การประเมนิโปรแกรมการเหนี่ยวนำาการเป็นสดัแบบระยะสัน้และระยะยาวต่อการพฒันาของฟอลลิเคิล

และโอโอไซต์ในแพะEvaluation of short-term and long-term progestin-based protocol on follicle and oocyte development in

goats จริฐัติ ธรรมศิร1ิ* ไชยณรงค์ นาวานุเคราะห์2 จารกึ ณัฏฐากรกลุ 1

สมจติร ์กันธาพรม 1 นุกลู แก่นจนัทร1์ และชรนิญา พมิพส์อน3

Jiratti Thammasiri1*, Chainarong Navanukraw2, Jaruk Nutthakornkul1, Somchit Guntaprom1,

Nukoon Kanchan1 ,Charinya Pimsorn3

1 สาขาเทคโนโลยกีารผลิตสตัว ์คณะเทคโนโลยอุีตสาหกรรมเกษตร มหาวทิยาลัยกาฬสนิธุ ์จงัหวดักาฬสนิธุ ์460002 ภาควชิาสตัวศาสตร ์คณะเกษตรศาสตร ์มหาวทิยาลัยขอนแก่น จงัหวดัขอนแก่น 400023 สาขาวทิยาศาสตรส์ขุภาพสตัว ์คณะเทคโนโลยอุีตสาหกรรมเกษตร มหาวทิยาลัยกาฬสนิธุ ์จงัหวดักาฬสนิธุ ์460001Department of Animal Production Technology, Faculty of Agro-Industrial Technology, Kalasin University, Kalasin 46000, Thailand

2Department of Animal Science, Faculty of Agriculture, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002, Thailand

3Department of animal health science, Faculty of Agro-industrial technology, Kalasin University, Kalasin 46000, Thailand

*Corresponding author: jiratti.th@gmail.com

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

1920

21

22232425262728293031

บทคัดยอ่ วตัถปุระสงค์ของการทดลองเพื่อประเมนิวธิกีารเหนี่ยวนำาการเป็น

สดัแบบสัน้และยาวต่อการพฒันาของรงัไขใ่นแพะใชแ้พะ 24 ตัว อายุเฉล่ีย 12 เดือน กลุ่มท่ี 1 (ระยะสัน้ 7 วนั) ทำาการเหน่ียวนำาการเป็นสดัโดยใชโ้ปรเจสเทอโรน (P4) สงัเคราะหช์นิดฟองนำ้า medroxyprogesterone acetate (MAP) 60 มลิลิกรมั รว่มกับ pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) 300 IU ในวนัท่ี 6 กลุ่มท่ี 2 (ระยะยาว 14 วนั) ใช ้P4 ชนิดเดียวกันเป็นเวลา 14 วนั รว่มกับการฉีด PMSG 300 IU ในวนัท่ี 13 ผ่าตัดเปิดชอ่งท้องเพื่อนับฟอลลิเคิล โอโอไซต์ และเก็บรงัไข ่24 ชัว่โมงหลังจากถอนฮอรโ์มน ผลการศึกษาพบวา่การเหนี่ยวนำาการเป็นสดัแบบระยะสัน้รว่มกับโกนาโดโทรฟนิ ฮอรโ์มน ไมพ่บความแตกต่างกันของจำานวนและดัชนีชีว้ดัการเจรญิเติบโต ของฟอลลิเคิลขนาดเล็กและขนาดกลาง ความเขม้ขน้ P4 ในชว่งตลอดการทดลองในแพะทัง้สองกลุ่มเมื่อเปรยีบเทียบกับโปรแกรมการเหนี่ยวนำาแบบระยะยาว แต่พบวา่จำานวนและดัชนีชีว้ดัการเจรญิเติบโตในชัน้แกรนูโลซา่ของฟอลลิเคิลขนาดใหญ่ และโอโอไซต์คณุภาพดีท่ีมคีวามแตกต่างกันระหวา่งแพะทัง้สองกลุ่ม โดยขอ้มูลดังกล่าวทำาใหท้ราบถึงการใชโ้ปรแกรมระยะสัน้สามารถลดผลเสยีของโปรแกรมระยะยาวท่ีมต่ีอคณุภาพของโอโอไซต์ซึ่งสง่ผลต่อการผสมติดหลังการใชโ้ปรแกรมและการพฒันาของตัวอ่อนต่อไปในแพะ

คำาสำาคัญ: การเหนี่ยวนำาการเป็นสดั, การพฒันาของรงัไข่, การตอบสนองต่อการเป็นสดั, แพะ

ABSTRACTThe objectives of the present study were to

evaluation of short term and long term progestin-based protocol on follicle and oocyte development in goats. Non pregnant goats (n=24), 12 months of age.

