen Hefezellen gebi ldet wurden, wohl deut l ieh mi t der Verr ingerung des Sauers tof f -Par t iMdruekes ab ; bei e inem Sauers~off-Pargialdruek von Null war aber immerhin noeh eine betr/ieh~,]iehe Anzah l von Sporen (I7~o) zu finden. Die hier ber ieh te ten Versuehe wurden zur t(_lgrung der Frage , ob Sauerstoff f/it die Sporul ierung notwendig ist, angestel l t .

I-Iefezelten (Stamfn F 49), die naeh einer yon Miller s besehriebenen 5{ethode kult iviert worden waren, ~urden in LSsungen iibertragen, yon denen bekannt ist, dal3 sic unter aeroben Bedingmagen immer eine sehr sgarke Sporulierung der I-Iefe induzieren. Diese bestandeu aus je 50 ml m/30 Phthalatpuffer yon p H 5, der geringe Konzentrat ionen yon Glucose oder Aeetat enthielt.. In sie wurden 4 Mill. I-Iefezellen pro Milliliter eingebraeht und die so erhalt.ene Misehung in 1-1-Kulturflasehen iiberfiihrt. Die Flasehen wurden mi~ einer Einleitungsvorriehttmg versehen, dureh welehe vorgereinigter, sauerst.off- freier Stickstoff etwa 20 Min. lung unter hgufigem Sehtitteln eingeleitet wurde. Danaeh ~:urden die Kulturflasehen auf ihre flaehe Seite in den Brutschrank (27 ~ gestellt. Am zweiten Tag des Experimentes wurde neuerlieh Stiekstoff einge!eitet, um etwa entstandenes CO~ zu entfernen, das naeh Adams und Miller 7 die Sporulierung hemmen kann.

Tabelle 1. V e r s u e h e i i b e r d i e S p o r u l i e r u n g d e r H e r e u n t e r a n a e r o b e n t 3 e d i n g u n g e n in v e r s c h i e d e n e n M e d i e n

I Sporulierungsmedium (Zusatz zu m/a0 I Prozent der Zellen,

Phthalatpuffer, t)H 5) I die Sporen enthalf.en

I 0,1% CI-IaCOONa �9 3 I-I~O . . . . . . . . . . . . . . . . i 0 0,05% Glucose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . II 0 0,1% Glucose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I 0 0,1% CI-IaCOONa �9 3 I-I20 d- 0,1% Glucose 0,5 0,2% CI-IaCOONa �9 3 I-I~O d- 0,05% Glucose 0

a E. Bautz. Z. Na.turforsch. l0 b, 312 (1955). J . J . Miller und C. Halpern; Canad. g. Mierobiol. 2, 519 (1956).

5 A . Slator, J. Chem. Soc. London 119, 115 (1921). s R . J . Winzler, J. Cell. Comp. Physiol. 17, 263 (1941). 7 A. M. Adams und J . J . Miller, C~nad. J. Botany 82, 320 (1954).

J. J. Miller, Canad. J. Microbiol. 8, 81 (1957).

H. 3/1957] Bedeutung des Sauerstoffs fiir die Sporulierung der Here 419

In Tabelle 1 sind die Ergebnisse dieser Versuche, die 7 Tage dauerf, en, zu- sammengestellt. Es zeigte sich, dab unter den anaeroben Bedingungen, wie sie durch die beschriebene Versuchsanordnung hergestellt wurden, die Spo- rulierungsfghigkeit der Here, wean fiberhaupt vorhanden, extrem gering ist.

Diese Ergebnisse steheu im Widerspruch zu den erw~hnten Befunden von A d a m s und M i l l e r L Wir glauben, den Ausfall dieser Experimente, an denen ja einer yon uns beteiligt war, damit erkl~ren zu kSnnen, dal~ die darnels gew~hlte Versuchsanordnung nicht dazu geeignet war, wirk- lich anaerobe Bedingungen zu gew~hrleisten. Vor allem diirfte in der ziemlich dicken Agarsehicht Luft in gelSster Form enthalten gewesen sein.

Unsere jetzt gewonnenen Ergebnisse erlauben auch eine Erkl~rung einer frfiheren Beobachtung 9, da]~ bei der ErhShung der Zel]dichte yon 4Mill. auf 8Mill. pro Milliliter im Acetat-Sporulierungsmedium die Anzahl der entstehenden Sporen abnimmt. Dureh die ErhShung der Zelldiclite wird offenbar im Verlauf der Inkubation der zur Verfiigung stehende Sauerstoff so weitgehend verbr~ucht, dal~ die Sporulierung gehemmt wird. Um diese Vorstellung experimentell zu prtifen, wurden 1-1-Kulturflasclien, die 50 ml Phthalatpuffer mit 0,3% Acetat enthielten, mit verschiedenen Mengen von Hefezellen beschickt und ohne Schfitteln bei 27 ~ inkubiert. Einige dieser Flasehen enthielten Luft als Gasphase, w~hrend die anderen mit Sauerstoff geffillt waren. Bei h5herer Zelldichte sollte, wenn Sauerstoff der begrenzende F~ktor w~re, das Ausmal~ der Sporulierung in denjenigen Flasehen grSBer sein, die mit Sauerstoff geftillt waren. Die in Tabelle 2 d~rgestellten Ergeblfisse beweisen die Riehtigkeit dieser Vorstellung. Es ist bemerkenswert, d~l~ in den Kultur- flaschen, die mit geringeren Zelldichten (4 Mill. pro Milliliter) beschickt w~ren, in Anwesenheit yon reinem Sauerstoff weuiger Sporen gebildet wurden als mit Luft. Dies stimmt mit l~esultaten yon A d a m s und M i l l e r 7 fiberein; damals wurde mit 1 Mill. Zellen pro Milliliter in einem Glucose und Acetat enthaltenden Medium eine st~rkere Sporulierung in Luft gefunden Ms in Sauerstoff.

