“Cursos de capacitación y actualización para la prevención y vigilancia de EETs”

Etiología y diagnóstico de las Encefalopatías

Espongiformes Transmisibles de los

animalesLaboratorio de Referencia para EET de los Laboratorio de Referencia para EET de los

AnimalesAnimalesCentro de Investigación en Ciencias Centro de Investigación en Ciencias

Veterinarias y Agrícolas - INTA CastelarVeterinarias y Agrícolas - INTA Castelar

Origen de la EEBOrigen de la EEB

• Garrapatas, Garrapatas, organoclorados????organoclorados????

•Enfermedad Enfermedad espontánea????espontánea????

• Origen exótico????Origen exótico????

• Origen humano???? Origen humano???? ((Colchester & Colchester Lancet. 366, 856; 2005).

Hipótesis sobre el origenHipótesis sobre el origen• ScrapieScrapie

• ScrapieScrapie ??

Ovino:Ovino: gen gen SipSip ssAA/s/sAA 150-200 días150-200 días

ssAA/p/pAA 300 días300 días

ppAA/p/pAA

PRNPPRNP1936: Transmisión experimental de Scrapie

Scrapie: enfermedad genética?Scrapie: enfermedad genética?

Agente etiológicoAgente etiológico

Características del agente de Características del agente de EETEET

-Hay cepas -Barrera de la especie-Tamaño similar a virus

-No hay respuesta de anticuerpos-Resistencia (calor, radiaciones, nucleasas)-Sensibilidad parcial a proteasas-Ácido nucleico?

(tiempo de incubación, lesiones SNC)

Modelo de agente de TSEModelo de agente de TSE

Debe explicarDebe explicar

--Falta de respuesta de anticuerposFalta de respuesta de anticuerpos

-Existencia de cepas -Existencia de cepas (tiempo de incubación, lesiones)(tiempo de incubación, lesiones)

-Barrera de la especie -Barrera de la especie (transmisión estocástica)(transmisión estocástica)

Calor húmedo121 ºC, 1 atm, 20 minIncompleta

133 ºC, 3 bar, 20 min133 ºC, 3 bar, 20 min

Calor seco138 ªCIncompleta

Métodos químicos

Hidróxido de Sodio 1N, 24 hsHidróxido de Sodio 1N, 24 hsHidróxido de Sodio 2N, 2 hsHidróxido de Sodio 2N, 2 hsHipoclorito de Sodio 12 hsHipoclorito de Sodio 12 hs

Inactivación del agente de EEBInactivación del agente de EEB

Agentes hipotéticos de "Scrapie"Agentes hipotéticos de "Scrapie"

• VirusVirus

LentosNo convencionales

• "Virino“

• Agentes no convencionales

PRIONES

Hipotéticos

Alper et al., BBRC 22: 278 (1966)Pattison & Jones, Vet Rec 80: 2 (1967)Griffith, Nature 215: 1043 (1967)

Merz et al., Merz et al., Acta Neuropathol Acta Neuropathol 5454: 63 (1981): 63 (1981)

SAF: Scrapie Associated FibrilsSAF: Scrapie Associated Fibrils

PrPPrP

“Pequeñas partículaspartículas proteináceas que resisten la inactivación por métodos que modifican ácidos nucleicos”

PrionesPriones

Stanley B. Prusiner. Science 216: 136-144, 1982

PrPPrPCC: proteína normal del : proteína normal del huespedhuespedPrPPrPScSc: proteína patogénica de : proteína patogénica de ScrapieScrapie

Isoformas de PrPIsoformas de PrP

NormalNormal PrP PrPCC (33-35 kD)(33-35 kD)

Asociada aAsociada aenfermedadenfermedad PrPPrPScSc (33-35 kD)(33-35 kD)

PrPPrP27-3027-30 (27-30 (27-30

kDkD))

Proteinasa Proteinasa KKDetergentDetergentee

++

++

--

--

Isoformas PrPIsoformas PrPCC y PrP y PrPScSc

PrPPrPCC PrPPrPScSc

DetergentesDetergentes soluble insoluble

ProteasasProteasas sensible resistente(PrP27-30)

--hélice (%)hélice (%) 42 30

hoja hoja (%)(%) 3 43

Modelo de nucleación-polimerizaciónModelo de nucleación-polimerización

PrPC PrPSc

(Equilibrio entre las dos isoformas)

Nucleación(muy lenta)

Incorporación de monóméros PrPSc (rápida)

Núcleo infeccioso Estructuraamiloide Fragmentación

en núcleos infecciosos

PrPrPP

Tiempo de incubaciónTiempo de incubación AñosAños Diagnóstico preclínicoDiagnóstico preclínico No No PrevenciónPrevención No No Signos clínicosSignos clínicos Neurológicos Neurológicos TratamientoTratamiento No No CuraCura No No EvoluciónEvolución Rápida Rápida DesenlaceDesenlace FatalFatal Diagnóstico definitivoDiagnóstico definitivo Post Post mortemmortem