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

Goats were randomly assigned to receive one of two treatment groups. Goats in group 1 were synchronized using the short-term protocol (7 days) by which animals were inserted with intravaginal sponges containing 60 mg medroxyprogesterone acetate (MAP) for 7 days and were intramuscularly injected with 300 IU pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) on day 6. Goats in group 2 were inserted with the same progestin using the long-term protocol (14 days) and were injected with 300 IU PMSG on day 13, and ovariectomy was performed to determine numbers of follicle at 24 h after sponge removal. The number of visible small, medium follicles, total numbers of follicle and labeling index (LI) were similar between treatment groups. There were not significantly different between treatment groups (P>0.05) at any time during the experiment. However, the number of large follicle and number of healthy oocyte was significantly greater (P<0.05) in goats received short term than those goats received long term progestin. The greatest LI of granulosa layer was observed in large follicular of goats in short term group. These data clearly demonstrated that the short-term treatment in goats prevents the deleterious effects of long term treatment on oocyte quality and early embryonic development in goats.

Keywords: Estrus synchronization, ovarian development, estrus response, goat

บทนำา แพะถือเป็นสตัวท์างเลือกท่ีมคีวามสำาคัญต่อความเชื่อทางศาสนา

ของชาวมุสลิมและยงัเป็นแหล่งโปรตีนท่ีสำาคัญ แต่อยา่งไรก็ตามการ

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

8687

88

8990

91

92

93

เล้ียงแพะในประเทศไทยพบวา่การเกิดวงรอบการเป็นสดัและอัตราการตกไขไ่มม่คีวามสมำ่าเสมอกันตลอดทัง้ปี (Lertchunhakiat et al., 2012) ดังนัน้การเหน่ียวนำาการเป็นสดัเพื่อใหแ้พะตัวหนึ่งหรอืหลายตัวเป็นสดัพรอ้มกันในเวลาท่ีกำาหนดไว ้จงึเป็นวธิกีารท่ีนำามาใช ้โดยมหีลักการคือการใชฮ้อรโ์มนท่ีสงัเคราะหเ์พื่อเลียนแบบการเปล่ียนแปลงฮอรโ์มนท่ีควบคมุวงรอบการเป็นสดัตามธรรมชาติ เชน่การใชโ้ปรเจสเทอโรน (progesterone, P4) สงัเคราะหแ์บบซลิิโคนสอดชอ่งคลอด โดยทัว่ไปแบง่เป็นการทำาโปรแกรมระยะสัน้และระยะยาว 7 วนั และ 14 วนั ตามลำาดับ ฮอรโ์มม P4 สงัเคราะหท่ี์นิยมใชเ้ชน่ medroxyprogesterone acetate (MAP) นับวา่เป็น P4 สงัเคราะหท่ี์ราคาไมส่งู ใชร้ว่มกับโกนาโดโทรฟนิฮอรโ์มน เชน่ pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) (Lertchunhakiat et al., 2012) แต่อยา่งไรก็ตามพบวา่การใช้โปรแกรมระยะยาวมคีวามสมัพนัธุต่์ออัตราผสมติดท่ีตำ่าในโค (Lucy et al., 2001) และในแกะ (Powell et al., 1996) เพื่อแก้ไขปัญหาดังกล่าวจงึได้มกีารศึกษาโดยลดระยะเวลาในการใช ้P4 ในการเหนี่ยวนำาโดยใชเ้วลาใหส้ัน้ลงเหลือ 5-7 วนัรว่มกับการใช ้โกนาโดโทรฟนิฮอรโ์มน (Ungerfeld and Rubianes 1999) การใชโ้ปรแกรมระยะสัน้พบวา่สามารถลดจำานวนของฟอลลิเคิลท่ีไมม่กีารตกไข ่(persistent follicle) ได้ (Rubianes and Menchaca 2003) เพื่อใหท้ราบถึงผลของการใชโ้ปรแกรมการเหนี่ยวนำาการเป็นสดัและตกไขทั่ง้แบบระยะสัน้และระยะยาวในแพะ และสามารถเลือกใชว้ธิท่ีีมคีวามเหมาะสมมากท่ีสดุ