Tabelle 2. E in f l u~ der Ze l l d i ch t e auf die S p o r e n b i l d u n g der Hefe in Gegenwar~ yon r e inem S a u e r s t o f f oder L u f t

Zelldichte Prozent der Zellen, (in ~[illionen pro die Sporen enthalten

4 4

10 10 20 20

Gasphase fiber der ml) KulturlSsung

Luft Sauerstoff

Luf~ Sauerstoff

Luft Sauerstoff

18,5 6,3 8,8]

42,8 4,5]

12,5

9 j . j . Mil ler , J . Calvin ~md J . H . Trvmaine , C~nad. J. Microbiol. 1, 560 (1955).

Monatshef~e ffir Chemie. Bd. 88/3 28

420 Miller u. a~. : Bedeu~ung des Sauerstoffs ftir die Sporulierung der IKofe

Ein Grund fiir die verringerte Sporulierung bei hSheren Zelldichten k6nnte allerdings aueh darin bestehen, dab die Zellen selbst w/ihrend der Inkubat ion tIemmstoffe der Sporulierung ausseheiden, deren Konzen- t rat ion bei h6heren Zelldiehten so grol3 wiirde, dab eine meBbare t I emmung der Sporenbildung zustande kommt. Zur Prtifung dieser Hypothese stellten wir folgenden Versueh an: In Acetat-Sporulierungs- medium der besehriebenen Art wurden 20 Mill. Zellen pro Milliliter ein- gebracht. In einer Versuehsserie wurde das Medium jeden Tag abzentri- fugiert und dutch frisehe LSsung ersetzt, w~ihrend es in der anderen fiber die gesamte Versuehsdauer belassen wurde. Der t~gliehe Ersatz des Mediums mfiBte die Konzentrat ion etwa gebildeter J-Iemmstoffe stark herabsetzen; es zeigte sieh aber, dab die Anzahl an Sporen in beiden Versuehsserien fast gleieh war, was die oben angef/ihrte t typothese widerlegt.

Vor kurzem beriehteten wit, dab der respiratorisehe Quotient (RQ) von Hefezellen, die aus einem Waehstumsmedium in ein Aeetat- oder in ein Glueose-Sporulierungsmedium ~bertragen werden, in kurzer Zeit deutlieh absinkt 1~ 1L Es interessierte uns, ob aueh fiir diesen Effekt die Anwesenheit yon Sauerstoff erforderlich ist. Entsprechende Versuehe, die mit Hilfe der bereits besehriebenen Teehnik 1~ durehgefiihrt wurden,

Tabelle 3. Die V e r a n d e r u n g e n des r e s p i r a t o r i s e h e n Q u o t i e n t e n d u r e h B e h a n d l u n g der I-Iefe in v e r s e h i e d e n e n Medien u n t e r

a e r o b e n und a n a e r o b e n B e d i n g u n g e n

] Bedingun- I respirato- .krt der Vorbehandlung gen derVor- rischer

belmndhmg Q'~mtient

I ~Vachstumsmedium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [ aerob 1,88 1 Tag in 0,23%igem Acetat-Sporulierungsmedinm . . . . . ! aerob 1,41 1 Tag in 0,23%igem Aeetat-Sporulierungsmedium . . . . . ana,erob 2,27 1 Tag in 0,1~oigem Glueose-Sporulierungsmedium . . . . . [ aerob 1,08 1 Tag in 0,1 ~oigem Glueose-Sporulierungsmedium . . . . . i anaerob 2, t 0

sind in Tabelle 3 zusammengefaBt. Die Ergebnisse zelgen deutlieh, dug ein Absinken des R Q nut unter aeroben Bedingungen erfolgt. Daraus und aueh aus anderen Resultaten 11 schlieBen wit, dab zwischen der Sporulierung und dem Absinken des I~Q in diesen Substraten ein Zusammenhang besteht.

J. J . Miller dankt der Ontario Research Foundation und dem National P~eseareh Council of Canada, O. Gabriel dem Theodor-K6rner-Stiftungs- fends und E. Scheiber der Ungarn-Flfiehtlingshilfe der Rockefeller Foundation fiir die ihnen gewS~hrte groBziigige Hilfe.

lo j . or Miller, E. Scheiber, O. Gabriel und O. Hof/mann-Oste~d~o], ~t l . Chem, 88, 271 (1957).

11 E. Seheiber, O. Gabriel, O. Ho/]mann.Ostenho] ,rod J. J. Miller, ~r Chem. 88, 61~ (1957).

t t e rausgeber : Akademie der Wissenschuften, W i e a I , Dr . - Ignaz-Seipel -Pla tz 2, und Verein (}st.err. Chemiker , Wien I , Eschenbachgasse 9. - Ver lag : Springer-Verlag, Wien I , M61kerbastei 5. --

Ff i r den InhMt verantwor~l~ch: Prof . Dr . F. GMinovsky, Wien I X , W~.hringer StraBe 38. D r u c k : Manzsche Buchdruckere i , Wien I X , Lus~kandlgasse 52