Upload
others
View
28
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN PENETAPAN KADAR FENOLIK
TOTAL EKSTRAK ETANOL BUAH BUNI (Antidesma bunius (L.) Spreng)
DENGAN METODE 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) DAN METODE
FOLIN-CIOCALTEU
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Margareta Novi Wijayanti
NIM : 128114117
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2016
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN PENETAPAN KADAR FENOLIK
TOTAL EKSTRAK ETANOL BUAH BUNI (Antidesma bunius (L.) Spreng)
DENGAN METODE 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) DAN METODE
FOLIN-CIOCALTEU
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Margareta Novi Wijayanti
NIM : 128114117
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2016
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
I can do all this through Him who gives me strength.
- Philippians 4:13-
“When you look closely to the path you have travel on, you will realise that God
was always with you, directing every step you took.”
-Lailah Gifty Akita-
“Life will always have a different plan for you. If you don’t give up, you will
eventually get to your destination. But towards the end of your life, you may look
back and realize that it was never really about the destination; it was the journey
that counted.”
-King Samuel Benson-
Kupersembahkan skripsi ini untuk :
- Tuhan Yesus yang selalu membimbing dan memudahkan dalam setiap
langkahku
- Kedua orang tua dan kakak yang selalu mendukung dan mendoakan
- Teman – teman yang selalu memberi semangat
- Almamaterku
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan atas berkat dan bimbingan-
Nya penulis dapat menyelesaikan Skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas
Antioksidan Dan Penetapan Kadar Fenolik Total Ekstrak Etanol Buah Buni
(Antidesma bunius (L.) Spreng) Dengan Metode 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
(DPPH) Dan Metode Folin Ciocalteu” ini dengan baik. Skripsi ini disusun untuk
memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program Studi
Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma.
Penulis mengalami berbagai macam kesulitan dan masalah dalam proses
pengerjaan Skripsi ini. Kesulitan dan masalah ini dapat diatasi penulis dengan
bantuan dari segala pihak. Oleh karena itu penulis hendak mengucapkan terima
kasih kepada :
1. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma.
2. Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt., selaku Dosen Pembimbing Utama dan
Dosen Penguji Skripsi atas segala kesabaran dan masukan sehingga Skripsi
ini dapat diselesaikan dengan baik.
3. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt.,selaku Dosen Pembimbing Pendamping
dan Dosen Penguji Skripsi atas segala kesabaran dan masukan sehingga
Skripsi ini dapat diselesaikan dengan baik.
4. Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., selaku Dosen Penguji Skripsi atas masukkan,
kritik, dan saran kepada penulis dalam penyusunan Skripsi ini.
5. Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc selaku Dosen Penguji Skripsi atas
masukkan, kritik, dan saran kepada penulis dalam penyusunan Skripsi ini.
6. Agustina Setiawati, M.Sc., Apt., selaku Kepala Laboratorium Fakultas
Farmasi yang telah memberikan izin dalam penggunaan laboratorium.
7. Pak Wagiran selaku Laboran Laboratorium Farmakognosi - Fitokimia, Pak
Suparlanselaku Laboran Laboratorium Kimia Organik, Mas Bimo selaku
Laboran Laboratorium Kimia Analisis, Mas Sigit selaku Laboran Kebun
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
Tanaman Obat atas segala bantuan dan kerja samanya selama proses
penelitian.
8. Ayah, Ibu dan Kakak yang selalu memotivasi dan mendukung penulis dalam
menyelesaikan skripsi ini.
9. Astrid Pangestuty, selaku teman seperjuangan dalam menyelesaikan Skripsi
ini.
10. Grace Shelia P.P, Veronika Novaliana S.D., Monika M.W., dan Agnes Serlyta
sebagai sahabat yang selalu memberikan semangat dalam penyusunan skripsi
ini.
11. Bertha, Ossa, Kristi, Noven, dan Astrid sebagai sahabat yang selalu
mendukung dalam penyusunan skripsi ini.
12. Teman – teman satu kelompok praktikum Meda, Berto, Desion, Rosa, Agata,
Tika, dan teman – teman lain yang selalu mendukung dalam menyusun
skripsi ini.
13. Kelurga besar kos Griya Kanna Putri, Cindya, Macho, Gery, Edward,
Andrew, Tasya, Mala, Bertha, Nanda, David, Yosef, dan teman – teman yang
selalu mendukung dan memberikan semangat.
14. Teman-teman FST B 2012, FSM C 2012 dan teman-teman Fakultas Farmasi
Sanata Dharma angkatan 2012 yang selalu memberikan dukungan dan
semangat dalam penyusunan Skripsi ini.
15. Semua pihak yang telah membantu dan memberikan dukungan yang tidak
dapat disebutkan satu per satu.
Penulis menyadari bahwa Skripsi ini masih memiliki kekurangan dalam
berbagai macam hal. Untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang
membangun dari segala pihak. Semoga Skripsi ini dapat berguna bagi seluruh
pembaca.
Yogyakarta, 19 Agustus 2016
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN ..................................................................... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................... v
HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ............... vi
PRAKATA... ............................................................................................... vii
DAFTAR ISI ............................................................................................... ix
DAFTAR TABEL ....................................................................................... xiii
DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xiv
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xv
INTISARI..... ............................................................................................... xvi
ABSTRACT....... ........................................................................................... xvii
BAB I PENGANTAR ................................................................................. 1
A. Latar Belakang ................................................................................ 1
B. Permasalahan................................................................................... 5
C. Keaslian Penelitian .......................................................................... 5
D. Manfaat Penelitian .......................................................................... 6
E. Tujuan Penelitian ............................................................................ 7
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA.......................................................... 8
A. Tanaman Buni ................................................................................. 8
1. Klasifikasi buah buni................................................................. 8
2. Nama umum .............................................................................. 8
3. Deskripsi tanaman ..................................................................... 9
4. Kandungan kimia buah buni ..................................................... 9
5. Aktivitas farmakologis .............................................................. 10
B. Ekstraksi .......................................................................................... 10
C. Senyawa Fenolik ............................................................................. 11
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
D. Radikal Bebas.................................................................................. 13
E. Senyawa Antioksidan ...................................................................... 14
F. Metode Folin-Ciocalteu .................................................................. 15
G. Metode DPPH ................................................................................. 16
H. Spektrofotometri Visibel ................................................................. 17
I. Landasan Teori ................................................................................ 18
J. Hipotesis .......................................................................................... 20
BAB III METODOLOGI PENELITIAN.................................................... 21
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ...................................................... 21
B. Variabel dan Definisi Operasional .................................................. 21
1. Klasifikasi variabel ................................................................... 21
2. Definisi operasional .................................................................. 21
C. Bahan Penelitian.............................................................................. 21
D. Alat Penelitian ................................................................................. 23
E. Tata Cara Penelitian ........................................................................ 23
1. Determinasi tanaman ................................................................. 23
2. Pengambilan bahan buah buni .................................................. 23
3. Pembuatan ekstrak .................................................................... 23
4. Uji pendahuluan ........................................................................ 24
a. Uji fenolik ........................................................................... 24
b. Uji aktivitas antioksidan ...................................................... 24
5. Skrining fitokimia ekstrak etanol 96% buah buni ..................... 25
a. Pembuatan larutan uji .......................................................... 25
b. Uji saponin .......................................................................... 25
c. Uji flavonoid ....................................................................... 25
d. Uji triterpenoid dan steroid ................................................. 25
e. Uji minyak atsiri .................................................................. 26
f. Uji alkaloid .......................................................................... 26
g. Uji tanin dan polifenol ........................................................ 26
h. Uji antosianin ...................................................................... 27
i. Uji antrakuinon.................................................................... 27
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
6. Penentuan kandungan fenolat total ........................................... 28
7. Penentuan aktivitas antioksidan ................................................ 30
F. Analisis Data ................................................................................... 32
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................... 33
A. Hasil Determinasi Tanaman ............................................................ 33
B. Hasil Pengumpulan Bahan .............................................................. 33
C. Hasil Preparasi Sampel ................................................................... 34
D. Uji Pendahuluan Ekstrak Etanol Buah Buni ................................... 35
1. Uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik .......................... 35
2. Uji pendahuluan keberadaan senyawa antioksidan ................... 37
E. Hasil Uji Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol 96% Buah Buni ........ 38
a. Uji saponin ................................................................................ 40
b. Uji flavonoid ............................................................................. 40
c. Uji triterpenoid dan steroid ....................................................... 41
d. Uji minyak atsiri ........................................................................ 42
e. Uji alkaloid ................................................................................ 42
f. Uji tanin dan polifenol .............................................................. 43
g. Uji antosianin ............................................................................ 44
h. Uji antrakuinon.......................................................................... 45
F. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total ....................................... 45
1. Penentuan operating time .......................................................... 45
2. Penentuan panjang gelombang maksimum ............................... 47
G. Penetapan Kandungan Fenolik Total .............................................. 48
H. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan ..................................................... 53
1. Penentuan Operating Time (OT) ............................................... 53
2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum .................. 55
I. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan ...................................................... 56
BAB V KESIMPULAN .............................................................................. 64
A. Kesimpulan ..................................................................................... 64
B. Saran ................................................................................................ 64
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 65
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
LAMPIRAN ................................................................................................ 72
BIOGRAFI PENULIS ................................................................................ 103
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 65
LAMPIRAN ................................................................................................ 72
BIOGRAFI PENULIS ................................................................................ 103
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. Hasil pengamatan uji tabung terhadap ekstrak etanol buah
buni …………………………………………………....…... 39
Tabel II. Hasil scanning panjang gelombang maksimumasam
galat yang direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu....... 48
Tabel III. Hasil pengukuran absorbansi asam galat yang telah
direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteu pada λ 745 nm... 51
Tabel IV. Hasil penentuan jumlah fenolik total ekstrak etanol buah
Buni. ....................................................................................... 52
Tabel V. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum
DPPH ..................................................................................... 56
Tabel VI. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode
DPPH ..................................................................................... 58
Tabel VII. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak etanol
buah buni dengan metode DPPH ........................................... 59
Tabel VIII. Hasil IC50 rutin dan ekstrak etanol buah buni ........................ 60
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Struktur rutin .......................................................................... 12
Gambar 2. Struktur asam galat ................................................................ 13
Gambar 3. Struktur DPPH ....................................................................... 16
Gambar 4. Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan ............ 17
Gambar 5. Buah buni ............................................................................... 34
Gambar 6. Hasil uji kualitatif senyawa fenolik pada ekstrak etanol
buah buni ................................................................................ 37
Gambar 7. Hasil uji kualitatif aktivitas antioksidan pada ekstrak
etanol buah buni ..................................................................... 38
Gambar 8. Reaksi flavonoid pada ekstrak etanol buah buni
berdasarkan uji Shinoda ........................................................ 41
Gambar 9. Mekanisme umum reaksi Liebermann-Burchard ................... 42
Gambar 10. Reaksi antara flavonoid dengan FeCl3 ................................... 44
Gambar 11. Perubahan struktur antosianin pada pH yang berberda ......... 45
Gambar 12. Grafik penentuan Operating Time asam galat ...................... 47
Gambar 13. Reaksi asam galat dengan senyawa molybdenum dari
reagen Folin-Ciocalteu .......................................................... 50
Gambar 14. Kurva baku asam galat dalam penetapan fenolik total
(Replikasi 3) .......................................................................... 51
Gambar 15. Grafik penentuan Operating Time rutin ................................ 55
Gambar 16. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan rutin
replikasi 3 .............................................................................. 58
Gambar 17. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan
ekstrak etanol buah buni replikasi 2 ..................................... 59
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Surat determinasi tanaman .................................................. 73
Lampiran 2. Gambar tanaman buah buni di taman Kampus III
Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta ............................. 74
Lampiran 3. Ekstrak etanol buah buni ..................................................... 74
Lampiran 4. Foto hasil uji saponin .......................................................... 75
Lampiran 5. Foto hasil uji flavonoid ........................................................ 75
Lampiran 6. Foto hasil uji triterpenoid dan steroid .................................. 76
Lampiran 7. Foto hasil uji minyak atsiri .................................................. 76
Lampiran 8. Foto hasil uji alkaloid .......................................................... 77
Lampiran 9. Foto hasil uji tanin dan polifenol ......................................... 77
Lampiran 10. Foto hasil uji antosianin....................................................... 78
Lampiran 11. Foto hasil uji antrakuinon .................................................... 78
Lampiran 12. Perhitungan rendemen ekstrak etanol buah buni ................. 79
Lampiran 13. Data penimbangan untuk penetapan kadar fenolik total ..... 80
Lampiran 14. Data optimasi penetapan kandungan fenolik total............... 81
Lampiran 15. Data penetapan kandungan fenolik total ............................. 85
aktivitas antioksidan
Lampiran 16. Data penimbangan untuk pengujian aktivitas
antioksidan ........................................................................... 89
Lampiran 17. Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding
dan larutan uji ...................................................................... 90
Lampiran 18. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan........................... 93
Lampiran 19. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH ....... 97
Lampiran 20. Perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak etanol
buah buni ............................................................................. 100
Lampiran 21. Data uji statistik ................................................................... 101
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvi
INTISARI
Radikal bebas merupakan suatu atom atau molekul yang memiliki satu
atau lebih elektron yang tidak berpasangan, sehingga relatif tidak stabil yang
dapat menimbulkan berbagai macam penyakit. Antioksidan adalah senyawa yang
dapat menghambat reaksi oksidasi dengan mengikat radikal bebas dan molekul
yang sangat reaktif, akibatnya kerusakan sel dapat dihambat.
Belakangan ini banyak penelitian yang menunjukkan bahwa antioksidan
sintetik seperti butylated hydroxyanisole (BHA) dan butylated hydroxytoluene
(BHT)dalam dosis besar dapat menyebabkan penyakit seperti gangguan fungsi
ginjal dan hati, kanker, dan reaksi alergi. Oleh karena itu penelitian terkait bahan
alam yang efektif, tidak toksik, dan memiliki aktivitas sebagai antioksidan
semakin gencar dilakukan.
Buah buni (Antidesma bunius(L.)Spreng) dilaporkan mempunyai
kandungan senyawa fenolik yang mempunyai aktivitas antioksidan. Senyawa-
senyawa yang berperan sebagai antioksidan yaitu asam fenolik, antosianin dan
flavonoid. Etanol dapat menyari berbagai macam senyawa fenolik seperti
polifenol, flavonoid, antosianin dan tanin. Sehingga tujuan dari penelitian ini
adalah untuk menetapkan kandungan fenolik total dan menguji aktivitas
antioksidan ekstrak etanol buah buni.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol buah buni
mempunyai kandungan fenolik total sebesar 0,2794 ± 0,0048 mg GAE/g ekstrak
etanol buah buni yang diukur dengan metode Folin-Ciocalteu. Sedangkan ekstrak etanol
buah buni mempunyai aktivitas antioksidan dengan IC50 sebesar 2049,7099 ±
91,2742μg/mL yang diukur dengan metode DPPH.
Kata kunci : Buah Buni, (Antidesma bunius (L.) Spreng), Antioksidan, Fenolik
Total, Metode DPPH, Metode Folin-Ciocalteu.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvii
ABSTRACT
A free radical is an atom or molecule having one or more unpaired
electrons.It is relatively unstable which cause various diseases. Antioxidants are
compounds that can inhibit oxidation reactions by binding free radicals and highly
reactive molecules, resulting in inhibited of cell damage.
Lately, many studies show that synthetic antioxidants such as butylated
hydroxyanisole (BHA) and butylated hydroxytoluene (BHT) in large doses can
cause diseases such as kidney and liver function disorders, cancer, and allergic
reactions. Therefore, the research related to the natural ingredients that are
effective, non-toxic, and have antioxidant activity more intensively conducted.
Berry (Antidesma bunius (L.) Spreng) has been reported to have phenolic
compounds. Phenolic compounds are potent sources of natural antioxidants.
Compounds that act as antioxidants are phenolic acids, anthocyanins and
flavonoids.Ethanol can extract wide range of phenolic compounds such as
polyphenols, flavonoids, antocyanin and tanin.Therefore, the purpose of this study
was to specify a total phenolic content and antioxidant activity of ethanol extract
test of buni fruits.
The results showed that the ethanolic extract of berry fruits obtained total
phenolic content of 0.2794 ± 0.0048 mg GAE/g of ethanol extract of berry fruit as
measured by the Folin-Ciocalteu method. While the berry fruit ethanol extract has
antioxidant activity with IC50 2049.7099 ± 91.2742 mg/mL as measured by
DPPH method.
Keywords: Buni fruits, (Antidesma bunius (L.) Spreng), Antioxidants, phenolic
Total, DPPH method, Folin-Ciocalteu method.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Di dalam tubuh kita setiap saat terjadi reaksi oksidasi sehingga memicu
terbentuknya radikal bebas yang sangat aktif yang dapat merusak struktur dan
fungsi sel. Tetapi reaktivitas radikal bebas tersebut dapat dihambat oleh sistem
antioksidan yang melengkapi sistem kekebalan tubuh (Damayanthi et al., 2010).
Oksidasi merupakan proses alami yang dapat terjadi ketika suatu zat berikatan
dengan oksigen (Chawda, 2011).
Radikal bebas merupakan suatu molekul yang kehilangan elektron
terluarnya yang dengan cepat dapat bereaksi dengan atom – atom atau senyawa –
senyawa di lingkungannya (Droge, 2002). Radikal bebas terbentuk melalui suatu
reaksi oksidasi. Kerusakan oksidatif yang ditimbulkan karena terpapar radikal
bebas dapat menyebabkan penuaan dan beragam penyakit seperti arterosklerosis,
diabetes, sirosis, dan kanker (Doss dan Thangavel, 2011).
Antioksidan adalah senyawa yang bertindak sebagai penangkal radikal
bebas dan mencegah terjadinya kerusakan yang diakibatkan oleh senyawa radikal
(Pham-Huy, 2008). Belakangan ini banyak penelitian yang menunjukkan bahwa
antioksidan sintetik seperti butylated hydroxyanisole (BHA) dan butylated
hydroxytoluene (BHT) berbahaya bagi kesehatan manusia. Antioksidan sintetik
tersebut dalam dosis yang besar dapat menyebabkan penyakit seperti gangguan
fungsi ginjal dan hati, kanker, dan reaksi alergi. Oleh karena itu penelitian terkait
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
bahan alam yang efektif, tidak toksik, dan memiliki aktivitas sebagai antioksidan
semakin gencar dilakukan (Gupta dan Sharma, 2006).