ดังนัน้การศึกษาครัง้นี้จงึมจุีดประสงค์เพื่อประเมนิวธิกีารเหนี่ยวนำาการเป็นสดัแบบสัน้และยาวต่อการพฒันาของรงัไขใ่นแพะ

อุปกรณ์และวธิกีาร

94

95

96

97

98

99

100

101

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114

115

116

117

118

119

120

สตัวท์ดลองวธิกีารศึกษาในงานทดลองครัง้นี้ผ่านการพจิารณาโดยคณะ

กรรมการจรรยาบรรณและมาตรฐานการเล้ียงและการใชส้ตัวเ์พื่องานทางวทิยาศาสตรม์หาวทิยาลัยขอนแก่น (Reference No. 0514.1.12.2/87) โดยใน งานทดลองนี้ใชแ้พะเพศเมยีจำานวน 24 ตัว อายุเฉล่ีย 12 เดือนนำ้าหนักเฉล่ีย 16.73 ± 0.42 กิโลกรมัมีคะแนนรา่งกายนับจาก 1-5 (1=ผอมแหง้ และ 5=อ้วน) ประมาณ 2.5-3.0 (Thammasiri et al., 2016) ใหอ้าหารขน้ตามความต้องการโภชนะของแพะ (NRC, 2007) จดัใหม้นีำ้าและหญ้าเป็นอาหารหยาบใหก้ินเต็มที

การเหนี่ยวนำาการเป็นสดัและการตรวจสดัเหนี่ยวนำาการเป็นสดัโดยใชโ้ปรเจสเทอโรนสงัเคราะหช์นิดฟองนำ้า

medroxyprogesterone acetate (MAP; Synchrogest esponjas®, Spain) 60 มลิลิกรมั สอดเขา้ชอ่งคลอดเป็นเวลา 7 วนั รว่มกับการฉีด PMSG (Synchrogest PMSG®, Spain) 300 IU เขา้กล้ามเน้ือวนัท่ี 6 (1 วนัก่อนถอดฟองนำ้า) ในกลุ่มท่ีเหนี่ยวนำาแบบสัน้ (short-term protocol) และ ใชโ้ปรเจสเทอโรนสงัเคราะหช์นิดเดียวกันสอดเขา้ชอ่งคลอดเป็นเวลา 14 วนั รว่มกับการฉีด PMSG 300 IU เขา้กล้ามเน้ือวนัท่ี 13 (1 วนัก่อนถอดฟองนำ้า) ในกลุ่มท่ีเหนี่ยวนำาแบบยาว (long-term protocol)

การเก็บตัวอยา่งรงัไขแ่ละเลือดทำาการตรวจนับจำานวนฟอลลิเคิลและเก็บตัวอยา่งรงัไขโ่ดยการ

ผ่าตัดเปิดชอ่งท้อง (ovariectomy) 24 ชัว่โมงหลังการถอดฟองนำ้าแบง่กลุ่มตามขนาดเสน้ผ่าศูนยก์ลางโดยแบง่เป็น ขนาดเล็ก (≤ 3 มลิลิเมตร) ขนาดกลาง (4-6 มลิลิเมตร) และ ขนาดใหญ่ (≥ 7 มลิลิเมตร) ตามวธิกีารของ Gonzalez et al. (2001) เพื่อใชใ้นการ

121

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

141

142

143

144

145

146

147

148

วเิคราะหค์่าดัชนีชีว้ดัการเจรญิเติบโตของฟอลลิเคิลและจำานวนโอโอไซต์ เก็บตัวอยา่งเลือดจากหลอดเลือดดำา (jugular vein) ปรมิาตร 7 มลิลิลิตร โดยใชห้ลอดท่ีมสีารป้องกันการแขง็ตัวของเลือด (EDTA solution) นำาไปป่ันเหวีย่งด้วย ความเรว็ 3,000 g เป็นเวลา 10 นาทีเก็บไวท่ี้อุณหภมู ิ-20 องศาเซลเซยีสจนกวา่นำาไปวเิคราะหท์ำาการตรวจ วดัปรมิาณฮอรโ์มน P4 ตามวธิกีารของ Thammasiri et al. (2016)

การวเิคราะห์ค่าดัชนีชีว้ดัการเจรญิเติบโตวเิคราะหก์ารเจรญิเติบโตของฟอลลิเคิล ด้วยวธิ ี

immunohistochemistry โดยใช ้PCNA เป็นดัชนีชีว้ดัการเจรญิเติบโต โดยแยกเนื้อเยื่อรงัไขใ่หไ้ด้ขนาดประมาณ 1-2 มลิลิเมตร และฝังในพาราฟนิ (paraffin embedding) ตัดเนื้อเยื่อที่ผ่านการฝังพาราฟนิด้วยเครื่อง microtome ประมาณ 6 ไมโครเมตร จากนัน้ตรวจการแสดงออกของ PCNA ตามวธิกีารของ Grazul-Bilska et al. (2007) โดยใช ้specific monoclonal antibody PCNA (MAB24R, Chemicon International, Temecula, CA) รว่มกับ diaminobenzadine (DAB kit; Vector Labolatories, Burligame, CA, USA) คำานวณหาดัชนีชีว้ดัการเจรญิเติบโตจากจำานวนเซลล์ท่ีนิวเคลียสปรากฏการยอ้มติด PCNA ต่อจำานวนเซลล์ในชัน้ทีกาเซลล์ (theca cell) และ แกรนูโลซา่เซลล์ (granulosa cell)

การวเิคราะห์ขอ้มูลทางสถิติการวเิคราะหข์อ้มูลจำานวนของฟอลลิเคิล จำานวนของโอโอไซต์ ค่า

ดัชนีชีว้ดัการเจรญิเติบโต (รอ้ยละของ LI) และความเขม้ขน้ของ P4 ทำาการวเิคราะหโ์ดยใช ้GLM procedure of SAS (2001) และการทดสอบความแตกต่างระหวา่งกลุ่มทดลองโดยใช ้student T-test (Steel et al., 1997)

149

150

151

152

153

154

155156

157

158

159

160

161

162

163

164

165

166

167

168

169

170

171

172

173

174

175

176

ผลการทดลองและวจิารณ์

ผลของวธิกีารเหน่ียวนำาการเป็นสดัต่อจำานวนฟอลลิเคิลและโอโอไซต์จากการทดลองพบวา่จำานวนของฟอลลิเคิลขนาดเล็ก (≤ 3

มลิลิเมตร) ขนาดกลาง (4-6 มลิลิเมตร) และจำานวนฟอลลิเคิลทัง้หมดระหวา่งแพะกลุ่มท่ีได้รบัการเหนี่ยวนำาการเป็นสดัแบบโปรแกรมระยะสัน้และระยะยาวไมม่คีวามแตกต่างกันทางสถิติ (Table 1) อยา่งไรก็ตามจำานวนของฟอลลิเคิลขนาดใหญ่ในแพะกลุ่มท่ีได้รบัการเหนี่ยวนำาแบบระยะสัน้มจีำานวนท่ีมากกวา่แพะกลุ่มท่ีได้รบัการเหนี่ยวนำาระยะยาวอยา่งมีนัยสำาคัญทางสถิติ (P<0.05) (Table 1) เนื่องจาก P4 สง่ผลโดยการควบคมุแบบยอ้นกลับ สง่ผลต่อระดับและการหลัง่ของฮอรโ์มน luteinizing hormone (LH) ท่ีทำาหน้าท่ีกระตุ้นการพฒันาและเจรญิเติบโตของฟอลลิเคิล (Rubianes and Menchaca 2003) จำานวนโอโอไซต์ทัง้หมดท่ีเก็บได้พบวา่ไมม่คีวามแตกต่างกันในแพะท่ีได้รบัการเหนี่ยวนำาทัง้สองกลุ่ม แต่พบวา่จำานวนโอโอไซต์ท่ีมคีณุภาพในแพะกลุ่มท่ีได้รบัการเหนี่ยวนำาแบบระยะสัน้มจีำานวนที่มากกวา่แพะกลุ่มที่ได้รบัการเหนี่ยวนำาระยะยาวอยา่งมนีัยสำาคัญทางสถิติ (P<0.05) (Table 1) ความสมัพนัธุร์ะหวา่งขนาดของฟอลลิเคิลและคณุภาพของโอโอไซต์มีการศึกษาและรายงานในโค (Lonergan et al., 1994) และแพะ (Crozet et al., 1995) เนื่องจากสตัวเ์คี้ยงเอ้ืองทัง้สองสายพนัธุ์พบวา่โอโอไซต์ท่ีเก็บจากฟอลลิเคิลขนาดใหญ่ได้มากกวา่ฟอลลิเคิลขนาดเล็ก จากการศึกษาของ Thammasiri et al, (2016) พบวา่การแสดงออกของ BCL-2 ยนีซึ่งเป็นยนีท่ีบง่ชีถึ้งการมคีณุภาพดีของโอโอไซต์ในแพะกลุ่มท่ีได้รบัการเหนี่ยวนำาระยะสัน้มกีารแสดงออกท่ีมากกวา่และสอดคล้องกับจำานวนโอโอไซต์ที่มคีณุภาพดี การแสดงออกของ BCL-2 มคีวามสมัพนัธุเ์ชงิบวกกับการพฒันาของโอโอไซต์ซึ่งเป็นตัว

177

178

179

180

181

182

183

184

185

186

187

188

189

190

191

192

193

194

195

196

197

198

199

200

201

202

203

บง่ชีท่ี้สำาคัญต่อคณุภาพโอโอไซต์ (Bogacki et al., 2014)

ค่าดัชนีชีว้ดัการเจรญิเติบโตของฟอลลิเคิลดัชนีชีว้ดัการเจรญิเติบโต (LI; ค่ารอ้ยละเซลล์ท่ียอ้มติด PCNA)

ของฟอลลิเคิลขนาดเล็ก และขนาดกลาง พบวา่ทัง้ในชัน้แกรนูโลซา่ และ ชัน้ทีกาของฟอลลิเคิลในแพะกลุ่มท่ีได้รบัการเหนี่ยวนำาแบบระยะสัน้และระยะยาวไมม่คีวามแตกต่างกันทางสถิติ (Table 2) ดัชนีชีว้ดัการเจรญิเติบโตของฟอลลิเคิลขนาดใหญ่พบวา่ในชัน้แกรนูโลซา่ของแพะกลุ่มท่ีได้รบัการเหนี่ยวนำาแบบระยะสัน้มคี่ามากกวา่แพะที่ได้รบัการเหนี่ยวนำาระยะยาวอยา่งมนีัยสำาคัญทางสถิติ (P<0.05) แต่พบวา่ในชัน้ทีกาของฟอลลิเคิลไมม่คีวามแตกต่างกันในแพะท่ีได้รบัการเหนี่ยวนำาทัง้สองกลุ่ม (Table 2) การแสดงออกของ PCNA ของฟอลลิเคิลเป็นตัวบง่ชีก้ารเจรญิของฟอลลิเคิลรวมถึงเป็นสญัญานท่ีบง่บอกถึงการขยายขนาดของ แกรนูโลซา่ และ ทีกาเซลล์ (Grazul-Bilska et al., 2007) อัตรากิจกรรมการแบง่ตัวของเซลล์ของชัน้แกรนนูโลซา่และทีกา ของฟอลลิเคิลคณุภาพดีจะมมีากกวา่ฟอลลิเคิลท่ีคณุภาพไมดี่ (Moonmanee et al., 2013) จากภาพแสดงใหเ้หน็ถึงเซลล์ท่ียอ้มติด PCNA ซึ่งบง่บอกใหท้ราบถึงเซลล์มกีิจกรรมการแบง่ตัวและเพิม่จำานวนเซลล์ในชัน้แกรนูโลซา่และชัน้ทีกาของฟอลลิเคิลขนาดเล็ก (Figure 1-A) ขนาดกลาง (Figure 1-B) และขนาดใหญ่ (Figure 1-C) ซึ่งสอดคล้องกับการศึกษาท่ีผ่านมาพบวา่การใชโ้ปรแกรมเหนี่ยวนำาระยะยาวกระตุ้นใหเ้กิดฟอลลิเคิลท่ีไมเ่กิดการฝ่อตามวงรอบ (persistent follicles) สง่ผลต่อการผสมติดตำ่าในโค (Gonzalez et al., 1994) และแพะ (Rubianes and Menchaca 2003) และเนื่องมาจากการท่ีโอโอไซต์แก่เกินไปสำาหรบักระบวนการปฏิสนธนิอกรา่งกายสง่ผลใหอั้ตราการผสมติดที่ตำ่า (Thammasiri et al., 2016)

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

217

218

219

220

221

222

223

224

225

226

227

228

229

230231

ความเขม้ขน้ของฮอรโ์มนโปรเจสเทอรโรนความเขม้ขน้ของฮอรโ์มน P4 ในเลือดแพะท่ีได้รบัการเหนี่ยวนำา

ตลอดการทดลองในแพะกลุ่มท่ีได้รบัการเหนี่ยวนำาระยะสัน้และระยะยาวตามลำาดับ (วนัท่ี 1/1 วนัท่ี 5/12 วนัท่ี 7/14 และ วนัท่ี 8/15) พบวา่ไมม่คีวามแตกต่างกันทางสถิติระหวา่งแพะทัง้สองกลุ่ม (Figure 2) ในวนัท่ี 1 ของการโปรแกรมเหนี่ยวนำาพบวา่ทัง้ระยะสัน้และยาวมคีวามเขม้ขน้ของ P4 ตำ่ากวา่ 2 ng/mL ตามลำาดับ (1.82 ± 0.32 และ 1.93 ± 0.37 ng/mL) ความเขม้ขน้ของ P4 เพิม่ขึ้นภายหลังจากสอดโฮโมนเป็น 3.69 ± 0.21 และ 4.42 ± 0.31 ng/ml ในวนัท่ี 5 และ 12 ตามลำาดับ และยงัมรีะดับความเขม้ขน้สงู ในวนัท่ี 7 และ 14 ตามลำาดับ (3.82 ± 0.23 และ 4.13 ± 0.37 ng/mL) สอดคล้องกับผลการศึกษาของ Rubianes and Menchaca (2003) พบวา่การใช ้P4 สงัเคราะหใ์นโปรแกรมเหนี่ยวนำาในระยะแอนเอสตรสั (anestrous) สง่ผลใหร้ะดับของ P4 เพิม่ขึ้นมากกวา่ระดับปกติในชว่งกลางและชว่งท้ายของวงรอบการเป็นสดั และหลังจากถอนฮอรโ์มนความเขม้ขน้ของ P4 ลดลงอยา่งรวดเรว็ไปท่ีระดับปกติ (≤2 ng/mL ภายใน 24 ชัว่โมง) (Figure 2) แต่อยา่งไรก็ตามการศึกษาในแพะ (Menegatos et al., 1995) พบวา่การใช ้P4 ในโปรแกรมระยะยาวมคีวามเกี่ยวขอ้งหรอืสง่ผลต่อการผสมติดท่ีตำ่า

สรุปจากการศึกษาครัง้นี้ทำาใหท้ราบถึงการเหนี่ยวนำาการเป็นสดัแบบ

ระยะสัน้รว่มกับโกนาโดโทรฟนิ ฮอรโ์มน ไมพ่บความแตกต่างกันของจำานวนและดัชนีชีว้ดัการเจรญิเติบโต ของฟอลลิเคิลขนาดเล็กและขนาดกลาง ความเขม้ขน้ P4 ในชว่งตลอดการทดลองในแพะทัง้สองกลุ่มเมื่อเปรยีบเทียบกับโปรแกรมการเหนี่ยวนำาแบบระยะยาว แต่พบวา่จำานวนและดัชนีชีว้ดัการเจรญิเติบโตในชัน้แกรนูโลซา่ของฟอลลิเคิลขนาดใหญ่

232

233

234

235

236

237

238

239

240

241

242

243

244

245

246

247

248

249

250

251

252

253

254

255

256

257

258

และโอโอไซต์คณุภาพดีท่ีมคีวามแตกต่างกันระหวา่งแพะทัง้สองกลุ่ม โดยขอ้มูลดังกล่าวทำาใหท้ราบถึงการใชโ้ปรแกรมระยะสัน้สามารถลดผลเสยีของโปรแกรมระยะยาวที่มต่ีอคณุภาพของโอโอไซต์ซึ่งสง่ผลต่อการผสมติดหลังการใชโ้ปรแกรมและการพฒันาของตัวอ่อนต่อไปในแพะ

กิตติกรรมประกาศขอขอบคณุสาขาเทคโนโลยกีารผลิตสตัว ์คณะเทคโนโลยี

อุตสาหกรรมเกษตร มหาวทิยาลัยกาฬสนิธุ ์และ ภาควชิาสตัวศาสตร ์คณะเกษตรศาสตร ์มหาวทิยาลัยขอนแก่นท่ีใหท้นุในการนำาเสนอผลงานในครัง้น้ี

เอกสารอ้างอิงBogacki, M., M. Wasielak, A. Kitewska, I. Bogacka, and

B.M. Jalali. 2014. The effect of hormonal estrus induction on maternal effect and apoptosis-related genes expression in porcine cumulus-oocyte complexes. Reprod. Biol. Endocrine 12: 32 - 40.

Crozet, N., M. Ahmed-Ali, and M.P. Dubos. 1995. Developmental competence of goat oocytes from follicles of different size categories following maturation, fertilization and culture in vitro. Reproduction 103: 293 - 298.

Grazul-Bilska, A. T., C. Navanukraw, M. L. Johnson, K. A. Vonnahme, S. P. Ford, L. P. Reynolds, and D. A. Redmer. 2007. Vascularity and expression of angiogenic factors in bovine dominant follicles of the first follicular wave. J. Anim. Sci. 85: 1914 -1922.

Gonzalez, A., H. Wang, T.D. Carruthers, B.D. Murphy, and R.J. Mapletoft. 1994. Superovulation in the cow with pregnant mares’ serum gonadotrophin:

259

260

261

262

263

264

265

266

267

268

269

270

271

272

273

274

275

276

277

278

279

280

281

282

283

284

285

286

287

288

289

effects of dose and antipregnant mare serum gonadotrophin Can. Vet. J. 35: 158 - 162.

Gonzalez, F., M. Batista, F. Cabrera, P. Calero, J.L. Alabart and A. Gracia, 2001. Local effect of the corpus luteum on ovarian follicular functional and morphological features in the goat. Reprod. Dom. Anim., 36: 147 - 151

Lertchunhakiat, K., C. Navanukraw, J. Thammasiri, W. Jaikan A. Swannakorn, T. Moonmanee, and D. A. Redmer. 2012. Evaluation of protocols based on synthetic progesterone and gonadotropin on estrus, and ovulatory response in Thai-native goats. J. Anim. Vet. Adv. 11: 3385 - 3389.

Lonergan, P., P. Monaghan, D. Rizos, M.P. Boland, and L. Gordon. 1994. Effect of follicle size on bovine oocyte quality and developmental competence following maturation, fertilization, and culture in vitro. Mol. Reprod. Dev. 37: 48 - 53.

Lucy, M.C., H. Jiang, and Y. Kobayashi. 2001. Changes in the somatotrophic axis associated with the initiation of lactation. J. Dairy Sci. 84: E113 - E119.

Menegatos, J., S.E. Chadio, G. Karatzas, and G. Stoforos. 1995. Progesterone levels throughout progestagen treatment influence the establishment of pregnancy in the goat. Theriogenology 43: 605 - 613.

Moonmanee, T., C. Navanukraw, S. Uriyapongson, A. Kraisoon, S. Aiumlamai, S. Guntaprom, T. Rittirod, P.P. Borowicz, and D.A. Redmer. 2013. Relationships among vasculature, mitotic activity, and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in bovine antral follicles of the first follicular wave. Domest. Anim. Endocrinol. 45: 11 - 21.

290

291

292

293

294

295

296

297

298

299

300

301

302

303

304

305

306

307

308

309

310

311

312

313

314

315

316

317

318

319

320

321

322

323

324

NRC. 2007. Nutrient requirements of small ruminants: sheep, goats, cervids, and new world camelids. National Academies Press, Washington DC.

