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1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity
Fundamentos
de la
UHPLC.
Isidre Masana
Agilent Technologies
Especialista Productos UHPLC/MS
UHPLC MasterClass Junio 2013
Agenda
1. Fundamentos de la UHPLC:
• Historia e Introducción Fundamentos
– Ecuación de Van Deemter
– Aumento de la capacidad de
separación en gradientes al aumentar
el flujo de trabajo
2. Conclusiones.
Página: 2
Agenda
1. Fundamentos de la UHPLC:
• Historia e Introducción Fundamentos
– Ecuación de Van Deemter
– Aumento de la capacidad de
separación en gradientes al aumentar
el flujo de trabajo
2. Conclusiones.
Página: 3
Pequeña historia de la UHPLC 198X Ya existían en el mercado columnas de 1.5 µm (x30mm long.)
……
2003 Agilent 1100 Binario Columnas 1.8µm RRHT UFLC
2004 Waters Acquity Columnas 1.7µm BEH UPLC
2006 Agilent 1200 RRLC 2ª generación 1.8µm UHPLC
Thermo Accela Columnas 1.9µm
Jasco Xtreme-LC
2007 Shimadzu UFLCxr
Hitachi LaChrom Ultra
Scient. Syst. Ultra HP
2008 Dionex RSLC
Knauer Platin Blue
2009 PE Flexar
Agilent 1290 Binario
…
2012 Agilent 1290 Cuaternario
10 New UHPLC Systems in 5 Years – All different. 10 nuevos sistemas UHPLC en 5 años -Todos con características diferentes
Página: 4
Fundamentos UHPLC
1. Ecuación de Van Deemter:
• Capacidad de poder trabajar a flujos elevados SIN perder eficacia, con columnas:
– De pequeño tamaño de partícula totalmente porosas (TP <2µm)
– Fino espesor de fase estacionaria; columnas núcleo sólido superficialmente porosas (SP 2.7µm).
2. Ecuación de la Capacidad de Separación en Gradientes:
• La capacidad de separación de picos trabajando con gradientes de concentración es directamente proporcional al flujo de trabajo y al tiempo de gradiente subir el flujo permitirá mejorar la separación con gradientes.
Página: 5
Columnas UHPLC “versus” HPLC
• UHPLC:
• Columnas que permiten trabajar a flujos elevados SIN perder eficacia:
– Rellenos totalmente porosos de pequeño tamaño de partícula (<2µm).
– Rellenos superficialmente porosos (fino espesor de fase estacionaria 0.5µm) con núcleo sólido (1.7µm). Tipo “Poroshell-120”
• Los cromatógrafos de 400 bars se pueden adaptar para trabajar con columnas de UHPLC tipo Poroshell-120 (hasta 10cm long.) y totalmente porosas de 1.8µm (hasta 5cm long.) con acetonitrilo/agua.
• HPLC:
• Columnas tradicionales de 3.5 y 5µm de tamaño de partícula.
Página: 6
Agenda
1. Fundamentos de la UHPLC:
• Historia e Introducción Fundamentos
– Ecuación de Van Deemter
– Aumento de la capacidad de
separación en gradientes al aumentar
el flujo de trabajo
2. Conclusiones.
Página: 7
Longitudinal diffusion
Optimización del Flujo de Fase Móvil. Ecuación
Van Deemter: Inverso Eficacia “ vs“ Flujo
Pla
te H
eig
ht
H:
H
EP
T
1/N
Linear Velocity u
Eddy Diffusion *
H Sum Curve: Van Deemter
Resistance to Mass Transfer *
u opt
H min
C
H = + + u
u
A B C
A
* Peak Broadening due to the A term reduces proportionally with Dp
* Peak Broadening due to the B: at low velocity, time in mobile phase is longer, diffusion decreases N, increasing H. More concentrated
band of sample diffuses more rapidly than a less concentrated band under the same conditions
* Peak Broadening due to the C term: 1.-at higher velocity, solutes undergo fewer transitions, N is smaller, H is larger
2.- reduces proportionally with Dp2
B
Static Mobile Phase
Diffusion Path Deviations
into pores of particle
Porous Particles
Página 8
Efecto en la Eficacia del Tamaño de Partícula.
HPLC vs UHPLC: Gráfico Van Deemter
Columnas: ZORBAX Eclipse XDB-C18
Dimensiones: 4,6 x 50 mm (30 mm, 1,8 m)
Eluyente: 85:15 ACN: Agua
Velocidades de flujo: 0,05 – 5,0 mL/min
Temp: 20°C
Muestra: 1,0 L octanofenona en eluyente
1/ 2.5
+ EFI
CA
CIA
-
HPLC:EFICACIA A FLUJOS ALTOS:
EFICACIA A FLUJOS ÓPTIMOS
Partícula H_min
5 μm 9,1 μm
3,5 μm 5,8 μm
1,8 μm 3,7 μm
N(1.8µm) = 2.5 x N(5µm)
1.6 x Rs(5µm)
0.0000
S.T.M.: Sub Two Microns
Ultra Fast LC
Particulas1,8 μm a 5ml/min* dan más eficacia
N(1.8µm) = 2.5 x N(3.5µm) = 4 x N(5µm)
* 5ml/min con columnas 4.6mm - 1ml/min con columnas de 2.1mm D.I.
HPLC
GC: Diám. col. cap.
Espesor film f.estac. N
/ Diámetro Columna & Espesor Film (GC)
Página 9
4.6 x 150, 1.8um
490 bar
N = 28669
RS = 1.80 (+ 57%)
S/N = 44
7 Impurezas
Las 7 Separadas
a línea de base
4.6 x 150, 5um
93 bar
N = 7259
RS = 1.15
S/N = 42
Ejemplo de un cliente
Método Impurezas Isocr.
Zoom zona critica
rango tiempo @ 7min
4.6 x 150, 3.5um
165 bar
N = 14862
RS = 1.37
S/N = 50
7 Impurezas
6 No Separadas
a línea de base
Ejemplo de Mejora de Resolución HPLC vs
UHPLC con Columnas de 150mm x 1.8µm Ejemplo con muestra compleja: hasta un 60% de Mejora en la Resolución
4 Impurezas
2 No Separadas
a línea de base
HPLC UHPLC
Página 10
2.1mm x 50mm 1.8µm
1.00ml/min, 40°C
Grad.: 35-95% en 0.9 min
Analysis Time= 1.1min
UHPLC/RRLC, 40°C
10x faster
PW = 0.5 sec
min 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0
Ejemplo de Mejora de Velocidad HPLC vs UHPLC Agilent 1200-RRLC (600bars)
HPLC, 40°C
PW = 3.4sec
4.6 x 150mm, 5µm
1.20ml/min, 40°C
Grad.: 35-95% en 10.8 min
Analysis Time = 11min
min 0 2 4 6 8 10
0.2 0.6 0 0.4 min
2.1mm x 50mm 1.8µm
2.40ml/min, 95°C
Grad.: 35-95% en 0.38 min
Analysis Time: 0.4min
UHPLC/RRLC, 95°C
27x faster
PW = 197msec
150mm > 50mm: 3x
1.2ml/min on 4.6 > 2.4ml/min on 2.1: 10x 3 x 10 = 30x
Hasta 20x más rápido que un HPLC. Manteniendo la resolución
Página 11
Página 12
Efecto de la Temperatura en Gráfico de “Van Deemter”
Al aumentar la temperatura el óptimo se desplaza a flujos mayores
25°C, 45%ACN 60°C, 40%ACN 90°C, 35%ACN 120°C, 28%ACN
uo, opt
25ºC
60ºC
90ºC
120ºC
H = f (u) – butilparaben Tamaño partícula: 5 µm
7.00
9.00
11.00
13.00
15.00
17.00
19.00
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00
u (mm/s)
H (
µm
)
HTLC: HPLC a Alta Temperatura permite trabajar a mayores flujos sin pérdida
de eficiencia y con mejor transferencia de masa (curva más plana a flujos altos)
Agenda
1. Fundamentos de la UHPLC:
• Historia e Introducción Fundamentos
– Ecuación de Van Deemter.
– Aumento de la capacidad de
separación en gradientes al aumentar
el flujo de trabajo.
2. Conclusiones.
Página: 13
• La Capacidad de Separación de picos con Gradientes de concentración, es DIRECTAMENTE proporcional al FLUJO y al tiempo del gradiente:
• x2 flujo gradiente x2 nº de picos que puedo separar*.
• x3 flujo gradiente x3 nº de picos que puedo separar*.
• …..
