Zeitschrift fiir Xrebsforschung, Bd. 58, S. 453--459 (1952).

Aus der I. Med. Xlinik der Universits Miinchen (Direktor: Prof. Dr. K. BI~GOLD) und dem Organisch-Chemisohen Institut der Technischen Hochschule Miinchen.

tdber die Verwendbarkeit radioaktiver Farbstoffe in der Tumordiagnostik.

Won H. CRAMER, H. W. PABST und ~. TREIBS.

(Eingegangen am 25. A~ril 1952.)

Die Schaffung eines diagnostischen Verfahrens zur friihzeitigen exakten Erkennung yon Krebsleiden ist eine unserer vordringlichsten Aufgaben, da die Prognose einer mMignen Erkrankung weitgehend yore rechtzeitigen Einsetzen einer Therapie abh~ngig ist. Durch die Anwendung yon radioaktivem Phosphor in der Tumordiagnostik war es uns bereits in der Verfolgung friiherer Arbeiten gelungen, oberfl~ch- liche Tumoren zu differenzieren, pa2 ist ein/~-Strahler mit einer Reich- weite yon nut 8--11 mm im Gewebe. Der Brauehbarkeit dieser Methode waren daher yon Anfang an bestimmte Grenzen gesetzt, die wit aller- dings dureh Anwendung yon Miniaturz~hlrohren in gewisser Weise auf endoskopischem Gebiet zu erweitern suchten. Zur Durchffihrung einer einwandfreien und in gleicher Weise iiir die inneren Organe durch- ffihrbaren Tumordiagnostik war es aber nofwendig, einen radioaktiven Stoff mit y-Strahlung, die ein st~rkeres DurchdringungsvermSgen besitzt, zu finden. Ein bezfiglich Strah]ungsart und HMbwertszeit g/instiges Isotop schien j1s~ zu sein. A]lerdings konnte yon diesem Isotop nieht erwarfet werden, dM~ es yon sieh aus eine besondere Affi- niter zum Tumorgewebe besitzt, es reichert sich vielmehr, wie bekannt, in der Schilddrfise an. Man konnte aber versuchen, j131 in eine chemische Verbindung einzubauen, die ihrerseits die Eigensehaft hat, sich im Krebsgewebe vermehrt anzureichern. Anf diese Weise wiirde dann auch das t~adiojod elektiv dureh die Tr~gersubstanz in den Tumor trans- portiert werden.

Auf der Suche nach Substanzen, die nach intravenSser Applikation im Tumorgewebe eine selektive Anreicherung erfahren und so eine Abgrenzung des Tumorgewebes yon der normMen Umgebung ermSg- lichen, fanden Moo~E und Mitarbeiter, dM~ Fluorescein im Hirntumor- gewebe selektiv gespeichert wird. Bei ErSffnung des Seh~tdels und Bestrah]ung mit u]traviolettem Licht kommt es zu deutlicher Fluores- cenz der gliomatSsen Gewebsabschnitte, wghrend das angrenzende normMe ttirngewebe keine oder nur ganz sehwache Fluorescenz zeigt. Durch Etikeft ierung des Fluoresceins mit j131 gelang es MOO~E, auf unblutigem Wege zu einer ann~hernden Tumorlokalisation zu kommen.

454 H. CRA~ER, H. W. PABST und A. T~IBS:

Dutch die Untersuchungen yon BINGOLD, STICK und C~Am~ wurde weiterhin bekannt, dab die Porphyrine zwar einerseits in bSsartigem Gewebe vermindert sind, bzw. vSllig fehlen, so dab man in Ubereinklang mit dem erniedrigten Katalase- und Cytochrom C-Oehalt yon einer verminderten Bildung der Tetrapyrrolsysteme im malignen Tumor sprechen kann, andererseits aber eine selektive Affinitgt zu neoplasti- schem Gewebe naehweisbar ist, wenn mail dem eareinomkranken Organismus Porphyrine intravenSs zufiihrt. Wghrend wir beim Radio- phosphor wissen, dal~ seine starke Anreieherung im Tumorgewebe durch seine Verwendung im erh5hten Nucleoproteidstoffweehsel der Krebszelle bedingt ist, kann fiber die Ursaehe des Ph~nomens der Konzentration sowohl des Fluoreseeins wie aueh des Porphyrins im Tumor noch nichts Endgfiltiges gesagt werden. Vielleieht sind ~nde- rungen der Permeabilit~itsverhgltnisse an dieser Erseheinung beteiligt.