Powell, M.R., M. Kaps, W.R. Lamberson, and D.H. Keisler. 1996. Use of melengestrol acetate-based treatments to induce and synchronize estrus in seasonally anestrous ewes. J Anim. Sci. 74: 2292 - 22302.

Rubianes, E., A. Menchaca. 2003. The pattern and manipulation of ovarian follicular growth in goats. Anim. Reprod. Sci. 78: 271 - 287.

SAS. 2001. SAS System (Release 8.2). SAS Institute Inc., Cary, NC.

Steel, R. G. D., J. H. Torrie, and D. A. Dickey. 1997. Principles and procedures of statistics a biometrical approach. 666 p.

Thammasiri J., C. Navanukraw, S. Uriyapongson, K. Lertchunhakiat, and S. Boonkong. 2016. Assessment of caprine corpora lutea growth, progesterone concentration and eNOS expression: Effect of a compensatory gain model. Domest. Anim. Endocrinol. 56: 45 - 46.

Ungerfeld, R., E. Rubianes. 1999. Effectiveness of short-term progestagen primings for the induction of fertile oestrus with eCG in ewes during late seasonal anoestrus. J. Anim. Sci. 68: 349 - 353.

325

326

327

328

329

330

331

332

333

334

335

336

337

338

339

340

341

342

343

344

345

346

347

348

349

350

351

352353

354

355

356

357

358

359

Figure Legends

Figure 1 Immunohistochemistry of PCNA in tissue sections of small follicle (A), medium follicle (B) and large follicle (C). The brownish color indicates positive PCNA staining (arrow). The blue color indicates negative PCNA staining (arrowheads). Magnification was with ×20 objective. The large whitish area on each image is the follicular antrum. Arrows identify the basement membrane. Magnification was with x20 objective lens. Scale bars represent 50 µm. G, granulosa cell layers; T, theca cell layers.

Figure 2 Plasma progesterone concentration in goats synchronized with MAP and PMSG

360

361

362

363

364

365

366

367

368

369370

371

372

373

374

375

376

377

378

379

380

381

382

383384

385

386

387

388

389

390

391

392

Table 1 Effect of short-term (7 days) and long-term (14 days) progestin based protocol on number of visible follicles, oocyte collected and healthy oocytes

Measurement Short term Long term P-valueNo. of goats 12 12Small follicle ≤3 mm (n)

5.42 ± 0.43

5.50 ± 0.51

0.9027

Medium follicle 4-6 mm (n)

5.92 ± 0.46

5.83 ± 0.47

0.8981

Large follicle ≥7 mm (n)

3.2 ± 0.17a

2.4 ± 0.15b

0.0019

Total number of follicles (n)

14.54 ± 0.87

13.75 ± 0.76

0.5001

Total number of oocytes (n)

12.79 ± 0.89

12.75 ± 0.70

0.9710

Healthy oocytes (n)

9.42 ± 0.73a

5.50 ± 0.65b

0.0006a, b Within a row, means with different superscripts differ (P < 0.05).

393

394

395

396

397

398

399

400

401

402

403

404

405

406

407

408

409

410

411

412413

Table 2 Labeling index of granulosa and theca cells of small follicle (≤3 mm), medium follicle (4-6 mm) and large follicle (≥7 mm)

Items

Small follicle (≤3 mm)

Medium follicle (4-6 mm)

Large follicle (≥7 mm)

Granulosa labelingindex (%)

Thecalabelingindex (%)

Granulosalabelingindex (%)

Thecalabelingindex (%)

Granulosalabelingindex (%)

Thecalabelingindex (%)

ST 35.75 ± 1.67

17.83 ± 1.05

27.75 ± 1.30

16.42 ± 1.10

24.92 ± 0.91a

14.67 ± 0.84

LT 36.25 ± 0.99

16.50 ± 1.25

26.08 ± 0.81

15.17 ± 1.39

19.58 ± 1.18b

12.83 ± 0.59

a, b Within a column, means with different superscripts differ (P < 0.05).ST = Short-term, LT= Long-term

414

415

416

417418419420421

422