Naunyn.Schmiedebergs Arch. Pharmak. u. exp. Path. 258, 430--439 (1967)

Untersuchungen zur renalen Elimination yon Demethylchlortetracyclin*

D. BOItGMANN, G. HOLLMANN $* *** u n d G. SEIqFTT

Pharmakologisches Insti tut der Freien Univers i~ t Berlin

Eingegangen am 24. Juni 1967

Studies on the Renal Excretion o/ Demethylchlortetraeycline

Summary. The renal clearance of demethylehlortetraeycline (DMCT) has been measured in rats during a constant infusion or after a single dose of the antibiotic.

U . V p (DMCT)

The clearance ratio U. V has been found to be lower than 1 indicating p (Inulin)

a tubular reabsorption of the antibiotic. Simultaneous application of probenecid has been shown to decrease the clearance suggesting that in addition to tubular reabsorp- tion tubular secretion of the compound is involved in its renal elimination. Conse- quently, the administration of probeneeid leads to an increase in plasma half life time and in a decrease in the elimination constant k S of DMCT.

U (DMCT)

Stop-flow studies revealed U (Inulin) ratios higher than i located at the

P site of proximal secretion of p-aminohippurate (PAIl), another finding indicating a tubular secretion of the antibiotic.

The distribution volume of DMCT has been found decreased in rats given probenecid together with the tetracycline. This result is in agreement with an extrarenal cellular uptake of DMCT reported previously (LosE~T and SE~FT, 1965).

Key-Words: Tubular Secretion of Demethylchlortetracycline - - Tubular Secre- tion and Suppression by Probeneeid -- Demethylchlortetracycline Distribution Volume.

Schl(tsselw6rter: Tubul~re Sekretion yon Demethylehlortetracyclin -- Tubu- l/~re Sekretion und Unterdriickung dureh Probenecid - - Demethylchlortetracyelin- Verteilungsvolumen.

* Ein Teil der Ergebnisse wurde auf der 5. Friihjahrstagtmg der Deutschen Pharmakologischen Gesellschaft vorgetragen (]3o~o~Az~ u. t t O L ~ A ~ r , 1964).

** Wit danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft fiir die Unterstfitzung unserer Untersuchungen.

*** Jetzige Anschrfft: Chirurgisehe Universit/itsklinik ~Ieidelberg.

Am 31. Oktober 1967 verstorben.

Elimination yon Demethylehlortetracyelin 431

In einer frfiheren Arbeit haben wir beschrieben, dal~ Demethylchlor- tetracyclin (DMCT) gegen einen Konzentrstionsgradienten in den Leber- zellen angereichert und in der Galle susgeschieden wird (Los]s~T u. S]s~T, 1965). Ds die intraeellul~re Akkumulation des Antibioticums durch Probenecid verhindert wurde und dabei such die Ausseheidung mit der Galle sbnshm, haben wir vermutet, dal~ ein sktiver Transport an der cellul~ren Aufnahme des Tetracyclinderivates beteiligt ist. Hier- fiir spraeh such, dal~ bei Erniedrigung der Temperatur weniger DMCT intracellulgr sngereichert wird und dal3 die cellul~re Konzentration einen Grenzwert erreicht, der auch bei Erh5hung der extrscellul~ren Konzentrstion nicht iiberschritten wird. Dss~oPouLos u. SONN]SN~V~RS (1967) hsben Befunde erhoben, nsch denen dem Transport yon schwschen orgsnischen S/~uren in der Leber und Niere offenbar ein gleieher Me- chanismus zugrunde liegt.

Hiervon susgehend haben wir untersucht, ob DMCT nicht nur glomerul~r filtrier~ wird, sondern such dureh tubul~re Sekretion in den Prim~rharn gelangt. Es wird sllgemein angenommen, dab die sezer- nierten Verbindungen zun~chst gegen einen Konzentrationsgradienten yon den Tubuluszellen sus dem peritubularen Blur sufgenommen werden. Der eigentliehe Sekretionsvorgang ist als Diffusion entlang einem Kon- zentrgtionsgef~lle zwischen der Tubuluszelle und dem Prim~rharn auf- zufassen (B~AuN, 1962; C~oss u. TA~A~T, 1950; SP]~]~R, 1959).