Salah satu jenis bahan pangan yang mempunyai aktivitas antioksidan
adalah berbagai jenis buah berry. Buah buni (Antidesma bunius (L.) Spreng)
merupakan jenis berry lokal.Senyawa antioksidan yang terdapat dalam buah buni
antara lain antosianin, flavonoid dan asam fenolik. Buni merupakan jenis berry
yang tumbuh secara liar di Australia, China, India, Indonesia, Myanmar, Filipina,
Srilanka, Thailand, dan Vietnam (Orwa et al., 2009). Berdasarkan penelitian yang
dilakukan oleh Butkhup dan Samappito (2008) menunjukkan bahwa ekstrak
metanol buah buni mengandung antosianin (prosianidin B1, prosianidin B2),
flavonoid (katekin, epikatekin, rutin, mirisetin, resveratrol, luteolin, kuersetin,
naringenin, dan kaempferol) dan asam fenolik (asam galat, asam kafeat, asam
elagat, dan asam ferulat). Pada penelitian sebelumnya oleh Butkhup dan
Samappito (2011) telah dilakukan uji aktivitas antioksidan buah buni dari tahap
mentah (hijau muda), mentah menuju kematangan (hijau), setengah matang
(merah muda), matang (merah), dan matang sempurna (ungu kehitaman). Hasil
yang didapatkan yaitu buah buni dengan tahap matang sempurna berwarna ungu
kehitaman berpotensi mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi. Senyawa
yang berperan dalam aktivitas antioksidan tersebut adalah polifenol, antara lain
prosianidin B2, prosianidin B1, katekin, epikatekin, rutin dan tran-resveratrol.
Oleh karena itu pada penelitian kali ini buah yang dipilih adalah buah dengan
kematangan sempurna berwarna ungu kehitaman yang diharapkan mempunyai
aktivitas antioksidan yang tinggi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
Metode uji yang sering digunakan untuk penentuan kandungan fenolik
total adalah metode Folin – Cioucalteu. Metode ini merupakan metode yang
umum digunakan sebagai standar penentuan kandungan fenolik total karena
merupakan metode yang cepat dan sederhana yang dinyatakan sebagai masa
ekuivalen asam galat tiap mg sampel (Fu et al., 2011). Asam galat digunakan
sebagai pembanding karena telah diketahui sebagai salah satu senyawa fenolik
yang terdapat dalam tanaman, selain itu asam galat merupakan standar yang
direkomendasikan untuk mendapatkan hasil yang reliabel karena mempunyai
reaktivitas yang cukup tinggi terhadap reagen Folin-Ciocalteu (Prior et al., 2005).
Prinsip metode ini adalah reaksi oksidasi senyawa fenol dalam suasana basa oleh
pereaksi Folin – Ciocalteu menghasilkan kompleks berwarna biru yang
memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 760 nm. Peningkatan
intensitas warna biru akan sebanding dengan jumlah senyawa fenolik yang ada
dalam sampel (Blainski et al., 2013).
Senyawa fenolik erat kaitannya dengan aktivitas antioksidan, tanaman
yang mempunyai kandungan senyawa fenolik yang tinggi diharapkan juga
mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi. Metode yang digunakan untuk
mengukur aktivitas antioksidan salah satunya adalah DPPH. Metode uji DPPH
menggunakan radikal bebas DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil). Metode ini
menggunakan kontrol positif rutin karena rutin merupakan salah satu senyawa
flavonoid yang ada pada tanaman yang mempunyai aktivitas antioksidan. Nilai
aktivitas antioksidan diketahui melalui nilai IC50 (Inhibitory Concentration 50)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
yang merupakan konsentrasi ekuivalen yang memberikan 50% efek aktivitas
antioksidan (Dehpour et al., 2009).
Radikal DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517
nm dengan warna violet gelap. DPPH dapat memberikan serapan karena memiliki
gugus kromofor dan auksokrom pada struktur kimianya dan dengan adanya
delokalisasi elektron pada DPPH akan memberikan warna violet (Dehpour et al.,
2009). Perubahan absorbansi akibat dari reaksi ini telah digunakan secara luas
untuk menguji kemampuan beberapa molekul sebagai penangkap radikal bebas.
Metode DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk
pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tumbuhan (Koleva
et al., 2002).
Pelarut yang sering digunakan untuk mengekstraksi senyawa fenolik
antara lain metanol, etanol, aseton dan etil asetat (Taroreh et al., 2015). Etanol
tergolong pelarut yang memiliki sifat polar sehingga diharapkan mampu
melarutkan sebagian besar senyawa fenolik dalam buah buni yang bersifat polar.
Oleh karena itu peneliti menggunakan etanol sebagai pelarut dalam pembuatan
ekstrak. Penggunaan etanol sebagai pelarut juga merupakan pengembangan
penelitian yang pernah dilakukan Butkhup dan Samappito 2008 dan 2011.
Perbedaan kepolaran pelarut sangat mempengaruhi kemampuan pelarut
untuk menarik zat aktif yang ada pada buah buni. Selain itu, adanya perbedaan
tempat tumbuh tanaman ini tentu saja akan mempengaruhi kadar metabolit dari
buah buni karena kadar edafik tanah setiap daerah berbeda-beda. Pada penelitian
Buthkup dan Samappito 2008 dan 2011 menggunakan tanaman buni yang tumbuh
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
di Thailand sedangkan penelitian ini menggunakan tanaman buni yang tumbuh di
Indonesia.
B. Permasalahan
a. Berapakah kandungan fenolik total ekstrak etanol buah buni dalam massa
ekivalen asam galat yang diukur dengan metode Folin - Ciocalteu?
b. Berapakah nilai aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah buni dalam nilai IC50
yang diukur dengan metode DPPH?
C. Keaslian Penelitian
Penelitian menggunakan tanaman Antidesma bunius (L.)Sprengpernah
dilakukan oleh :
a. Butkhup dan Samappito (2008) mengenai analisis total antosianin
menggunakan spectrophotometric pH differential protocol dan komponen
fenolik berupa (flavonoid, prosianidin, dan asam fenolik) menggunakan
metode RP-HPLC-DAD (Reverse Phase High-Performance Liquid
Chromatrography-Photodiode Detector), fenolik total dengan metode
Folin-Ciocalteu dan aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH
pada ekstrak metanol 50 % buah buni.
b. Butkhup dan Samappito (2011) melaporkan mengenai pengaruh
perkembangan dan kematangan buah buni pada perubahan fisika kimia,
aktivitas antioksidan dan akumulasi polifenol. Total fenolik diukur
menggunakan metode Folin-Ciocalteu, komponen polifenol dianalisis
menggunakan metode RP-HPLC-DAD (Reverse Phase High-Performance
Liquid Chromatrography-Photodiode Detector), dan aktivitas antioksidan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
ditetapkan menggunakan metode DPPH. Hasil yang didapatkan adalah
pada ekstrak metanol 60% buah buni matang mempunyai aktivitas
antioksidan yang tinggi.
c. Butkhup dan Samappito (2011) melakukan penelitian mengenai penetapan
total flavonoid, jumlah antosianin, total fenolik, aktivitas antibakteri dan
aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH. Hasil yang diperoleh
yaitu pada ekstrak metanol 60 % kulit buah buni mempunyai kandungan
antosianin yang tinggi, sedangkan pada ektrak metanol 60 % biji buah
buni mempunyai kandungan fenolik yang tinggi.
Perbedaan penelitian ini dengan penelitian – penelitian sebelumnya adalah
pada tempat pengambilan sampel, pelarut etanol 96 % yang digunakan, dan cara
ekstraksi buah buni.
D. Manfaat Penelitian
1. Manfaat teoritis. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan tambahan
pengetahuan mengenai aktivitas antioksidan yang dinyatakan dengan IC50
dalam ekstrak etanol 96 % buah buni yang diukur dengan metode DPPH,
sehingga hasil penelitian dapat menjadi acuan untuk penelitian selanjutnya.
2. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi bagi
masyarakat mengenai potensi buah buni sebagai salah satu sumber antioksidan
alami yang dapat meningkatkan pertahanan tubuh manusia dari radikal bebas.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
E. Tujuan Penelitian
1. Tujuan umum : menguji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH
dan menetapkan kandungan fenolik total menggunakan metode Folin-
Ciocalteu dari ekstrak etanol buah buni.
2. Tujuan khusus
a. Mengetahui nilai kandungan fenolik total pada ekstrak etanol buah buni
yang dinyatakan dengan massa ekuivalen asam galat menggunakan
metode Folin-Ciocalteu.
b. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah buni yang
dinyatakan dalam nilai IC50 dengan metode DPPH.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Tanaman Buni
1. Klasifikasi buah buni
Menurut United States Departement of Agriculture (USDA), tanaman buni
diklasifikasikan sebagai berikut :
Kerajaan : Plantae
Sub-kerajaan : Tracheobionta
Superdivisi : Spermatophyta
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsido
Sub-kelas : Rosidae
Bangsa : Euphorbiales
Suku : Euphorbiaceae
Marga : Antidesma L.
Jenis : Antidesma bunius (L.) Spreng
2. Nama umum
Tanaman ini dikenal dengan nama wuni di Jawa dan Sunda, burneh di
Madura, bune tedong di Sulawesi, dan di Melayu dikenal dengan nama buni
(Hariyana, 2013). Diluar negeri dikenal dengan nama bignai di Filipina, ma mao
luang di Tailand, choi moi di Vietnam, kywe-pyisin di Birma, antidesme di
Perancis dan di Inggris dikenal dengan nama Chinese laurel (Orwa et al., 2009).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
3. Deskripsi tanaman
Tanaman ini berbentuk pohon, dengan tinggi 15 – 30 m. Daun bertangkai
pendek, bentuk lanset sampai eliptis dengan panjang 9 – 25 cm. Tanaman ini
berumah dua; bunga di ujung dan dalam ketiak tandan, tandan jantan bentuk
mulai mengecil. Bunga jantan duduk atau bertangkai pendek, bau tidak enak;
kelopak berbentuk bola cawan, pendek berlekuk 3 – 4, panjang 1 – 2 mm. Benang
sari 3 – 4; tonjolan penebalan dasar bunga dengan taju yang tidak sama, gundul,
dan berseling dengan kelopak; putik yang rudimenter besar. Bunga betina
bertangkai; kelopak bentuk cekungan, bertaju 3 – 4 pendek, panjang 1 mm, bakal
buah gundul, bentuk telur – botol; kepala putik 3 – 4, pendek dan tebal,
melengkung keluar. Buah eliptis lebar, hijau kemudian merah, akhirnya ungu
kehitaman, gundul, bentuk telur; kepala putik 3 – 4, pendek dan tebal,
melengkung keluar. Buah eliptis lebar, hijau kemudian merah, akhirnya dapat
dimakan dan biji berbentuk pipih dengan rusuk yang berbentuk jala. Pohon yang
tumbuh di hutan tingginya mencapai 1.300 m (Van Steenis, 1992).
4. Kandungan kimia buah buni
Menurut Butkhup dan Samappito (2008) ekstrak metanol buah buni
mengandung antosianin (prosianidin B1, prosianidin B2), flavonoid (katekin,
epikatekin, rutin, mirisetin, resveratrol, luteolin, kuersetin, naringenin, dan
kaempferol) dan asam fenolik (asam galat, asam kafeat, asam elagat, dan asam
ferulat).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
5. Aktivitas farmakologis
Tanaman buni dapat digunakan untuk mengobati flu dan kanker (Micor,
2005). Tanaman buni juga dapat digunakan untuk mengobati kurang darah, darah
kotor, hipertensi, jantung berdebar, batuk, sifilis dan kencing nanah (Haryanto,
2009). Buah yang sudah matang dapat digunakan untuk mengatasi masalah pada
saluran cerna seperti disentri, diabetes, indigesti, dan konstipasi (Kassem et al.,
2013).
B. Ekstraksi
Ekstraksi merupakan proses pemisahan bahan dari campurannya dengan
menggunakan pelarut. Sedangkan ekstrak adalah sediaan yang diperoleh dengan
cara ekstraksi tanaman obat dengan ukuran partikel tertentu menggunakan cairan
penyari yang sesuai. Maserasi adalah metode penyarian simplisia sederhana yang
dilakukan dengan menggunakan berbagai macam pelarut pada suhu kamar selama
beberapa waktu (Agoes, 2009). Remaserasi adalah pengulangan penambahan
pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama, dan seterusnya (Depkes
RI, 2000).
Pada proses ekstraksi, pelarut berdifusi kedalam sel dan selanjutnya zat
aktif akan larut kedalam pelarut. Sehingga, akan dicapai kesetimbangan antara
solut dan solven (Agoes, 2009). Keuntungan metode ekstraksi yaitu dapat
diaplikasikan dalam sampel dengan jumlah yang sedikit, prosesnya mudah, dan
alat yang digunakan sederhana (List dan Schmidt, 2000).
Pelarut yang digunakan dalam proses pembuatan ekstrak adalah pelarut
optimal yang dapat menyari senyawa aktif atau berkhasiat, sehingga senyawa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
tersebut dapat terpisah dari bahan atau kandungan lainnya. Pelarut yang dipilih
adalah pelarut yang bisa melarutkan hampir semua metabolit sekunder yang
terkandung. Pelarut yang sering digunakan untuk mengekstraksi senyawa fenolik
antara lain metanol, etanol, aseton dan etil asetat (Tarorehet al., 2015).
C. Senyawa Fenolik
Senyawa fenolik merupakan kelompok terbesar metabolit sekunder pada
tanaman. Senyawa ini termasuk dalam alkohol aromatik karena gugus
hidroksilnya selalu melekat pada cincin benzen. Senyawa fenolik secara umum
memiliki potensi sebagai bakterisidal, antiseptik, antioksidan, dan sebagainya
(Pengelly, 2006).
Beberapa senyawa yang termasuk dalam kelompok fenolik adalah fenol
sederhana, kumarin, tannin, saponin, dan flavonoid. Senyawa tersebut biasanya
berada dalam bentuk glikosida atau ester pada tanaman (Proestos, 2006).
Senyawa fenolik ini merupakan molekul yang dapat bertindak sebagai
antioksidan untuk mencegah penyakit jantung, mengurangi peradangan,
menurunkan kejadian kanker dan diabetes, serta mengurangi tingkat mutagenesis
pada sel manusia. Perlindungan yang diperoleh dari mengonsumsi produk
tanaman seperti buah-buahan, sayuran dan kacang-kacangan sebagian besar
terkait dengan adanya senyawa fenolik pada tanaman tersebut (Khoddami et al.,
2013). Senyawa fenolik dapat memberikan perlindungan sebagai antioksidan
dikarenakan senyawa fenolik dapat bereaksi dengan reactive oxygen species
(ROS) dan menghilangkan aktivitas radikalnya sehingga tidak berbahaya lagi
terhadap sel tubuh manusia (Sochor, 2010).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
Flavonoid merupakan senyawa fenolik yang paling umum, karena tersebar
luas di jaringan tanaman, dan bersama karotenoid dan klorofil bertanggung jawab
memberikan warna seperti biru, ungu, kuning, oranye dan merah pada tanaman.
Flavonoid meliputi flavon, flavonol, iso-flavonol, anthocyanin, anthocyanidin,
proanthocyanidin dan katekin (Khoddami et al., 2013).
Flavonoid merupakan senyawa polar karena memiliki sejumlah gugus
hidroksil. Umumnya flavonoid larut dalam pelarut polar seperti air, etanol,
metanol, aseton, dimetilsulfoksida, dan dimetilformamida. Gula yang terikat pada
flavonoid dapat membantu meningkatkan kelarutan flavonoid dalam air, sehingga
dengan menggunakan campuran pelarut air dengan beberapa contoh pelarut polar
lain dapat menjadi pelarut yang baik untuk flavonoid khususnya glikosida.
Sebaliknya aglikon bersifat kurang polar, contohnya adalah isoflavon, flavon, dan
flavonol yang termetoksilasi. Mereka akan cenderung lebih mudah larut dalam
pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988).
Rutin (3’,4’,5,7-tetrahidroksiflavon-3β-D-rutinosida) adalah glukosida
flavonoid yang sangat umum dikenal dengan vitamin P. Dalam keseharian, rutin
biasa digunakan untuk mengobati tekanan darah tinggi serta penyakit lain yang
berkaitan dengan vaskuler (dos Santos, 2008).
Gambar 1. Struktur rutin (Lopez, 2003)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
Golongan senyawa fenolik lainnya antara lain, asam fenolik, kumarin, dan
flavonol. Asam fenolik yang sering ditemukan antara lain asam hydroxylbenzoic,
dan yang tergolong didalamnya antara lain asam galat, asam salisilat, dan asam
vanillic (Vermerris dan Nicholson, 2008).
Asam galat (asam 3,4,5-trihidroksibenzoat) merupakan senyawa fenolik
yang bukan tergolong dalam flavonoid. Asam galat termasuk dalam golongan
antioksidan alami yang sering digunakan sebagai pengawet makanan (Lopez,
2003).
Gambar 2. Struktur asam galat (Lopez, 2003)
D. Radikal Bebas
Radikal bebas merupakan suatu atom atau molekul yang memiliki satu
atau lebih elektron yang tidak berpasangan, sehingga relatif tidak stabil. Atom
atau molekul tersebut bersifat reaktif mencari pasangan elektron disekitarnya
untuk menstabilkan diri atau sering disebut sebagai reactive oxygen species (ROS)
(Ardhie, 2011). Sifat sangat reaktif yang dimiliki oleh radikal bebas menyebabkan
radikal ini dapat bereaksi dengan protein, lipid, karbohidrat dan DNA untuk
memperoleh kembali pasangan elektronnya dan menjadi stabil (Badarinath et al.,
2010).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
Efek berbahaya dari radikal bebas menyebabkan potensi kerusakan
biologis yang disebut dengan oxidative stress dan nitrosative stress. Efek tersebut
terjadi dalam sistem biologi bila ada produksi lebih dari ROS/RNS. Oxidative
Stress dapat merusak jaringan lipid, protein, atau DNA seluler sehingga
menghambat fungsi normal mereka. Maka oxidative stressdapat disimpulkan
terlibat dalam menimbulkan sejumlah penyakit pada manusia serta dalam proses
penuaan (Valko et al., 2006).
E. Senyawa Antioksidan
Menurut Pham-Huy (2008) antioksidan adalah senyawa yang bertindak
sebagai penangkal radikal bebas dan mencegah terjadinya kerusakan yang
diakibatkan oleh senyawa radikal. Radikal bebas dapat mengoksidasi asam
nukleat, protein, lipid, serta DNA, sehingga menyebabkan penyakit degeneratif.
Senyawa antioksidan seperti asam fenolik, polifenol, dan flavonoid dapat
meredam radikal bebas peroksida, hidroperoksida atau lipid peroksil dan
menghambat mekanisme oksidatif yang menimbulkan penyakit degeneratif
(Prakash et al., 2001).
Berdasarkan sifatnya antioksidan dibagi menjadi 2, yaitu antioksidan
enzimatis dan non enzimatis. Antioksidan enzimatis merupakan sistem pertahanan
terhadap kerusakan oksidatif dalam sel. Contoh antioksidan enzimatis adalah
superoksida dismutase (SOD), katalase, glutation reduktase dan glutation
peroksidase. Sedangkan antioksidan non-enzimatis adalah antioksidan yang
mempertahankan membran sel, seperti vitamin C di fase air, vitamin E, ubiquinol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
di fase lipid, karotenoid (β karoten), glutation, bilirubin, abumin,
transferin/laktoferin/serulo-plasmin, feritin, sistein, dan flavonoid (Ardhie, 2011).
Berdasarkan sumbernya, antioksidan dapat digolongkan menjadi dua jenis,
yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetis. Antioksidan sintetis adalah
antioksidan yang dibuat dengan melakukan sintetis kimia seperti TBHQ, BHT,
dan propil galat (Gulcin et al., 2004). Antioksidan alami terdapat pada makanan
sehari – hari, seperti buah dan sayuran yang mengandung berbagai senyawa
fenolik atau nitrogen dan karotenoid. Antioksidan alami dapat melindungi tubuh
manusia dari radikal bebas dan menurunkan terjadinya perkembangan penyakit
kronis (Sing, 2007).