Wit haben nun an einer t%eihe yon tumorkranken Patienten Unter~ suchungen mit Natrium-Dijod-Fluoreseein und Dijod-Deuteropophyrin durchgeffihrt.

Methodik.

A. Chemische Darstellung.

Definierte jodhaltige Porphyrine sind bisher noeh nieht dargestellt worden. Um Jod stabil an das Porphyrinmolekfil zu binden, kommt in erster Linie die Einffihrung als fi-Substituent in Frage. Entspreehende bromierte ]~orphyrine entstehen leicht bei der Einwirkung yon Brom auf Porphyrine mit unsubstituierter ~-Stellung und sogar dureh Eli- minierung fi-st~ndiger Vinylgruppen. Sie sind in grSBerer Zahl besehrie- ben worden (vgl. H. FISCg~R-O~T~, Die Chemie des Pyrrols II/l~ S. 230 If.). Bei st~rkerer Einwirkung wird das Porphyrinmolekfil dutch Brom, wie aueh Chlor, ~n den 4 Methinbrfieken substituiert. Im Gegensatz dazu sind derartige Jodierungen bisher nicht beobaehte~ worden.

Einige Vorversuche zeigten, dab die Einwirkung yon Jod nur schwie- rig erfolgt. Als geeignetes Porphyrin wurde das aus H~min leieht zug~tngliehe Deuteroporphyrin bzw. der Dimethylester, gews das 2 freie fi-Stellungen aufweist. Als geeignetes LSsungsmittel erwies sieh Chloroform, weshalb der darin leieht 15s]iehe Ester zu verwenden war, w~hrend in Eisessig, der aueh ftir das freie Porphyrin in Frage kommt, die Reaktion sehwieriger verl~uft. Zur Bindung des bei der Reaktion auftretenden Jodwasserstoffs bew~hrte sieh ein Zusatz yon wenig Pyridin, doch erfolgte die Jodierung aueh in reinem Chloroform bei vielstfindigem Erhitzen auf 100 ~ EinsehluBrohr. Diese Arbeitsweise war aueh notweudig, um Jodverluste zu vermeiden. Bei Verwendung von radioaktivem Jod wurde die verdfinnte w~Brige NaJl~l-Lasung

Verwendbarkeit radioaktiver Farbstoffe in der Tumordiagnostik. 455

zungchst im Bombenrohr bis auf 1 Tropfen verdampft, damit die konzentrierte LSsung mit dem zugesetzten elementaren Jod in Aus- tauseh treten konnte und Porphyrinester sowie Jod und etwa 5 em a Chloroform zugegeben. Zweeks guter Ausnutzung des Jods wurde das Porphyrin im kleinen IJbersehug verwendet und naeh vollendeter Umsetzung mit Brom aus dem gebildeten Jodwasserstoff wieder Jod freigemaeht und weiter erhitzt. So wurden z. ]3. 10 mg Deuteroporphy- rin-dimethylester (Mol.-Gew. 538,5) mit 8 mg (4 J ' = 508) umgesetzt. Naeh 6--12stiindigem Erhitzen im Wasserbad wurden 2 mg Br 2 in 1 em 3 Chloroform zugesetzt und naeh weiterem 4stiindigen Erhitzen noehmals mit 1,5rag Dr 2 umgesetzt. Der jodierte Porphyrinester wurde dann naeh Abdampfen der L6sung mit wenig Pyridin auf- genommen und dureh 1/4stiindiges Erhitzen mit methylalkoholiseher Kalilauge im offenen Bombenrohr verseift. Naeh Verdiinnen mit Wasser fS~llt das Porphyrin dutch Ansguern mit Essigs~ure quantitativ aus, naeh Auswasehen mit Wasser wurde dann mit sehr verdiinnter w~griger Kalilauge gelSst und sterilisiert. Das Na-Salz ist schwerer 16slieh und daher weniger geeignet. Einige Male wurde aueh der Ester in i/therisehe LSsung iibergefiihrt, mit 5%iger Salzs~ure unveri~nderter Deuteroporphyrinester entfernt und dann erst verseift.

Die Jodierung verlief nieht immer gleiehmg~gig und die Ausbeute an aktivem Porphyrin war sehr weehselnd. Bei einem Versueh der direkten Jodierung yon freiem Deuteroporphyrin in Eisessig Ms LSsungsmittel war die Ausbeute an aktivem Material gering.