Diese Frage sehien uns such deswegen interessant, weft andere Tetra- eyelinderivate wie Chlortetracyclin (ALTE~V,I:~R, 1951 ; BOnifACe, 1964) und N-Pyrrolidinomethylte~racyclin (Rv, u ~ u . M ~ G ~ , 1967), die sich yore DMCT nur dureh eine geringffigige J~nderung der Struktur unter- scheiden, nicht tubular sezerniert werden.

Methodik Die Versuche warden an mgrmlichen Sprague-Dawley-Ratten mit emem Ge-

wicht zwisehen 180 und 220 g durchgeffihrt. Zur Messung der renalen Clearance yon DMCT bei konstanter Zufuhr des

Antibioticums verwendeten wir eine Methode, die in der Arbeit yon H~_~x~x, Sv, N~% Scn~v~z u. M~R]~ER (1963) n~her beschrieben ist. Die Tiere sitzen dabei in Plexiglask~figen, die eine getrennte Sammlung yon Stuhl und Urin ermSglichen. Sie sind in einer temperatur- und feuchtigkeitskonstanten Kammer untergebracht. Die Ratten erhielten zun~chst eine einmalige i.v. Injektion yon 2,5 mg DMCT/ Tier und anschlieBend eine Dauerinfusion mit 5 ml/Tier und Stunde einer L6sung, die 0,90/o ~aC1 und 0,5 mg/ml DMCT enthielt. In einem Tell der Experimente wurde der Infusionsflfissigkeit Probenecid in einer Konzentration yon 0,8 mg/ml zugesetzt. Die Clearance des Autibioticums wurde zwischen der 105. und 120. rain nach Begir~ der Infusion gemessen. Als NIaB ffir die glomerul~re Filtration be- stimmten wir zugleich die Inulinclearance. Die Konzentration des Tetracyclin- derivates im Ham und in dem durch Zentrffugieren des Dekapitationsblutes ge- wormenen Plasma wurde spektrofluorometrisch naeh der yon Konw (1961) an- gegebenen Methode gemessen, ttierbei wird das Antibiotieum in einen Tetraeyclin-

432 D. BORGMANN, G. HOLLMANN und G. SENFT ~ :

Calcium-Barbituratkomplex fiberffihrt, der ein Fluorescenzmaximum bei einer Wellenl~nge yon 550 m~ hat, werm er bei 390 m~ aktiviert wird. Die Messung des Inulins erfolgte nach den Angaben yon Ffim~, KAczl~czYx u. KRfiTTOEN (1955).

Zur Messung der renalen Ausscheidung des Antibioticums nach einmaliger Injektion yon 20 mg/kg DMCT bei gleichzeitiger Bestimmtmg der Plasmakonzentra- tion verwendeten wir die gleiche Infusionstechnik. Anstelle einer isotonischen NaC1-LSsung erhie]ten die Ratten 5 ml/Tier und Stunde einer LSsung infundiert, die 0,2°/0 NaC] und 4,3°/0 Glucose, sowie in einem Teil der Versuche 0,8 mg/ml Probenecid enthielt. 2 Std nach Beginn der Infusion wurde das Antibioticum i.v. injiziert. Seine Plasmakonzentration wurde nach 1, 10 und 30 rain, sowie nach 1, 2, 4, 6, 8, und 24 Std gemessen. Um den Tieren mehrfaeh hintereinander Blur abnehmen zu kSnnen, batten wir ihnen am Vortage in Evipannarkose einen Poly- ~thylenkatheter (Hodell PE 10 der Firma Clay-Adams, Aul~endurchmesser 0,61 ram) in eine A. carotis communis eingebunden. Der Katheter wurde zur Verhinderung einer Thrombenbildung mit einer L6sung geffillt, die 0,2°/0 Calciumhepariaat und 0,90/0 NaC1 enthielt. An seinem distalen Ende war or mit einem Hahn verbunden, der wie eine Kaniile an eine Tubcrkuliuspritze angeschlossen werden kann (Bo~G- ~XN~, 1964; LODE, 1966). Nach jeder Blutentnahme wurde den Tieren zur Ver- hinderung yon Blutdrucksehwankungen eine gleiche Menge heparinisierten Blutes eines Spendertieres reinfundiert. In dem durch Zentrffugieren gewonnenen Plasma, sowie dem zwischen den einzelnen Blutabnahmen gesammelten Urin bestimmten wir die Konzentration des DMCT. Aus dem Abfall der Plasmakonzentration (PK) wurde die Eliminationskonstante (ka) naeh der Formel