F. Metode Folin-Ciocalteu
Metode ini didasarkan pada reduksi asam fosfotungstat dalam larutan
alkali menjadi fosfotungstat biru. Absorbansi yang terbentuk akibat fosfotungstat
biru sebanding dengan jumlah senyawa fenolik yang terdapat dalam sampel,
sehingga dapat diketahui seberapa besar jumlah kandungan senyawa dengan
gugus fenol dalam suatu sampel tanaman yang dinyatakan dengan ekuivalen asam
galat (Cindrić et al., 2011).
Metode spektrofotometri UV/VIS banyak menggunakan reaksi
kolorimetrik karena mudah, cepat dan biayanya terjangkau. Metode ini mengukur
konsentrasi total senyawa fenolik dalam ekstrak tumbuhan. Polifenol dalam
ekstrak tumbuhan akan bereaksi dengan reagen Folin Ciocalteu sehingga
membentuk kompleks berwarna biru yang dapat diukur dengan cahaya tampak
spektrofotometri. Reagen Folin Ciocalteu mempunyai kelemahan, yaitu sangat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
cepat terurai dalam larutan alkali, sehingga perlu untuk menggunakan reagen
secara berlebih untuk mendapatkan reaksi yang lengkap. Tetapi penggunaan
reagen berlebih dapat menimbulkan endapan dan kekeruhan yang tinggi, sehingga
membuat analisis spektrofotometri tidak bisa dilakukan. Untuk mengatasi masalah
ini, didalam reagen Folin Ciocalteu terdapat garam lithium, yang dapat mencegah
kekeruhan. Reaksi ini pada umumnya memberikan data yang akurat dan spesifik
pada beberapa kelompok senyawa fenolik (Blainski et al., 2013).
G. Metode DPPH
Metode uji ini menggunakan radikal bebas DPPH (2,2-difenil-1-
pikrilhidrazil). Radikal bebas DPPH dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat
mendonorkan atom hidrogen. Tujuan metode ini adalah untuk mengetahui
parameter konsentrasi yang ekuivalen memberikan 50% efek aktivitas antioksidan
(IC50) yaitu dengan cara menginterpretasikan data eksperimental dari metode
DPPH tersebut (Dehpour et al., 2009).
Metode DPPH dapat digunakan untuk sampel yang berupa padatan
maupun cairan. DPPH sering digunakan untuk menguji senyawa yang berperan
sebagai free radical scavengers atau donor hidrogen, mengevaluasi aktivitas
antioksidannya dan mengkuatifikasi jumlah kompleks radikal antioksidan yang
terbentuk (Prakash et al., 2001).
Gambar 3. Struktur DPPH (Molyneux, 2004)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
Metode DPPH merupakan metode yang sederhana, cepat, sensitif, dan
reprodusibel untuk pengujian aktivitas antioksidan (Savatovic et al., 2012). DPPH
memberikan serapan kuat pada 517 nm dikarenakan adanya elektron yang tidak
berpasangan. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh keberadaan
penangkap radikal bebas, maka absorbansinya akan menurun. Keberadaan
senyawa antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi
kuning. Perubahan absorbansi akibat dari reaksi ini telah digunakan secara luas
untuk menguji kemampuan beberapa molekul sebagai penangkap radikal bebas
(Dehpour et al., 2009).
Gambar 4. Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan
(Prakash et al., 2001)
Warna DPPH yang berubah dari warna ungu menjadi kuning dikarenakan
adanya penambahan antioksidan yaitu saat elektron tunggal pada DPPH
berpasangan dengan hidrogen dari antioksidan. Hasil dekolorisasi oleh
antioksidan setara dengan jumlah elektron yang tertangkap (Prakash et al., 2001).
H. Spektofotometri Visibel
Prinsip spektrofotometri UV/Visibel yaitu radiasi pada rentang panjang
gelombang 200–700 nm dilewatkan melalui suatu larutan senyawa. Elektron pada
ikatan dalam molekul menjadi tereksitasi sehingga berada pada keadaan energi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
yang lebih tinggi dalam proses menyerap sejumlah energi yang melewati larutan
tersebut (Watson, 2010). Absorpsi cahaya ultraviolet atau cahaya tampak
mengakibatkan adanya transisi elektronik, yaitu perpindahan elektron dari orbital
dasar yang energinya rendah menuju keadaan tereksitasi yang energinya lebih
tinggi (Fessenden dan Fessenden, 1982).
Hal - hal yang perlu diperhatikan dalam analisis spektrofotometri antara
lain waktu operasional dan panjang gelombang maksimum. Waktu operasional
ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan
absorbansi larutan. Tujuan dari waktu operasional untuk mengetahui waktu
pengukuran yang stabil. Pada awal terjadi reaksi absorbansi akan terus meningkat
hingga pada waktu tertentu absorbansi yang dihasilkan stabil. Terdapat
kemungkinan senyawa mengalami kerusakan atau terurai sehingga menyebabkan
intensitas warna dan absorbansinya menurun seiring bertambahnya waktu. Oleh
karena hal tersebut perlu dilakukan pengukuran pada saat waktu operasional yang
tepat (Gandjar dan Rohman, 2007).
Panjang gelombang yang digunakan dalam pengukuran adalah panjang
gelombang yang memiliki absorbansi maksimal. Pada panjang gelombang
maksimal kepekaan yang dihasilkan tinggi. Oleh karena itu perubahan absorbansi
untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar (Gandjar dan Rohman,
2007).
I. Landasan Teori
Radikal bebas merupakan suatu atom atau molekul yang memiliki satu
atau lebih elektron yang tidak berpasangan, sehingga relatif tidak stabil.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
Antioksidan seperti asam fenolik, polifenol, dan flavonoid merupakan senyawa
pemberi elektron yang dapat memerangi aktivitas oksidan dalam tubuh yang dapat
mencegah timbulnya penyakit degeneratif.
Buah buni merupakan sumber antioksidan yang memiliki kandungan
senyawa fenolik, flavonoid dan antosianin yang tinggi. Ekstrak metanol buah buni
mengandung antosianin (prosianidin B1, prosianidin B2), flavonoid (katekin,
epikatekin, rutin, mirisetin, resveratrol, luteolin, kuersetin, naringenin, dan
kaempferol) dan asam fenolik (asam galat, asam kafeat, asam elagat, dan asam
ferulat) yang tinggi.
Maserasi dipilih karena metodenya tidak menggunakan panas dan tidak
merusak kandungan senyawa dalam buah buni. Etanol 96 % dipilih sebagai
pelarut karena bersifat polar sehingga diharapkan senyawa – senyawa flavonoid
dan fenolik yang bersifat polar dapat tersari ke dalam etanol. Etanol dapat menyari
berbagai macam senyawa fenolik seperti polifenol, flavonoid, antosianindan tanin.
Metode yang sering digunakan untuk mengukur aktivitas antioksidan
adalah metode DPPH. Metode ini menggunakan rutin sebagai kontrol positif
karena rutin merupakan salah satu senyawa flavonoid dalam tanaman yang telah
diketahu mempunyai aktivitas antioksidan. Tujuan metode ini adalah untuk
mengetahui parameter konsentrasi yang ekuivalen memberikan 50% efek aktivitas
antioksidan (IC50), yaitu dengan cara menginterpretasikan data eksperimental dari
metode DPPH tersebut.
Aktivitas antioksidan juga berhubungan dengan kadar fenolik totalnya,
kadar fenolik total dapat ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Metode
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
Folin-Ciocalteu didasarkan pada reduksi asam fosfotungstat dalam larutan alkali
menjadi fosfotungstat biru. Kandungan fenolik total dinyatakan dengan ekuivalen
asam galat sebagai pembanding karena asam galat merupakan salah satu senyawa
asam fenolik yang banyak terdapat dalam tanamanyang mempunyai aktivitas
antioksidan.
J. Hipotesis
1. Ekstrak etanol buah buni memiliki kandungan senyawa fenolik yang dapat
diukur dengan metode Folin-Cioucalteu dan dinyatakan dengan ekuivalen
asam galat.
2. Ekstrak etanol buah buni memiliki aktivitas antioksidan yang dapat diukur
dengan metode DPPH dan dinyatakan dalam nilai IC50.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan
rancangan acak sederhana.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Klasifikasi variabel
a. Variabel utama
1) Variabel bebas : konsentrasi ekstrak etanol buah buni
2) Variabel tergantung : aktivitas antioksidan dan kandungan fenolik total
ekstrak etanol buah buni.
b. Variabel pengacau
1) Variabel pengacau terkendali : waktu pemanenan, umur tanaman yang
dipanen, dan metode ekstraksi.
2) Variabel pengacau tak terkendali : kondisi cuaca dan lingkungan pada
tempat tumbuh tanaman.
2. Definisi operasional
a. Ekstrak etanol buah buni adalah ekstrak kental yang diperoleh dari
maserasi buah buni yang masih segar selama 24 jam dengan etanol 96%
dan diremaserasi sebanyak dua kali selama 24 jam dengan pelarut yang
sama lalu diuapkan menggunakan vacuum rotary evaporator hingga
diperoleh pengurangan berat ekstrak yang tetap sebesar 0,01.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
b. Metode DPPH adalah salah satu metode pengujian aktivitas antioksidan
menggunakan radikal bebas DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl).
Prinsip metode ini adalah penangkapan radikal bebas yang menyebabkan
elektron bebas menjadi berpasangan dan mengakibatkan pemudaran warna
ungu.
c. Persen inhibitory concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan
kemampuan ekstrak etanol buah buni dalam menghambat radikal bebas
dalam hal ini DPPH.
d. Inhibitory concentration 50 (IC50) adalah konsentrasi ekstrak etanol buah
buni yang dapat menghambat 50 % radikal bebas (DPPH).
C. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan adalah buah buni yang diambil dari taman Kampus
III Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Aquadest dan etanol 96 % diperoleh
dari CV. General Labora. Natrium karbonat p.a diperoleh dari laboratorium
Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Bahan kimia kualitas pro analitik Sigma
Chem. Co., USA berupa rutin, asam galat, reagen Folin-Ciocalteu, DPPH (2,2-
diphenyl-1-picrylhdrazyl). Reagen Mayer LP, Dragendroff LP, serbuk magnesium
P, gelatin 1%, dan bahan kimia pro analitik E. Merck berupa metanol, asam asetat
glasial, asam klorida 37%, kloroform, natrium hidroksida, besi (III) klorida, KOH,
hidrogen peroksida, asam sulfat, benzena, ammonia yang diperoleh dari
Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
D. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah : spektrofotometer UV-
Vis (Shimadzu), vacuum rotary evaporator (buchi rotavapor), maserator/orbital
shaker, corong Buchner, pompa vaccum, waterbath (Labo-tech, Haraeus), neraca
analitik (Scaltec SBC 22, BP 160p), oven, vortex (Junke & Kunkel), micropipet
50 – 200 μl, micropipet 200 – 1000 μl, dan alat – alat gelas (Pyrex-Germany dan
Iwaki).
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Buah buni yang diteliti dideterminasi menurut pustaka acuan. Determinasi
dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat, Fakultas Farmasi, Universitas
Sanata Dharma, Yogyakarta. Proses determinasi dilakukan dengan menggunakan
bagian tanaman buni seperti daun, buah, dan bunga.
2. Pengambilan bahan buah buni
Buah buni diperoleh dari taman Kampus III Universitas Sanata Dharma,
Yogyakarta. Cara pemanenan buah buni yang digunakan pada penelitian ini yaitu,
diambil buah yang berwarna ungu kehitaman berbentuk bulat telur dengan
permukaan kulit licin halus dan buah tidak jatuh ke tanah. Pemanenan buah buni
dilakukan bulan Februari 2015 pada pagi hari pukul 09.00 WIB.
3. Pembuatan ekstrak
Sebanyak 1000 g buah buni segar dicuci beberapa kali menggunakan air
mengalir dan diangin-anginkan, kemudian direndam dengan etanol 96% setinggi
kurang lebih dua sentimeter dari tinggi buah buni dan didiamkan dalam tempat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
gelap selama 5 bulan, kemudian dilakukan maserasi selama 24 jam dengan etanol
96% dan diremaserasi sebanyak dua kali selama 24 jam dengan pelarut yang
sama. Hasil maserasi dan remaserasi disaring kemudian filtrat yang diperoleh
dipekatkan menggunakan vaccum rotary evaporator pada suhu 600C sehingga
diperoleh ekstrak kental etanol buah buni. Hasil penguapan dari rotary evaporator
diuapkan kembali di waterbath untuk menghilangkan seluruh pelarut yang masih
terdapat di dalam ekstrak. Ekstrak kental ditimbang dan dihitung rendemen
ekstrak kemudian disimpan dalam desikator.
4. Uji pendahuluan
a. Uji fenolik
Sebanyak 0,5 mL larutan uji dengan konsentrasi 11 mg/mL dan larutan
pembanding asam galat dengan konsentrasi 150,0 µg/mL masing – masing
dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambah dengan 2,5 mL
reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades dengan
perbandingan 1:10 v/v dalam tabung reaksi. Campuran didiamkan selama 10
menit, lalu ditambah dengan 7,5 mL larutan natrium karbonat 1 M. Warna
larutan diamati secara visual dengan mata.
b. Uji aktivitas antioksidan
Sebanyak 1,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing –
masing tiga tabung reaksi, kemudian ke dalam masing – masing tabung reaksi
ditambahkan 1,0 mL metanol p.a., larutan pembanding rutin 25 µg/mL, dan
larutan uji 11 mg/mL. Campuran tersebut ditambah dengan 3 mL metanol p.a.,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
lalu divortex selama 30 detik. Selama 30 menit, warna larutan tersebut diamati
secara visual dengan mata.
5. Skrining fitokimia ekstrak etanol 96% buah buni
a. Pembuatan larutan uji
Pembuatan larutan uji untuk uji fitokimia dilakukan dengan cara
melarutkan sebanyak 500 mg ekstrak etanol 96% buah buni dilarutkan dengan
50 mL etanol 96%, kemudian didapat larutan uji yang digunakan untuk
skrining fitokimia.
b. Uji saponin
Sebanyak 0,05 g sampel dilarutkan dalam 10 mL akuades, kemudian
dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Dikocok vertikal selama 30 detik
kemudian dibiarkan selama 30 detik, diamati perubahan yang terjadi. Apabila
terbentuk busa yang tetap maka identifikasi menunjukkan adanya saponin
(Marliana et al., 2005).
c. Uji flavonoid
Sebanyak 3 mL larutan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian
ditambahkan serbuk Mg dan 5 tetes HCl pekat. Jika menghasilkan warna
kuning, oranye, dan merah menandakan adanya flavonoid (Nafisah et al.,
2014).
d. Uji triterpenoid dan steroid
Larutan uji sebanyak 2 mL diuapkan dalam cawan porselen. Residu
dilarutkan dengan 0,5 mL kloroform, setelah itu ditambahkan dengan asam
asetat anhidrat sebanyak 0,5 mL. Selanjutnya ditambahkan 2 mL asam sulfat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
pekat melalui dinding tabung. Adanya triterpenoid ditandai dengan
terbentuknya cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan larutan, sedangkan
adanya steroid ditandai dengan terbentuknya cincin biru kehijauan (Hayati dan
Halimah, 2010).
e. Uji minyak atsiri
Larutan uji dipipet sebanyak 1 mL kemudian diuapkan diatas cawan
porselen hingga diperoleh residu. Hasil positif minyak atsiri ditandai dengan
bau khas yang dihasilkan oleh residu tersebut (Padmasari et al., 2013).
f. Uji alkaloid
Sebanyak 2 mL larutan uji diuapkan diatas cawan porselen. Residu
yang terbentuk dilarutkan dengan 5 mL HCl 2 N. Larutan yang dihasilkan
dibagi ke dalam 3 tabung reaksi. Tabung pertama berfungsi sebagai blanko
yang ditambahkan dengan HCl, tabung kedua ditambahkan 3 tetes pereaksi
Dragendorff dan tabung ketiga ditambahkan 3 tetes pereaksi Mayer. Hasil
positif adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan jingga pada
tabung kedua dan endapan kuning pada tabung ketiga (Puspitasari et al.,
2013).
g. Uji tanin dan polifenol
Sebanyak 3 mL larutan ekstrak uji dibagi ke dalam 3 bagian yaitu
tabung A, tabung B, dan tabung C. Tabung A digunakan sebagai blanko,
tabung B direaksikan dengan larutan besi (III) klorida 10%, warna biru tua
atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tannin dan polifenol, sedangkan
pada tabung C hanya ditambahkan gelatin 1%. Apabila terbentuk endapan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
pada tabung C maka larutan ekstrak positif mengandung tannin (Marliana et
al., 2005).
h. Uji antosianin
Sebanyak 10 mL larutan uji ditambahkan HCl 2 M kemudian
dipanaskan 1000C selama 5 menit. Hasil positif bila timbul warna merah. Juga
ditambahkan NaOH 2M tetes demi tetes sambil diamati perubahan warna yang
terjadi. Hasil positif bila timbul warna hijau biru yang memudar perlahan –
lahan (Putri dan Gunawan, 2015).
i. Uji antrakuinon
Uji Brontrager dilakukan dengan cara mengambil 0,05 gekstrak dan
dilarutkan dengan 10 mL akuades kemudian disaring, filtrat diekstrak dengan
5 mL benzena. Hasil ekstrak dibagi menjadi 2 bagian, A dan B. Filtrat A
digunakan sebagai blanko dan filtrat B ditambahkan 5 mL amonia kemudian
dikocok, bila terdapat warna merah berarti hasil positif (Marliana et al., 2005).
Uji Brontrager termodifikasi dilakukan dengan melarutkan 0,05 g
sampel dengan 10 mL 0,5 N KOH dan 1 mL larutan hidrogen peroksida.
Kemudian dipanaskan pada waterbath selama 10 menit, didinginkan dan
disaring. Pada filtratnya ditambahkan asam asetat bertetes – tetes sampai pada
kertas lakmus menunjukkan asam. Selanjutnya diekstrak dengan 5 mL
benzena. Hasil ekstrak dibagi menjadi 2 bagian, A dan B. Larutan A
digunakan sebagai blanko, sedangkan larutan B dibuat basa dengan 2 – 5 mL
larutan amonia. Perubahan warna pada lapisan basa diamati. Warna merah
atau merah muda menunjukkan adanya antrakuinon
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
6. Penentuan kandungan fenolat total
a. Pembuatan larutan asam galat
Asam galat ditimbang sebanyak 25 mg, kemudian dimasukkan ke
dalam gelas Beker dan dilarutkan dengan aquades : metanol p.a (1:1).
Larutan dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL, tambahkan akuades :
metanol p.a (1:1) sampai batas tanda. Larutan tersebut diambil sebanyak
0,5; 0,75 ; 1 ; 1,25 dan 1,5 mL, masukkan ke dalam labu takar 10 mL dan
tambahkan aquades : metanol p.a (1:1) sampai batas tanda, sehingga
diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125; dan
150 μg / mL.
b. Pembuatan larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total
Ekstrak etanol buah buni ditimbang sebanyak 250 mg, larutkan
menggunakan metanol p.a dalam gelas beker. Kemudian masukkan ke
dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan metanol p.a hingga batas tanda.