Zur Bestgtigung wurde der inak~;ive Dijod-Deuteroporphyrin- dimethylester rein dargestellt: 50 mg Deuteroporphyrin-dimethylester wurden in 50 em 3 Chloroform mit 100 mg Jod unter Zusatz yon einem Tropfen Pyridin im Einsehmelzrohr 24 Std im siedenden ~Tasserbad erhitzt. Nach Beseitigung des fibersehiissigen Jods dureh Aussehiitteln mit w~igrigem Bisulfit, Eindampfen der mit Wasser gewaschenen und mit Kaliumearbonat getroekneten L6sung auf 2--3 era, kristallisierte der Ester auf Zusatz yon 5 em s heil3em Methanol. Naeh noehmaligem Umkristallisieren aus Chloroform-Methanol ersehien der Ester in glitzernden Prismen yon F 239%

C~2H~20~N4J 2 Ber. J--~ 32,2%, Gef. 32,81%. Der Ester ist ziem]ieh sehwer 15slieh und im Gegensatz zu vielen

anderen Porphyrinestern sogar in kaltem Chloroform nur m~13ig 15slieh. Absorptionsspektrum in eh]oroformhMtigem Ather: I. 628,3; II. 573,3; III . 536,2; IV. 502,6m/~. Gegeniiber dem Deuteroporphyrin hat eine betr~ehtliche Versehie-

bung der Bandenmaxima naeh dem Langwelligen stattgefunden, die entsprechenden Zahlen sind:

I. 621,7; II. 566,8; III . 525,9; IV. 494,1 m/~.

456 i . CRAMER, H. W. PABST und A. T~EIBS:

Die Basizitgt ist erwartungsgemal~ viel geringer, Salzs~urezahl 14. Die Verseifung zur freien Carbons~ure erfolgt durch lstfindiges Ste- hen der L5sung des Esters in 20%iger Salzs~ure oder durch 1/4stfin- diges Erw~rraen oder lgngeres Stehen einer rait raethylalkoholischer Kalilauge versetzten LSsung in Pyridin. Das Porphyrin ist spektro- skopisch rait dem Ester identiseh und besitzt etwa die gleiche Salz- sgurezahl 14, w~hrend die Ester der halogenfreien Porphyrine stets hShere Sa]zs~urezahlen aufweisen wie die entsprechenden Carbonsguren.

Die Bildung yon Metallkoraplexen erfolgt ebenso leicht wie bei den halogenfreien Porphyrinen. Dijod-Deuteroporphyrin-diraethylester-Zn in Xther: I. 578,9; II. 542,4 ra#.

Aktives Dijod-Fluorescein wurde ira Prinzip ebenso wie das jodierte Porphyrin hergestellt. Zur LSsung yon Fluorescein, das ebenso ira kleinen ~)berschul~ verwendet wurde, in verdfinnter Natronlauge, gab man eine LSsung yon Jod in Natron]auge. Nach Freilegung yon Jod und Fluorescein rait Essigsgure wurde dutch raehrstfindiges Erhitzen des Einschraelzrohres ira Wasserbad jodiert. Auch hier wurde der gebildete Jodwasserstoff dutch zweiraaliges Urasetzen rait Brora wieder in freies Jod verwandelt und nochraals in Reaktion gebracht. Die Aus- beute an aktivem jodierten Fluorescein war wechselnd. Die Isolierung erfolgte dutch Eindampfen der LSsung, die auch ausgefallene Anteile euthielt, ira Vakuura, Auswaschen rait wenig Wasser. Der jodierte Farbstoff wurde dann rait sehr verdfinnter Natronlauge gel5st und ansehlieBend sterilisiert.

B. Mefimethodik. Dem zu untersuchenden Patienten wurden 0,1--0,47 raC jlSl in

Form y o n Na-Dijod-Fluorescein bzw. Dijod-Deuteroporphyrin intra- venSs injiziert. AnschlieBend erfolgte fiber raehrere Stunden bis zu einigen Tagen die Messung rait dem Mfiller-Geiger-Z~thlrohr fiber dera Tumor und einer syrametrischen Verg]eiehsstelle. Grunds~tzlich wurden yon uns nur solche F~lle untersueht, wo das Vorliegen turaor6ser Prozesse bereits rSntgenologisch, bronchographiseh oder histol0gisch rait Sicherheit festgestellt worden war. Zur Absehirraung des Z~hlrohrs gegen seitlich ankoraraende Strahlen versenkten wit es in einen Blei- tubus yon 1,3 em Dieke und einera Fenster rait einer 0ffnung yon 9,5 cra ~, der an einem yon uns besonders konstruierten Gestell nach allen Riehtungen schwenkbar angebracht war. Um raSglichst genaue Ergebnisse zu erhalten haben, wir fiber einer KSrperstelle bis zu 10 rain geraessen.