In PK 1 -- In PK~ /c~ ~ t2 _ tl

berechnet. PK 1 und PK~ sind dabei die don Abfall begrenzenden Konzentrationen, t~ un4 t 1 die dazu gehSrigen Zeitabschnitte.

Die biologische Halbwertszeit ermittelten wir nach der Formel

t ln2 2-- k~

Zur Bereclmung der renalen Antibiotieaclearance unter den Bedingungen einer fallenden PK des Tetraeyclmderivates verwendeten wir die mittlere Konzentration yon DMCT im Plasma. In diesen Versuchen bestimmten wir auch das Verteilungs- volumen des Antibiotieums. Es ergibt sich aus der Formel

injizierte Dosis in ~g/Tier -- im Harn ausgeschiedene Menge in ~g/Tier Plasmakonzentration in/tg/ml

und wird in der Dimension ,,Prozent des KSrpergewichtes" angcgeben. Die Frage, ob DMCT tubular sezerniert wird, untersuchten wir auch mit Hilfe

yon Stop-Flow-Experimenten, die wir nach der in einer vorangegangenen Arbeit (tIo~MANN, SEN~r u. Wra~E~, 1964) n~her beschriebenen Methode yon M_~v~, SULLrCAN U. W~DE (1957), sowie M)mvIN, WILDE u. SUItIVAN (1958) durch- fiihrten. Nach Narkotisierung der Tiere mit IIexobarbital wurden die Ureteren yon der BauchhShle aus pr~pariert und in jeden Ureter ein Poly~thylenkatheter (Modcll PE 10 der Firma Clay-Adams) eingebunden. Danach erhielten die l~atten eine eiumalige i.v. Injektion yon 20 mg/kg DHCT und anschlieBend zur Erzeugung einer osmotischen Diurese eine Dauerinfusion mit 0,4 ml/Tier und Minute einer L6sung, die folgende Zusammensetzung hatte: 9,000 g NaOl, 0,894 g KC1, 0,250 g CaCl~, 0,200 g NattCOs, 200,0 g Mannit, 20,0 g Inulin, 1,0 g Paraaminohippursaure

Elimination yon Demethylchlortetracyclin 433

(PAH), Aqua dest. ad 1000,0. Vor der Stop-Flow-Periode wurden zwei Fraktionen als ,,Free-Flow-Proben" gesammelt, nach Beendigung der Occlusion 26 Fraktionen zu je 2 Tropfen gesondert aufgefangen. In diesen Urinproben, sowie in dem durch Zentrifugieren des Dekapitationsblutes gewormenen Plasma bestimmten wir die I)MCT-, Inulin- und PAH-Konzentration. Die Messung der PAH erfolgte nach der yon F~IED~sr, POLLE¥ u. FRIED~A~ (1947) angegebenen Methode.

Ergebnisse und Besprechung Erhielten Ratten eine i.v. Dauerinfusion mi~ 2,5 mg DMCT/Tier

und Stunde, so betrug die zwischen der 105. und 120. min gemessene Clearance des An~ibioticums 2,95 ml/kg und mill. Bei einer glomerulgren

Tabelle 1. Erniedrigung der DMCT-Clearance dur~h Probenecid

DMCT-Kon- zentration im Plasma

DMCT-Aus- scheidung im Urin

U . V

Inulin- DMCT-

Clearance

UI'V U. V P~ P

ml/(kg .rain) ml/(kg .rain)

Clearance- Quotient

U.V P

UI "V PI

~g/ml b~g/(kg • min)

DMCT 19,49 57,47 8,88 2,95 0,33 (n = 10) 4- 1,791 4- 13,410 4- 0,220 4- 0,123 4- 0,022

DMCT 31,99 71,68 9,57 2,24 0,23 + Probene- cid (n=12) 4- 1,373 ± 7,018 4- 0,255 4- 0,056 4- 0,013

p < 0,0002 < 0,01 < 0,003

Filtration von 8,9 ml/kg und min wurde somit eia Drittel der filtrierten Menge des Antibiotieums ausgesehieden. Bei gleichzeitiger Infusion von 20 nag Probeneeid/kg und Stunde blieb die glomerulgre Filtration un- vergndert. Dagegen f ielder aus der Clearance des Tetraeyelinderivates und der Inulinelearanee gebildete Quotient yon 0,33 auf 0,23 ab. Dies bedeutet, dab nur noeh 23°/0 des fil~rierten DMCT mit dem Endharn eliminiert werden, wenn mit dem Antibioticum ein Pharmakon gegeben wird, das eine hohe Affinitgt zu dem Transportsystem besitzt, dutch das schwache organisehe Sguren tubulgr sezerniert werden (B~¥wl~, 1950, 1954; BI~AIIN, 1962 ; SCI~A~KEt~, 1962 ; DESrOrOVLOS, 1965, siehe dort weitere Literatur) (Tab. l).

In den Versuchen mit kontinuierlicher Infusion des Tetracyclin- derivates wurde zwar die Clearance des Antibioticums durch Probenecid veiTingert, die Ausscheidung yon DMCT nahm jedoch nieht ab. Dies kann damit erklgrt werden, dab wghrend der zweistiindigen Infusion

434 D. BORGMAN~, G. HOLL~A_W~¢ und G. Sv.~crT ~f:

in Anwesenheit des l~emmstoffes der tubul~ren Sckretion die Plasma- korrzentration des Antibioticums und damit auch die filtrierte Menge des Pharmakons anstieg.

Nach einmaliger Injektion yon 20 mg/kg DMCT wurde dagegen auch die Ausseheidung des Tetracyeliuderivates bei gleiehzei~iger Infusion yon Probeneeid vermindert. Sie nahm w/~hrend eines sechsstfindigen

Tabelle 2. Erniedrigung der DMCT-Ausscheidung und der DMCT-Clearance nach Gabe vow Probenecid

0--1

1--2

2--4

4--6

0--6

U.V

444,6 137,40

193,8 -4- 34,44

353,0 47,45

188,9 ~: 41,00

1179,4 191,50

I IL DMCTi I. DMCT -t- Pro-

n ~ 6 benecid . . . . n----7

Std tzg/Tier ~g/Tier

P zwischen

I. + II.

Mittlere Plasmakon- zeatration zwischen

den einzelnen Sammelperioden

DMCT DMCT + Pro-

benecid

t~g/ml vg/ml

U ' V P

DMCT

ml/(Tier.min)