Larutan intermediet dibuat dengan mengambil 3,6 mL dari larutan stok,
masukkan ke dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan metanol p.a hingga
batas tanda. Sejumlah 2,5 mL larutan intermediet diambil, masukkan ke
dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan metanol p.a hingga batas tanda.
Konsentrasi larutan uji sebesar 4500,0 μg / mL.
c. Penentuan operating time
Larutan asam galat dengan konsentrasi 50; 100; dan 150 μg/mL
diambil sebanyak 0,5 mL. Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
2,0 mL pada masing – masing larutan. Selanjutnya, ditambahkan dengan 4,0
mL natrium karbonat 1 M. Baca absorbansi larutan setiap 5 menit dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 760 nm selama 60 menit.
d. Penentuan panjang gelombang maksimum
Larutan asam galat dengan konsentrasi 50; 100; dan 150 μg/mL
diambil sebanyak 0,5 mL. Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak 2
mL pada masing – masing larutan. Selanjutnya, ditambahkan dengan 4,0
mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama operating time yang telah
didapat, kemudian dilakukan scanning panjang gelombang maksimum
dengan spektrofotometer visibel dengan panjang gelombang 600-800 nm.
e. Pembuatan kurva baku asam galat
Larutan asam galat dengan konsentrasi 50; 75; 100; 125; dan 150
μg/mL diambil sebanyak 0,5 mL. Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan
sebanyak 2 mL.Selanjutnya, ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat
1 M, diamkan selama operating time yang telah didapat. Baca
absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh.
Lakukan replikasi sebanyak 3 kali.
f. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Larutan uji dengan konsentrasi 4500,0 μg/mL diambil sebanyak 0,5
mL. Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak 2mL. Selanjutnya,
ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M, diamkan selama
operating time yang telah didapat. Baca absorbansinya pada panjang
gelombang maksimum yang telah diperoleh.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
7. Penentuan aktivitas antioksidan
a. Pembuatan larutan DPPH
Sejumlah DPPH ditimbang sebanyak 5 mg dan dilarutkan dengan
metanol p.a. di dalam labu ukur 50 mL sehingga diperoleh larutan stok
dengan konsentrasi 100 . Diambil sebanyak 5 mL larutan stok
DPPH kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 25,0 mL. Larutan
ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.
b. Pembuatan larutan stok rutin
Sejumlah 5 mg rutin dilarutkan dalam metanol p.a sampai 50,0
mL.
c. Pembuatan larutan standar rutin
Kemudian diambil sebanyak 3,0 ; 4,0 ; 5,0; 6,0; dan 7,0 mL larutan
stok, lalu ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh
konsentrasi larutan standar rutin sebesar 30; 40; 50; 60; dan 70 µg/mL.
d. Pembuatan larutan uji
Sejumlah 250,0 mg ekstrak etanol buah buni ditimbang kemudian
ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL. Dari larutan tersebut diambil
sebanyak 2,0 mL untuk ditambahkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL,
menjadi larutan intermediet. Kemudian diambil 0,6; 1,0; 1,4; 1,8; dan 2,2
mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 600; 1000; 1400;
1800; 2200 µg/mL.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
e. Pembuatan larutan kontrol
Larutan yang digunakan adalah 0,2 mL metanol p.a dimasukkan ke
dalam tabung reaksi dan ditambahkan 3,8 mL DPPH, divortex selama 30
detik. Didiamkan selama 30 menit (Reaction Time).
f. Penentuan operating time (OT)
Digunakan 3 konsentrasi rutin (5, 15, 25 µg/mL). Sebanyak 3,8 mL
larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi tertutup kemudian
ditambah dengan 0,2 mL larutan standar rutin. Campuran larutan tadi
kemudian divortex selama 30 detik. Larutan dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometer visible pada panjang gelombang maksimal 517 nm setiap
5 menit selama 60 menit sampai diketahui terjadi penurunan absorbansi
secara nyata.
g. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Larutan DPPH yang telah dibuat dengan konsentrasi 20, 30, 40
µg/mL ditentukan spektrum serapannya menggunakan spektrofotometer
UV pada panjang gelombang 400 nm hingga 700 nm. Dan ditentukan
panjang gelombang optimumnya.
h. Penentuan aktivitas antioksidan
Dari masing – masing larutan uji dipipet 0,2 mL dimasukkan ke
dalam tabung reaksi. Ditambahkan 3,8 mL DPPH 20 µg/mL, divortex
selama 30 detik, kemudian didiamkan selama 30 menit (Operating Time)
dan diukur serapannya pada panjang gelombang 516 nm. Dilakukan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
pengujian yang sama untuk pembanding rutin. Replikasi dilakukan
sebanyak 3 kali.
i. Estimasi aktivitas antioksidan
Hasil dari prosedur, dihitung nilai %IC dan IC50 untuk rutin dan
ekstrak etanol buah buni.
F. Analisis Data
Kandungan fenolik total ekstrak etanol buah buni dinyatakan sebagai mg
ekivalen asam galat (GAE) per g ekstrak etanol buah buni. Nilai absorbansi
larutan uji yang telah didapatkan dimasukkan ke dalam persamaan kurva
persamaan regresi linear asam galat, sehingga diperoleh nilai ekivalensi larutanuji
terhadap asam galat. Kandungan fenolik total diperoleh berdasarkan rumus :
Konsentrasi ekstrak etanol buah buni x
Aktivitas penghambatan radikal bebas DPPH (%IC) dihitung dengan
menggunakan rumus :
%IC=
x 100 %
Setelah didapatkan presentase inhibisi dari masing – masing konsentrasi,
kemudian ditentukan persamaan y = a + bx dengan perhitungan secara regresi
linear dimana x adalah konsentrasi (µg/mL) dan y adalah presentase inhibisi (%).
Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan Inhibition Concentration 50 % (IC50)
yaitu konsentrasi sampel yang dapat menghambat radikal.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat,
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang diidentifikasi menurut acuan
Flora untuk Sekolah di Indonesia (1992). Determinasi tumbuhan ini bertujuan
untuk memastikan bahwa tanaman yang digunakan benar Antidesma bunius (L.)
Spreng. Bagian tanaman yang digunakan untuk determinasi adalah daun, batang,
bunga dan buah. Determinasi dilakukan sampai kategori spesies, hasil determinasi
menunjukkan bahwa buah buni yang digunakan dalam penelitian ini memiliki
nama ilmiah Antidesma bunius (L.) Spreng (Lampiran 1) dengan warna kulit buah
ketika masih muda hijau, ketika hampir matang berwarna merah, dan ketika
matang berwarna ungu kehitaman dengan permukaan kulit yang licin dan halus.
B. Hasil Pengumpulan Bahan
Buah buni yang digunakan pada penelitian ini berasal dari taman Kampus
III Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta tepatnya di depan laboratorium
Farmasetika Dasar. Bahan berupa buah buni hanya berasal dari satu pohon di satu
tempat, hal tersebut bertujuan agar tidak terjadi variasi kandungan senyawa pada
tanaman yang dapat disebabkan oleh adanya perbedaan kondisi tanah, lingkungan,
dan unsur hara dari tempat tanaman berasal (Rahardjo et al., 2006).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
Gambar 5. Buah buni (Dokumentasi pribadi, 2015).
Buah buni yang digunakan berwarna ungu kehitaman karena diharapkan
mengandung sejumlah senyawa kimia fenolik dengan jumlah maksimal.
Pemanenan dilakukan di pagi hari agar metabolit sekunder yang terkandung
dalam buah buni belum mengalami fotosintesis sehingga kadar metabolit
sekundernya tidak berkurang karena menurut Pallipane dan Rolle (2008)
pemanenan paling baik dilakukan pada kondisi tersejuk, yaitu pagi hari atau
malam hari ketika aktivitas fisiologi tanaman rendah.
C. Hasil Preparasi Sampel
Sampel yang digunakan dalam preparasi sampel berupa buah buni yang
masih segar. Menurut Markham (1988), alasan digunakan buah buni yang masih
segar adalah untuk menjaga kestabilan senyawa flavonoid dalam sampel, karena
bahan tumbuhan yang telah dikeringkan mempunyai kecenderungan adanya
perubahan susunan senyawa flavonoid berupa glikosida menjadi aglikonnya yang
disebabkan karena pengaruh fungi dan aglikon yang peka menjadi teroksidasi.
Perendaman dilakukan selama 5 bulan, menurut Cooper-Driver dan Balick
(1978), senyawa fenolik masih dapat terdeteksi didalam etanol 95 % yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
digunakan untuk merendam bahan segar selama 1 bulan. Metode ekstraksi yang
dipilih adalah maserasi dengan bantuan shaker. Maserasi dipilih karena menurut
Williamson et al., (1996) maserasi tidak menggunakan pemanasan sehingga tidak
terjadi dekomposisi senyawa kimia yang terkandung didalamnya. Dekomposisi
senyawa kimia terjadi karena oksidasi senyawa fenolik, sehingga dapat
menyebabkan penurunan senyawa fenolik (Dai dan Mumper 2010).
Pada penelitian ini etanol dipilih karena merupakan pelarut polar,
sehingga diharapkan dapat menarik senyawa yang bersifat polar. Dasar pemilihan
pelarut yang lain yaitu, kemudahan penggunaan, efisiensi, selektivitas dan
penerapan yang luas (Dai dan Mumper, 2010). Menurut Schirmer (1990), etanol
memiliki indeks polaritas 5,2, sehingga dapat menarik senyawa senyawa fenolik
yang cenderung polar, seperti teori like dissolve like menurut Wagner (2013),
dimana senyawa yang bersifat polar cenderung akan menarik senyawa yang
bersifat polar juga, dan sebaliknya. Selain itu kelebihan dari etanol adalah tidak
berbahaya bagi lingkungan, dan dapat mencegah pertumbuhan kapang pada
konsentrasi lebih dari 20%. Hasil ekstrak kental yang didapat memiliki bobot
138,41 gram dari 1000 gram buah segar yang digunakan. Dari hasil perhitungan
rendemen yang diperoleh adalah 13,841 %.
D. Uji Pendahuluan Ekstrak Etanol Buah Buni
1. Uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik
Uji pendahuluan senyawa fenolik bertujuan untuk mengetahui keberadaan
senyawa fenolik pada ekstrak etanol buah buni. Uji kualitatif ini menggunakan
reagen Folin-Ciocalteu yang terdiri dari asam fosfomolibdat dan asam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
fosfotungstad (Nunes, et al., 2012). Prinsip uji kualitatif ini adalah reaksi
oksidasi-reduksi dalam suasana basa menggunakan reagen Folin-ciocalteu dan
natrium karbonat. Senyawa fenolik akan berubah menjadi ion fenolat dalam
suasana basa. Ion fenolat yang terbentuk akan mereduksi asam fosfomolibdat-
fosfotungstat dalam reagen Folin-Ciocalteu selama proses oksidasi fenol menjadi
senyawa kompleks molybdenum-tungsten berwarna biru (Haciet al., 2009).
Perubahan menjadi warna biru inilah yang digunakan sebagai indikator
keberadaan senyawa fenolik dalam sampel.
Uji pendahuluan senyawa fenolik menggunakan kontrol positif dan kontrol
negatif. Kontrol positif yang digunakan yaitu reagen Folin-Ciocalteu yang
direaksikan dengan asam galat dan natrium karbonat untuk menunjukkan warna
larutan jika hasilnya positif (Gambar 6). Kontrol negatif yang digunakan yaitu
reagen Folin-Ciocalteu, metanol : air (1:1) dan natrium karbonat untuk
menunjukkan jika hasilnya negatif.
Gambar 6. Hasil uji kualitatif senyawa fenolik pada ekstrak etanol buah buni
[A = kontrol positif (asam galat + reagen Folin-Cioucalteu + natrium karbonat)] ;
B = sampel [larutan uji ekstrak etanol buah buni + reagen Folin-Ciocalteu +
natrium karbonat] ; C = kontrol negatif [air : metanol (1:1) + reagen Folin-
Ciocalteu + natrium karbonat]
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
Hasil dari uji kualitatif ekstrak etanol buah buni (Gambar 6) menunjukkan
perubahan warna menjadi biru, sama seperti kontrol positif. Hal ini berarti dalam
ekstrak etanol buah buni mengandung senyawa – senyawa fenolik. Warna yang
dihasilkan oleh sampel yang direaksikan dengan pereaksi Folin dan natrium
karbonat tidak sepekat pada kontrol positif karena kandungan fenolik dalam
sampel rendah. Semakin tinggi kandungan fenolik dalam sampel maka intensitas
warna biru juga semakin meningkat. Asam galat digunakan sebagai senyawa
pembanding karena merupakan salah satu asam fenolik yang banyak terdapat
dalam tanaman, dan sering digunakan untuk mendeterminasi kandungan fenol
dalam tanaman melalui uji Folin-Ciocalteu (Fiuza et al., 2004)
2. Uji pendahuluan keberadaan senyawa antioksidan
Tujuan dilakukannya uji pendahuluan antioksidan pada ekstrak etanol
buah buni adalah untuk mengetahui aktivitas antioksidan secara kualitatif. Prinsip
uji ini adalah reaksi antara ekstrak etanol buah buni dengan DPPH (2,2-difenil-1-
pikirihidrazil). Senyawa antioksidan yang terdapat dalam ekstrak etanol buah buni
akan bereaksi dengan radikal bebas DPPH. Senyawa antioksidan akan mengikat
elektron bebas dari senyawa radikal. Keberadaan senyawa antioksidan inilah yang
dapat mengubah warna larutan DPPH dari warna ungu menjadi kuning (Dehpour
et al., 2009).
Uji pendahuluan aktivitas antioksidan menggunakan kontrol positif dan
kontrol negatif. Kontrol positif yang digunakan adalah DPPH yang direaksikan
dengan rutin. Rutin digunakan sebagai senyawa pembanding karena merupakan
jenis flavonoid yang paling sering dijumpai pada pemeriksaan flavonoid yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
banyak terdapat dalam tumbuhan dan tersebar luas dalam pigmen tanaman. Rutin
juga telah terbukti mempunyai aktivitas antioksidan terhadap radikal bebas
(Mu’awwanah dan Ulfah, 2015). Kontrol negatif yang digunakan adalah DPPH.
Gambar 7. Hasil uji kualitatif aktivitas antioksidan pada ekstrak etanol buah
buni [A = kontrol negatif (larutan DPPH) ; B = kontrol positif (larutan DPPH +
rutin) ; C = sampel (larutan DPPH + larutan uji ekstrak etanol buah buni)
Hasil dari uji kualitatif ekstrak etanol buah buni (Gambar 7) menunjukkan
perubahan warna menjadi ungu menjadi kuning, sama seperti kontrol positif. Hal
ini berarti dalam ekstrak etanol buah buni mengandung senyawa – senyawa yang
mempunyai aktivitas antioksidan.
E. Hasil Uji Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol 96% Buah Buni
Tujuan utama skrining fitokimia adalah untuk mengidentifikasi senyawa
bioaktif atau senyawa yang mempunyai aktivitas yang menguntungkan, yaitu
sebagai antioksidan. Skrining fitokimia ini menggunakan uji tabung yaitu dengan
mereaksikan bahan tanaman dengan larutan atau pereaksi tertentu menggunakan
tabung reaksi, sehingga diperoleh hasil yang mengarah ke kandungan senyawa
aktif dari bahan tanaman tersebut.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
Tabel I. Hasil pengamatan uji tabung terhadap ekstrak etanol buah
buni
No Uji Tabung Pereaksi Hasil Keterangan
1. Uji saponin Akuades - Tidak terbentuk
buih
2. Uji flavonoid Mg dan HCl + Merah
3. Uji triterpenoid
dan steroid
Liebermann-
Burchard +
Terbentuk cincin
coklat, positif
mengandung
triterpenoid
4. Uji minyak atsiri - + Berbau khas
5. Uji alkaloid
Dragendroff -
Tidak terdapat
endapan berwarna
coklat muda sampai
kuning
Mayer -
Tidak terdapat
endapan berwarna
putih
6. Uji tannin dan
polifenol
Gelatin 1% + Hijau kehitaman,
ada endapan
FeCl3 + Hijau kehitaman
7. Uji antosianin HCl + Hijau
NaOH + Merah
8. Uji antrakuinon
Brontrager - Tidak berwarna
merah
Brontrager
termodifikasi -
Tidak berwarna
merah
Keterangan : - = negatif ; + = positif
Uji tabung meliputi uji alkaloid, antrakuinon, saponin, flavonoid,
triterpenoid dan steroid, antosianin, minyak atsiri, tanin dan polifenol. Salah satu
indikator terjadinya reaksi pada uji tabung adalah perubahan warna. Berdasarkan
hasil penelitian diduga bahwa ekstrak etanol buah buni mengandung minyak
atsiri, tanin dan polifenol, flavonoid, antosianin, fenolik, dan triterpenoid
sebagaimana dalam tabel I.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
a. Uji saponin
Uji saponin dilakukan dengan menggojog kuat ekstrak dengan akuades
selama 30 detik hingga terbentuk buih setinggi 10 cm. Buih yang terbentuk ini
akan tahan dalam jangka waktu yang lama, tidak akan hilang selama 30 detik.
Saponin pada umumnya berada dalam bentuk glikosida, sehingga mempunyai
kemampuan membentuk buih dalam air (Marliana et al., 2005). Saponin
merupakan senyawa aktif permukaan yang dapat menimbulkan busa jika dikocok
dengan air. Hal ini karena saponin memiliki gugus polar dan non polar yang akan
membentuk misel. Apabila misel terbentuk maka gugus polar akan menghadap
keluar yang akan berikatan dengan air dan gugus non polar akan menghadap
kedalam menjauhi air yang tampak seperti busa (Padmasari et al., 2013),
akibatnya terjadi penurunan tegangan permukaan air yang dapat menimbulkan
buih. Hasil penelitian sesuai dengan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh
Rakasiwi dan Soegihardjo (2014), yaitu ekstrak etanol buah buni tidak
mengandung saponin karena tidak terbentuk buih pada saat pengocokan.
b. Uji flavonoid
Untuk mengetahui kandungan flavonoid pada ekstrak uji digunakan uji
Shinoda test, yaitu menggunakan larutan HCl pekat dan serbuk Mg yang
menghasilkan warna kuning, oranye, atau merah jika dinyatakan positif.
Mg(s) + 2HCl(l) MgCl2(aq) + H2(g)
MgCl2(aq) + 6ArOH(s) [Mg(OAr)6]-4
(aq) + 6H+ + 2Cl
-
Gambar 8. Reaksi flavonoid pada ekstrak etanol buah buni
berdasarkan uji Shinoda(Nafisah et al., 2014)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
Menurut Rakasiwi dan Soegihardjo (2014), ekstrak etanol buah buni
mengandung senyawa flavonoid. Hasil penelitian yang dilakukan sesuai dengan
penelitian sebelumnya yaitu timbul warna merah pada ekstrak etanol buah buni
yang direaksikan dengan HCl dan Mg, hal ini menunjukkan bahwa ekstrak positif
mengandung flavonoid.
c. Uji triterpenoid dan steroid
Pada pengujian steroid dan triterpenoid, analisis senyawa didasarkan pada
kemampuan senyawa tersebut membentuk warna dengan H2SO4 pekat dalam
pelarut asam asetat anhidrat (Sangi et al., 2008). Pereaksi Lieberman-Burchard
yang terdiri dari campuran asam asetat anhidrat, asam sulfat pekat dan kloroform.