• Flujos elevados permiten maximizar el poder de separación en gradiente por unidad de tiempo:
• P. Petersson et al., J.Sep.Sci, 2008,31, 2346-2357
• D. Guillarme et al., Journal of Chromatography A, 1216 (2009) 3232–3243
* El nº de picos que se pueden separar aumentará algo menos con columnas de 5um (por la ligera perdida de eficacia al subir el flujo), pero aún así compensa la pérdida de eficacia.
¿Porqué es Importante en Gradiente poder trabajar
a FLUJOS Elevados en HPLC y UHPLC?
K‘ α F x Tg
Página: 14
HPLC con GRADIENTES: NO es Imprescindible Cambiar
de Columna para Reducir Tiempos SIN perder Resolución Incluso con tamaños de partícula de 5 y 3.5µm
Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C8
4.6x50, 3.5µm
Gradiente 45 – 90% B en 3 y 2 min
Fase Móvil: A:25mM Na2HPO4 , pH 3
B: Metanol
Flujo: 2 y 3 mL/min
Temperatura: 35°C Muestra: Fármacos Cardiacos:1. Diltiazam
2. Dipyradamole 3. Nifedipina
4. Lidoflazina 5. Flunarizina
1
2 3
4
5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time (min)
F = 2.0 mL/min
Tg = 3 min
3 min
1
2 3
4
5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time (min)
F = 3.0 mL/min
Tg = 2 min
2 min
• Sin cambiar de columna, ni de tiempo de gradiente, SUBIR el FLUJO, permitirá
mejorar la resolución/capacidad de separación.
• El aumento de capacidad de separación al subir el flujo, compensa la pérdida de
eficacia de las columnas de 3.5 y 5 µm.
K‘ = (87 x F x Tg) / (Δ % x V0 x S)
Si mantenemos Tg=3 ( y F=3) obtendremos:
+Resolución y un tiempo análisis < 3min
Página: 15
Columnas: ZORBAX Eclipse XDB-C18
Dimensiones: 4,6 x 50 mm (30 mm, 1,8 m)
Eluyente: 85:15 ACN: Agua
Velocidades de flujo: 0,05 – 5,0 mL/min
Temp: 20°C
Muestra: 1,0 L octanofenona en eluyente 1/ 2.5
+ EFI
CA
CIA
-
EFICACIA A FLUJOS ÓPTIMOS
Partícula H_min
5 μm 9,1 μm
3,5 μm 5,8 μm
1,8 μm 3,7 μm
N(1.8µm) = 2.5 x N(5µm)
1.6 x Rs(5µm)
0.0000
Ultra Fast LC
* 5ml/min con columnas 4.6mm - 1ml/min con columnas de 2.1mm D.I.
HPLC
Página: 16
El aumento de capacidad de separación al subir el flujo, compensa la pérdida de
eficacia de las columnas de 3.5 y 5 µm.:
• 5µm 0.75 mL/min: Eficacia/2.4 pero Capacidad Separación x7
• 3.5µm 0.85 mL/min: Eficacia/2 pero Capacidad Separación x6
K‘ = (87 x F x Tg) / ( Δ % x V0 x S)
Las columnas de 1.8µm NO conviene
que trabajen a flujos bajos; empiezan a
perder eficacia por debajo de
0.8mL/min (en columnas 4.6mm d.i //0.16
mL/min con 2.1mm d.i..)
La Ventaja de Subir el Flujo Trabajando con
Gradientes Incluso en HPLC (columnas 3.5 y 5µm)
ó Poroshell 120
Influencia del Flujo en Gradiente con Columnas 5 µm Comparación GRADIENTE 10 min a 1-3-5 ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm
3mL/min
1mL/min
5mL/min 1290 Infinity Cuaternario
Columna: 5µm 4.6x150mm Eclipse XDB-C8
Gradiente: H20/ACN50/50-0/100 en 10 min
Flujo: 1, 3 y 5mL/min (pruebas respetando Pmáx
columna: 400bars) 40ºC.
Inyección: 2 µl muestra (1500ppm dimetilftalato y
dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm o-
terfenilo en metanol)
8min
4.5min
3.3min
Al subir flujo se reduce el
tiempo y el ancho de los picos
Página: 17
FxTg= 10
FxTg= 30
FxTg= 50
Influencia del Flujo en Gradiente con Columnas 5 µm Comparación en ESCALA TIEMPO NORMALIZADA GRADIENTE 10 min a 1-3-5
ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm
3mL/min
1mL/min
5mL/min Al subir flujo en gradiente se reduce el tiempo y el
ancho de los picos y en especial de los del principio
mejora la capacidad de separación de picos
8min
4.5min
3.3min
Peak width:
0.0546
Peak width:
0.0242
Peak width:
0.0171
Peak width:
0.0496
Peak width:
0.0542
Peak width:
0.0696
Página: 18
Peak width:
0.0696
Peak width:
0.0446
Peak width:
0.0371
Flujo
mL/
min
Capacidad
Separación Nº picos
(ref.1º)
Capacidad
Separación Nº picos
(ref.3º)
1 35 30
3 45 35
5 55 40
Nº de picos que se pueden
separar con resolución hasta
línea de base en función del
ancho en línea de base del 1er
(zona inicial) y 3er pico (zona
central) del cromatograma a
distintos flujos con la columna de
5µm totalmente porosa
Al subir flujo aumenta el nº de picos que se pueden separar -INCLUSO con una
columna de 5µm- y además se reduce el tiempo e análisis
FxTg= 10
FxTg= 30
FxTg= 50
min 2 4 6 8 10
mAU
0
500
1000
1500
DAD1 A, Sig=240,80 Ref=360,100 of AIAFOR~1\1AA-0401.AIA\SIGNAL01.CDF (AIA imported)
1.9
63
2.6
62
5.4
15
10.6
43
min 2 4 6 8 10
mAU
0
500
1000
1500
DAD1 A, Sig=240,80 Ref=360,100 of AIAFOR~1\1AA-3601.AIA\SIGNAL01.CDF (AIA imported)
0.6
72
0.9
09
1.8
32
3.5
89
min 2 4 6 8 10
mAU
0
500
1000
1500
DAD1 A, Sig=240,80 Ref=360,100 of AIAFOR~1\1AA-0501.AIA\SIGNAL01.CDF (AIA imported)
0.4
07
0.5
50
1.1
15
2.2
04
HPLC ISOCRÁTICO: Pérdida de Eficacia con 5 µm a Flujos Elevados Comparación Isocrático a 1-3-5 ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm
Flujo: 1 ml/min. ACN/H2O 70/30
Flujo: 3 ml/min. ACN/H2O 70/30
Flujo: 5 ml/min. ACN/H2O 70/30 Isocrático: ACN/H2O 70/30
Inyección: 5 µl muestra (isocrática:1500ppm dimetilftalato y
dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm o-terfenilo en metanol
Detección: DAD 240/80 nm ref:360/100nm, slit 8nm y frecuencia de adquisición a 0.01 y 0.05min Celda 6mm y 5µl
N= 15.700 N= 16.200
N= 10.000 N= 9.900
N= 6.900
N= 6.500
• En ISOCRÁTICO Con 5µm hay una pérdida
de eficacia al pasar de 1 a 3-5 ml/min, pero
mantiene una buena resolución.
• 5ml/min con columna 4.6mm d.i.: N(1.8µm)
= 2.5 x N(3.5µm) = 4 x N(5µm)
Comparación Normalizada
min 2 4 6 8 10
1mL/min
3mL/min
5mL/min
Página 19
Entre 1 y 3ml/min
apenas se aprecia
pérdida de resolución
Agenda
1. Fundamentos de la UHPLC:
• Historia e Introducción Fundamentos
– Ecuación de Van Deemter
– Aumento de la capacidad de
separación en gradientes al aumentar
el flujo de trabajo
2. Conclusiones.
Página: 20
Conclusiones: UHPLC “versus” HPLC
Página: 21
UHPLC permite MAXIMIZAR:
• Reducción de Tiempos de Análisis SIN perder Resolución.
• Aumentar la Resolución SIN incrementar tiempo de Análisis.
HPLC (400 bars) -incluso sin cambiar de columna- permite:
• Simplemente SUBIENDO el FLUJO de trabajo* Reducir Tiempos y
Aumentar la Resolución.
* Trabajando con gradientes de concentración
1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity
Serie 1200 Infinity: la Máxima Flexibilidad
para trabajar en HPLC y UHPLC,
en Todo Tipo Aplicaciones.
Hasta 5mL/min*
para máxima eficacia y
mínimo tiempo de análisis
incluso con las
tradicionales y robustas
columnas de 4.6mm d.i
*hasta 10mL/min con bombas
cuaternarias
Página: 22
Agilent 1290 Infinity LC
Muchas
Gracias
por su
Atención
Estamos a su disposición en
tel.: 901.11.6890 [email protected]
[email protected] www.agilent.com/chem
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