U . V P

DMCT + Pro- benecid

ml/(Tier, mir

195,6 j= 28,08

106,6 17,51

141,1 J= 17,70

134,7 ± 23,11

552,7 ± 57,55

< 0,2

< 0,05

< 0,002

< 0,3

< 0,01

5,25

4,09

2,76

4,44

9,55

7,98

6,13

8,44

0,61 0,19

0,72 0,15

0,57 0,18

0,74 0,18

Versuches auf die H/~lfte ab. Da die glomerul/~re Filtration durch Pro- beneeid nieht eingeschrKnkt wird, kSnnen wit aus dem Abfall der Clearance des Antibioticums schlieSen, da$ seine verminderte Elimi- nation auf einer Ver/~nderung des tnbul/iren Transports beruht (Tab. 2). Dies/~uSert sich in einem langsameren Abfall der DMCT-Plasmakonzen- trat ion (Abb.1). Die Italbwertzeit des Tetraeyclinderivates n immt yon 3,70 auf 5,47 Std zu, d. h. um fast 48°/o, die Eliminationskonstante k 2 wird yon 0,1869 auf 0,1268 und damit um 32°/o erniedrigt (Tab.3).

Ubersteigt die Clearance eines Pharmakons die des Inulins, so mu$ man fordern, da$ die Verbindung nieht nur glomerul/~r filtriert, sondern aueh dutch tubul/~re Sekretion ausgesehieden wird. I m Falle des DMCT

Elimination yon Demethylchlortetracyclin 435

haben wit ha der Clearaneeperiode (siehe Tab. 1) keinen fiber 1 liegenden Quotienten

u - v p (Pharmakon)

U ' V p (Inulin)

gemessen. Dies sprieht zun/~chst dagegen, dab das Tetracycl inder ivat tubul/~r sezerniert wird. Dabei m ug m an jedoch berficksichtigen, dab ein unter 1 liegender Clearancequotient auf eine tubul/ire Rfiekdiffusion

@

o 8 2 . - ~

-E ~>-LJ T "~r---~.

a 3 ' ? ~ ' - - [ T ,,, ' , / > - - 4 = . 2 , ~

[ 1 I I 1 1 l I ~ I I

11030 60min 2 3 t/2 /* 5 t/2 6 7 Std 8 Abb. 1. Abfall der Plasmakonzentration yon DMCT nach i.v. Injektion yon 20 rag/ kg des Antibioticums. I : bei gleiehzeitiger Infusion yon 4 mg Probenecid/Tier und

Stunde; I I : ohne gleichzeitige Infusion yon Probenecid

Tabelle 3. Verliingerung der biologisohen Halbwertzeit und Abnahme der Elimina- tionskonstante yon D M C T dutch Gabe von Probenecid

t Halbwertzeit ~-

Eliminationskonstante k 2

DMCT n = 6

DMCT + Probenecid n : 7

3,70

A -- 1,77 (= 47,80/0)

0,1869

A = 0,0601 (= 32,2O/o)

5,47

0,1268

hinweist. Es ist m6glieh, dag auf diesem Wege mehr DMCT in das peritubul/~re Blur zurfiekgelangt, als ia de~ vorgeschalteten Abschni t ten des Nephrons tubulgr sezerniert wurde. Dies zeigt, dab ein Clearance- quotient, der geringer als 1 ist, eine tubul~re Sekretion nicht aussehlieBt.

436 D. BORO~ANN, G. HOLLMANN und G. SEN~T ~ :

Da die Clearance von DMCT durch Probenecid jedoch erniedrigt wird, kSnnen wir aufgrtmd der Kenntnis des Wirkungsmechanismus dieses Derivates der Benzoes~ure annehmen, dab das Antibioticum tubul~r sezerniert wird.

Tabelle 4. 1Vachweis der tubulSren Sel~retion yon DMCT im Bereich des proximalen FAH-Sebretionsmaximums (Stop-Flow- Versuch Verschluflzeit: 3 rain

Fraktion

-p- (DMCT)

U ~ - (Inulin)

U ~ - (PAH)

U ~ - (Inulin)

0,76

0,94

0,76

0,94

0,71

1,04

0,92

1,09

0,92

1,14

11

1,24

1,33

12

1,26

1,20

1,23

1,15

13 10

1,25

Fraktion

U -p- (DMCT)

U --p- (Inulin)

U --p- (PAH)

U -P- (Inulin)

14

0,73

1,40

15

0,84

1,46

16

0,40

1,40

17

0,40

1,37

18

0,69

1,34

19

0,69

1,27

20

0,53

1,22

21

0,69

1,18

Stop-Flow-Analysen zeigten darfiber hinaus, dab bei einem ver- lgngerten Kontakt zwischen Prim~rharn und Tubuluszellen fiber 1 liegende Clearancequotienten auftreten, die im Bereich des proximalen PAH-Sekretionsmaximums lokalisiert sind (Tab.4). In diesen Ver- suchen fiel auf, dab im gleiehen Bereieh dot Quotient

u ~ - (PAH)

U (Inulin) P

wi~hrend einer DMCT-Infusion nur ungefi~hr 25°/o des Wertes betrug, der bei Abwesen_heit des Antibiotieums gemessen wurde (Abb.2). Da tubular sezernierte Substanzen, zu denen bekanntlich auch das PAH gehSrt, um den Transportmechanismus konkurrieren (ScHA~K~R, 1962), kSnnen wir aueh aus dieser Beobaehtung auf eine tubul/~re Sekretion yon DMCT schlieBen.

Elimination von Demethylchlortetracyclin 437

A n der rena len Aussehe idung des Te t r acychnde r iva t e s is t demnach offensichtl ieh ein gleieher T ranspo r t betei l igt , wie wi t ihn ffir die celluli~re Aufnahme des An t ib io t i eums in die Leber und seine Aussehe idung mi~

n -

~2 o_

5"

Verschlul3periode 3min

if-

ii L

r r r ~ r I a r r I I I { I I I I r I I I I I I r r i } T

2 3 h 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Abb. 2. Reduktion des PAH/Inulin-Clearancequotienten im Stop-Flow-Experiment bei i.v. Gabe von DMCT. Oberes Diagramm: ohne Injektion yon DMCT; unteres

Diagramm: nach i.v. Injektion von 20 mg/kg DMCT

700

~50C

~ 4oc

ae 200 / ~ / i /

T I00 50

~ i i l [ r I { i

10 30 60min 2 3 4 5 Std 6

Abb. 3. Abnahme des ])MOT-Verteilungsvo]umens bei gleichzeitiger Gabe yon Probenecid. Obere Kurve: DMCT-Verteilungsvolumen ohne Gabe yon Probenecid; untere Kurve: DMCT-Verteilungsvolumen bei gleichzeitiger Infusion yon 4 mg

Probenecid/Tier und Stunde

438 D. BORC~AN~V, G. HOLLMANN und G. S]~Iv:~T $:

der Galle angenommen h a b e n (S]~FT u. LOSE~T, 1964; LOSWRT u. SE~FT, 1965). Dal3 Probenee id n ieh t nur die tubul i i re E l imina t ion , sondern gleichzeit ig auch den T ranspo r t yon DMCT in andere Zellen herabse tz t , li~itt sich durch ~ e s s u n g des Ver tef lungsvolumens belegen. Bei Gabe von Probenee id s te ig t die P l a s m a k o n z e n t r a t i o n des An t ib io t i cums hSher an, als aufgrund der ve rminde r t en renalen Aussche idung zu e rwar ten w~re. Dies erkl~rt , w a r u m das Ver te i lungsvolumen des Te t raeye l inder iva tes durch Probenee id erniedr ig t wi rd (Abb. 3).

L i t e r a t u r

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Prof. Dr. reed. G. S~FT t Lehrstuhl fiir Klinische Pharmakologie der Freien Universitat Berlin

Sonderdruckanforderungen: Dr. W. Los~T Pharmakologisches Institut der Freien Universit~t Berlin 1000 Berlin 33, Thielallee 69/73

30 Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmak. exp. Path., Bd. 258