Yersuchsergebnisse. Aus unseren Ergebnissen, die in Tabelle ] zusamraengefaBt sind,

ist ersichtlich, dal~ wir die grSl~te Anreicherung der radioaktiven Farb-

Verwendbarkeit radioaktiver Farbstoffe in der Tumordiagnostik. 457

Nr.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13

14

i5 16

Name

M a X J . Johann G. Johann Gs. Gertrud R. Robert P. Alois B. Michael B. Benno G. Franz Sch. Johann It . Ludwig B. Wenzel M. Alois I-I.

Lorenz E.

Franz M. Anna P.

Tabelle 1.

Verwendeter Stoff

0,1 mC Fluorescein 0,4 mC ,, 0,28 mC ,, 0,47 mC ,, 0,43 mC ,, 0,39 mC ,, 0,4 mC ,, 0,4 mC ,, 0,25 mC ,, 0,1 mC Porphyrin 0,1 mC ,,

i0,25 mC ,, 0,25 mC ,,

'0,25 mC ,,

0,1 mC ,, 0,1 mC ,,

1E[axim ale Differenz zwi-

sehen Aktivitf~t liber normMer Vergleiehsstelle

(= 100%) und Tumor

%

post inj ee-

ti onem

+ 32,8

Std

+ 1 9 1 § 27,5 + 28,5 2 + 36,3 1/~ + 50 1/~ +16,4 2 - t -7 6 + 10 1 + 40 4 -t- 30,7 24 + 7,2 48 + 39,7 24 -t- 56,3 /2

4

-~ 22,5 + 2,3

Diagnose

Glioblastom

Oligodendrogliom

Bronchial-Ca.

Fibrosarkom- Lungenmetastase

Stirnhirntumor (keine histolo-

gisehe Diagnose, wahrscheinlich

Glioblastom) Hypernephrom

Ovarialeyste

s toffe in den e r s t en S t u n d e n n a c h der i n t r a v e n S s e n I n j e k t i o n f iber

d e m T u m o r g e f u n d e n h a b e n . Be i den F g l l e n 9 - - 1 2 w u r d e n die e r s t en

M e s s u n g e n ers t 24 S t d p o s t i n j e c t i o n e m durchgef f ih r t , da d ie P a t i e n t e n

in a n d e r e n K l i n i k e n lagen.

N a c h d e n E r g e b n i s s e n y o n L ~ R o ~ , T W e e D Y u n d AsHK~NAzY

w e r d e n in d e n e r s t e n 24 S t d 10% des r ad ioak~ iven F luo resee ins d u t c h

den H a m ~usgeseh ieden . U m fes tzus te l l en , we lehe r A n t e i l auf u n v e r -

~nde r t e s Na -Di jod l3 i -F luo re see in u n d auf be re i t s a b g e s p a l t e n e s j~3i en t -

f~ll t , h a b e n w i t bei e iner l~eihe y o n P a t i e n t e n ebenfa l l s die A u s s e h e i d u n g

Tabelle 2.

Ausseheidung dutch den Karn in % dIer gesamten verabfolgten AktiviUit

Fall A ' . . . . . Fall B . . . . .

E x m = Extrakt ; E. It . = extrahierter Harn.

Z. Krebsforsehung. Bd . 58.

0_3 ] i 0 i o c oiooo in

6,3~ ~ 1,96 1 1,38 3,85 ~ 16,56 5,21 I 0,81 10 ~ 1,24 10:5~164 15:75 Ira9 1 s,44

31

458 H. C~A~R, H. W. PABST und A. T~EI~s:

bestimmt, und zwar haben wir das Fluoreseein aus dem H a m isoliert und dann Extrakt und extrahierten Harn getrennt gemessen.

Die Methode war folgende: Der H a m wurde anges~uert und 3mal mit ~ther im Verh~ltnis 5 : 1 ausgeschiittelt. (Bei einmaliger Extraktion gehen etwa 99,6% des Fluoreseeins in die ~therphase.) Anschliel~end wurde mit n/10 Natronlauge gef~llt. In Tabe]le 2 haben wir 2 Ergebnisse herausgestellt.