Hasil positif ditunjukkan dengan adanya cincin coklat atau violet untuk
triterpenoid, sedangkan untuk hasil positif steroid ditunjukkan dengan adanya
cincin biru kehijauan.
Gambar 9. Mekanisme umum reaksi Liebermann-Burchard (Nafisah, et al.,
2014).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
Menurut Rakasiwi dan Soegihardjo (2014), ekstrak etanol buah buni
mengandung senyawa triterpenoid. Hasil penelitian sesuai dengan penelitian
sebelumnya yaitu ekstrak etanol buah buni positif mengandung triterpenoid
ditandai dengan terbentuknya cicin berwarna coklat.
d. Uji minyak atsiri
Minyak atsiri dapat dihasilkan dari berbagai tanaman (Kardinan, 2005).
Telah diketahui bahwa bunga, buah batang, dan akar rempah – rempah
mengandung bahan yang mudah menguap serta berbau khas yang dikenal dengan
minyak atsiri (Fachriyah dan Sumardi, 2007). Minyak atsiri didefinisikan sebagai
sebagai campuran kimiawi yang terdapat pada berbagai tumbuhan dan
mempunyai sifat mudah menguap. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak
etanol buah buni mengandung minyak atsiri karena menimbulkan bau khas setelah
larutan ekstrak uji diuapkan. Hasil positif ini diperkuat dengan penelitian
sebelumnya yang dilakukan oleh Rakasiwi dan Soegihardjo (2014) bahwa ekstrak
etanol buah buni mengandung senyawa triterpenoid, sedangkan triterpenoid
merupakan komponen penyusun minyak atsiri.
e. Uji alkaloid
Pada uji ini larutan ekstrak uji yang telah diuapkan kemudian ditambahkan
asam klorida. Penambahan asam klorida bertujuan untuk mengubah alkaloid yang
bersifat basa menjadi garam alkaloid, agar bisa larut dalam air. Alkaloid
merupakan senyawa yang mengandung atom N dan sebagian besar bersifat basa.
Tujuan dari pemanasan adalah mempercepat pembentukan garam alkaloid.
Setelah dingin, larutan kemudian dimasukkan kedalam 2 tabung reaksi dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
direaksikan dengan pereaksi Dragendroff dan Mayer masing – masing sebanyak 3
tetes. Reaksi positif jika terbentuk endapan berwarna coklat muda sampai kuning
pada penambahan Dragendroff dan endapan berwarna putih pada penambahan
Mayer (Marliana et al., 2005). Menurut Rakasiwi dan Soegihardjo (2014), ekstrak
etanol buah buni tidak mengandung alkaloid. Hasil penelitian yang didapatkan
sesuai dengan penelitian sebelumnya yaitu negatif dengan ditandai tidak adanya
endapan dari kedua tabung sampel.
f. Uji tanin dan polifenol
Pada uji tanin diperoleh hasil positif yaitu berwarna hijau dan terbentuk
endapan, adanya tanin akan mengendapkan protein pada gelatin. Tanin akan
bereaksi dengan gelatin membentuk kopolimer mantap yang tidak larut dalam air
(Marliana et al., 2005).
Uji tanin juga dilakukan dengan menggunakan pereaksi besi (III) klorida
untuk menentukan apakah sampel mengandung gugus polifenol atau tidak. Salah
satu senyawa polifenol adalah tanin. Adanya gugus fenol ditunjukkan dengan
perubahan warna sampel menjadi hijau kehitaman atau biru tua setelah
penambahan besi (III) klorida. Terjadinya pembentukan warna ini karena
terbentuknya senyawa kompleks antara logam Fe dan tanin.
FeCl3(aq) + 6ArOH(s) 6H+ + 3Cl
- + [Fe(OAr)6]
3-(aq)
Gambar 10. Reaksi antara flavonoid dengan FeCl3 (Nafisah et al., 2014).
Menurut Rakasiwi dan Soegihardjo (2014), ekstrak etanol buah buni
mengandung senyawa tanin. Hasil positif ditunjukkan pada penelitian ini adalah
adanya perubahan warna ekstrak menjadi hijau kehitaman, hal ini sesuai dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
penelitian sebelumnya bahwa ekstrak etanol buah buni mengandung senyawa
tanin yang tergolong sebagai tanin kondensasi (Sangi et al., 2008).
g. Uji antosianin
Salah satu faktor yang mempengaruhi warna dari antosianin adalah
perubahan pH. Sifat asam akan menyebabkan warna antosinin menjadi merah,
sedangkan sifat basa menyebabkan antosianin menjadi biru.
Dalam penelitian ini digunakan asam kuat (HCl) dan basa kuat (NaOH).
Penambahan asam kuat akan mengubah pH antosinin menjadi lebih asam,
sedangkan penambahan basa akan mengubah pH antosinin menjadi basa (Putri et
al., 2015). Menurut Maulida dan Guntarti (2015), pada pH asam antosianin akan
berada pada bentuk ion flavilium yang berwarna merah dan berganti warna biru-
hijau pada keadaan basa. Warna biru-hijau disebabkan karena antosianin banyak
berada dalam bentuk ion anhidro basa.
Gambar 11. Perubahan struktur antosianin pada pH yang berbeda (Maulida
dan Guntarti 2015).
Saat larutan sampel ditambahkan dengan HCl terjadi perubahan warna
menjadi merah, dan ketika larutan sampel ditambahkan NaOH terjadi perubahan
warna menjadi biru sehingga dapat disimpulkan bahwa sampel mengandung
antosianin.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
h. Uji antrakuinon
Uji Brontrager dan uji Brontrager termodifikasi bisa mendeteksi adanya
antrakuinon, antrakuinon akan memberikan karakteristik warna merah, violet,
hijau atau ungu dengan basa (Marliana et al., 2005). Uji Brontrager bisa
mendeteksi senyawa antrakuinon, namun uji ini akan menunjukkan negatif untuk
glikosida antrakuinon yang sangat stabil atau turunan tereduksi dari tipe antranol.
Oleh karena itu uji Brontrager dimodifikasi dengan melakukan uji Brontrager
sebelumnya untuk menghidrolisis dan mengoksidasi senyawa antrakuinon. Tidak
terjadinya perubahan warna pada uji Brontrager menunjukkan tidak adanya
antrakuinon pada ekstrak antrakuinon karena antrakuinon yang terdapat dalam
ekstrak kemungkinan sangat stabil atau turunan tereduksi dari tipe antranol
sehingga menyebabkan hasil negatif.
F. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total
1. Penentuan operating time
Penentuan operating time bertujuan untuk mendapatkan waktu dimana
reaksi antara sampel dan pereaksi berada pada kondisi optimum. Reaksi yang
optimum ditunjukkan dengan nilai absorbansi yang relatif stabil. Pada awal reaksi,
absorbansi senyawa yang berwarna akan terus meningkat hingga pada waktu
tertentu akan diperoleh absorbansi yang stabil. Tetapi, semakin lama waktu
pengukuran, ada kemungkinan senyawa berwarna tersebut akan mengalami
kerusakan sehingga menyebabkan intensitas warnanya menurun dan
absorbansinya juga menurun (Gandjar dan Rohman, 2007).
Penentuan OT dilakukan menggunakan asam galat sebagai senyawa
pembanding. Asam galat digunakan sebagai standar karena asam galat adalah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
salah satu senyawa fenolik dan memiliki aktivitas antioksidan (Fiuza et al., 2004).
Penentuan OT ini dilakukan dengan mereaksikan senyawa baku asam galat dan
reagen Folin-Ciocalteu. Hasil reaksi antara senyawa fenolik dengan pereaksi
Folin-Ciocalteu akan membentuk kompleks berwarna biru sehingga warna larutan
menjadi biru yang selanjutnya diukur dengan spektrofotometer visibel. Reaksi
dianggap optimal apabila absorbansi dari tiap selang waktu yang diukur telah
stabil. Absorbansi yang stabil terlihat dari makin kecilnya selisih absorbansi antar
selang waktu. Pengukuran OT dilakukan selama satu jam dengan waktu
pengamatan setiap 5 menit sekali.
Penentuan OT dilakukan pada 3 konsentrasi yang berbeda. Setiap
konsentrasi memberikan nilai absorbansi yang berbeda pada panjang gelombang
maksimum teoritis, sehingga ketiga konsentrasi tersebut akan mempresentasikan
OT pada masing – masing konsentrasinya. Konsentrasi yang digunakan yaitu 50
μg/mL, 100 μg/mL, dan 150 μg/mL.
Operating time dilakukan menggunakan panjang gelombang teoritis.
Panjang gelombang teoritis yang digunakan untuk menentukan operating time
dari reaksi penentuan fenolik total adalah 760 nm (Blainski et al., 2013).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
Gambar 12. Grafik penentuan operating time asam galat
Dari grafik (Gambar 12) terlihat pada menit ke 30 nilai absorbansi yang
didapat telah stabil, berarti reaksi sudah berjalan sempurna. Sehingga dapat
disimpulkan OT untuk pengukuran asam galat adalah 30 menit.
2. Penentuan panjang gelombang maksimum
Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan untuk mendapatkan
panjang gelombang serapan maksimum dari hasil reaksi antara asam galat dengan
reagen Folin-Cioucalteu yang akan digunakan untuk pengukuran absorbansi
pengujian kandungan fenolik total sampel. Pembacaan panjang gelombang
dilakukan dengan mereaksikan asam galat dan pereaksi Folin-Ciocalteu dan
didiamkan selama 30 menit.
Penentuan panjang gelombang serapan maksimum sangat penting dalam
sensitifitas suatu analisis dengan menggunakan spektrofotometer. Hal ini
dikarenakan pada panjang gelombang maksimum kepekaannya tinggi, sehingga
perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar
(Gandjar dan Rohman, 2007).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Ab
sorb
an
si
Waktu (menit)
50 µg/mL
100 µg/mL
150 µg/mL
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada 3
konsentrasi yang berbeda, yaitu konsentrasi tinggi, tengah, dan rendah. Setiap
konsentrasi akan memberikan nilai absorbansi yang berbeda pada panjang
gelombang maksimum, sehingga ketiga konsentrasi larutan asam galat, yaitu yaitu
50 μg/mL, 100 μg/mL, dan 150 μg/mL.
Penggunaan tiga konsentrasi tersebut diharapkan akan
mempresentasikan panjang gelombang maksimum pada masing – masing
konsentrasinya. Scanning panjang gelombang maksimum dilakukan pada rentang
panjang gelombang 600 nm – 800 nm, dimana menurut Blainskiet al. (2013)
panjang gelombang serapan maksimum untuk pereaksi Folin-Ciocalteu yang
direaksikan dengan senyawa fenolik adalah 760 nm.
Tabel II. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum asam
galat yang direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu
Konsentrasi
larutan asam galat
λ maksimum hasil
scanning (nm)
λ maksimum yang
digunakan
50 750
745 100 746
150 µg/mL 740
Dari hasil scanning pada tiga seri konsentrasi asam galat pada tabel,
didapatkan rata – rata panjang gelombang maksimum sebesar 745 nm. Panjang
gelombang tersebut yang digunakan untuk pengukuran absorbansi kurva baku
asam galat dan pengujian kandungan fenolik total sampel.
G. Penetapan Kandungan Fenolik Total
Potensi senyawa fenolik sebagai antioksidan disebabkan oleh
keberadaan gugus hidroksil dalam senyawa fenol. Gugus hidroksil berfungsi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
sebagai penyumbang atom hidrogen ketika bereaksi dengan senyawa radikal
melalui mekanisme transfer elektron sehingga proses oksidasi dapat terhambat.
Menurut Haci et al., (2009), prinsip reaksi pada metode Folin
Ciocalteu adalah ion fenolat akan mereduksi asam fosfomolibdat-fosfotungstat
dalam reagen Folin-Ciocalteu dalam suasana basa selama proses oksidasi fenol
menjadi senyawa kompleks molybdenum-tungsten berwarna biru.Ion fenolat
dibentuk melalui disosiasi proton dalam suasana basa yang didapatkan dari suatu
senyawa alkali. Senyawa alkali yang digunakan adalah natrium karbonat.
Semakin besar konsentrasi senyawa fenolik maka ion fenolat yang
terbentuk pun semakin banyak, sehingga semakin banyak ion fenolat yang
mereduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat yang menyebabkan warna biru yang
terbentuk semakin pekat, hal ini menyebabkan absorbansi yang terukur pun akan
semakin besar.
Kandungan fenolik total dalam ekstrak etanol buah buni yang
diperoleh ditetapkan sebagai massa ekivalen asam galat. Asam galat digunakan
sebagai sebagai senyawa pembanding karena asam galat merupakan asam
heteropoli yang mempunyai 3 gugus hidroksi fenolat. Gugus hidroksi fenolat
tersebut yang akan dioksidasi oleh reagen Folin-Ciocalteu dalam suasana basa.
Reagen Folin-Ciocalteu akan mengoksidasi asam galat pada gugus hidroksi
fenolatnya membentuk kompleks molybdenum-tungsten yang memiliki warna biru
(Alfian dan Susanti, 2012). Pada saat reaksi berlangsung terjadi reduksi ion
molybdenum (Mo6+
) menjadi Mo5+
yang menyebabkan perubahan warna larutan
kuning menjadi biru (Prior, 2005).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
Gambar 13. Reaksi asam galat dengan senyawa molybdenum dari reagen
Folin-Ciocalteu (Nunes, et al., 2012)
Pembuatan kurva baku ini dilakukan sebanyak tiga kali replikasi.
Kurva baku ini menghasilkan suatu persamaan regresi linier yang digunakan
dalam menentukan jumlah kandungan fenolik total dalam sampel. Tidak semua
persamaan regresi linier digunakan dalam menentukan kandungan fenolik total.
Menurut Gandjar dan Rohman (2007) persamaan regresi dengan linieritas terbaik
yaitu jika nilai r mendekati 1. Persamaan regresi linear terbaik akan digunakan
untuk menentukan kandungan fenolik total. Tabel III menunjukkan hasil
pengukuran absorbansi kurva baku asam galat.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
Tabel III. Hasil pengukuran absorbansi asam galat yang telah direaksikan
dengan reagen Folin-Ciocalteu pada λ 745 nm
Replikasi Konsentrasi
(µg/mL)
Absorbansi Persamaan regresi linear
1
50 0,268
y = 0,0050x + 0,0002
r = 0,9961
75 0.344
100 0,498
125 0,622
150 0,749
2
50 0,239
y = 0,0047x + 0,0040
r = 0,9989
75 0,369
100 0,475
125 0,585
150 0,724
3
50 0,232
y = 0,0048x – 0,0032
r = 0,9995
75 0,360
100 0,482
125 0,587
150 0,717
Gambar 14. Kuva baku asam galat dalam penetapan fenolik total (Replikasi 3)
Persamaan yang digunakan dalam menentukan kandungan fenolik
total adalah persamaan regresi dari replikasi ketiga, yaitu y = 0,0048x - 0,0032
dengan linieritas sebesar 0,9995. Nilai linieritas menunjukkan korelasi antara
y = 0.0048x - 0.0032
r = 0.9995
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150 200
Ab
sorb
an
si
Konsentrasi μg/mL
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
konsentrasi dan absorbansi yang dihasilkan. Semakin baik nilai linieritas (nilai R
sama dengan 1 atau mendekati 1) maka korelasi juga semakin baik.
Tabel IV. Hasil penentuan jumlah fenolik total ekstrak etanol buah buni
Absorbansi
Kandungan
fenolik total
(mg GAE/g)
Rata – rata
± SD (mg
GAE/g)
% CV
Replikasi 1 0,681 0,2849 0,2794 ±
0,0048 1,7180% Replikasi 2 0,661 0,2769
Replikasi 3 0,660 0,2764
Tabel IV menunjukkan hasil pengukuran sampel uji untuk penentuan
kandungan fenolik total. Absorbansi sampel yang diperoleh kemudian
dimasukkan ke dalam persamaan regresi linier yang telah didapatkan. Hasil
perhitungan menunjukkan bahwa ekstrak etanol buah buni memiliki nilai
kandungan fenolik total rata – rata sebesar 0,2794 ± 0,0048 mg ekivalen asam
galat gram ekstrak etanol buah buni.
Penelitian yang dilakukan oleh Butkhup dan Samappito (2011),
menunjukkan bahwa kadar fenolik total ekstrak metanol buah buni yang diperoleh
adalah sebesar 8,66 ± 1,14 mg ekivalen asam galat/gram, sedangkan hasil kadar
senyawa fenolik pada penelitian ini tergolong rendah. Hal ini karena jenis pelarut
yang digunakan dan cara ekstraksi yang berbeda.
Jenis pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah etanol 96 %,
etanol mempunyai sifat polar tetapi tidak lebih polar dibandingkan dengan
metanol. Menurut Boeing et al. (2014) solvasi etanol dalam melarutkan senyawa
fenolik yang berefek antioksidan lebih rendah daripada metanol karena etanol
mempunyai rantai C yang lebih panjang daripada metanol, sehingga senyawa
senyawa fenolik yang bersifat polar akan lebih terlarut pada metanol.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
Menurut Sari et al. (2013), lama waktu ekstraksi dapat mempengaruhi
kandungan senyawa fenolik yang ada dalam suatu tanaman. Waktu perendaman
buah buni yang terlalu lama dalam penelitian ini, dapat meningkatkan peluang
untuk terjadinya oksidasi senyawa fenolik sehingga kandungan total fenolik yang
terekstrak turun, dan kadar fenolik yang diperoleh kecil. Hal ini juga dibuktikan
pada penelitian yang dilakukan oleh Cooper-Driver dan Balick (1978) bahwa
bahan yang direndam dengan etanol selama 1 bulan masih mengandung senyawa
fenolik walaupun kadarnya rendah.
Menurut Blainski et al. (2013) reagen Folin-Ciocalteu mempunyai
kelemahan, yaitu sangat cepat terurai dalam larutan alkali sehingga dapat
menimbulkan endapan dan kekeruhan yang dapat menganggu pengukuran
absorbansi. Pengatasan kelemahan tersebut dalam penelitian ini adalah dengan
mengambil supernatan bagian atas untuk diukur dalam spektrofotometer.
Supernatan tersebut dianggap tidak mengandung endapan sehingga tidak
mengganggu dalam pengukuran.
H. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan
1. Penentuan Operating Time (OT)
Penentuan OT bertujuan untuk mendapatkan rentang waktu pengukuran
absorbansi yang tepat, dimana reaksi antara senyawa uji, dan senyawa
pembanding sudah mereduksi radikal bebas DPPH dengan sempurna sehingga
memberikan absorbansi yang stabil. Apabila nilai absorbansi stabil maka
pengukuran bisa reprodusibel dan meminimalkan kesalahan analisis. DPPH dapat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
memberikan serapan karena mempunyai gugus kromofor dan auksokrom, selain
itu juga adanya delokalisasi elektron sehingga menghasilkan warna ungu.