Encefalopatías Espongiformes Encefalopatías Espongiformes TransmisiblesTransmisibles

NHNHCOOHCOOH

Prusiner, Science 278: 245 (1997)

108108 189189

LLFF

TTVV

MurinoMurinoBovinoBovino

8686

OctapéptidosOctapéptidos

136136

AAVV

142142 154154

HHRR

171171QQRRHH

OvinoOvino

IIMM

CaprinoCaprino

ELW/00

Polimorfismos en PrP animalesPolimorfismos en PrP animales

Scrapie:Scrapie:95% QQ95% QQ171171

Esquema del gen PRNP de los ovinos

Valina (V) Fenilalanina (F) Arginina (R) Arginina (R) Alanina (A) Leucina (L) Histidina (H) Glutamina (Q)

Histidina (H)

136 141 154 171

Polimorfismo del gen PRNP

Nivel de Riesgo Polimorfismo RAZAS

R1 ARR / ARRCharollais, Bleu de Maine, Bluefaced Leicester, Hampshire, Suffolk, Blackface, Cheviot, Texel

R2AHQ / AHQARR / AHQ

Bluefaced Leicester, Blackface, Cheviot, Texel

R3

AHQ / ARQBluefaced Leicester, Blackface, Cheviot, Texel

AHQ / ARHARR / ARH

Texel

ARR / ARQ*Charollais, Bleu de Maine, Bluefaced Leicester, Texel Blackface, Cheviot, Hampshire , Suffolk

R4

VRQ / ARR Blackface, Cheviot, Texel

VRQ / ARH Charollais, Bleu de Maine, Texel

VRQ / AHQ Blackface, Cheviot, Texel

ARQ / ARQCharollais, Bleu de Maine, Blackface, Cheviot

ARQ / ARHARH / ARH

Texel

R5VRQ / VRQVRQ / ARQ

Charollais, Bleu de Maine, Blackface, Cheviot,Texel

Alelos y genotipos más frecuentes del gen PRNP

Genotipo Grupo NSP Grado de resistencia / susceptibilidad

ARR / ARR 1 Ninguna restricción para su reproducción

ARR / AHQARR / ARHARR / ARQ

2 Ninguna restricción para su reproducción

AHQ / AHQARH / ARHAHQ / ARHARQ / ARHARQ / AHQARQ / ARQ

3Dependiendo de la raza, tiempo máximo para su venta o uso limitado para su reproducción en campos asociados a NSP

ARR / VRQ 4Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP, tampoco para su venta. Reglamentación de castración / sacrificio del ovino

ARQ / VRQARH / VRQAHQ / VRQVRQ / VRQ

5Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP, tampoco para su venta. Reglamentación de castración / sacrificio del ovino

Grupos de riesgo de adquisición de Scrapie por resistencia / susceptibilidad genética

P C RP C R

SecuenciaciónSecuenciación

Manual o AutomáticaManual o Automática

Determinación de genotiposDeterminación de genotipos

PCR - RFLPPCR - RFLP

PCR - ELISAPCR - ELISA

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Nro

. ab

solu

to

1

Genotipos

ALRQ / ALRQ

ALRR / ALRQ

ALRR / ALRR

ALHQ / ALRQ

VLRQ / ALRQ

ALHQ / ALHQ

ALRH / ALRQ

AFRQ / ALRQ

ALRH / ALRR

ALRH / ALRH

AFRQ / ALRR

VLRQ / ALRR

VLRQ / VLRQ

ALHQ / ALRR

ALHQ / ALHR

VLRQ / ALHQ

AFRQ / AFRQ

AFRQ / ALHQ

VLRQ / ALRH

VLRQ / AFRQ

VLRH / ALRH

VLRH / ALRR

AFRR / ALRR

ALHR / ALHR

ALHQ / ALRH

Determinación de las frecuencias de genotipos

47.

33%

29.

00%

9.5

0%

4.6

7%

4.5

0%

3.6

7%

0.8

3%

0.3

3%

0.1

7%

ALRQ

ALRR

ALHQ

ALRH

VLRQ

AFRQ

ALHR

VLRH

AFRR

Determinación de las frecuencias de los diferentes alelos

Genotipo Grupo NSP Grado de resistencia / susceptibilidad Porcentaje

ARR / ARR 1 Ninguna restricción para su reproducción 16,38

ARR / AHQARR / ARHARR / ARQ

2 Ninguna restricción para su reproducción 25,25

AHQ / AHQARH / ARHAHQ / ARHARQ / ARHARQ / AHQARQ / ARQ

3Dependiendo de la raza, tiempo máximo para su venta o uso limitado para su reproducción en campos asociados a NSP

50,51

ARR / VRQ 4Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP, tampoco para su venta. Reglamentación de castración /

sacrificio del ovino1,36

ARQ / VRQARH / VRQAHQ / VRQVRQ / VRQ

5Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP, tampoco para su venta. Reglamentación de castración /

sacrificio del ovino6,48

Determinación de las frecuencias de los grupos de riesgo

Cepas de ScrapieCepas de Scrapie

-20 definidas por pasaje en ratón20 definidas por pasaje en ratón

- Nor 98: aislada de casos de campo:- Nor 98: aislada de casos de campo:

Definida por:Definida por:- - ClínicaClínica- Histopatología- Histopatología- “R” en 171: susceptible- “R” en 171: susceptible

Casalone et al. Proc Natl Acad Sci 101:3065, 2004

Cepas de BSECepas de BSE

BASE: Bovine Amyloidotic Spongiform EncephalopathyBASE: Bovine Amyloidotic Spongiform Encephalopathy

1: Italia1: Italia

2) Francia: 2) Francia: Biacabe et al , EMBO reports, 5: 110, 2004 Biacabe et al , EMBO reports, 5: 110, 2004

3) Japón?? 3) Japón??

Biacabe et al , EMBO reports, 5: 110, 2004

“Molecular analysis of ovine prion protein identifies similaritiesbetween BSE and an experimental isolate of natural scrapie,CH1641”. Hope et al., J Gen Virol. 80: 1, 1999Hope et al., J Gen Virol. 80: 1, 1999

““Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases”Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases”

Diagnóstico de EETDiagnóstico de EET

•Solamente en el Solamente en el post post mortemmortem

•““Test del tercer párpado” (in vivo) para Test del tercer párpado” (in vivo) para

“scrapie”“scrapie”

-Histopatología-Histopatología

-Detección de PrP:-Detección de PrP:

InmunohistoquímicaSAF

Western Blot ELISA

Histopatología(Lesión espongiforme)

Inmunohistoquímica(Depósitos de PrP)

En ovinosEn ovinos

SAF: Scrapie Associated FibrilsSAF: Scrapie Associated Fibrils

Medula Oblongata (Región del Obex)

1) Médula espinal

2) Cerebro

3) Región del Obex

4) Area utilizada para WB/ELISA

5) Muestra de elección

Tests rápidos

Scrapie- IDEXX Herdchek

- InPro CDI-5

BSE

-Prionics Check Western

-Prionics LIA

-TeSeE (BioRad)

-CDI InPro

- CediTect BSE Test

- Enfer TSE Kit version 2.0, automated sample preparation

- IDEXX HerdChek BSE Antigen Test Kit, EIA

- Institut Pourquier Speed´it BSE

- Prionics Check PrioSTRIP

- Roboscreen Beta Prion BSE EIA Test Kit

- Roche Applied Science PrionScreen

Métodos de referencia:Métodos de referencia:

-Histopatología -Histopatología

--InmunohistoquímicaInmunohistoquímica

-Western blot -Western blot

Métodos utilizados en el Programa de Vigilancia de

Argentina

Test rápidos:Test rápidos:

--Western blot (Prionics)Western blot (Prionics)

- - Enfer TSE (ensayo piloto-2003)Enfer TSE (ensayo piloto-2003)

Detección de PrPDetección de PrPScSc en sangre en sangre (Scherr et al.,(Scherr et al., J. ChromatJ. Chromat 697: 223, 1997)697: 223, 1997)

Unión de PrPUnión de PrPScSc a plasminógeno en soporte a plasminógeno en soporte sólido sólido

(Fischer et al., Nature 408: 479, 2000)(Fischer et al., Nature 408: 479, 2000)

Detección de PrPDetección de PrPScSc en orina en orina (Shaked et al., J Biol Chem (Shaked et al., J Biol Chem 276: 31479, 2001)276: 31479, 2001)

““Protein misfolding cyclic amplification”Protein misfolding cyclic amplification”(Saborio et al. Nature 411: 810, 2001)(Saborio et al. Nature 411: 810, 2001)

Detección de secuencias cortas de ADN asociadas a EET en sangre

( Schütz et al, Clin Diagn Lab Inmunol. 12 (7): 814-820, 2005)

Algunos métodos en estudio Algunos métodos en estudio (in vivo)(in vivo)

Laboratorio de referencia para el Laboratorio de referencia para el diagnóstico de EET de animalesdiagnóstico de EET de animales

B. J. Carrillo F.J. Blanco Viera E. L. WeberM. AlegreF. CapellinoF. DelgadoS. DuffyD. FunesL. JiménezE. LeónA. MarcosS. MartínezG. PintoC. SotoC. VallejosC.HirschvogelA. MarcosG. FigueroaS. CarcellerA. Elisei

Centro de Investigación en Ciencias Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y AgronómicasVeterinarias y Agronómicas

CastelarCastelar

GRACIAS