Die grSl~te Na-Dijod131-Fluoresceinmenge wird also in den ersten 3 Std post applicationem ausgeschieden. Die durchschnittliehe Gesamt- ausseheidung aller yon uns untersuchten Patienten betrug in den ersten 24 Std 11,7% und entspricht damit ann~hernd den Angaben oben genannter Autoren.

Kritik. Die Ergebnisse zeigen, dal~ eine Tumordiagnostik mit den angeffihrten

Farbstoffen schwierig ist, da die Untersehiede zwischen der Tumorstelle und einer analogen gesunden Me~stelle nicht sehr groB sind. Wir weisen an dieser Stelle auf unsere Arbeiten mit p32 hin, we wir nach Ablauf der H~]fte der Halbwertszeit noch eine Aktivit~tserhShung yon mindestens 25 % fiber dem Tumor verlangen, um ihn als maligne anzu- spreehen. Aueh ist hier die Anreieherung ann~hernd proportional der BSsartigkeit und wir erhalten z. B. bei Sarkomen zum Teil eine Stei- gerung um mehrere 100%. Bei j131 sind auBerdem die absoluten Ak- tivit~tswerte bei Verwendung yon 0,1--0,4 mC verh~ltnism~13ig niedrig, da die Farbstoffe sieh im ganzen KSrper verteilen und zun~chst zum groBen Tell in der Leber festgehalten werden. In der Leber erfolgt dann ein gewisser Abbau, Jod wird in Freiheit gesetzt und gelangt ent- sprechend seiner Organaffinit~t teflweise in die Sehilddrfise. Somit bleibt nur ein kleiner Teil des F~rbstoffes zur Speicherung im Tumor fibrig. Um die Fehlergrenze mSglichst klein zu hal~en, haben wir fiber einer MeBstelle bis zu 10 min gemessen. Die geringen Impulszahlen haben MOORE und Mitarbeiter veranlaf~t, mit der Injektionsmenge bis auf etwa 1 mC zu steigen und dann 2--5 rain je Ste]le zu messen. LE ROY, TWEEDY und AStIKENAZu fanden, dal~ eine Menge yon 1,0--1,1 mC ohne Schaden vertragen wurde. Zur Verabfolgung der- artiger Radiojodmengen konnten wir uns aber nicht entschlieBen, da wir mit ] mC schon in den Bereich einer therapeutisehen Joddosis kommen. Es ist m5glich, daI3 die Ergebnisse unter diesen Umstanden besser sind, Ms unsere. Trotzdem konnten wir aber bei unseren Unter- suchungen die Ansichten MOOREs, daI~ benigne Hirntumoren weniger l~adioflflorescein speichern, als maligne, nieht bestatigt finden, da gerade die im histologischen Sinne benignen Oligodendrogliome mehr Radiofluorescein anreicherten, als die ma]ignen Glioblastome. Auch DE WINTER stellte nach Untersuehung yon 34 Hirntumoren lest, dall

Verwendbarkeit radioaktiver Farbstoffe in der Tumordiagnostik. 459

die Dijodlal-Fluoreseeinmethode in der grogen Mehrzahl der Fglle n icht

in der Lage war, i rgendeine definit ive Auskunf t fiber den Sitz yon Tumoren zu geben. B~LO~E~ u n d EVASS beriehten, dab es m6glieh ist, kr~nkhaf te Vergnderungen, die radioakt ives lq'luorescein anreiehern, mi t dem Zghlrohr zu entdecken, vorausgesetzt, dag die Konzen t r a t i on

der Aktivi t i i t in diesen 10mal grSger ist, als im normalen Hirngewebe u n d dab die GrSBe des Tumors fiber ein gewisses Min imumvo lumen in Abhgngigkei t von seiner Tiefe hinausgeht . W e n n diese Tiefe 5 em betrggt, ist das Grenzvolumen 14 ema; bei 8 em Tiefe wird es 36 em a.

AbsehlieBend m6chten wit sagen, dag zwar eine mel3bare Anreiehe- rung yon Farbstoffen im Tumor s ta t t f indet , dab uns diese Methode der Tumorlokal isa t ion jedoeh znr al lgemeinen Verwendung in der kl inischen Diagnost ik ungeeignet erseheint.

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Doz. Dr. H. C~AMER, (13b) Mfinchen 15, I. Medizinische Universit~tsklinik, Ziemssenstr. l a.

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