Pengukuran absorbansi dilakukan dengan mereaksikan larutan DPPH
dengan larutan rutin sebagai kontrol positif pada tiga konsentrasi yang berbeda
yaitu konsentrasi rendah, tengah, dan tinggi. Setiap konsentrasi akan memberikan
nilai absorbansi yang berbeda pada panjang gelombang maksimum, sehingga
ketiga konsentrasi tersebut akan mempresentasikan operating time pada masing –
masing konsentrasinya. Konsentrasi rutin yang digunakan yaitu 5 μg/mL,
15μg/mL, dan 25μg/mL.
Pengukuran OT dilakukan setiap 5 menit dalam jangka waktu 60 menit
menggunakan spektrofotometer visibel dengan panjang gelombang serapan
maksimum teoritis pada penelitian Dehpour et al. (2009) yaitu pada 517 nm.
Operating Time ditentukan berdasarkan waktu ketika nilai absorbansi mulai stabil
atau selisih nilai absorbansi tiap selang waktu mulai kecil.
Dari hasil yang ditampilkan grafik (Gambar 15) didapatkan operating time
rutin yaitu 30 menit. Hal ini ditunjukkan dengan absorbansi yang stabil pada
menit ke 30, yang berarti reaksi sudah berjalan sempurna setelah 30 menit.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
55
Gambar 15. Grafik penentuan OT rutin
2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λ maks)
Penentuan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk menentukan
panjang gelombang yang dapat memberikan absorbansi optimal dengan adanya
sedikit perubahan konsentrasi dari hasil reaksi antara radikal DPPH dengan
senyawa uji atau senyawa pembanding. Penentuan panjang gelombang serapan
maksimum dilakukan pada 3 konsentrasi DPPH yang berbeda yaitu 20 30
, dan 40 . Setiap konsentrasi akan memberikan nilai absorbansi yang
berbeda pada panjang gelombang serapan maksimum, sehingga ketiga konsentrasi
tersebut akan mempresentasikan panjang gelombang maksimum pada masing –
masing konsentrasinya. Scanning panjang gelombang maksimum dilakukan pada
rentang panjang gelombang 400 nm – 700 nm. Pemilihan rentang panjang
gelombang 400 nm – 700 nm didasarkan pada penelitian Dehpour et al. (2009),
bahwa panjang gelombang maksimum DPPH secara teoritis adalah 517 nm yang
masuk kedalam rentang tersebut. DPPH memiliki kromofor dan auksokrom pada
strukturnya, serta adanya delokalisasi elektron disekitar molekulnya, sehingga
0,4
0,45
0,5
0,55
0,6
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Ab
sorb
an
si
Waktu (menit)
5 µg/mL
15 µg/mL
25 µg/mL
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
menimbulkan warna ungu yang dapat diukur serapannya pada panjang gelombang
visibel.
Tabel V. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum DPPH
Konsentrasi
larutan DPPH
λ maksimum hasil
scanning (nm)
λ maksimum yang
digunakan
λ maksimum
teoritis
20 516
516 517 30 516
40 516
Panjang gelombang serapan maksimum yang didapatkan yaitu 516 (Tabel
V), sedangkan panjang gelombang serapan maksimum secara teoritisnya 517 nm.
Perbedaan panjang gelombang yang diperoleh dengan panjang gelombang secara
teoritis masih dapat diterima karena menurut Farmakope Indonesia edisi IV
(1995), pergeseran panjang gelombang yang diperbolehkan yaitu 2 nm dari batas
yang ditentukan.
I. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan
Pengujian aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah buni dilakukan dengan
metode penangkapan radikal bebas 2,2-difenil-1-pikrihidrazil (DPPH). Metode
DPPH merupakan salah satu metode yang paling sering digunakan untuk menguji
aktivitas antioksidan suatu tanaman. Prinsip metode DPPH adalah penangkapan
elektron bebas dari senyawa radikal yang menyebabkan berkurangnya intensitas
warna radikal DPPH dari warna ungu menjadi kuning (Dehpour et al., 2009).
Metode ini tidak spesifik untuk antioksidan jenis tertentu, tetapi dapat digunakan
untuk pengujian aktivitas antioksidan secara keseluruhan dalam sampel yang
dianalisis.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
57
Suatu senyawa dapat dikatakan memiliki aktivitas antioksidan jika mampu
mendonorkan elektronnya sehingga membuat DPPH menjadi stabil. Peristiwa
tersebut menyebabkan penurunan intensitas warna DPPH dari berwarna ungu
menjadi kuning, hal ini menandakan bahwa sifat DPPH sebagai radikal bebas
menurun atau bahkan hilang. Pada pengukuran dengan spektrofotometer visibel
nilai absorbansi yang terbaca adalah nilai warna ungu DPPH yang tersisa.
Menurut Molyneux (2004), penurunan warna DPPH ini diikuti juga oleh
penurunan absorbansi DPPH sehingga aktivitas antioksidan penangkapan radikal
dapat diketahui dengan menghitung rasio penurunan absorbansi DPPH. Makin
kuat suatu senyawa antioksidan yang ada dalam senyawa uji dapat menyebabkan
warna DPPH makin memudar.
Dalam penelitian ini menggunakan rutin sebagai kontrol positif karena
rutin merupakan senyawa golongan flavonoid yang telah diketahui mempunyai
aktivitas antioksidan.
Rutin memiliki gugus fenol didalam strukturnya yang bertanggung jawab
dalam aktivitas antioksidan dengan mereduksi DPPH sehingga terjadi penurunan
intensitas warna ungu menjadi kuning. Perubahan warna tersebut sebanding
dengan jumlah radikal bebas DPPH yang ditangkap oleh senyawa antioksidan.
Parameter pengukuran aktivitas antioksidan mengunakan DPPH adalah
IC50. Inhibitory concentration 50 adalah konsentrasi dari senyawa atau ekstrak
yang mempunyai aktivitas antioksidan yang dapat menghambat radikal bebas
(dalam penelitian ini DPPH) sebesar 50 % yang diperoleh dari suatu persamaan
regresi linear yang menyatakan hubungan antara konsentrasi senyawa atau ekstrak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
58
dengan %IC. Semakin kecil konsentrasi yang dapat menimbulkan IC50 maka
aktivitas antioksidan dari senyawa atau ekstrak tersebut semakin baik (Zou et al.,
2004).
Tabel VI. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan rutin dengan
metode DPPH
Replikasi Konsentrasi
( Absorbansi
kontrol
DPPH
Absorbansi
larutan
rutin
%IC
Persamaan
regresi
linear
1
29,4
0,535
0,403 24,6730
y = 0,8259x
+ 0,4674
r = 0,9990
39,2 0,361 32,5234
49 0,315 41,1215
58,8 0,268 49,9065
68,6 0,233 56,4486
2
30
0,501
0,365 27,1457
y = 0,6467x
+ 8,4231
r = 0,9963
40 0,324 35,3293
50 0,300 40,1198
60 0,260 48,1038
70 0,235 53,0938
3
30
0,514
0,373 27,4319
y = 0,7529x
+ 5,2335
r = 0,9993
40 0,332 35,4086
50 0,290 43,5798
60 0,255 50,3891
70 0,218 57,5875
Gambar 16. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan
rutin replikasi 3
y = 0.7529x + 5.2335
r = 0.9993
0
10
20
30
40
50
60
70
0 20 40 60 80
% I
C
Konsentrasi μg/mL
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
59
Tabel VII. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah buni
dengan metode DPPH
Replikasi Konsentrasi
( Absorbansi
kontrol
DPPH
Absorbansi
ekstrak etanol
buah buni
%IC
Persamaan
regresi
linear
1
600
0,577
0,403 20,1040
y = 0,0222x
+ 6,8271
r = 0,9980
1000 0,361 28,0763
1400 0,315 39,1611
1800 0,268 47,1404
2200 0,233 54,9393
2
600
0,605
0,504 16,6942
y = 0,0221x
+ 3,7190
r = 0,9992
1000 0,444 26,6116
1400 0,400 33,8843
1800 0,342 43,4711
2200 0,288 52,3967
3
599.76
0,590
0,480 18,6441
y = 0,0211x
+ 5,4739
r = 0,9987
999.6 0,423 26,6116
1399.44 0,371 33,8843
1799.28 0,330 43,4711
2199.12 0,284 52,3967
Gambar 17. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan ekstrak
etanol buah buni replikasi 2
Dari gambar 16 dan 17 dapat dilihat bahwa kurva persamaan regresi linear
rutin replikasi 3 dan ekstrak etanol buah buni replikasi 2 mempunyai nilai r paling
y = 0.0221x + 3.719
r = 0.9992
0
10
20
30
40
50
60
0 500 1000 1500 2000 2500
% I
C
Konsentrasi μg/mL
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
60
baik yaitu yaitu 0,9993 dan 0,9992. Menurut Gandjar dan Rohman (2007)
persamaan regresi dengan linieritas terbaik yaitu jika nilai r mendekati 1.
Dari tabel VI dan VII dapat dilihat bahwa konsentrasi rutin dan ekstrak
buah buni berbanding lurus dengan %IC. Hal ini dikarenakan semakin besar
konsentrasi rutin ataupun ektrak etanol buah buni maka semakin banyak pula
pendonor elektron yang mereduksi DPPH, sehingga warna DPPH menjadi
memudar. Pengukuran aktivitas antioksidan rutin dan ektrak etanol buah buni
dilakukan sebayak 3 kali replikasi.
Tabel VIII. Hasil IC50 rutin dan ekstrak etanol buah buni
Rutin
Replikasi IC50 ( Rata-rata ± SD ( % CV
1 59,9741
61,2413 ± 2,6536 4,3330 2 64,2909
3 59,4588
Ekstrak Etanol Buah Buni
Replikasi IC50 ( Rata-rata ± SD ( % CV
1 1944,7252
2049,7099 ± 91,2742 4,4530 2 2094,1629
3 2110,2417
Hasil pengukuran aktivitas antioksidan yang dinyatakan dalam nilai IC50
ditunjukkan pada tabel VIII. Rata-rata IC50 rutin adalah 61,2413 ± 2,6536 ,
hasil IC50 dalam penelitian ini berbeda jauh dengan penelitian yang dilakukan
oleh Sintayehu et al. (2012) dengan IC50 rutin sebesar 3,53 , Sedangkan
rata – rata IC50 ekstrak etanol buah buni adalah 2049,7099 ± 91,2742 ,
Penelitian yang dilakukan oleh Haripyaree et al. (2010) didapatkan IC50 ekstrak
metanol buah buni sebesar 100,08 , sedangkan hasil kadar antioksidan
pada penelitian ini tergolong kecil.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61
Perbedaan IC50 yang besar tersebut disebabkan perbedaan pelarut, dan cara
ekstraksi yang digunakan peneliti. Pada penelitian ini, peneliti menggunakan
etanol 96%, sehingga tidak semua fenolik yang bersifat polar tersari secara
sempurna. Etanol 96 % merupakan pelarut polar tetapi tidak lebih polar daripada
metanol. Menurut Boeing et al. (2014) solvasi etanol dalam melarutkan senyawa
fenolik yang berefek antioksidan lebih rendah daripada metanol, karena etanol
mempunyai rantai C yang lebih panjang daripada metanol, sehingga senyawa
senyawa fenolik yang bersifat polar akan lebih terlarut pada metanol. Jika kadar
senyawa fenolik yang diperoleh kecil maka dapat dimungkinkan kadar
antioksidan yang diperoleh juga kecil.
Perendaman yang terlalu lama menyebabkan buah buni kontak dengan
etanol terlalu lama. Menurut Maslukhah et al. (2016) terlalu lama kontak dengan
pelarut dapat berdampak negatif pada ekstrak yang dihasilkan. Waktu paparan
dengan pelarut yang terlalu lama menyebabkan paparan oksigen lebih banyak,
sehingga meningkatkan peluang terjadinya oksidasi senyawa fenolik. Waktu
ekstraksi yang berlebihan, tidak dapat mengekstrak komponen fenolik lebih
banyak, hal ini telah dijelaskan dalam hukum kedua difusi yaitu bahwa
kesetimbangan akhir akan dicapai antara konsentrasi zat terlarut dalam matriks
tanaman dan pelarutnya setelah waktu tertentu. Hal ini menyebabkan fenolik yang
terekstrak menjadi turun, sehingga kadar antioksidan yang dihasilkan pun juga
kecil.
Terdapat perbedaan besar antara IC50 rutin dan ekstrak etanol buah buni,
nilai IC50 rutin lebih rendah daripada ekstrak etanol buah buni. Menurut Fidrianny
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
62
et al. (2014) kekuatan antioksidan dapat digolongkan menjadi 4, yaitu sangat kuat,
kuat, sedang, dan lemah. Dalam penelitian ini hasil yang didapatkan yaitu rutin
memiliki daya antioksidan yang kuat sedangkan ekstrak etanol buah buni
memiliki daya antioksidan yang lemah.
Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan rutin lebih besar
daripada ekstrak etanol buah buni. Terdapat korelasi antara kandungan fenolik
total dengan aktivitas antioksidan (IC50), semakin banyak senyawa fenolik yang
terdapat dalam suatu ekstrak maka aktivitas antioksidan semakin tinggi (IC50
semakin kecil) (Sivaci dan Duman, 2014).
Uji statistik dilakukan setelah mendapatkan nilai IC50, hal ini untuk
menguji kebermaknaan nilai IC50 rutin dan ekstrak etanol buah buni. Uji statistik
dilakukan menggunakan software R seri i386 3.2.4. Pertama, dilakukan uji
normalitas data untuk melihat apakah data terdistribusi secara normal atau tidak.
Jumlah data yang dimiliki oleh peneliti kurang dari 50, maka digunakan uji
normalitas Shapiro-Wilk (Dahlan, 2012).
Hasil uji statistik yang didapatkan yaitu, nilai p-value IC50 rutin adalah
0,1857 sedangakan p-value IC50 ekstrak etanol buah buni adalah 0,1684. Nilai p-
value rutin dan ekstrak etanol buah buni lebih besar dari 0,05 (taraf kepercayaan
95%), hal ini menandakan bahwa nilai signifikansi yang dihasilkan lebih besar
daripada nilai signifikansi yang telah ditentukan, sehingga nilai IC50 rutin dan
ekstrak etanol buah buni terdistribusi secara normal.
Uji yang kedua yaitu uji variansi data yang bertujuan untuk mengetahui
apakah dua kelompok data atau lebih mempunyai variansi yang sama atau tidak.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
63
Hasil yang didapatkan untuk uji variansi ini adalah p-value = 0,001689. Nilai p
yang didapatkan < 0,05 (taraf kepercayaan 95%) sehingga dapat disimpulkan
bahwa IC50 rutin dan ekstrak etanol buah buni mempunyai variansi data yang
tidak homogen.
Uji yang ketiga adalah uji parametrik yaitu uji t tidak berpasangan, hal ini
bertujuan untuk menguji perbedaan antara dua kelompok data dengan objek yang
berbeda yaitu kontrol negatif dan ekstrak etanol buah buni, dilihat dari perbedaan
rata – ratanya IC50. Hasil pengujian statistik diperoleh nilai p-value sebesar 6,4695
x 10-3
. Nilai p-value tersebut menunjukkan bahwa ekstrak etanol buah buni
berbeda bermakna bermakna dengan kontrol negatif. Hal ini menunjukkan bahwa
ekstrak etanol buah buni mempunyai aktivitas antioksidan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
64
BAB V
KESIMPULAN
A. Kesimpulan
1. Kandungan fenolik total ekstrak etanol buah buni sebesar 0,2794 ±
0,0048 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak etanol buah buni.
2. Nilai aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah buni menggunakan
metode DPPH yang dinyatakan sebagai IC50 sebesar 2049,7099 ±
91,2742 μg/mL.
B. Saran
1. Perlu dilakukan optimasi lama waktu metode ekstraksi dengan maserasi
terhadap kandungan senyawa fenolik pada buah buni.
2. Perlu dilakukan identifikasi semua kandungan senyawa spesifik yang
berefek sebagai antioksidan pada buah buni.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
65
DAFTAR PUSTAKA
Agoes, G., 2009, Serial Farmasi Industri – 2 : Teknologi Bahan Alam, edisi
revisi, Penerbit ITB, Bandung, hal.31-32.
Alfian, R., Susanti, H., 2012, Penetapan Kadar Fenolik Total Ekstrak Metanol
Kelopak Bunga Rosella Merah (Hibiscus sabdariffa Linn) Dengan Variasi
Tempat Tumbuh Secara Spektrofotometri, Jurnal Ilmiah Kefarmasian, 2
(1), 73-80..
Ardhie, A.M., 2011, Radikal Bebas dan Peran Antioksidan Dalam Mencegah
Penuaan, Medicinus, 24 (1), 5.
Badarinath, A.V., Rao, K.M., Chetty, C.M.S., Ramkanth, S., Rajan, T.V.S.,
Gnanaprakash, K., 2010, A Review on In-vitro Antioxidant Methods :
Comparisions, Correlations and Considerations, International Journal of
PharTech Research, 2 (2), 1276-1285.
Budiarto, E., 2002, Biostatistika untuk Kedokteran dan Kesehatan Masyarakat,
Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, hal. 95.
Butkhup, L., Samappito, S., 2008, Analysis of Anthocyanin, Flavonoids, and
Phenolic Acid in Tropical Bignay Berries, International Journal of Fruit
Science, 8(1), 15–34.iradical and Antimicrobial Capacities, Journal of
Food Biochemistry, 35, 1671-1679.
Butkhup, L., Samappito, S., 2011, Phenolic Constituents of Extract From Mao
Luang Seeds and Skin-Pulp Residue and Its Antiradical and Antimicrobial
Capacities, Journal of Food Biochemistry,35, 1671-1679.
Butkhup, L., Samappito, S., 2011, Phenolic Constituents of Extract from Mao
Luang Seeds and Skin-Pulp Residue ands Its Antiradical and
Antimicrobial Capacities, Journal of Food Biochemistry, 35 (2011), 1671-
1679.
Blainski, A., Lopes, G.C., de Mello, J.C.P., 2013, Application and Analysis of the
Folin Ciocalteu Method for the Determination of the Total Phenolic
Content from Limonium brasiliense L, Molecules, 18 : 6852-6865.
Boeing, J.S., Barizao, E.O., Silva, B.C.E., Montanher, P.F., Almeida, V.D.C.,
Visentainer, J.V., 2014, Evaluation of Solvent Effect on the Extraction of
Phenolic Compounds and Antioxidant Capacities from the Berries :
Application of Principal Component Analysis, Chemistry Central Journal,
8 (48), 1-9.
Chawda, H.S., 2011, Prospective Study of Antioxidants, Its Mechanism and
Potential Role in Cancer, International Journal of Research in
Pharmaceutical and Biomedical Science, 2 (3), 888-894.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
66
Cindrić I.J., Kunštic M., Zeiner M., Stingeder G., Rusak G., 2011, Sample
Preparation Methods for the Determination of the Antioxidative Capacity
of Apple Juices, Croat. Chem. Acta, 84 (3), 435-438.
Cooper-Driver, G.A., Balick, M.J., 1978, Effects of Fields Preservation on The
Flavonoid Content of Jessenia Bataua, Botanical Museum Leaflets
Harvard University, 26 (8), 257-265.
Dahlan, 2012, Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan, Salemba Medika,
Jakarta, hal.17.
Dai, J., Mumper, J., 2010, Plant Phenolics : Extraction, Analysis and Their
Antioxidant and Anticancer Properties, Molecules, 15, 7313-7352.
Damayanthi, E., Kustiyah, L., Khalid, M., Farizal, H., 2010, Aktivitas
Antioksidan Bekatul Lebih Tinggi Daripada Jus Tomat dan Penurunan
Aktivitas Antioksidan Serum Setelah Intervensi Minuman Kaya
Antioksidan, Journal of Nutrition and Food, 5(3) : 205-210.
Dehpour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Fazel, N.S., Mohamad, N.S., 2009,
Antioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula Assafoetida and Its
Essential Oil Composition, Grasas Aceites, 60(4), 405-412.
Depkes RI, 1995, Farmakope Indonesia, edisi 4, Departemen Kesehatan Republik
Indonesia, Jakarta, hal. 1006, 1036, 1066.
Depkes RI, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat,
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 10-11.
Doss, A.V., Thangavel, K.P., 2011, Antioxidant and Antimicrobial Activity Using
Different Extracts of Anacardium Occidentale L., International Journal of
Applied Biology and Pharmaceutical Technoloy, 2, 436-443.
Dos Santos, S, X., Mazo, L.H., Cavalheiro, E.T., 2008, The Use Of a Graphite-
Silicone Rubber Composite Electrode in The Determination of Rutin in
Pharmaceutical Formulation, J. Braz, Chem, Soc., 19 (8) : 1601.
Droge, W., 2002, Free Radicals in the Physiological Control, Physiol Rev.,82, 48-
94.
Fessenden, R. J., Fessenden, J.S., 1982, Kimia Organik, Edisi Ketiga, jilid 2,
Jakarta, Erlangga, pp. 436 – 437.
Fidrianny, I., Darmawati, A., Sukrasno, 2014, Antioxidant Capacities From
Different Polarities Extracts of Cucurbitaceae Leaves Using FRAP, DPPH
Assays and Corelation With Phenolic, Flavonoid, Carotenoid Content,
International Journal of Pharmachy and Pharmaceutical Science, 6 (2),
852-862.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
67
Fiuza, et al., 2004, Phenolic Acid Derivates With Potential Anticancer Properties
a Structure Activity Relationship Study. Part 1 : Methyl, Propyl, and Octyl
Esters of Caffeic and Gallic Acids, Bioorganic and Medicinall
Chemistry,12, 3581-3589.
Fu, L., Xu, B.T., Gan, R.Y., Zhang, Y., Xu, X.R., Xia, E. Q., Li, H., B., 2011,
Total Phenolic Contents and Antioxidant Capacities of Herbal and Tea
Infusion, Int. J. Mol. Sci., 12, 2112-2124.
Gandjar, I. G., Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,
Yogyakarta, pp. 253 – 254, 353-360.
Gulcin, I., Uguz, M.T., Oktay, M., Beydemir, S., Kufrevioglu, O.I., 2004,
Evaluation of the Antioxidant and Antimirobial Activities of Clary Sage
(Salvia sclarea L.), Turk. J. Agric. For., 28, 25-33.
Gupta, V. K., Sharma, S. K., 2006, Plants as Natural Antioxidant, Natural
Product Radiance, Vol. 5(4) : 326-334.
Haci, I.A.E., Didi, A., Bekkara, F.A., Gherib, M., 2009, In Vitro Antioxidant
Activity and Total Phenolic Contents in Methanol Crude Extracts From
The Algerian Medicinal Plant Limoniastrum feei, Scientific Study and
Research, X(4), 329-336.
Handa, S.S., Khanuja, S. P. S., Longo, G., Rakesh, D.D, 2008, Extraction
Technologies for Medicinal and Aromatic Plants, International Centre For
Science And High Technology, Trieste, pp. 22 – 23.
Hariana, A., 2013, 262 Tumbuhan Obat dan Khasiatnya, edisi revisi, Penerbit
Swadaya, Jakarta, pp.79.
Haryanto, S., 2009, Ensiklopedi Tanaman Obat Indonesia, Palmall, Yogyakarta,
pp. 109-111.
Hayati, E.K. Halimah, N., 2010, Phytochemical Test and Brine Shrimp Lethality
Test Against Artemia salina Leach of Anting – Anting (Acalypha indica
Linn.) Plant Extract, ALCHEMY, 1 (2), 53-103.
Kardinan, A., 2005, Tanaman Penghasil Minyak Atsiri, Agromedia, Jakarta,
hal.1-2.
Kassem, M. E. S., Hashim, A. N., Hassanein, H. M., 2013, Bioactivity of
Antidesma bunius Leaves (Euphorbiaceae) and Their Major Phenolic
Constituents, European Scientific Journal, 9 (18), 217-228.
Khoddami, A., Wilkes, M.A., Roberts, T.H., 2013, Techniques for Analysis of
Plant Phenolic Compounds, Molecules, 18 : 2328-2375.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
68
Koleva, I.I., van Beek, T.A., Linssen, J.P.H., de Groot, A., Evstatieva, L.N., 2002,
Screening of Plant Extracts For Antioxidant Activity : A Comparative
Study on Three Testing Methods, Phytochemical Analysis, Vol. 13, 8-17.
Kovacs, et al., 1993, Process For The Complex Processing And Preservation of
Alimentary Plants, Particulary Seasonal Alimentary Plants, United States
Patent, 1-12.
List, P.H., Schmidt, P.C., 2000, Phytopharmaceutical Technology, CRC Press,
USA, pp.107,109.
Lizardo, R.C.M., Mabesa, L.B., Dizon, E.I., Aquino, N.A., 2015, Functional and
antimicrobial properties of bignay [Antidesma bunius (L.) Spreng],
International Food Research Journal 22 (1), 88-95.
Lopez, M., Martinez, F., Del-Valle, C., Ferrit, M., Luque, R., 2003, Study of
Phenolic Compounds as Natural Antioxidants by a Fluorescence Method,
J.Talanta, 60, 610-612.
Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, ITB, Bandung, hal.15.
Marliana, S.D., Suryanti, V., Suyono, 2005, Skrining Fitokimia dan Analisis
Kromatografi Lapis Tipis Komponen Kimia Buah Labu Siam (Sechium
edule Jacq. Swartz.) dalam Ekstrak Etanol, Biofarmasi, 3 (1), 26-31.
Maslukhah, Y.,L., Widyaningsih, T.D., Waziiroh, E., Wijayanti, N., Sriherfyna,
F.H., 2016, Faktor Pengaruh Ekstraksi Cincau Hitam (Mesona palustris
BL) Skala Pilot Plant : Kajian Pustaka, Jurnal Pangan dan Agroindustri, 4
(1), 245-252.
Maulida, R., Guntarti, A., 2015, Pengaruh Ukuran Partikel Beras Hitam (Oryza
sativa L.) Terhadap Rendemen Ekstrak dan Kandungan Total Antosianin,
Pharmaciana, 5 (1), 9-16.
Micor, J.R.L., Deocaris, C.C. Mojica, E.R.E, 2005, Biological Activity of Bignay
(Antidesma bunius (L.) Spreng) Crude Extract in Artemia Salina, J. Med.
Sci., 5 (3), 195 – 198.
Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl
(DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin
J.Sci.Technol, 26 (2), 211-219.
Moniruzzaman, M., Khalil, M.I., Sulaiman, S.A., Gan, S.H., 2012, Advances in
the Analytical Methods For Determining the Antioxidant Properties of
Honey : A Review, Afr J Tradit Complement Altern Med., 9 (1), 36-42.
Nafisah, M., Tukiran, Suyatno, Hidayati, N., 2014, Phytochemical Screening Test
On Hexan, Chloroform and Methanol Extracts of Patikan Kebo
(Euphorbiae hirtae), Prosiding Seminar Nasional Kimia, hal.279-286.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
69
Nunes, X.P., et al., 2012, Biological Oxidation and Antioxidant Activity of
Natural Products, University Federal Sao Fransisco, Brazil, pp. 1-20.
Orwa, C., Mutua, A., Kindt, R., Jamnadass, R., Anthony, S., 2009, Agroforestry
Database 4.0: Antidesma bunius,
http://www.worldagroforestry.org/treedb/AFTPDFS/Antidesma_bunius.P
DF, diakses pada tanggal 29 Mei 2016.
Padmasari, P.D., Astuti, K.W., Warditiani, N.K., 2013, Skrining Fitokimia
Ekstrak Etanol 70% Rimpang Bangle (Zingiber purpureum Roxb.), Jurnal
Farmasi Udayana, hal.1-7.
Putri, N.K., Gunawan, I.,W.,G., 2015, Aktivitas Antioksidan Antosianin Dalam
Ekstrak Etanol Kulit Buah Naga Super Merah (Hylocereus costaricensis)
Dan Analisis Kadar Totalnya, Jurnal Kimia, 9 (2), 243-251.
Pallipane, K.B., Rolle, R., 2008, Good Practice For Assuring The Post-Harvest
Quality Of Exotic Tree Fruit Crops Produced In Jamaica, FAO, Rome,
pp. 12.
Pengelly, A., 2006, The Constituents of Medicinal Plants : An Introduction To
The Chemistry and Theraputics of Herbal Medicines, 2nd
edition, Allen &
Unwin, Australia, pp.15-25.
Prakash, A., Rigelhof, F., Miller, E., 2001, Antioxidant Activity, Medallion
Laboratories-Analytical Progress, 19(2), 1-4.
Prior, R.L., Wu, X., Schaich, K., 2005, Standardized Methods for the
Determination of Antioxidant Capacity and Phenolics in Foods and
Dietary Supplements, J. Agric. Food Chem., 53, 4290-4302.
Proestos, C., Sereli, D., Komaitis, M., 2006, Determination of Phenolic
Compounds in Aromatic Plants by RP-HPLC and GC-MS, Food
Chemistry, 95, 44-52.
Puspitasari, L., Swastini, D.A., Arisanti, C.I.A., 2013, Skrining Fitokimia Ekstrak
Etanol 95% Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.), Jurnal
Farmasi Udayana,, hal.1-5.
Putri, N.K.M., Gunawan, I.W.G, Suarsa, I.W., 2015, Aktivitas Antioksidan
Antioksidan Dalam Ekstrak Etanol Kulit Buah Naga Super Merah
(Hylocereus costaricensis) Dan Analisis Kadar Totalnya, Jurnal Kimia, 9
(2), 243-251).
Rahardjo, M., Darwati, I., Shusena, A., 2006, Produksi Dan Mutu Simplisia
Purwoceng Berdasarkan Lingkungan Tumbuh Dan Umur Tanaman, Jurnal
Bahan Alam Indonesia, 5,310 – 316.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
70
Rakasiwi, B.L., Soegihardjo, 2014, Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol
Daging Buah Buni (Antidesma bunius (L.) Spreng) Terhadap
Staphylococcus aureus ATCC 25922 dan Escherichia coli ATCC 25923,
Journal Farmasi Sains dan Komunitas, 11 (1), 23-31.
Sangi, M., Runtuwene, M.R.J., Simbala, H.E.I., Makang, V.M.A., 2008, Analisis
Fitokimia Tumbuhan Obat Di Kabupaten Minahasa Utara, Chem. Prog.,
1(1), 47-53.
Sari, D.K., Wardhani, D.H., Prasetyaningrum, A., 2013, Kajian Isolasi Senyawa
Fenolik Rumput Laut Euceuma Cottonii Berbantu Gelombang Micro
Dengan Variasi Suhu dan Waktu, Jurnal Teknik Kimia, 3 (19), 38-43.
Savatovis, S.M., Cetkovic, G.S., Canadonovic-Brunet, J.M., Djilas, S.M., 2012,
Kinetic behavior of the DPPH radical-scavenging activity of tomato waste
extracts, J. Serb. Chem. Soc., 77(0), 1-12.
Schirmer, R.E., 1990, Modern Methods of Pharmaceutical Analysis, 2nd
Edition,Volume III, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida.
Sing, Y.Y., 2007, Determination of Synthetic Phenolic Antioxidant in Food Item
Using HPLC and Total Antioxidants Using Fia Approaches, Thesis, 3-5,
Universiti Sains Malaysia, Penang.
Sintayehu, B., Asres, K., Raghavendra, Y., 2012, Radical Scavenging Activities
of the Leaf extracts and a Flavonoid Glycoside Isolated fromCineraria
abyssinica Sch. Bip. Exa. Rich, Journal of Applied Science, 2 (4), 44-49.
Sivaci, A.,Duman, S., 2014, Evaluation of Seasonal Antioxidant Activity and
Total Phenolic Compounds in Stems and Leaves of Some Almond (Prunus
amygdalus L.) Varieties, Biological Research, 47 (9), 1-5.
Sochor, J., Zitka, O., Skutkova, H., Pavlik, D., Babula, P., Krska, B., Horna, A.,
Adam, V., Provaznik, I., Kizek, R., 2010, Content of Phenolic Compounds
and Antioxidant Capacity in Fruits of Apricot Genotypes, Molecules,
15(9) : 6285-6305.
Tanjung, B.LM., Utami, F.H., 2008, Pengaruh pH dan Kecepatan Pengadukan
Pada Ekstraksi Protein dari Tulang Ayam dengan Solvent Larutan NaOH,
Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknik, Universitas Diponegoro,
Semarang, hal.1-8.
Taroreh, M., Raharjo, S., Hastuti, P., Murdiati, A., 2015, Ekstraksi Daun Gedi
(Abelmoschus manihot L) Secara Sekuensial Dan Aktivitas
Antioksidannya, AGRITECH, 35 (3), 280-287.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
71
Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., Kaur, H., 2011, Phytochemical
screening and Extraction : A review, International Pharmaceutica
Sciencia, 1 (1), 98-106.
United States Departemet of Agriculture, 2014, Antidesma bunius (L.) Spreng,
http:// plants. usda. gov/ core / profile ? symbol = ANBU3, diakses pada
tanggal 24 Januari 2016.
Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T. D., Mazur, M., Telser, J.,
2007, Free Radicals and Antioxidants in Normal Physiological Functions
and Human Disease, The International Journal of Biochemistry & Cell
Biology, 39 : 44–84.
Van Steenis C.G.E., 1992, Flora : untuk sekolah di Indonesia, Cetakan keenam,
PT Pradnya Paraminta, Jakarta, hal. 35-259.
Vermerris, W., Nicholson, R., 2008, Phenolic Compound Biochemistry, Springer,
USA, pp. 1-2.
Wagner, K.M., 2013, Like Dissolves Like, Princeton University Chemistry
Department, pp. 1-5.
Watson, D. G., 2010, Analisis Farmasi : Buku Ajar Untuk Mahasiswa Farmasi
Dan Praktisi Kimia Farmasi, Edisi 2, EGC, Jakarta, pp. 105.
Williamson, E.M., David, T.T., &Fred., 1996, Selection, Preparation and
Pharmacological Evaluation of Plant Material, Wiley & Sons Ltd,
England, pp. 16-17.
Zou, Y., Lu, Y., Wei, D., 2004, Antioxidant Activity of a Flavonoid- Rich Extract
of Hypericum perforatum L. In Vitro, Journal of Agricultural and Food
Chemistry,52, 5032-5039.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
72
LAMPIRAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
73
Lampiran 1. Surat determinasi tanaman
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
74
Lampiran 2. Gambar tanaman buah buni di taman Kampus III Universitas Sanata
Dharma, Yogyakarta.
Lampiran 3. Ekstrak etanol buah buni
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
75
Lampiran 4. Foto hasil uji saponin
Lampiran 5. Foto hasil uji flavonoid
A B
Keterangan :
A. Blanko sampel
B. Sampel setelah digojog
Keterangan :
A. Blanko sampel
B. Sampel + logam Mg + HCl
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
76
Lampiran 6. Foto hasil uji triterpenoid dan steroid
Blanko Sampel Sampel + Liebermann Burchard
Lampiran 7. Uji minyak atsiri
Larutan ekstrak etanol buah buni Larutan ekstrak etanol buah
buni setelah diuapkan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
77
Lampiran 8. Foto uji alkaloid
A B C
Lampiran 9. Foto uji tannin dan polifenol
A B C
Keterangan :
A. Blanko sampel
B. Sampel + pereaksi Mayer
C. Sampel + pereaksi
Dragendroff
Keterangan :
A. Blanko sampel
B. Sampel + FeCl310 %
C. Sampel + Gelatin 1 %
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
78
Lampiran 10. Foto uji antosianin
A B C
Lampiran 11. Foto uji antrakuinon
Keterangan :
A. Blanko sampel
B. Sampel + HCl 2 M
C. Sampel + NaOH 2 M
Keterangan uji antrakuinon dengan
metode Brontrager :
A. Blanko sampel
B. Sampel + benzena + amonia
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
79
Keterangan uji antrakuinon dengan
metode Brontrager termodifikasi :
A. Blanko sampel
B. Sampel + KOH + H2O2 + benzena +
ammonia
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
80
Lampiran 12. Perhitungan rendemen ekstrak etanol buah buni
Bobot buah buni yang digunakan adalah 1000 gram
Total berat ekstrak etanol buah buni = 138,41 g
Rendemen ekstrak etanol buah buni =
=
= 13,841 %
Lampiran 13. Data penimbangan untuk penetapan kadar fenolik total
a. Data penimbangan asam galat
Replikasi
1 (g)
Replikasi
2 (g)
Replikasi
3 (g)
Berat kertas 0,2435 0,2403 0,2478
Berat kertas + asam
galat
0,2685 0,2655 0,2732
Berat kertas + sisa 0,2436 0,2405 0,2482
Berat asam galat 0,0249 0,0250 0,0250
b. Data penimbangan Natrium karbonat
Replikasi
1 (g)
Replikasi
2 (g)
Replikasi
3 (g)
Berat kertas 0,2466 0,2440 0,2408
Berat kertas +
Natrium karbonat
2,3683 2,3660 2,3628
Berat kertas + sisa 0,2468 0,2444 0,2409
Berat Natrium
karbonat
2,1215 2,1216 2,1219
c. Data penimbangan ekstrak etanol buah buni
Replikasi
1 (g)
Replikasi
2 (g)
Replikasi
3 (g)
Berat gelas arloji 33,3512 32,8026 32,5339
Berat gelas arloji +
ekstrak
33,6012 33,0526 32,7841
Berat gelas arloji +
sisa
33,3515 32,8027 32,5341
Berat ekstrak 0,2497 0,2499 0,2500
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
81
Lampiran 14. Data optimasi penetapan kandungan fenolik total
a. Penentuan operating time (OT) asam galat
Waktu
(menit)
Absorbansi
konsentrasi
50 µg/mL
Absorbansi
konsentrasi
100 µg/mL
Absorbansi
konsentrasi
150 µg/mL
5 0,265 0,423 0,684
10 0,280 0,448 0,713
15 0,287 0,454 0,733
20 0,285 0,461 0,741
25 0,288 0,466 0,748
30 0,288 0,470 0,753
35 0,288 0,472 0,756
40 0,289 0,473 0,759
45 0,289 0,473 0,761
50 0,289 0,473 0,762
55 0,289 0,473 0,763
60 0,287 0,472 0,763
1. Spektrum asam galat konsentrasi 50 µg/mL
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
82
2. Spektrum asam galat konsentrasi 100 µg/mL
3. Spektrum asam galat konsentrasi 150 µg/mL
OT yang diperoleh 30 menit
b. Penentuan λ maksimum asam galat
Konsentrasi seri asam
galat
Absorbansi λ maksimum
(nm)
50 0,264 750
100 0,501 746
150 0,778 740
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
83
1. Spektrum λ maksimum asam galat konsentrasi seri asam galat 50
2. Spektrum λ maksimum asam galat konsentrasi seri asam galat 100
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
84
3. Spektrum λ maksimum asam galat konsentrasi seri asam galat 150
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
85
Lampiran 15. Data penetapan kandungan fenolik total
a. Konsentrasi asam galat
1. Konsentrasi larutan stok asam galat
Replikasi 1
498
Replikasi 2
500
Replikasi 3
500
2. Konsentrasi seri larutan asam galat
Contoh perhitungan konsentrasi seri larutan asam galat replikasi 3 :
Seri 1
C1.VI = C2.V2
500 µg/mL.0,5 mL = C2.10 mL
C2 = 50 µg/mL
Seri 2
C1.V1 = C2.V2
500 µg/mL.0,75 mL = C2.10 mL
C2 = 75 µg/mL
Seri 3
C1.V1 = C2.V2
500 µg/mL.1 mL = C2.10 mL
C2 = 100 µg/mL
Seri 4
C1.V1 = C2.V2
500 µg/mL.1,25 mL = C2.10 mL
C2 = 125 µg/mL
Seri 5
C1.V1 = C2.V2
500 µg/mL.1,5 mL = C2.10 mL
C2 = 150 µg/mL
Perhitungan konsentrasi seri larutan asam galat :
Replikasi C1 (µg/mL) V1 (mL) C2 (µg/mL) V2 (mL)
1
498 1 49,8 10
498 1,5 74,7 10
498 2 99,6 10
498 2,5 124,5 10
498 3 149,4 10
2
500 1 50 10
500 1,5 75 10
500 2 100 10
500 2,5 125 10
500 3 150 10
3
500 1 50 10
500 1,5 75 10
500 2 100 10
500 2,5 125 10
500 3 150 10
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
86
Kurva baku asam galat
Replikasi Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi Persamaan regresi
linear
1
50 0,268
y = 0,0050x + 0,0002
r = 0,9961
75 0.344
100 0,498
125 0,622
150 0,749
2
50 0,239
y = 0,0047x + 0,0040
r = 0,9989
75 0,369
100 0,475
125 0,585
150 0,724
3
50 0,232
y = 0,0048x – 0,0032
r = 0,9995
75 0,360
100 0,482
125 0,587
150 0,717
b. Konsentrasi Natrium karbonat
Konsentrasi larutan Natrium karbonat 1 M
Molaritas = 1 M x 0,02 L
= 0,02 mol
Massa yang ditimbang = mol x Mr
= 0,02 mol x 106
= 2,12 gram
Replikasi 1
106075
Replikasi 2
106080
Replikasi 3
106095
Persamaan regresi linear yang digunakan adalah y = 0,0048x – 0,0032
c. Penetapan kandungan fenolik total larutan uji
1. Konsentrasi ekstrak etanol buah buni
Konsentrasi stok
Replikasi 1
25010
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
87
Replikasi 2
24990
Replikasi 3
25000
Konsentrasi intermediet
Replikasi 1
C1 . V1 = C2 . V2
.3,6 mL = C2.10 mL
C2 = 9003,6
Replikasi 2
C1 . V1 = C2 . V2
.3,6mL= C2.10 mL
C2 = 8996,4
Replikasi 3
C1 . V1 = C2 . V2
.3,6 mL = C2 . 10 mL
C2 = 9000
Konsentrasi larutan seri Replikasi 1
C1 . V1 = C2 . V2
.2,5 mL = C2.5 mL
C2 = 4501,8
Replikasi 2
C1 . V2 = C2 . V2
. 2,5 mL = C2.5 mL
C2 = 4498,2
Replikasi 3
C1 . V1 = C2 . V2
. 2,5 mL = C2 . 5 mL
C2 = 4500
2. Absorbansi ekstrak etanol buah buni
Replikasi Absorbansi
1 0,681
2 0,661
3 0,660
3. Konsentrasi ekstrak etanol buah buni
Replikasi 1
Persamaan regresi linear
y = 0,0048x – 0,0032
0,681 = 0,0048x – 0,0032
x = 142,5417
Replikasi 2
Persamaan regresi linear
y = 0,0048x – 0,0032
0,661= 0,0048x – 0,0032
x = 138,3750
Replikasi 3
Persamaan regresi linear
y = 0,0048x – 0,0032
0,660 = 0,0048x – 0,0032
x = 138,1667
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
88
4. Kandungan fenolik total ekstrak etanol buah buni
Kandungan fenolik total = konsentrasi ekstrak etanol .
Replikasi 1
Kandungan fenolik total = 0,1425 mg/mL .
= 0,2849 mg ekivalen asam galat per gram
ekstrak
Replikasi 2
Kandungan fenolik total = 0,1384 mg/mL .
= 0,2769 mg ekivalen asam galat per gram
ekstrak
Replikasi 3
Kandungan fenolik total = 0,1382 mg/mL .
= 0,2764 mg ekivalen asam galat per gram
ekstrak
Replikasi x
(mg/mL)
volume
(mL)
massa
(g)
Kandungan
fenolik total
x± SD %CV
(mg
ekivalen
asam galat
per gram
ekstrak
etanol buah
buni)
1 4501,8 0,5 0,2501 0,2849 0,2794
±
0,0048
1,718
0% 2 4498,2 0,5 0,2499 0,2769
3 4500 0,5 0,2500 0,2764
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
89
Lampiran 16. Data penimbangan untuk pengujian aktivitas antioksidan
a. Penimbangan DPPH
Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)
Berat kertas 0,2412 0,2435 0,2480
Berat kertas +
DPPH
0,2464 0,2486 0,2534
Berat kertas + sisa 0,2414 0,2436 0,2484
Berat DPPH 0,0050 0,0050 0,0050
b. Penimbangan rutin
Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)
Berat kertas 0,2516 0,2362 0,2421
Berat kertas + rutin 0,2566 0,2415 0,2472
Berat kertas + sisa 0,2517 0,2365 0,2422
Berat rutin 0,0049 0,0050 0,0050
c. Data penimbangan ekstrak etanol buah buni
Replikasi 1
(g)
Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)
Berat gelas arloji 32, 5350 33,3522 32,5349
Berat gelas arloji +
ekstrak
32,7851 33,6026 32,7850
Berat gelas arloji +
sisa
32,5351 33,3526 32,5351
Berat ekstrak 0,2500 0,2500 0,2499
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
90
Lampiran 17. Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding dan
larutan uji
a. Konsentrasi DPPH
1. Konsentrasi stok
Replikasi 1
Replikasi 2
Replikasi 3
2. Konsentrasi DPPH yang digunakan
Replikasi 1
C1 . V1 = C2 . V2
. 5 mL = C2 . 25 mL
C2 = 19,6
Replikasi 2
C1 . V1 = C2 . V2
. 5 mL = C2 . 25 mL
C2 = 20
Replikasi 3
C1 . V1 = C2 . V2
. 5 mL = C2 . 25 mL
C2 = 20
b. Konsentrasi rutin
1. Konsentrasi larutan stok
Replikasi 1
Replikasi 2
Replikasi 3
2. Konsentrasi seri larutan rutin
Contoh perhitungan konsentrasi seri larutan rutin replikasi 2
Seri 1
C1 . VI = C2 . V2
. 3 mL = C2 . 10 mL
C2 = 30
Seri 2
C1 . V1 = C2 . V2
. 4 mL = C2 . 10 mL
C2 = 40
Seri 3
C1 . V1 = C2 . V2
. 5 mL = C2 . 10 mL
C2 = 50
Seri 4
C1 . V1 = C2 . V2
. 6 mL = C2 . 10 mL
C2 = 60
Seri 5
C1 . V1 = C2 . V2
. 7 mL = C2 . 10 mL
C2 = 70
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
91
Perhitungan konsentrasi seri larutan rutin :
Replikasi C1 (µg/mL) V1 (mL) C2 (µg/mL) V2 (mL)
1
98 3 29,4 10
98 4 39,2 10
98 5 49 10
98 6 58,8 10
98 7 68,6 10
2
100 3 30 10
100 4 40 10
100 5 50 10
100 6 60 10
100 7 70 10
3
100 3 30 10
100 4 40 10
100 5 50 10
100 6 60 10
100 7 70 10
c. Konsentrasi ekstrak etanol buah buni
1. Konsentrasi larutan stok
Replikasi 1
Replikasi 2
Replikasi 3
2. Konsentrasi intermediet
Replikasi 1
C1 . V1 = C2 . V2
. 2 mL = C2 . 10 mL
C2 = 5000
Replikasi 2
C1 . V1 = C2 . V2
. 2 mL = C2 . 10 mL
C2 = 5000
Replikasi 3
C1 . V1 = C2 . V2
. 2 mL = C2 . 10 mL
C2 = 4998
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
92
3. Konsentrasi larutan seri
Contoh perhitungan konsentrasi seri larutan sampel replikasi 3:
Replikasi 3
Seri 1
C1 . V1 = C2 . V2
. 0,6 mL = C2 . 5 mL
C2 = 599,76
Seri 2
C1 . V1 = C2 . V2
. 1 mL = C2 . 5 mL
C2 = 999,6
Seri 3
C1 . V1 = C2 . V2
. 1,4 mL = C2 . 5 mL
C2 = 1399
Seri 4
C1 . V1 = C2 . V2
. 1,8 mL = C2 . 5
mL
C2 = 1799.28
Seri 5
C1 . V1 = C2 . V2
. 2,2 mL = C2 . 5
mL
C2 = 2199.12
Perhitungan konsentrasi seri larutan ekstrak etanol buah buni :
Replikasi C1 (µg/mL) V1 (mL) C2 (µg/mL) V2 (mL)
1
5000 0,6 600 5
5000 1 1000 5
5000 1,4 1400 5
5000 1,8 1800 5
5000 2,2 2200 5
2
5000 0,6 600 5
5000 1 1000 5
5000 1,4 1400 5
5000 1,8 1800 5
5000 2,2 2200 5
3
0,6 599.76 5
4998 1 999.6 5
4998 1,4 1399.44 5
4998 1,8 1799.28 5
4998 2,2 2199.12 5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
93
Lampiran 18. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
a. Penentuan operating time (OT)
Waktu
(menit)
Absorbansi
konsentrasi
rutin 5
µg/mL
Absorbansi
konsentrasi
rutin 15 µg/mL
Absorbansi
konsentrasi
rutin 25 µg/mL
5 0,538 0,504 0,497
10 0,533 0,500 0,488
15 0,529 0,495 0,484
20 0,528 0,493 0,482
25 0,528 0,491 0,482
30 0,529 0,488 0,481
35 0,531 0,488 0,480
40 0,533 0,489 0,480
45 0,535 0,489 0,482
50 0,538 0,491 0,483
55 0,542 0,492 0,483
60 0,547 0,493 0,485
1. Spektrum rutin konsentrasi 5 µg/mL
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
94
2. Spektrum rutin konsentrasi 15 µg/mL
3. Spektrum rutin konsentrasi 25 µg/mL
OT yang diperoleh 30 menit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
95
b. Penentuan λ maksimum
Konsentrasi
seri DPPH
Absorbansi λ
maksimum
(nm)
x λ
maksimum
(nm)
λ maksimum
teoritis (nm)
20 0,558 516
516 517 30 0,680 516
40 0,786 516
1. Spektrum DPPH konsentrasi 20
2. Spektrum DPPH konsentrasi 30
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
96
3. Spektrum DPPH konsentrasi 40
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
97
Lampiran 19. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH
%IC =
1. Rutin
Replikasi Konsentrasi
( Absorbansi
kontrol
DPPH
Absorbansi
larutan
pembanding
%IC
Persamaan
regresi
linear
1
29,4
0,535
0,403 24,6730
y = 0,8259x
+ 0,4674
r = 0,9990
39,2 0,361 32,5234
49 0,315 41,1215
58,8 0,268 49,9065
68,6 0,233 56,4486
Replikasi Konsentrasi
( Absorbansi
kontrol
DPPH
Absorbansi
larutan
pembanding
%IC
Persamaan
regresi
linear
2
30
0,501
0,365 27,1457 y =
0,6467x +
8,4231
r = 0,9963
40 0,324 35,3293
50 0,300 40,1198
60 0,260 48,1038
70 0,235 53,0938
Replikasi Konsentrasi
( Absorbansi
kontrol
DPPH
Absorbansi
larutan
pembanding
%IC
Persamaan
regresi
linear
3
30
0,514
0,373 27,4319 y =
0,7529x +
5,2335
r = 0,9993
40 0,332 35,4086
50 0,290 43,5798
60 0,255 50,3891
70 0,218 57,5875
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
98
Contoh perhitungan %IC replikasi 3 :
a. Konsentrasi 30
%IC =
%IC = 27,4319 %
b. Konsentrasi 40
%IC =
%IC = 35,4086 %
c. Konsentrasi 50
%IC =
%IC = 43,5798 %
d. Konsentrasi 60
%IC =
%IC = 50,3891 %
e. Konsentrasi 70
%IC =
%IC = 57,5875 %
2. Ekstrak etanol buah buni
Replikasi Konsentrasi
( Absorbansi
kontrol
DPPH
Absorbansi
ekstrak
etanol buah
buni
%IC
Persamaan
regresi
linear
1
600
0,577
0,461 20,1040 y =
0,0222x +
6,8271
r = 0,9980
1000 0,415 28,0763
1400 0,351 39,1611
1800 0,305 47,1404
2200 0,260 54,9393
Replikasi Konsentrasi
( Absorbansi
kontrol
DPPH
Absorbansi
ekstrak
etanol buah
buni
%IC
Persamaan
regresi
linear
2
600
0,605
0,504 16,6942 y =
0,0221x +
3,7190
r = 0,9992
1000 0,444 26,6116
1400 0,400 33,8843
1800 0,342 43,4711
2200 0,288 52,3967
Replikasi Konsentrasi
( Absorbansi
kontrol
DPPH
Absorbansi
ekstrak
etanol buah
buni
%IC
Persamaan
regresi
linear
3
599.76
0,590
0,480 18,6441
y = 0,0211x
+ 5,4739
r = 0,9987
999.6 0,423 26,6116
1399.44 0,371 33,8843
1799.28 0,330 43,4711
2199.12 0,284 52,3967
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
99
Contoh perhitungan %IC replikasi 2 :
a. Konsentrasi 600
%IC =
%IC = 16,6942 %
b. Konsentrasi 1000
%IC =
%IC = 26,6116 %
c. Konsentrasi 1400
%IC =
%IC = 33,8843 %
d. Konsentrasi 1800
%IC =
%IC = 43,4711 %
e. Konsentrasi 2200
%IC =
%IC = 52,3967 %
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
100
Lampiran 20. Perhitungan nilai IC50 rutin dan ektrak etanol buah buni
1. Rutin
Replikasi Persamaan regresi linear y IC50 x (nilai IC50)
1 y = 0,8259x + 0,4674 50 59,9741
2 y = 0,6467x + 8,4231 50 64,2909
3 y = 0,7529x + 5,2335 50 59,4588
Replikasi IC50 SD x
( x SD % CV
1 59,9741 2,6536 61,2413 61,2413 ±
2,6536
4,3330%
2 64,2909
3 59,4588
Replikasi 1
Persamaan regresi linear
y = 0,8259x + 0,4674
50 = 0,8259x + 0,4674
x = 59,9741
Replikasi 2
Persamaan regresi linear
y = 0,6467x + 8,4231
50 = 0,6467x + 8,4231
x = 64,2909
Replikasi 3
Persamaan regresi linear
y = 0,7529x + 5,2335
50 = 0,7529x + 5,2335
x = 59,4588
2. Ekstrak etanol buah buni
Replikasi Persamaan regresi linear y IC50 x (nilai IC50)
1 y = 0,0222x + 6,8271 50 1944,7252
2 y = 0,0221x + 3,7190 50 2094,1629
3 y = 0,0211x + 5,4739 50 2110,2417
Replikasi IC50 SD x ( x SD % CV
1 1944,7252 91,2742 2049,7099 2049,7099
± 91,2742
4,4530 %
2 2094,1629
3 2110,2417
Replikasi 1
Persamaan regresi linear
y = 0,0222x + 6,8271
50 = 0,0222x + 6,8271
x = 1944,7252
Replikasi 2
Persamaan regresi linear
y = 0,0221x + 3,7190
50 = 0,0221x + 3,7190
x = 2094,1629
Replikasi 3
Persamaan regresi linear
y = 0,0211x + 5,4739
50 = 0,0211x + 5,4739
x = 2110,2417
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
101
Lampiran 21. Data uji statistik
1. Uji normalitas
2. Uji homogenitas
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
102
3. Uji t independen
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
103
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas
Antioksidan Dan Penetapan Kadar Fenolik Total
Ekstrak Etanolik Buah Buni (Antidesma bunius (L.)
Spreng) memiliki nama lengkap Margareta Novi
Wijayanti. Dilahirkan di Gunungkidul pada tanggal 28
November 1994 dari pasangan Bapak Antonius
Djumakir dan Ibu Lusia Sumiyem. Penulis merupakan
anak kedua dari dua bersaudara. Penulis telah
menyelesaikan pendidikan di TK Santa Ana pada
tahun 1999 hingga 2000 lalu melanjutkan pendidikan di SD Kanisius Petung pada
tahun 2000 hingga 2006. Penulis menempuh sekolah menengah di SMP 1
Wonosari pada tahun 2006 hingga 2009 kemudian melanjukan sekolah tingkat
atas di SMA 2 Wonosari pada tahun 2009 hingga 2012. Penulis melanjutkan
pendidikan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta pada tahun 2012 hingga 2016. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma penulis cukup aktif dalam organisasi,
kegiatan kemahasiswaaan dan kepanitiaan antara lain menjadi koordinator Divisi
Pengembangan dan Pengkaderan Organisasi JMKI periode 2014/2015, Panitia
Cara Belajar Ibu Aktif 2014, Panitia Pharmacy Road To School 2013, Panitia
Pharmacy Performance 2013, Panitia Makrab Jaringan Mahasiswa Kesehatan
Indonesia 2014, Panitia Seminar Nasional Interprofessional Health Care “Take
Care Your Miraculous Filter Perfectly” 2014, Asisten Dosen Praktikum Bentuk
Sediaan Farmasi 2013/2014, Asisten Dosen Praktikum Bentuk Sediaan Farmasi
2014/2015, Asisten Dosen Praktikum Kimia Organik II 2014/2015, dan Asisten
Dosen Praktikum Farmakognosi Fitokimia 2015/2016.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI