T.C.
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
PARAZİTOLOJİ ANABİLİM DALI
KALA-AZARLI HASTALARDA ETKEN TÜRLERİN PCR-RFLP
YÖNTEMİ İLE TANIMLANMASI
Dr. Dilek NAS ÖZERDEM
DOKTORA TEZİ
DANIŞMANI
Prof. Dr. İsmail Soner KOLTAŞ
ADANA-2009
ii
TEŞEKKÜR
Doktora eğitimim süresince bilgi ve tecrübelerini esirgemeyen, tez konumun seçimi
ve yürütülmesinde yol gösteren ve destekleyen tez danışmanım Parazitoloji Anabilim
Dalı Başkanı Prof. Dr. İsmail Soner KOLTAŞ’a teşekkür ederim.
Tez çalışmalarım süresince bilgi ve tecrübelerini benimle paylaşan Parazitoloji
Anabilim Dalı Bilim Uzmanı Biyolog Fadime EROĞLU ve Biyokimya Anabilim Dalı
Doktora öğrencisi Biyolog Ahmet GENÇ’e teşekkür ederim.
Örneklerimin toplanmasında desteğini esirgemeyen Parazitoloji Anabilim Dalı
çalışanlarına ve tezimin yazılmasındaki katkılarından dolayı Dr. Günhan ÖZERDEM’e
teşekkür ederim.
Ayrıca tez çalışmasını TF2005D4 no’lu proje ile destekleyen Ç.Ü. Rektörlüğü
Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi’ne teşekkür ederim.
Dr. Dilek NAS ÖZERDEM
iii
İÇİNDEKİLER
KABUL VE ONAY i
TEŞEKKÜR ii
İÇİNDEKİLER iii
ŞEKİLLER DİZİNİ vi
ÇİZELGELER DİZİNİ vii
ÖZET viii
ABSTRACT ix
1.GİRİŞ 1
2.GENEL BİLGİLER 3
2.1.Leishmania’ların Sınıflandırılması 4
2.2.Yapı 5
2.2.1.Amastigot Şekil 5
2.2.2.Promastigot Şekil 6
2.3.Leishmania Parazitlerinin İnce Yapısı 7
2.3.1.Plazma Zarı ve İlgili Organeller 7
2.3.2.Kamçı ve Bazal Cisim 8
2.3.3.Kinetoplast 8
2.3.4.Mitokondri 9
iv
2.3.5.Çekirdek 9
2.3.6.Diğer Organeller 9
2.4.Leishmania’ların Evrimi 9
2.5.Visseral Leyişmanyoz 12
2.5.1.Epidemiyoloji 12
2.5.1.1.Dünyada Visseral Leyişmanyoz 12
2.5.1.2.Türkiye’de Visseral Leyişmanyoz 12
2.5.2.İmmünoloji 13
2.5.3.Patogenez 15
2.5.4.Klinik 16
2.5.4.1.İmmun Yetmezliği Olan Kişilerde Kala-Azar 18
2.5.4.2. Kala-Azar Sonrası Deri Leyişmanyozu 19
2.5.5.Tanı 19
2.5.5.1.Etkensel Tanı 19
2.5.5.2.Serolojik Tanı 21
2.5.5.2.1.rK39 Hızlı Tanı Testi 22
2.5.5.3.Moleküler Tanı 22
2.5.5.3.1.Polimeraz Zincir Reaksiyonu 23
2.5.5.3.2.Restriksiyon Enzimi Uzunluk Polimorfizmi 23
2.5.6.Tedavi 24
2.6.Leishmania Türlerinin PCR-RFLP ile Tanımlanması 25
3. GEREÇ VE YÖNTEMLER 28
3.1.Kan Örneklerinden DNA İzolayonu 28
v
3.2.Amplifikasyon İçin Gerekli Çözeltiler ve Kimyasal Maddeler 29
3.2.1.Çözeltiler 29
3.2.2.Amplifikasyon Koşulları 30
3.2.3.Termal Cycler ile PCR Protokolü 30
3.2.4.Agaroz Jelde Yürütme 31
3.2.5.1.Çözeltiler 31
3.2.5.2.Yöntem 31
3.3.Restriksiyon Enzimi Uzunluk Polimorfizmi 32
4. BULGULAR 33
5. TARTIŞMA 37
6. SONUÇLAR ve ÖNERİLER 44
7. KAYNAKLAR 46
8. EKLER 51
9. ÖZGEÇMİŞ 53
vi
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil.1.1. Leishmania amastigotu 6
Şekil.1.2. Leishmania promastigotları 6
Şekil.2.1. Leishmania amastigot ince yapısı 7
Şekil.2.2. Leishmania promastigot ince yapısı 8
Şekil.3. Leishmania’nın yaşam döngüsü 11
Şekil.4. Miniekzon PCR-RFLP genotipleri 27
Şekil.5.13A-13B primerleri ile amplifiye olmuş örneklerin PCR sonuçları 35
Şekil.6.Fme-Rme primerleri ile amplifiye olmuş örneklerin PCR sonuçları 35
Şekil.7.Eae I restriksiyon enzimi ile kesilen ve L.donovani bulunan örnekler 36
Şekil.8. Eae I restriksiyon enzimi ile kesilen ve L.infantum bulunan örnekler 36
vii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 1. Visseral leyişmanyozlu hastaların klinik belirtileri 17
Çizelge 2. Visseral leyişmanyoz tanısında kullanılan yöntemlerin karşılaştırılması20
Çizelge 3. Araştırma ve gelişim dönemindeki antileishmania ilaçları 25
Çizelge 4. Leishmania cinsine özgül primer dizilimi 30
Çizelge 5. 13A-13B ve Fme-Rme primerleri için kullanılan PCR programı 30
Çizelge 6. Enterobacter aerogenes (Eae I) restriksiyon enzimi 32
Çizelge 7. rK39 ve mikroskop bakısı ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması 33
Çizelge 8. PCR ve mikroskop bakısı ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması 33
Çizelge 9. PCR ve rK39 ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması 34
viii
ÖZET
KALA-AZARLI HASTALARDA ETKEN TÜRLERİN PCR-RFLP YÖNTEMİ
İLE TANIMLANMASI
Kala azar( VL) özellikle Çukurova bölgesinde ve ülkemizde halen önemli
bir halk sağlığı sorunudur. Akdeniz’e kıyısı bulunan ülkelerde endemiktir.
Hastalığın tanısında kemik iliğinden ve kandan yapılan yayma preparat, kültür ve
serolojik yöntemler kullanılmaktadır. Visseral leyişmanyoz (VL) endemik
bölgelerde yaşayan immun sistemi baskılanmış HIV enfeksiyonlu hastalarda
olduğu gibi bağışıklığı yetersiz hastalarda da fırsatçı bir infeksiyon olarak
bildirilmektedir. Bu yüzden visseral leyişmanyozun tanısı böyle hastalarda zordur,
serolojik tanı güvenilir sonuçlar vermemekte, ayrıca kültür yöntemi ve doğrudan
mikroskop bakısı da hassas olmamakta ve kültür zaman alıcı olmaktadır. Bu
nedenle, son yıllarda hastalığın tanısı ve daha da önemlisi hangi türün hastalığa
neden olduğunu saptamak için özellikle DNA’ya dayalı moleküler yöntemler
geliştirilmiştir.
Bu çalışmada visseral leyişmanyoz ön tanısı ile izlenen 50 hastaya ait kan
örnekleri doğrudan mikroskop bakısı, rK39 hızlı tanı testi ve PCR-RFLP yöntemi
ile çalışıldı. On hastanın doğrudan mikroskop bakısında amastigotlar görülürken,
40 hastanın mikroskop bakısında amastigotlar görülmedi. On üç hasta rK39 (+)
pozitif, otuz yedi hasta rK39(-) negatif bulundu. Yirmi dokuz hastanın PCR (+)
pozitif, yirmi bir hastanın PCR (-) negatif olduğu görüldü. PCR’ ın doğrudan
mikroskop bakısı ve rK39 hızlı tanı testine oranla sırasıyla %90 -% 100 duyarlı ve
%50-% 56.8 özgül olduğu görüldü. Sonuç olarak bu çalışmada etken türlerin
L.infantum ve L.donovani olduğu saptandı.
Anahtar Sözcükler: Visseral leyişmanyoz, ayırıcı tanı, PCR-RFLP.
ix
ABSTRACT
IDENTIFICATION OF CAUSATIVE SPECIES IN PATIENTS WITH
VISCERAL LEISHMANIOSIS BY PCR-RFLP ASSAY
Visceral leishmaniosis is a health care problem especially in Çukurova
region and in Turkey. Visceral leishmaniosis is endemic in the countries beside of
the Meditterranean Sea. Direct microscopic examination from blood and bone
marrow, culture and serological tests are the methods that used for diagnosis of
visceral leishmaniosis. Visceral leishmaniosis has been reported to be an
oppurtunistic infection in immunosuppressed patients and immunocompromised
subjects such as patients with human immunodeficiency virus infections living in
areas in which visceral leishmaniosis is endemic. Because of this the diagnosis of
visceral leishmaniosis is difficult in such patients, serological diagnosis is not
reliable for immunosuppressed patients, direct diagnosis and culture is not
sensitive and culture is time consuming. Therefore recently several methods
especially based on DNA have been developed for the diagnosis and more
important from that for the identification of the species which caused infections.
In this study, blood samples belonging to 50 patients whose were following
by preliminary diagnosis of visceral leishmaniosis were studied by direct
microscopic examination, rK39 dipstick test and PCR-RFLP. Amastigote forms
were detected from 10 samples, and not detected other 40 samples by direct
microscopic examination. Thirteen samples were found to be rK39 (+) and 37
samples were found to be rK39 (-). Twenty nine samples were (+) and 21 samples
were (-) by PCR. Sensitivity of PCR was found to be %90-%100 compare to direct
microscopic examination and rK39 dipstick test. On the other side specifity of PCR
was found to be %50-%56.8 compare to direct microscopic examination and rK39
dipstick test. As a result, in this study we found the causative species as L.infantum
and L.donovani.
Key Words: Visceral leishmaniosis, identification, PCR-RFLP.
1
1.GİRİŞ
Leyişmanyoz (Leishmaniosis) dünyada vektör aracılığı ile yayılan hastalıklar
arasında önem sırasına göre üçüncü sırada yer alan, 72’si az gelişmiş veya gelişmekte
olan ülke olmak üzere toplam 88 ülkenin tropikal ve subtropikal bölgelerinde görülen
bir hastalıktır. Afrika, Amerika ve Asya’nın pek çok ülkesinde endemiktir. Dünyada
bilinen 12-13 milyon leyişmanyoz olgusu vardır ve yılda tahminen 500.000’i visseral
(organ leyişmanyozu, kala azar) leyişmanyoz olmak üzere 2 milyon yeni olgu
görülmektedir, 350 milyon insan infeksiyon riski altındadır. Hastalığın bildirimi 32
ülkede zorunludur ve önemli sayıda olgu tespit edilememektedir 1,2,3.
Avrupa’da; Fransa, İtalya, Yunanistan, Malta, İspanya ve Portekiz’in de içinde
bulunduğu 16 ülkede insan olguları görülmektedir. Deri leyişmanyozu olgularının
%90’ından fazlası İran, Afganistan, Suudi Arabistan, Suriye, Brezilya ve Peru’dadır.
Kala-azar olgularının %90’ından fazlası ise Bangladeş, Brezilya, Hindistan, Nepal,
Etiyopya ve Sudan’dadır. Kala-azardan iyileşmeyi takiben ortaya çıkabilen ve kala-azar
sonrası dermal leyişmanyoz (PKDL) olarak bilinen şekil ise Hindistan ile başlıca Sudan
ve Kenya olmak üzere diğer Afrika ülkelerinde görülmektedir. Deri leyişmanyozunu
takiben ortaya çıkabilen ve mukokutanöz leyişmanyoz olarak bilinen diğer şekli ise
Meksika ile Orta ve Güney Amerika’da endemiktir 1,2.
Yirmiden fazla Leishmania türü insanlarda infeksiyona neden olabilir ve 30’dan
fazla tatarcık türü hastalığın yayılımında rol alır 2.
Kala-azar, sıtma, tifo, tüberküloz gibi bir grup hastalıklar ile benzer klinik
şekillerde görülebildiğinden ve bunların bazıları da kala-azar ile birlikte olabileceğinden
(koenfeksiyon) klinik tanısı zordur. Ayrıca HIV nedeni ile bağışıklığı baskılanmış
hastalarda leyişmanyoz, fırsatçı infeksiyon olarak da karşımıza çıkabilmektedir. Bu
nedenle 1980’lerin başından beri leyişmanyoz tanısında kullanılan klasik metodlara
ilaveten DNA’ya bağlı moleküler teknikler gerek tanı gerek hastalığa neden olan türü
tanımlamak için geliştirilmiştir. Çeşitli moleküler yöntemler ile infeksiyon tanımı için
2
Leishmania DNA’sını bulma ve türlerin tanımlanması hedeflenmiştir. Birçok araştırıcı
tarafından Leishmania’ya özgü primerler ile PCR amplifikasyonu yapılarak (nükleer
veya minisörkıl kinetoplast DNA, small subunit RNA veya miniekson DNA sekansları)
tür tayini yapılmaktadır. Leishmania türlerini tanımlamak için kullanılan metodlar
multiplex PCR, rastgele amplifiye polimorfik DNA (RAPD), single-strand
konformasyon polimorfizmi, restriksiyon fragment length polimorfizmi (RFLP) ve
DNA dizi analizidir. DNA’ya dayalı bu genotipik moleküler teknikler diğer tanı
yöntemlerine oranla daha güvenilir ve özgüldür 5,6,7.
Bu çalışmada klasik metodlar ile tanısı konulan ya da konulamayan kala-azarlı
hastalarda tanı amacıyla polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi kullanılmış ve
restriksiyon enzimi uzunluk polimorfizmi (RFLP) yöntemi ile de tür tayini yapılmıştır.
3
2. GENEL BİLGİLER
Antartika dışında bütün kıtalarda görülen leyişmanyoz vektör aracılığı ile
yayılım gösteren zoonotik/antroponotik karakterli bir paraziter infeksiyon hastalığıdır 3.
Protozoonların Mastigophora grubunda bulunan Trypanosomatidae ailesinin
Leishmania ve Trypanosoma cinsi insanların kan ve dokularında yerleşirler 5,8.
Leishmania türleri yaşam döngülerinde biri omurgalı diğeri omurgasız olmak
üzere iki konak kullanırlar; insan, köpek, kemirgen, sırtlan, kobay gibi omurgalı
canlıların vücudunda hücre içi paraziti olarak amastigot şeklinde; omurgasız konakta ve
in vitro kültür ortamlarında promastigot şeklinde bulunurlar. Bu parazitlerin vektörü ya
da omurgasız konağı Eski Dünya’da Phlebotomus ve Yeni Dünya’da Lutzomyia cinsi
kan emici kum sinekleridir. Sadece dişi olanlar biyolojik vektörlük yapabilir; çünkü
erkek tatarcık kan emmez 5,8,9.
Leyişmanyoz insanda üç klinik şekilde görülür.
-İç organlar leyişmanyozu (visseral leyişmanyoz, VL, kala-azar)
-Deri leyişmanyozu (Kutanöz leyişmanyoz, KL)
-Mukokutanöz leyişmanyoz (Espundia, MKL)
Sonraki yıllarda diffüz (yaygın) deri leyişmanyozu (DKL) ve kala-azar sonrası
deri leyişmanyozu (PKDL) da bu gruplara eklenmiştir 3,8,9.
Asya’da kara hastalık veya kala-azar olarak bilinen visseral leyişmanyoz uzamış
ve düzensiz ateş, splenomegali, hepatomegali, kilo kaybı, progresif anemi, pansitopeni,
hipergamaglobulinemi ve komplikasyon olarak ciddi infeksiyonlarla karakterizedir.
Visseral leyişmanyoz hastalığın en ciddi şeklidir ve tedavi edilmezse %100 ölümle
sonuçlanmakta, bağışıklık bırakmamaktadır 3,4.
Visseral leyişmanyoz 88 ülkede görülmekle birlikte olguların %90’ı Hindistan
ve Sudan’dadır. Visseral leyişmanyozdan iyileşmeyi takiben bazı hastalarda (Sudan’da
%50 ve Hindistan’da %1-3 oranında) uzun süreli ve pahalı tedaviyi gerektiren kala-azar
sonrası deri leyişmanyozu (PKDL) gelişmektedir. Visseral leyişmanyozun yayılımında
bu hastalar önemli role sahiptir. Visseral leyişmanyoza Leishmana donovani kompleksi
neden olmaktadır. Bu kompleks üç türü kapsar; L. donovani, L. infantum ve L. chagasi.
4
L. donovani Hindistan’da görülen visseral leyişmanyoz etkenidir. L. infantum Akdeniz
bölgesinde çocuklarda görülen kala-azar etkenidir. Bununla birlikte bu bölgede HIV
infeksiyonunun artan prevalansı nedeniyle HIV-VL koenfeksiyonu erişkin
populasyonda sıklıkla rapor edilmektedir. L. chagasi ise Latin Amerika’da çocuklarda
görülen ve lenfadenopatinin baskın olduğu kala-azar etkenidir. Eski Dünya deri
leyişmanyozu etkeni olan L.tropica’nın bağışıklığı baskılanmış kişilerde kala-azara
neden olduğu da rapor edilmiştir 4.
Leishmania’nın 20’den fazla türü insanları infekte edebilir, özellikle HIV/AIDS
birlikteliğinde farklı türler görülebilmektedir. Hastalığın yayılımında rol alan 30 tatarcık
türü tanımlanmıştır. Leyişmanyoz hayvan rezervuarlardan dolayı zoonotik bir hastalık
iken bazı bölgelerde ise insan hastalığın tek rezervuarıdır, bu da vektör ve rezervuar
kontrolünü masraflı ve imkânsız kılmaktadır 2.
2.1. Leishmania’ların Sınıflandırılması
Leyişmanyozda insan infeksiyonu 30 Leishmania türünün 21’i tarafından
oluşturulmaktadır. Bu farklı türler yapısal olarak ayırt edilememekte ancak izoenzim
analizleri, moleküler metodlar veya monoklonal antikorlar kullanılarak tür tayinleri
yapılabilmektedir 3.
Alem: Protista
Alt alem: Protozoa
Şube: Sarcomastigophora
Alt şube: Mastigophora
Takım: Kinetoplastida
Aile: Trypanosomatidae
Cins: Leishmania
Türler: L. donovani, L. infantum, L. chagasi, L. tropica, L. major, L. aethiopica,
L. mexicana (L.m. mexicana, L.m. amazonensis, L.m. venezuelensis, L.m. pifanoi, L.m.
enrietti)
5
2.2. Yapı
Leishmania cinsine ait türlerin insan ve diğer memelilerin vücudunda kamçısız
(amastigot) ve tatarcık vücudunda kamçılı (promastigot) olmak üzere iki evrim şekli
vardır 3,5.
2.2.1 Amastigot Şekil
Amastigotlar 2.5-6.8 µm büyüklüğünde yuvarlak veya oval şekilli ve
hareketsizdir. Parçalı çekirdekli lökositler, monositler ve endotel hücreleri içinde tek tek
veya gruplar halinde veya hücre dışında bulunurlar. Besinlerini içinde bulundukları
hücreden alırlar, aeropturlar, büyük makrofajlar içinde boyuna ikiye bölünerek
çoğalırlar 3,8,10.
Amastigotlar çok küçük olduklarından dolayı ışık mikroskobunda Giemsa ile
boyalı preparatlarda mavi sitoplazmalı merkezi yerleşimli yuvarlak veya oval pembe-
koyu kırmızı çekirdek veya çekirdeğe bitişik fakat daha küçük olan yuvarlak veya
çubuk şeklinde parlak kırmızı-menekşe renkte boyanan bir sonraki dönemde kamçının
çıkacağı yer olan kinetoplast dışında iç yapısı ayırt edilemez (Şekil 1.1 ) 8,10.
Sitoplazmada ayrıca vakuoller, nokta şeklinde bleforablast (kamçı kökü) ve
bleforablasttan çıkıp ön kısımda sonlanan bir akson bulunmakta, ancak kamçı hücre
dışına serbest olarak çıkmamaktadır 3.
Bütün Leishmania türlerinde sitoplazmada tek bir mitokondrium, düz ve
granüllü endoplazmik retikulum, golgi cihazı ve lizozomlar yer almaktadır. Golgi cihazı
endositoz ve ekzositozda rol alır, lizozomlar içerdikleri hidrolitik enzimler sayesinde
çeşitli enzim aktiviteleri ile parazitin beslenmesine yardımcı olurlar 3,10.
6
Şekil 1.1. Leishmania amastigotu X100
2.2.2. Promastigot Şekil
Promastigotlar vektörü olan tatarcıkların bağırsaklarında ve amastigotların
uygun besiyerlerinde şekil değiştirmesinden sonra görülür. Promastigotlarda da
organeller sayıca değişmekle beraber aynıdır. En önemli fark promastigotların 8-15 µm
mekik şeklinde ve hareketli olmalarıdır. Ön uçtan çıkan 18-20 µm uzunluğunda serbest
bir kamçısı ve kamçı kökü yanında yerleşmiş 9 çift periferik ve bir çift merkezi liften
oluşmuş bir aksonemi bulunmaktadır. Ön uçta yuvarlak veya at nalı şeklinde bir
kinetoplast, kinetoplastın ön kısmında ve kamçının dip kısmında bleferoblast
bulunmaktadır. Merkezi bir çekirdek ve çekirdekçik ve çekirdek zarında da porlar
bulunmaktadır (Şekil 1.2 ) 8,10.
Şekil 1.2. Leishmania promastigotları X100
7
2.3 Leishmania Parazitlerinin İnce Yapısı 2.3.1. Plazma Zarı ve İlgili Organeller
Amastigot ve promastigot şekillerinde bulunan plazma zarı 2-4 nm genişliğinde
ve 3 tabakalı görünümdedir. Hemen altında 20-22 nm çaplı ve düşük yoğunlukları
nedeniyle plazma zarından ayırt edilebilen birbirine paralel yerleşimli subpelliküler
mikrotübüller uzanmaktadır, bunlar organizmanın iskeleti görevini görürler.
Mikrotübüllerin sayıları, kalınlıkları, birbirinden uzaklıkları türlere göre değiştiği için
Leishmania türlerinin ayırımında da kullanılmaktadır. L. donovani’de 80-120; L.
tropica’da 80-115 arasında mikrotübül bulunmaktadır. Bu ayrım Yeni Dünya ile Eski
Dünya türleri arasında daha belirgin olarak görülmektedir 3,10.
Plazma zarı parazitin ön ucunda invagine olarak bir kese oluşturmaktadır. Bu
kese "kamçı kesesi" veya "rezervuar" olarak adlandırılmakta ve parazit için hayati
öneme sahip olan kamçıyı barındırmaktadır (Şekil 2.1 ve 2.2) 3.
Şekil 2.1.* Leishmania amastigot ince yapısı 10
8
Şekil 2.2.* Leishmania promastigot ince yapısı 10
* n: çekirdek, k: kinetoplast, f: kamçı, fp: kamçı kesesi, ly: lizozom, g:
glikozom, gc: golgi kompleksi, mt: mikrotubül, mi: mitokondri, pm: plazma zarı
2.3.2 Kamçı ve Bazal Cisim
Promastigotlarda bulunan kamçı ince, uzun, ip gibi, dışı hücre zarından yapılı
kılıfla kaplı bulunmaktadır. Kılıf içinde 9 çift çevrede, bir çift ortada olmak üzere 10
çift mikrotübülden oluşmaktadır. Kamçı 200 nm kalınlığında olup parazitin
gövdesinden daha uzundur, başlangıç ucu kamçı kesesi ile çevrilidir 3.
2.3.3 Kinetoplast
Kinetoplastida takımında yer alan Leishmania, Trypanosoma, Crithida ve diğer
cinslere ait olan organizmaların hepsi kamçının bazal kısmında yerleşmiş kinetoplast
adı verilen bir hücresel organele sahiptir. Kinetoplast birkaç bin kopya sarmal DNA
molekülünden oluşmuştur, mitokondrium içine yerleşiktir. Bu DNA şebekesi
kinetoplast DNA (kDNA) olarak adlandırılmaktadır. Kinetoplast büyük sarmal
9
(maksisörkıl) ve küçük sarmal (minisörkıl) adı verilen iki gruptan oluşmuştur; her
kinetoplastta büyük sarmalda 20-35 kb büyüklüğünde, homojen 20-50 kopya; küçük
sarmalda ise 0.5-2 kb büyüklüğünde heterojen 5 bin-10 bin kopya bulunmaktadır 3,10.
2.3.4 Mitokondri
Tüm Leishmania türlerinde tek bir mitokondri bulunmaktadır, ancak bazen ek
olarak çok küçük ve az kristalı başka mitokondrilerde görülebilmektedir. Kinetoplast da
mitokondri içinde yer almaktadır 3.
2.3.5 Çekirdek
Parazitin ön kısmına yakın bulunan oval veya yuvarlak çekirdek 7 nm
kalınlığında iki zardan oluşmaktadır. Merkezi bir çekirdekçiği bulunmakta, dış çekirdek
zarı endoplazmik retikulum ile devam etmektedir 3.
2.3.6 Diğer Organeller
Endoplazmik retikulumun hem düz hem de granüllü tipleri bulunmakta ve
çekirdeğin etrafında yer almaktadır. Stoplazmanın her yerine dağılmış durumdadır.
Golgi cihazı çekirdek veya kinetoplasta yakın bir yerde bulunmaktadır. Lizozomlar
kamçı rezervuarı ile çekirdek arasındadır, vakuoller sitoplazmada yer alan zarla çevrili
yapılar olarak görülmektedir 3.
2.4 Leishmania’ların Evrimi
Leishmania türlerinin vektörü olan Phlebotomus veya Lutzomyia cinsi tatarcıklar
leyişmanyozlu bir omurgalı konaktan kan emerken makrofajlar içinde bulunan paraziti
amastigot şeklinde almaktadır. Tatarcık vücudunda amastigotlar gelişim sürecinde
birkaç farklı yapısal şekle dönüşürler, bunlar sırasıyla prosiklik promastigotlar,
nektomonad promastigotlar, haptomonad promastigotlar, paramastigotlar ve metasiklik
promastigotlar olarak adlandırılır 3.
İn vitro koşullarda uygun kültür ortamı ve sıcaklık ( genellikle 26oC)
sağlandığında amastigotların promastigotlara dönüşümü 24-48 saatte tamamlanır 3,5.
Tatarcıkların kan emmesinden 1 saat sonra amastigotlar abdominal midededir,
12-24 saat sonra abdominal midenin peritrof zarının içinde promastigotlar
10
görülmektedir. Nektomonadlar midede 36-48 saat sonra görülürler, 3. günde torasik
midede haptomonadlar, 6. günde bütün sindirim kanalında promastigotlar görülmeye
başlar, 14. güne kadar gittikçe artar. Tatarcıklardaki evrim süresi Leishmania’nın
türüne ve çevrenin sıcaklığına bağlı olarak 4-18 gündür 5,8,9.
İnfektif metasiklik promastigotları barındıran vektör tatarcık, kan emmek için
omurgalı konağı soktuğu zaman belli miktarda (500-1000) promastigotları da gidiş
yönü kan akımının tersine olduğu halde konağa inoküle ederler. Deriden vücuda giren
promastigotlar ilk saatlerde serumdaki kompleman tarafından opsonize edilmekte ve bu
şekilde komplemanla opsonize edilmiş parazit omurgalının makrofaj, monosit veya
Langerhans hücreleri tarafından kolayca fagosite edilmektedir. Fagosite edilen
promastigotlar kamçılarını kaybederek amastigot şekle dönüşürler, bu süreç 12-24
saatte tamamlanır 3,8.
Amastigotlar daha sonra konak hücrenin fagolizozomal kompartmanında
fagositik vakuol içinde bölünerek çoğalır. İnfekte hücre parazitin sayıca çoğalması
sonucunda parçalanır ve amastigotlar ortaya çıkarlar. Bu amastigotlar tekrar diğer
makrofajları infekte edebilmekte ve dalak, karaciğer, kemik iliği gibi organlara
dağılarak bu organlarda çeşitli patolojilere neden olmaktadır 3,11.
İnfeksiyonun bundan sonraki seyrini parazitin türü, invazyon yeteneği,
patojenitesi ve konağın immün cevabını yönlendiren genetik özellikleri belirler.
İnfeksiyon deride sınırlı kalabilmekte veya iç organlara göç edebilmektedir 3,11..
Seyrek olarak görülse de leyişmanyoz tranplasental yol ile kan transfüzyonu ve
kontamine iğneler ile de bulaşabilmektedir (Şekil 3) 2,3,11.
11
i
Şekil 3. Leishmania’nın yaşam döngüsü2
12
2.5 Visseral Leyişmanyoz
2.5.1 Epidemiyoloji
2.5.1.1 Dünyada Visseral Leyişmanyoz
Visseral leyişmanyoz dünyada 88 ülkenin tropikal ve subtropikal bölgelerinde
endemiktir. Dünyada bilinen 12 milyon leyişmanyoz olgusu vardır, her yıl 1.5 -2 milyon
yeni olgu görülmektedir. Her yıl görülen 500.000 yeni visseral leyişmanyozun % 90’ı
Nepal, Bangladeş, Hindistan, Sudan ve Brezilya’dadır. Dünyadaki olguların yaklaşık
%50’si Hindistan’da görülmektedir. İnfeksiyon erkeklerde kadından daha fazla
görülmektedir 1,2,3.
Visseral leyişmanyozda, sadece insanın rol aldığı "insan-vektör-insan" döngüsü
Hindistan gibi bazı bölgelerde meydana gelmekte diğer bölgelerde ise küçük
kemirgenler veya köpekgiller rezervuar olarak davranmaktadır 1,2,3.
Leyişmanyozun coğrafik yayılımı, infeksiyonun vektörü olan tatarcıkların
bulunduğu yerlerle sınırlıdır. Kentleşmenin getirdiği ekonomik gelişmeler, ormanların
yok edilmesi, yeni yerleşim alanlarının geliştirilmesi, kırsal alanlardan kentsel bölgelere
göç tatarcıkların yayılımında rol alan faktörlerdir. Ayrıca bağışıklığı yetersiz HIV ile
infekte hastalar özellikle Güney Avrupa ve Afrika’da yeni bir hasta grubunu
oluşturmaktadır. Leishmania/HIV koenfeksiyonu özellikle Güney Avrupa’ da; ki
buradaki erişkin VL olgularının %25-70’i HIV ile infektedir, gerçek bir "yeni ortaya
çıkan hastalık" olarak değerlendirilmelidir. Leyişmanyoz böyle hastalarda fırsatçı bir
infeksiyon gibi davranmaktadır. Ayrıca Leishmania parazitlerinin RES dışında, kanda
bulunması HIV ile infekte hastaları bir rezervuar ve vektörler için infeksiyon kaynağı
haline getirmektedir 4.
2.5.1.2. Türkiye’de Visseral Leyişmanyoz
Visseral leyişmanyoz daha çok Ege ve Akdeniz bölgelerinde görülmekle birlikte
hemen hemen bütün bölgelerimizden bildirilmiş olgular bulunmaktadır. Hastalığın
etkeni olan Leishmania parazitleri hem insandan hem de köpeklerden izole edilmiş,
izoenzim analizi, EF (excreted factor) analizi, monoklonal antikorlar ve PCR ile diğer
Akdeniz bölgesi ülkelerinde olduğu gibi etkenin Leishmania infantum olduğu ve
doğadaki rezervuarlığını da köpeklerin yaptığı epidemiyolojik çalışmalarla
kanıtlanmıştır 3.
13
Ülkemizde visseral leyişmanyozu bulaştıran vektör Phlebotomus türü kesin
olarak gösterilmemekle birlikte P. neglectus, P. syriacus ve P. tobbi olası vektörler
olarak saptanmışlardır 3.
Hastalık ülkemizde genelde 12 yaş altındaki çocuklarda görülmekle birlikte
Denizli, İzmir ve Çanakkale gibi bazı bölgelerimizde erişkinlerde görülebilmektedir 3.
2.5.2 İmmunoloji
Bağışıklık sisteminin Leishmania infeksiyonlarına karşı cevabı karmaşıktır.
Birtakım özel koşullara bağlı olarak hızla iyileşebilir veya daha da kötüleşebilir. Bunlar
kısmen memeli konakların genetik farklılıklarına, kısmen parazitin tür ve suşlarının
genetik farklılıklarına, kısmen de ısıran sinek sayısı, yeri ve büyüklüğü gibi faktörlere
bağlıdır 11.
L. donovani’ye karşı ise insanların direnci değişiktir. Normal insan serumunda
bu paraziti eriten bazı maddelerin varlığı gösterilmiştir. Bu eritici madde yeni doğan
çocuklarda vardır, fakat daha sonra azalır ve 5,5-6 yaşından sonra yeniden ortaya çıkar.
İnsanda Leishmania infeksiyonları sırasında antikorlar ve hücre aracılığıyla olan
bağışıklık gelişmektedir. Hücresel bağışıklık, geç tip aşırı duyarlılık reaksiyonu
şeklindedir ve bunun varlığını göstermek için Leishmanin (Montenegro) deri testi
kullanılır. Bu testte antijen olarak besiyerlerinde üretilmiş promastigotlar kullanılır. Test
türe özgül değildir, aktif kala azarda negatiftir fakat tedaviden veya infeksiyonun
kendiliğinden iyileşmesinden sonra pozitifleşir 3,5,8,9.
Leyişmanyoz infeksiyonları hasta serumunda anti-leishmania antikorlarının
varlığı ile karakterizedir. Deri leyişmanyozunda aktif lezyon döneminde antikor titreleri
genellikle çok düşük olarak bildirilmekle birlikte bazı çalışmalarda antikor takiplerinin
L. braziliensis infeksiyonlarında tanı ve prognoz takibinde kritik öneme sahip olduğu
vurgulanmaktadır. Ancak kala azar olgularında antikor seviyeleri tipik olarak çok
yüksek saptanmaktadır. Yapılan klinik çalışmalarda tüm hastalarda IgG1 artışı
saptanırken antimon tedavisine dirençli olgularda belirgin olarak IgG2 ve IgG3 artışı
olduğu, IgM, IgA ve IgE seviyelerinde değişiklik olmadığı saptanmıştır. Son
çalışmalarda IgG’nin koruyucu etkisi olmadığı gibi infeksiyonun ilerlemesine neden
olan faktörlerden olduğu anlaşılmıştır 11.
14
Leishmania parazitlerinin makrofaj içinde yaşama mecburiyeti göz önüne
alındığında bu parazitlerin makrofaj effektör mekanizmaları tarafından ortadan
kaldırılmaya çalışılacağı ve bu yüzden de nitrik oksit sentezini tetiklediği
görülmektedir. İn vitro ve in vivo modellerde bu sentezin parazitin hücre içinde yok
edilmesi için gerekli olduğu gösterilmiştir 11,12.
Leishmania parazitleri konak makrofajlarının fagolizozomları içinde gizlenmek
suretiyle sıvısal bağışıklıktan (antikor yanıtı) kaçmaktadırlar. Hücre içindeki parazit
dolaşımdaki antikorlara maruz kalmadığı için antikorların hastalığın seyri üzerine etkisi
yoktur. Hayvanlarda B hücrelerinin yokluğunun infeksiyonun seyrini etkilememesi,
anti-IgM ile antikorların baskılanmasının herhangi bir etki yaratmaması, yüksek
düzeyde IgG ve IgM seviyelerinin enfeksiyona karşı koruyucu bir etki göstermemesi
gibi delillerden dolayı da bağışıklığın tamamıyla hücresel bağışıklığa bağlı olduğu
belirtilmektedir 11.
Leyişmanyozdaki koruyucu bağışıklık da hücresel bağışıklık ile ilgilidir.
Bununla beraber T lenfositleri yabancı antijenleri sadece MHC II yüzey molekülüne
sahip olan makrofajlar, Langerhans hücreleri ve keratinositler gibi antijen sunan
hücreler tarafından sunulduğu zaman tanıyabilmektedir. Sistem çalıştığı zaman ve
antijen sunan hücre T hücre ile etkileştiğinde T hücre sitokin üretmekte ve bu da
makrofajlar tarafından Leishmania’nın öldürülmesini desteklemektedir 3,11.
Leishmania antijenlerinin T hücrelerine sunulması iki şekilde sonuçlanır; ya
etkili bir hücresel yanıt oluşur, bu Th 1 etkisidir veya etkisiz bir humoral yanıt oluşur bu
da Th 2 etkisidir. Th 1 yanıtı ile T hücreleri IL-2 ve IFN gamma sitokinlerinin sentezini
arttırarak makrofajları aktive ederler. Th 2 cevabı ile de IL-4, IL-5, IL-10 ve
Leishmania parazitlerinin makrofaj içinde yok edilmesini durduran TGF-β salınır. Buna
rağmen her bir Leishmania türü hastalığın bir şekli ile sonuçlanır, konak hücresel
bağışıklığı kliniği belirler; infeksiyon klinik veya subkliniktir, visseral, kutanöz veya
mukokutanöz şekildedir, lezyonlar azdır veya yaygındır ve tedaviye yanıt tam veya
yetersizdir 11,12.
15
2.5.3 Patogenez
Parazite ait faktörler ve konağın savunma mekanizmaları patogenezi doğrudan
şekillendirmektedir 11.
Kala azara neden olan Leishmania türleri tüm vücutta RES (retiküloendotelyal
sistem) hücrelerini infekte etmektedir. Dalakta mononükleer fagositlerin artması sonucu
hipertrofi görülür. Lenf düğümleri folliküllerinin yerini parazitli mononükleer
hücrelerin alması ile büyürler. Karaciğerde parçalı nekroz ve Kupffer hücrelerinin
büyümesi ve sayıca artması sonucu hipertrofi görülür. Kemik iliğinde genellikle
hiperplazi olur ve diseritropoez ile sonuçlanır. Kemik iliğinde yapısı bakımından
normoblast ile megaloblast arasında ara eritroblastlara daha fazla rastlanır.
Trombositopeni ve pıhtılaşma faktörlerinde azalma sonucunda kanamalar olabilmekte,
ayrıca dalaktaki hipertrofiye bağlı ortaya çıkan hipersplenizm eritrosit, granülosit ve
trombositlerin dalakta yıkımına neden olmakta, etkisiz eritropoez nedeniyle de ciddi
pansitopeni tablosu ortaya çıkmaktadır. Beyaz kan hücre sayısı genelikle mikrolitrede
4000’in altında, 2000- 3000 arasında değişmekte ve ilerleyici monositoz gelişmektedir.
Gamaglobülinler serum proteinlerinin %60-70’ini oluşturabilmektedir 3,5,9.
Kala azara bağlı olarak deri belirtileri de söz konusu olmaktadır. Bunlar
tedavinin sonlarına doğru veya tedaviden bir iki hafta sonra görülebildiği gibi,
tedaviden 1-2 yıl sonra, spontan iyileşmeden yıllarca sonra da görülebilirler. Kala azar
sonrası deri leyişmanyozu (PKDL) adı verilen deri belirtileri deri leyişmanyozunun
erken dönem deri belirtilerinden farklılık gösterir. Makülle başlar ve lezyon büyüdükçe
epidermisin incelmesine ve böylece hipopigmentasyona neden olur. Lezyonlar
eritamatöz ve nodülerdir, bol lenfosit ve plazma hücre infiltrasyonu vardır 3.
Glomerüler komplekslerde IgG, IgA, IgM, kompleman ve fibrinojen
tanımlanmıştır. Glomerüllerde subendotelyal ve mezenşimal immun komplekslerin
birikmesiyle böbreklerin hepatosplenik şistozomiyoz olgularına benzemekte olduğu
bildirilmiştir. Lenfosit ve plazma hücreleri infiltrasyonu ile interstisiyel nefrit
bildirilmiştir 9.
İnce bağırsağın lamina propriyasında parazit dolu makrofajlar, villuslarda
genişlemeye ve bölmeli kısalmaya neden olabilirler. Ancak ülserasyon yalnızca kalın
bağırsakta görülür. Ayrıca parazit içeren histiyositlere sürrenallerin sinüzoid
16
hücrelerinde, pankreas ve testisin interstisiyel bağ dokusunda ve diğer organlarda da
rastlamak mümkündür.13
2.5.4 Klinik
Visseral leyişmanyoz L. infantum ve L.donovani ’nin neden oldukları infeksiyon
ile karakterizedir. L.tropica ile de bazı olgular olabildiği bildirilmiştir. Bu iki tür de
benzer kliniğe neden olur, ancak L.infantum genellikle küçük çocukları etkiler ve lenf
bezi tutulumu daha önceliklidir 3.
Hastalık 2 hafta ile 6 ay arasında değişebilen bir inkübasyon periyodunu takiben
ortaya çıkmaktadır. Klinik bulgular ani veya sinsi başlangıçlıdır. Sinsi başlangıç
endemik bölgelerde sık görülür. Ani başlayan olgularda burun, diş eti ve bağırsak
kanamaları görülebilir. Anemi, granülositopeni ve hatta agranülositoz gelişebilir. Bu
olgularda birkaç haftada ölüm gerçekleşebilir. Subakut ve süregen olgularda ateş,
halsizlik, iştahsızlık, öksürük ve kilo kaybı vardır. Çocuklarda bu klinik bulgulara
gelişme geriliği ve organomegali eşlik edebilir 3,9.
Hastalık ilerledikçe zayıflama ve anemi belirginleşir. Sıklıkla karında şişlik
vardır. Akut başlangıç sıtma nöbetini andıran bir periyodisite gösterir. Bazen ishal ve
tifoid ateşi andıran bir başlangıç olabilir. Ateş sürekli, intermittant veya remittant
olabilmekte ve düzensiz aralıklarla oluşabilmekte, günde iki veya üç kez ateşin
yükselmesi tipik olsa da her zaman görülmemektedir. Ateşin yükselmesi ile birlikte
dalak ve daha yavaş olarak karaciğer büyür. Hepatomegali olguların 1/3’ünde görülür.
İki organ da sıklıkla yumuşak ve genelde hassas değildir. Hastalığın ilerleyen
dönemlerinde asit oluşabilmektedir. Çocuklarda ileriki dönemlerde periferal ödem
görülebilmektedir ve hipoalbuminemi ile birlikte olabilir. Olguların %5-10’unda hafif
bir hepatosellüler sarılık gelişir ve karaciğer enzimleri de yüksektir. Bu tablolar kötü
prognozu gösterir 3,9.
Deride pullanma, kepeklenme görülür ve saçlar dökülür. Kala azar, kara ateş
anlamındadır ve derinin tipik olarak koyulaşmasını anlatmaktadır. Deri koyulaşması
genellikle açık tenli kişilerde olmakta, çok açık tenli veya koyu tenli kişilerde bu
koyulaşmayı anlamak zorlaşmaktadır. Koyuluk özellikle alın, şakaklar ve ağız etrafında
belirgindir 3,9.
17
L. donovani genellikle deri lezyonlarına neden olmaz. Nadiren başlangıçta
ısırma yerinde bir papül oluşur. Deri leishmanoidi olarak bilinen bir durum bazen
visseral leyişmanyozun tedavi edildiği hastalarda veya subklinik olgularda görülebilir.
Deri lezyonları tüm vücudu kaplayan veya yama şeklinde olan eritematöz ya da
depigmente maküllerdir. Burun üzerinde kelebek şeklinde yayılım görülebilir. Daha
sonra lezyonlar nodüler olmaya eğilim gösterir ve bu evrede lepra nodülleri ile
karışabilir. Deri lezyonlarında parazit bulunabilir ve bu hastaların da bu yüzden
rezervuar olabileceği düşünülmektedir 3.
Visseral leyişmanyozlu hastalarda değişik klinik belirtiler görülür ( Çizelge 1) 3.
Çizelge 1. Visseral leyişmanyozlu hastaların klinik belirtileri3
Klinik belirti Sudan Hindistan Brezilya (%) (L. donovani) (L. donovani) (L. chagasi) Ateş 95 99 95 Splenomegali 95 98 99 Kilo kaybı 80 87 98 Anemi 75 96 98 Lenfadenopati 75 90 30 İştah kaybı 70 30 20 Öksürük 75 50 40 Hepatomegali 60 98 90 İshal 40 50 60 Bulantı 15 az az Ödem 5 _ 40
Birçok yerde sıtma daha yaygın olarak görülen bir infeksiyondur ve visseral
leyişmanyoz ile kliniği benzerdir. Uzun süren düzensiz ateşi olan, antimalarya ilaçlarına
yanıt vermeyen veya kan yaymaları birkaç kez incelendikten sonra sıtma parazitlerine
rastlanmayan hastalarda visseral leyişmanyoz mutlaka düşünülmelidir. Ayırıcı tanıda
ise; tifo, tuberküloz, AIDS, bruselloz, kronik hepatit, lenfoma ve lösemi gibi hastalıklar
akla gelmelidir 3.
Laboratuvarda lökopeni, trombositopeni ve serumda etkene özgü antikorların
saptanması klinik tanıyı doğrulamak için önemlidir. Pnömoni, bronşit, tuberküloz,
sıtma, ishal, viral infeksiyonlar, bakteriye bağlı deri infeksiyonları, orta kulak iltihabı,
ağızda yaralar visseral leyişmanyoz sırasında ortaya çıkabilen ikincil infeksiyonlardır.
18
Trombositopeni nedeniyle burun, diş eti ve bağırsak kanamaları olabilir. Ölüm ikincil
infeksiyonlar veya kanamalara bağlı olarak gelişir 3,13.
Serolojik çalışmalar ve leishmanin deri testi sonuçları spontan iyileşen L.
infantum ve L. chagasi’nin neden olduğu subklinik infeksiyonların L. donovani’nin
neden olduğu klinik kala azardan daha sıklıkla görüldüğünü göstermektedir. Ancak L.
donovani epidemilerinde infeksiyon çoğunlukla semptomatiktir ve ölüm oranı daha
yüksektir 12.
2.5.4.1 İmmun Yetmezliği Olan Kişilerde Kala-Azar
İmmun sistem ile son derece yakın ilişkili bir infeksiyon olan leyişmanyoz
hücresel immun yanıtın azaldığı her durumda atipik bir klinikle görülmekte ve tedaviye
daha dirençli olmaktadır. Bu durumdaki kişilerin çoğu HIV ile infekte kişilerdir ve
özellikle Güney Avrupa, Hindistan, Güney Amerika ve Afrika’da HIV/Leishmania
infeksiyonlarının birlikte görülme sıklığı artmaktadır 3,4,12.
Leishmania-HIV koenfeksiyonu özellikle visseral leyişmanyozlu erişkinlerin
%25-70’inin aynı zamanda AIDS de olduğu Güney Avrupa’da yeni bir hastalık gözüyle
değerlendirilmekte ki leyişmanyoz bu hastalarda fırsatçı bir infeksiyon gibi
davranmakta ve burada visseral leyişmanyozun AIDS ile sınırlı bir hastalık olarak ele
alınması önerilmektedir. Ayrıca Leishmania parazitlerinin RES dışında periferik kanda
da bulunması HIV ile infekte hastalarda bu kişileri vektörler için infeksiyon kaynağı ve
rezervuar yapmaktadır. Periferik kanda parazit yükü genellikle fazladır ve intravenöz
ilaç kullanıcıları arasında ortak şırınga paylaşımından dolayı bulaşmanın olduğu da
gösterilmiştir. Farklı coğrafik bölgelerde ve farklı konaklarda leyişmanyozun yeniden
ortaya çıkması infekte hastaların klinik bulgularının değişmesinden başka tanı alanında,
tedavi ve hastalık kontrolünde yeni yaklaşımların olmasını gerektirmiştir 4.
Kortikosteroid kullanan, immun baskılayıcı tedavi alan hastalar, lenfomalı,
lösemili, kronik hepatitli, böbrek nakli olan, sarkoidozisli, Crohn hastalığı olanlar,
sistemik lupus eritematozisli hastalar gibi başka nedenlerle immun sistemi baskılanan
hastalar visseral leyişmanyoza daha duyarlı kişiler olarak bildirilmektedir 3.
19
2.5.4.2 Kala-Azar Sonrası Deri Leyişmanyozu
Kala azar sonrası deri leyişmanyozu genel olarak visseral leyişmanyozun bir
komplikasyonudur. Visseral leyişmanyoz geçirmiş ve iyileşmiş, bazen geçirmemiş
hastalarda maküler, makülopapüler ve nodüler döküntü ile karakterizedir 3,12,13.
Kala azar sonrası deri leyişmanyozunn ortaya çıkışında hastaların immun
yanıtındaki olayların etken olduğu görüşü ağırlık kazanmakla birlikte mekanizması tam
olarak açıklanamamıştır 3.
L. donovani’nin neden olduğu visseral leyişmanyozun başarılı tedavisinden
sonra kala azar sonrası deri leyişmanyozu gelişebilmektedir ancak L. infantum ve L.
chagasi’ nin etken olduğu olgularda ise çok ender olarak görülmektedir 3,12.
Dünyada post kala-azar dermal leyişmanyoza Asya’da Nepal, Bangladeş ve
Hindistan’da, Doğu Afrika’da ise Sudan, Etopya ve Kenya’da rastlanılmaktadır, ancak
genel özellikleri arasında farklar olduğu belirtilmektedir 3.
Afrika’da ya başarılı olduğu kesin olan tedavinin sonuna doğru ya da tedaviden
sonra birkaç hafta ile bir ay sonraki sürede ortaya çıkar. Sudan’da subklinik ve klinik
visseral leyişmanyozlu hastaların yaklaşık %55’inde kala azar sonrası deri
leyişmanyozu gelişir. Hindistan’da ise daha az sıklıkla gelişmekle birlikte tedaviden
aylar hatta yıllar sonra ortaya çıkabilir. Kala azar sonrası deri leyişmanyozu genellikle
ani ve ciddi başlangıçlıdır, deri ve mukozalarda deskuamasyonlara neden olur. Daha
sıklıkla hipopigmente yamalar, nodüller ve plaklarla karakterizedir. Biyopsilerde parazit
yok veya çok azdır. Salgınlarda kala azar sonrası deri leyişmanyozlu hastalar L.
donavani rezervuarı olabilirler 3,12.
2.5.5 Tanı
Visseral leyişmanyoz tanısında eğer olanak varsa birden fazla tanı yönteminin
kullanılması önerilmektedir. Böylelikle diğer hastalıklardan ayırıcı ve doğru tanı
konulması mümkün olmaktadır 3,4.
2.5.5.1 Etkensel Tanı
Leyişmanyoz, klinik özellikleri ile akla gelebilir, serolojik ve deri testleri ile de
desteklenebilir ancak doğrudan bakı veya kültür ile parazit görülerek doğrulanmalıdır 10.
20
Etkene yönelik araştırmalar, doğrudan etkenin kendisine veya ona karşı oluşan
reaksiyonlara dayandırılmakta olup her tanı metodunun parazitin tipi ya da incelenen
klinik örnekten bağımsız olarak kendi içinde avantajları ve dezavantajları bulunduğu
çeşitli araştırmalarla ortaya konmuştur (Çizelge 2) 14.
Çizelge 2. Visseral leyişmanyoz tanısında kullanılan yöntemlerin karşılaştırılması14
Yöntem Avantajlar Dezavantajlar
Doğrudan tanı *Basit *Hızlı *Parazitin doğrudan araştırılması *Parazit sayısı yüksek olmadığından *Yapısal olarak farklı düşük duyarlılık göstermesi, organizmaların ayrımı *Benzer yapıdaki organizmaların ayırt edilememesi, *Deneyimli personele gereksinim duyulması Kültür ile tanı *Virulans ve infektivitenin *Pahalı ve yavaş olması ölçülebilmesi *Örnekte parazitlerin canlılığının *Canlı parazitlerin saptanabilmesi sürdürülmesi gerekliliği *Türler arasında varyasyonların saptanmaması *Hayvan kullanımı Serolojik tanı *Basit ve hızlı *Düşük özgüllük *Çok sayıda örneğin incelenmesine *Aktif ve geçirilmiş ya da latent elverişli olması infeksiyonun ayırt edilememesi *Standardize ayıraçların gerekliliği Moleküler tanı *Doğrudan parazitin türünün *Çok aşamalı ve pahalı araştırılması ve ayrımı *Ölü organizmaların da saptanması *İnhibitörleri nedeniyle olası yanlış negatiflik (PCR) *Kontaminasyon nedeniyle olası yanlış pozitiflik (PCR)
Leishmania parazitlerini görerek tanı koymak için kemik iliği, dalak, karaciğer,
lenf bezi aspirasyonu yapılabilmekte veya periferik kan örneğindeki çekirdekli hücreler
incelenmektedir. Alınan materyallerin bir kısmı Giemsa ile boyalı preparatlarda
amastigotların gösterilmesi amacıyla kullanılır. Kalanı ise kültür amacıyla 26-28
derecede uygun besiyerlerine ekilir ve 2 hafta içinde hareketli promastigotlar pozitif
kültürlerde görülür 4,13.
21
Ayrıca, aspirasyonla elde edilen örnekler veya doğrudan kan kullanılarak
polimeraz zincir reaksiyonu uygulanabilmektedir 15,16,17,18. Özellikle immun yetmezliği
olan hastalarda perifer kanda parazit sayısı çok miktarda olduğundan uygun türdeki
tatarcıklar kullanılmak suretiyle hastadan kan emdirilmekte ve tatarcıkta
promastigotların gelişimi disseksiyon ile araştırılmaktadır (ksenodiagnosis) 4.
Visseral leyişmanyozda parazitin görülmesi; dalak aspirasyonlarında %95’den
fazla, kemik iliği ve karaciğerden yapılan aspirasyonlarda %70-85 oranında, lenf bezi
aspirasyonlarında (Afrika’da) %58-65 oranında ve kandan yapılan bufy coatlarda
%70’lere varan orandadır. Doğru yapıldığı takdirde kültürde parazitin görülme olasılığı
yaklaşık %10 oranındadır 13.
Yeni bir latex aglütinasyon testi (KATEX) idrardaki antijeni saptayarak tanı
koymak amacıyla kullanılmaktadır. İnvaziv olmayan bu testin özellikle antikor yanıtı
yetersiz olan immunsupresif kişilerde ve visseral leyişmanyoz tedavisinin takibinde çok
yararlı olacağı bildirilmektedir 3.
2.5.5.2 Serolojik Tanı
Leyişmanyozun serolojik tanısı için IFA (dolaylı floresan antikor) testi, IHA
(dolaylı hemaglütinasyon antikor) testi, ELISA, rK39 özgül antijeninin kullanıldığı
ELISA, rK39 hızlı tanı testi, DAT (doğrudan aglütinasyon testi), FAST (hızlı
aglütinasyon tarama testi) ve western blot (WB) gibi yöntemler geliştirilmiş olmasına
rağmen söz konusu bu yöntemlerin duyarlılıkları arasında farklar olabilmektedir 4,19.
Son yıllarda geliştirilen ve visseral leyişmanyoz etkenine özgü rekombinant
antijene karşı antikor varlığını gösteren rK39 hızlı tanı testi yaygın olarak
kullanılmaktadır. Bu test yüksek duyarlılığı ve özgüllüğünden dolayı referans test
olmuştur. Bu testin kullanımı kolaydır, hızlıdır, minimal düzeyde teknoloji ve
laboratuvar ekipmanı gerektirmektedir 1.
22
2.5.5.2.1 rK39 Hızlı Tanı Testi
K39 proteini visseral leyişmanyoza neden olan Leishmania türlerinin
amastigotlarında bulunan bir epitoptur ve visseral leyişmanyozun hızlı tanısı için uygun
bir proteindir 20.
Rekombinant antijen (rK39) Escherichia coli’den klonlanan 39 aminoasitten
oluşur. Bu 39 aminoasit, L.major’un kinesin proteininin C terminalindedir. rK39 hızlı
tanı testi yapılan birçok çalışmanın sonucunda hem visseral leyişmanyoz hem de kala
azar sonrası deri leyişmanyozunun tanısında yüksek oranda duyarlı ve özgül
bulunmuştur 20.
rK39 hızlı tanı testi insan serumunda L.donovani’ye karşı oluşan antikorların
kalitatif tanımlanması için geliştirilmiş bir immunokromatografik testtir. Striplerin zarı
test bölgesinde rekombinant VL antijeni ile kontrol bölgesinde ise tavuk anti-protein A
ile kaplıdır. Eğer serumda antikor varsa zar üzerindeki rK39 antijeni ile reaksiyon
gerçekleşir ve test bölgesinde kırmızı bir çizgi oluşması pozitif sonuçtur, test bölgesinde
bu çizginin yokluğu negatif sonuçtur. VL antijenine karşı antikor olmadığı zaman
kırmızı çizgi tavuk anti-protein A’nın bulunduğu kontrol bölgesinde oluşmaktadır; bu
çizginin varlığı da örneğin yeterli ve ayıraçların doğru olduğunu kanıtlamaya hizmet
etmektedir 20.
2.5.5.3 Moleküler Tanı
Leishmania türlerinin yapısal olarak ayırt edilmesi mümkün olmadığından
patojenik türlerin sınıflandırılması için monoklonal antikorlarla izoenzim elektroforezi
veya minisörkıl DNA probları gibi türe özgü problarla hibridizasyon gibi çeşitli
biyokimyasal, immunolojik ve moleküler yöntemler geliştirilmiştir 21.
Polimeraz zincir reaksiyonu teknolojisinin ilerlemesiyle tür tayini amacıyla pek
çok PCR’a dayalı yöntem geliştirilmiştir. Amplifikasyon için ya nükleer DNA (SSU
rRNA gen bölgesi, internal transcribed spacer gen bölgesi-ITS-, gp63 gen bölgesi,
tubulin gen, mikrosatellit DNA) veya ekstrakromozomal DNA (minisörkıl kinetoplast
DNA) bölgeleri hedef bölgeler olarak belirlenmiştir 21.
Leishmania türlerini tiplendirmek için kullanılan metotlar multiplex PCR,
rastgele amplifiye polimorfik DNA (RAPD), single-strand konformasyon polimorfizmi,
restriksiyon fragment length polmorfizmi (RFLP) ve DNA dizi analizidir. DNA’ya
23
dayalı bu genotipik moleküler teknikler diğer tanı yöntemlerine kıyasla daha güvenilir
ve özgüldür 5,6,7.
2.5.5.3.1 Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Polimeraz zincir reaksiyonu; dizisi bilinen iki bölge arasında uzanan bir DNA
parçasını çoğaltmak için genomik DNA’ya ait primerlerin kullanıldığı yapay bir
tepkimedir. Bu tepkime DNA polimeraz tarafından katalizlenir ve sonunda genomik
DNA konsantrasyonu moleküler yöntemlerle görüntülenebilir düzeye çıkartılır 22.
Amplifikasyon için önce DNA iki oligonükleotit (primer) ve dört
deoksinükleotit trifosfatın (dNTP) varlığında 95oC’ye kadar ısıtılarak denatüre edilir.
Daha sonra 55-65oC arasında bir ısıya düşürülerek özgül primerlerin komplementer
dizilerine yapışması (annealing) sağlanır. Son olarak 72 oC’de DNA polimeraz aktivitesi
gösteren ve yüksek ısıdan etkilenmeyen Taq polimeraz enzimi ortamda bulunan
dNTP’ların 5’-3’ yönünde eklenmesiyle zincirin uzamasını sağlar. Denatürasyon,
annealing ve DNA sentezi döngüsü defalarca tekrarlanır. Amplifikasyonun bir
döngüsünün ürünleri sonraki döngü için kalıp olduğundan dolayı her bir döngü ile DNA
iki katına çıkmakta ve üssel olarak artmaktadır 22,23.
2.5.5.3.2 Restriksiyon Enzimi Uzunluk Polimorfizmi
Restriksiyon enzimleri çift iplikçikli DNA’da özgül bölgelerden kesim yapan ve
DNA’dan bir gen bölgesinin veya gen taşıyan bir DNA segmentinin çıkartılmasında rol
alan enzimlerdir 21.
Restriksiyon enzimlerinin büyük DNA moleküllerini özgün parçacıklara
ayırması bu parçacıkların ana moleküle nazaran daha net bir şekilde görüntülenmesini
sağlar, çünkü değişik uzunluktaki DNA parçacıkları aralarındaki ufak uzunluk
farklılıkları nedeniyle jel ektroforezinde farklı yerlere göç etmektedir. Jel elektroforezi
için yüksek çözünürlüğe sahip agaroz jeller tercih edilmektedir. Ethidium bromid
sayesinde jelde oluşan DNA bantları görüntülenebilmekte, bu bantların yeri ve sayısına
göre gen haritaları kullanılarak tür tayini yapılabilmektedir 21,22.
24
2.5.6 Tedavi
Leyişmanyoz tedavisinin başarılı olarak sonuçlanması uygun ilaç seçimi ile
mümkündür. İlaçların seçimi esnasında birçok faktör göz önüne alınmalıdır. Tedaviyi
etkileyen faktörlerin en önemlilerinden biri olan Leishmania’ nın türü, ilaç seçiminde de
önemli bir rol oynar. İnsanda infeksiyon etkeni olabilen 15’den fazla Leishmania
türünün ilaçlara gösterdiği duyarlılığın farklı olması, Leishmania türlerinin
biyokimyasal ve moleküler özelliklerinin farklı olmasından kaynaklanmaktadır. İn vitro
çalışmalarda L.donovani ve L.brasiliensis’in sodyum stiboglukonat tedavisine L.major,
L.tropica ve L.mexicana’dan 3-5 kat daha duyarlı olduğu gösterilmiştir 24,25.
Visseral leyişmanyoz, deri leyişmanyozu, mukokutanöz leyişmanyoz ve yaygın
deri leyişmanyozu olarak dört farklı klinik tabloya neden leyişmanyozun tedavisinde
halen en yaygın kullanılan ilaç grubu pentavalan antimon bileşikleridir 26.
Pentamidin antimonlara dirençli visseral leyişmanyoz olgularının tedavisinde
kullanılmaktadır, ancak dirençli olgularda pentamidinlerin de başarı oranı %75’dir 27.
Paromomisin (aminosidin) visseral leişmanyozda günde bir defa IM yolla
kullanılan aminoglikozid grubu antibiyotiktir. Antimon direncinin yüksek olduğu
Hindistan’da ilk seçenek ilaç olarak tek başına kullanılmaktadır, ancak bu antibiyotiğin
de ciddi ototoksik ve nefrotoksik yan etkileri vardır 27.
Tedavide allopurinolün antimonlarla kombine kullanımının tedavi etkinliğini
değiştirmediği, fakat antimona dirençli olgularda allopurinol-pentamidin
kombinasyonunun tek başına pentamidin uygulamasından daha iyi yanıt verdiği
randomize kontrollü çalışmalarla gösterilmiştir 27.
Antifungal bir ajan olan amfoterisin B güçlü bir leishmaniasid ilaçtır.
Antimonlara karşı gelişen ilaç direnci ve bu olgularda pentamidinin de etkisiz kalması,
amfoterisinin popularitesini arttırmıştır. Hindistan’da bu tür olgularda amfoterisin B
dezoksilat ile %98 oranında başarı elde edilmiştir 24.
Son zamanlarda, visseral leyişmanyoz tedavisinde amfoterisin B’nin özellikle
yağlı formüllerinin kullanımı gündeme gelmiştir. Bu grup ilaçlar, lipid ilişkili
amfoterisin B (lipid kompleks, kolesterol dispersiyon, lipozomal amfoterisin B gibi) ya
da yağ emülsiyonu içindeki amfoterisin B şeklinde olabilir. Bu yağlı formüllerin ilacın
etkinliğini arttırdığı ve konvansiyonel amfoterisin B’nin toksisitesini sınırladığı
kanıtlanmıştır 26,27 .
25
Alkilfosfokolinler serisinden bir ilaç olan miltefosin başlangıçta antineoplastik
bir ilaç olarak geliştirilmiştir ancak visseral leyişmanyozda oral olarak etkili olduğu
çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir. Miltefosinin antileishmania etkisi sadece sitotoksik
etki ile değil ayrıca hücresel bağışıklık mekanizmalarının aktivasyonuyla da ilişkili
olduğu gösterilmiştir 24,28.
Visseral leyişmanyoz tedavisinde ketokonazol, itrakonazol, flukonazol,
terbinafin ve metronidazol gibi farklı oral ilaçlar tek başına ve kombine olarak
denenmiş fakat hiçbiri umut verici olmamıştır. Bir 8-aminokinolin türevi olan sitamakin
ile ilgili yaklaşık 8 yıldır süren araştırmalar halen ilacın etkisi ve toksisitesi ile ilgili
yeterli bilgi vermemektedir 27.
İnterferon gama bir makrofaj uyarıcıdır, farelerle yapılan çalışmalarda
antimonlarla sinerjistik aktivitesi olduğu görülmüştür, ancak insan visseral leyişmanyoz
olgularında tek başına interferon gama etkisi sınırlıdır. Bazı ağır olgularda kombine
interferon tedavisinin antimonlara yanıtı hızlandırdığı bildirilmektedir 24,27.
Tedavide direnç gelişimi, parenteral kullanım zorluğu gibi nedenler yeni ilaç
araştırmalarını gerektirmektedir (Çizelge 3) 26.
Çizelge 3. Araştırma ve gelişim dönemindeki antileishmania ilaçları26 Geç keşif fazı Faz1/Faz2 Faz3 Faz4
Bifosfanatlar (risedronat ve Sitamakin Paromomisin Miltefosin pamidronat)(VL ve KL) (VL) (VL) (VL) Likokalkon A deriveleri (VL ve KL) Topikal paromomisin (KL) Miltefosin (KL)
Propilkinolinler Antimonlarla kombine
topikal imikuimod (KL)
Azoller: posokonazol (KL) Azoller: itrakonazol,
ketokonazol,flukonazol
2.6 Leishmania Türlerinin PCR-RFLP ile Tanımlanması
Leishmania populasyon genetiği çalışmalarında, tür tayininde ve suş ayırımında
kullanılan polimorfik DNA sekansları PCR’a dayalı yöntemlerle amplifiye
edilmektedir. Tür tayini tedavinin ve kontrol yöntemlerinin planlanması kadar doğru
tanı ve hastalığın prognozunun takibi açısından da çok önemlidir 29.
26
Leishmania türlerinin tanımlanmasında kullanılan standart metodlar izoenzim
elektroforezi (zimodem analizi), monoklonal antikorlar veya minisörkıl DNA probları
gibi türe özgül problarla hibridizasyondur. Ancak bu yöntemler yavaş, zahmetli ve
pahalı, kültür yapılmasını gerektiren, sadece uzmanlaşmış laboratuarlarda yapılabilen
yöntemlerdir. PCR’a dayalı yöntemler ise daha kolay ve sadece az miktarda organizma
gerektirmektedir 21,29.
Leishmania’nın PCR ile amplifikasyonu için genomik DNA’ya ait internal
transkript spacer (ITS) gen bölgesi, splice leader mini-exon (SLME), SSU rRNA geni,
gp 63 gen bölgesi, tubulin geni gibi gen bölgeleri ve kinetoplast DNA’nın minisörkılları
gibi ekstranükleer DNA’ya ait gen bölgeleri kullanılmaktadır 21,30.
kDNA her hücrede büyüklüğü yaklaşık 800 bç olan (200 bç uzunluğunda
korunmuş bölgeden ve 600 bç uzunluğunda değişken bölgeden oluşan) 10000-20000
civarında minisörkıl içerir. Değişken bölgedeki bu heterojenlik aynı türler arasındaki
suş farklılığını açıklamaktadır. Leishmania’nın her türünde 10000-20000 kadar
minisörkıl olduğu için bir etkenin Leishmania olup olmadığını tanımlamak için kDNA
ile çalışmak çok uygun olmaktadır. Bu yüzden tanıda kDNA PCR yöntemi oldukça
duyarlı bulunmaktadır 21,30.
Miniekzon geni ise her nükleer genomda 100-200 kez tekrar etmektedir ve
omurgalı konaklar ile omurgasız vektörlerde bulunmamaktadır. Leishmania türlerinin
tekrarlı miniekzon geni içinde bulunan transkript edilmeyen spacerların dizi analizi ile
DNA dizilerinin çıkarılmasıyla görülen çeşitlilik sonucunda bunların filogenetik marker
olabilecekleri tespit edilmiştir. Miniekzon genin bu özelliğinden dolayı PCR ürünleri
restriksiyon enzimi ile kesilerek tür tayini mümkün olmaktadır. Restriksiyon enzimi ile
kesim sonucunda elde edilen fragmanların uzunlukları her tür için tipiktir (Şekil 4 ) 21.
27
L. naiffi (X69454) 220 L amazonensis I (L05000) 285 L. donovani I (X69453) 378L. naiffi (AY1555505) 221 L amazonensis II (X64317) 283 L. donovani II (X69456) 389L. panamensis (X69450) 223 L. mexicana (X69447) 308 L. donovani III (X69443) 424L. panamensis (AY155509) 226 L. mexicana (AY155508) 327 L. infantum (X69445) 434L. braziliensis (X69441) 226 L. colombiensis (AY155502) 420 L. infantum (AY155503) 435L. guyanensis (X69452) 226 L. venezuelensis (AY155507) 443 L. tropica (X69451) 403L. peruviana (AY155506) 226 L. chagasi (X69446) 418 L. killicki (AY155504) 402
L. aethiopica (X68788) 406L. aethiopica (AY155501) 418L. major (X69449) 427
Eae I: no digest* 155/130 184/107/87145/138 281/108149/102/57 230/107/87112/102/60/53 326/108277/143 327/108
Rsa I L. naiffi 139/81 138/120/94/70/21 227/178L. naiffi 139/82 245/104/41/28 232/170
327/108 213/193276/142125/119/92/70/21
Hae III L. braziliensis 118/108 309/111 208/104L. peruviana 119/107 221/197
232/190/21159/149 274/104165/162 284/105
320/104Nco I L. guyanensis 173/53 214/94 326/108
L. panamensis 223 233/94 330/105L. panamensis 173/53
194/91200/83
L. colombiensis L. venezuelensis L. chagasi I L. chagasi II
Eae I L. amazonensis L. amazonensis L. mexicana L. mexicana
New World Viannia (220-226 bp) New World Leishmania (283-443 bp) Old World Leishmania(378-435 bp)
PCR products: PCR products: PCR products:
Eae I L. donovani I L. donovani II L. donovani III L. infantum L. infantum L. tropica L. killicki L. aethiopica L. aethiopica L. major
L. infantum L. infantum
Mbo I L. colombiensis
Not I L. venezuelensis L. mexicana L. mexicana
Mlu I L. mexicana L. mexicana
Sma I L. aethiopica L. aethiopica
Nco I L. donovani I L. donovani II L. donovani III
Hae III L. tropica 225/178 L. killicki 230/172 L. major 127/68/60/59/39/38/21/15 C. fascicul. 318/88
Eco72 I L. amazonensis I L. amazonensis II
Şekil 4.Miniekzon PCR-RFLP genotipleri21
28
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. Kan Örneklerinden DNA İzolasyonu Bu çalışmada, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Enfeksiyon,
Pediatrik Hematoloji, Pediatrik Onkoloji, Süt Çocuğu, Yetişkin İnfeksiyon Hastalıkları
ve Başkent Üniversitesi Araştırma ve Uygulama Hastanesi Çocuk İnfeksiyon
Hastalıkları kliniğine visseral leyişmanyoz ön tanısı ile yatırılan hastalardan alınan 50
kan örneği kullanıldı. Örneklerden amastigot şekillerin saptanması amacıyla ince yayma
preperatlar yapıldı. Ayrıca, serum örneklerinde visseral leyişmanyoz etkenine özgül
rekombinant antijene karşı antikor bulunup bulunmadığını tanımlamak amacıyla rK39
hızlı tanı testi yapıldı. Serumu ayrılmış olan kan örnekleri daha sonra DNA izolasyonu
yapmak amacıyla -200C’de saklandı. -200C’de saklanan kan oda sıcaklığına getirildi ve çözülmesi beklendi. Çözülen
kan örnekleri temiz bir ependorf tüpüne alındı ve Agencourt DNA izolasyon kitinin
(BeckmanCoulter) kullanım talimatina göre işlem yapıldı. Aşağıda Agencourt DNA
izolasyon kitinin kullanım talimatı verilmektedir. 1.200 µL kan örneği alındı. 2.400 µL parçalıyıcı tampon solusyonu ve 10 µL proteinaz K eklendi. 3.Etüvde 370C’de 20 dakika inkübe edildi.
4.Etüvden alınan karışıma 300 µL bağlayıcı tampon solusyonu eklendi ve
karışım vortekslendi. 5.Bağlayıcı tampon solusyonu içindeki manyetik boncukların karışımdaki
DNA’lara bağlanabilmesi amacıyla oda sıcaklığında 5 dakika beklendi. 6.Örnekler manyetik boncuk plağına yerleştirildi ve 15 dakika beklendi. 7.Örnekler plakta iken ependorftaki üst kısım aspire edildi. 8.Ependorflar plaktan çıkarıldı ve her birine 800 µL yıkama tampon solusyonu 1
eklendi ve vortekslendi. 9.Ependorflar tekrar plağa yerleştirildi ve 10 dakika beklendi. 10.Örnekler plakta iken ependorftaki üst kısım aspire edildi.
29
11.Ependorflar plaktan çıkarıldı ve her birine tekrar 800 µL yıkama tampon
solusyonu 1 eklendi ve vortekslendi. 12. Ependorflar tekrar plağa yerleştirildi ve 10 dakika beklendi. 13. Örnekler plakta iken ependorftaki üst kısım aspire edildi. 14. Ependorflar plaktan çıkarıldı ve her birine 500 µL yıkama tampon sulusyonu
2 eklendi ve vortekslendi. 15. Örnekler manyetik boncuk plağına yerleştirildi ve 6 dakika beklendi. 16. Örnekler plakta iken ependorftaki üst kısım aspire edildi. 17. Ependorflar plaktan çıkarıldı ve her birine tekrar 500 µL yıkama tampon
solusyonu 2 eklendi ve vortekslendi. 18. Örnekler manyetik boncuk plağına yerleştirildi ve 6 dakika beklendi. 19. Örnekler plakta iken ependorftaki üst kısım aspire edildi. 20. Ependorflar plaktan çıkarıldı ve her birine 50 µL damıtık su eklendi ve
vortekslendi. 21.Örnekler tekrar plağa yerleştirildi, sıvı renksiz kalıncaya kadar beklendi,
örnekler plakta iken alınan üst kısımlar temiz ependorflara kondu. Bu yöntemle kandan
amastigot DNA’ları izole edildi.
Çalışmada kullanılacak olan DNA’ların varlığı elektroforez yöntemi ile saptandı. 3.2.Amplifikasyon İçin Gerekli Çözeltiler ve Kimyasal Maddeler 3.2.1. Çözeltiler 1. 10X (NH4)2SO4 Tamponu
700 mM/L Tris-HCl (pH:8.8)
200 mM/L (NH4)2SO4
% 0.1 Tween 20
2. PCR Karışımı
10X (NH4)2SO4 Tamponu 5 µL
12,5 mM dNTP karışımı 1 µL
25 mM MgCl2 5 µL
Steril distile su 33 µL
30
3.Primerler: PCR ile mikroskop bakısını karşılaştırmak amacıyla Leishmania
kinetoplast DNA’sına ait olan ve en az 10 parazite karşı duyarlı olan 13A ve 13B
(Alpha DNA) primerleri kullanıldı. Leishmania tiplendirmesi yapmak için Leishmania
parazitinin kinetoplast DNA’sından daha özgül, miniekzon gen bölgesine ait olan Fme-
Rme (Alpha DNA) primerleri kullanıldı (Çizelge 4).
Çizelge 4. Leishmania cinsine özgül primer dizilimi 21
3.2.2. Amplifikasyon Koşulları PCR karışımı 44 µL
5' Forward primer 13A veya Fme 0.5 µL
3' Reverse primer 13B veya Rme 0.5 µL
gDNA (0.5–1 µg/mL) 5.0 µL
Taq polimeraz (5 U/uL) 0.2 µL
Toplam hacim 50 µL’dir.
3.2.3. Termal Cycler ile PCR Protokolü
Bu çalışmada 13A-13B ve Fme-Rme primerleri ile yapılan PCR protokolündeki
sıcaklık, süre ve döngü sayısı çizelge 5’te gösterilmektedir.
Çizelge 5. 13A-13B ve Fme-Rme primerleri için kullanılan PCR programı
13 A 5'- TTG ACC CCC AAC CAC ATT ATA- 3'
13 B 5'- GTG GGG GAG GGG CGT TCT -3'
Fme 5'- ACA GAA ACT GAT ACT TAT ATA GCG -3'
Rme 5'- TAT TGG TAT GCG AAA CTT CCG -3'
95°C 5 dakika Ön Denatürasyon →1 döngü 95°C 1 dakika Denatürasyon
→40 döngü 54°C 1 dakika Primer bağlanması 72°C 1 dk 30 sn Zincir uzaması 72°C 10 dakika Son döngüde zincir uzaması →1 döngü
31
3.2.4.Agoroz Jelde Yürütme
Amplifiye edilmiş DNA örnekleri, 50 bp ve 100 bp’lik DNA markırları (Bio
Basic) ile birlikte %3’lük agaroz jelde 120 V’da 45 dk. yürütüldü.
3.2.5.1. Çözeltiler
1. 5×Tris Borat EDTA (TBE) Tamponu pH 8.0:
Tris baz 54.0 g
Borik asit 27.5 g
EDTA [0.5 M, pH:8.0] 20 mL
Bir miktar damıtık suda çözünerek 1 L’ye tamamlandı.
2. Elektroforez için 0.5X TBE Tamponu:
5×TBE’den 10 mL alınarak damıtık su ile 200 mL’ye tamamlandı.
3. %3’lik agaroz jel:
3 g Agaroz 100 mL 0.5×TBE tamponu içeresinde mikrodalga fırında eritildi. Jel
hafif soğuyunca içerisine tarak yerleştirilmiş jel aparatlarına döküldü.
4. Yükleme tamponu
Brom fenol Mavisi %0.05
Gliserol %10
Ficoll %15
0.5×TBE tamponu ile 100 mL’ye tamamlandı.
5. Etidyum Bromür çözeltisi:
Etidyum bromür 5 µg/µL olacak şekilde damıtık suda çözülerek hazırlandı.
3.2.5.2. Yöntem
3 gr agaroz tartılıp temiz bir erlen içine alındı, üzerine 100 mL 0,5 X TBE tamponu
ilave edildi ve bu karışım mikrodalga fırında homojen hale gelene kadar ısıtıldı. Erlen
içerisindeki jel soğuduktan sonra içerisine tarak yerleştirilen elektroforez tankına
döküldü ve tank 0.5×TBE tamponuyla dolduruldu. Jel içindeki tarak çıkarılıp
aplikasyon kuyuları tampon ile temizlendi. Amplifiye edilen örnekten 10 µL alınıp 5 µL
32
yükleme tamponu ile karıştırılarak kuyulara aplike edildi. Kuyulardan birine fragman
uzunluklarını değerlendirmek için DNA markeri (50 bp Bio Basıc) aplike edildi. Bu jel
120 voltta 45 dakika yürütüldü. Elektroforez sonrası jel, elektroforez tankından
çıkartılıp etidyum bromür ile 1 dakika boyandı ve damıtık suda yarım saat bekletilerek
boya atıklarından temizlendi. Ultraviyole ışık (UV) altında görülen DNA
fragmanlarının fotoğrafı çekilerek sonuç değerlendirildi.
3.3. Restriksiyon Enzimi Uzunluk Polimorfizmi
Fme-Rme primerleri ile amplifiye olmuş her PCR ürününden 10 µL alınıp PCR
tüplerine aktarıldı ve üzerlerine 1 µL Eae I (5U/ µL) enzimi ilave edildi. Bu karışım
370C’de 1 gece inkübe edildikten sonra %4’lük agaroz jelinde marker ile beraber
yürütüldü. Agaroz jelde yürütülüp, etidyum bromür boyası ile boyandıktan sonra
fragman uzunlukları kaynak 21’deki verilere göre değerlendirildi.
Enterobacter aerogenes (Eae I) restriksiyon enziminin Fme-Rme primerleri ile
amplifiye olmuş Leishmania parazitlerinde kestiği gen bölgeleri çizelge 6’da
gösterilmektedir.
Çizelge 6. Enterobacter aerogenes (Eae I) restriksiyon enzimi 21
Enzim Köken Tanıma alanı Tepkime şartları Eae I Enterobacter aerogenes 5’-Py*GGCCPu-3’ 370C 1 gece Eae I restriksiyon enziminin Leishmania parazitinde kestiği gen bölgeleri Eae I .L.donovani I ……184/107/87 L.donovani II ….. 281/108 L.donovani III …. 230/107/87 L.infantum …… 327/108 L.tropica ………. 227/178 L.kilicki ……….. 232/170 L.aethiopica ……. 213/193 L.aethiopica ……. 276/142 L.major………… 125/ 119/ 92/ 70/ 21
33
4.BULGULAR
Elli hastadan alınan kan örnekleri Giemsa boyası ile hazırlanıp X100 büyütmede
incelendi ve bu inceleme sonucunda 10 hastanın mikroskop bakısı (+), 40 hastanın
mikroskop bakısı (-) bulundu. Aynı zamanda rk39 ve PCR çalışıldı. Bu çalışma
sonucunda 13 hastada rk39 (+) , 37 hastada rk39 (-) , 29 hastanın PCR (+) , 21 hastanın
PCR (-) olduğu görüldü (Çizelge 7, 8 ve 9).
Çizelge 7. rK39 ve mikroskop bakısı ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması
Mikroskop bakısı(+
Mikroskop bakısı(-)
TOPLAM
rK39 (+)
6
7
13
rK39 (-)
4
33
37
Toplam
10
40
50
Çizelge 8. PCR ve mikroskop bakısı ile elde edilen sonuçları karşılaştırılması
Mikroskop
bakısı(+)
Mikroskop bakısı(-) Toplam
PCR(+) 9 20 29
PCR(-) 1 20 21
Toplam 10 40 50
34
Çizelge 9. PCR ve rK39 ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması
rK39 (+)
rK39 (-)
TOPLAM
PCR (+)
13
16
29
PCR (-)
0
21
21
Toplam
13
37
50
PCR ile mikroskop bakısının karşılaştırılması sonucunda PCR’ın duyarlılığı
%90, özgüllüğü %50 bulundu. PCR ile rK39 sonuçları karşılaştırıldığında PCR’in
duyarlılığı % 100, özgüllüğü %56.8 bulundu.
Bu çalışmada PCR ile diğer tanı yöntemlerini karşılaştırmak için kinetoplast
DNA (kDNA)’sında bulunan ve 10 Leishmania parazitine kadar hassas olan 13A-13B
primerleri kullanıldı. 13A-13B primerleri ile yapılan PCR çalışmasında elde edilen PCR
ürünleri %2’lik agaroz jelde yürütüldü ve 120 bp uzunluğunda elde edilen fragmanlar
pozitif kabul edildi (Şekil 5). 13A-13B primerleri ile PCR pozitif olan DNA örnekleri
ile tiplendirme yapmak için Fme-Rme primerleri ile çalışıldı ve agaroz jelde 400-500 bp
uzunluğundaki fragmanlar pozitif kabul edildi (Şekil 6).
Daha sonra Fme-Rme primerleri ile Leishmania paraziti tespit edilen 7 örnek
Eae I restriksiyon enzimi ile kesildi ve 4’ünün L.donavani, 3’ünün L.infantum olduğu
görüldü. (Şekil 7 ve 8).
35
Şekil 5. 13A-13B primerleri ile amplifiye olmuş örneklerin PCR sonuçları
(1.Marker (50bp-Bio Basic), 2-4 Hastalardan alınan örnekler)
Şekil 6. Fme-Rme primerleri ile amplifiye olmuş örneklerin PCR sonuçları.
(1.100 bp marker (Biobasic) 2-4 Hastalardan alınan örnekler)
1 2 3 4 500 400 300 200 150 100 50
4 3 2 1
600 500 400 300 200 100
36
Şekil 7. Eae I restriksiyon enzimi ile kesilen ve L.donavani bulunan örnekler
(1.100 bp marker (Biobasic) 2-4 Hastalardan alınan örnekler)
Şekil 8. Eae I restriksiyon enzimi ile kesilen ve L.infantum bulunan örnekler
(1.50 bp marker (Biobasic) 2-4 Hastalardan alınan örnekler)
1 2 3 4 5
1 2 3 4
600 500 400 300 250 200 150 100
600 500 400 300 200 100
37
5.TARTIŞMA
Leyişmanyoz, ülkemizin de dahil olduğu tropikal ve subtropikal ülkelerde
oldukça yaygındır. Ülkemizde insanlarda visseral (kala-azar) ve deri leyişmanyozu
(şark çıbanı) klinik şekillerinde görülmektedir. İnsanlarda Leishmania amastigotları
dalak, karaciğer, lenf bezleri ve kemik iliğine yerleşerek visseral leyişmanyoza neden
olmaktadır, tedavi edilmediği takdirde ölümcül olabilmektedir 19,31.
Ülkemizde başta Ege ve Akdeniz bölgesi olmak üzere hemen hemen her
bölgemizde sporadik veya endemik olarak görülen kala-azarın etkeninin L.infantum
olduğu bildirilmiştir 32.
Çalışmamızda, visseral leyişmanyoz ön tanısı ile kiniklerde izlenen olgularda
serolojik tanının (rK39 hızlı tanı testi) yanı sıra doğrudan mikroskop tanısı ve PCR’ın
karşılaştırılması amaçlanmıştır.
Türkiye’de kala azar daha çok çocuklarda görülmekte olup hastalığın sporadik
olgular halinde ortaya çıkması nedeniyle tanıda güçlükler yaşanmaktadır. Klinik
bulguları birçok hastalığın kliniği ile benzerlik gösterdiğinden dolayı kala azar öncelikli
olarak düşünülmemektedir. Ayırıcı tanı amaçlı kemik iliği aspirasyonu uygulanması
durumunda örnekte amastigot sayısının az olması ve deneyim gerektirmesi nedeniyle
gözden kaçabildiği belirtilmektedir. Kala azarın düşünülmesi durumunda tanıda
yardımcı olmak amacıyla dünyanın birçok bölgesinde olduğu gibi ülkemizde de yüksek
duyarlılık ve özgüllükte olan serolojik testler uygulanmaktadır. Uzun zamandır
uygulanan indirek floresan antikor (IFA) testine ek olarak ELISA, rK39 antijeninin
kullanıldığı hızlı tanı testi ve doğrudan aglütinasyon (DAT) testi de antileishmania
antikorlarının saptanması için rutinde ve sero-epidemiyolojik çalışmalarda yaygın
olarak kullanılmaktadır 19,32,33.
Visseral leyişmanyoz tedavi edilmediğinde öldürücü olabildiğinden tedavide
başarı etkenin tanımlanmasını gerektirmektedir. Yapılan bir moleküler çalışma ile deri
etkeni olarak bilinen L.tropica’nın visserotropik olduğu tespit edilmiştir. Başka bir
araştırmaya göre de Güney Batı Avrupa’da L.infantum’un hem deri hem de visseral
38
leyişmanyozdan sorumlu olduğu belirlenmiştir 31. Bu nedenle bölgemizde visseral
leyişmanyoza neden olan etkenlerin moleküler yöntemlerle tanımlanması önemlidir.
Serin ve ark 34 visseral ve deri leyişmanyozlu olgularda miniekzon bölgesi ile
yaptıkları PCR-RFLP ile tür tayini çalışmasında üç deri leyişmanyoz olgusunda kala
azar öyküsü olmadığı halde L.infantum tespit etmişler, kolay ve hızlı sonuç verdiğinden
dolayı PCR-RFLP’nin rutinde kullanılmasını önermişlerdir.
Polimeraz zincir reaksiyonu birçok hastalıkta olduğu gibi leyişmanyoz tanısında
da yaygın olarak uygulanmakta, klinik örneklerde az miktarda bulunan paraziti
saptayabilmesi, direk tanıda yardımcı olacak deneyimli personele ihtiyaç duyulmaması,
tedavi sonrası izlemin yapılabilmesi gibi avantajları bulunmaktadır. PCR’da parazit
genomuna veya kinetoplast DNA’ya ait primerler kullanılarak tanı konulması yanı sıra
türe özgü primerler kullanılarak parazitin tür ayrımı da yapılabilmektedir 7,19,35,36,37.
Bu yüzden çalışmamızda PCR yönteminin kala azar tanısında rutine
konulabilmesi amacıyla bütün Leishmania türlerinin kinetoplast DNA’sında bulunan bir
bölgeden elde edilen, 10 parazite kadar saptayabilen ve tanıda yaygın olarak kullanılan
13A ve 13B primer çifti ile klinikte izlenen olgulara PCR uygulanmıştır. Çalışmamızda
daha sonra PCR ile kinetoplast DNA’sını tespit ettiğimiz başka bir deyişle kala azar
tanısı koyduğumuz örneklere tür tayini yapabilmek için daha özgül bir gen bölgesi olan
miniekzon gen bölgesinde ITS-I gen bölgesini çoğaltan Fme ve Rme primer çifti ile
PCR uygulanmıştır. En son burada pozitif sonuç elde ettiğimiz yedi olguya Eae I
restriksiyon enzimi kullanılarak kesim yapılmıştır. Çalışmamızda bu olgulardan 3’ünün
L.infantum ve 4’ünün de L.donovani ile infekte olduğu tespit edilmiştir (Şekil 7 ve 8).
Ayırıcı tanıda visseral leyişmanyoz düşünülen hastalarda invaziv olmayan ve
yüksek oranda duyarlılık ve özgüllük gösteren serolojik testler büyük oranda yardımcı
olmaktadır. Antikor saptanan olgularda hala altın standart olarak kabul edilen kemik
iliği aspirasyon yaymasında parazitlerin gösterilmesi ile kesin tanı konmaktadır. Fakat
kemik iliği aspirasyonu sırasında zaman zaman kanama olabilmekte, yetersiz materyal
alınabilmekte ve örnekte amastigot görülmeyebilmektedir. Kemik iliği aspirasyonlarının
kültürü de sensitiviteyi arttırabilmektedir, fakat pahalı ve deneyimli donanıma
gereksinim duyulduğundan rutinde pek tercih edilmemektedir. DAT veya rK39 hızlı
tanı testi gibi antikor saptamaya dayalı testler de yüksek oranda duyarlıdır, ancak
tedaviden sonra bile pozitif sonuç verebildiğinden relapsların tanısında kullanımı tercih
39
edilmemektedir. Alınan örnekte çok az sayıdaki parazitin dahi DNA’sını saptayabilen
PCR yöntemi kemik iliği aspirayonu ile tanının hassasiyet ve duyarlılığını
arttırmaktadır. 7,38. Çalışmamızda mikroskop bakısı ile parazite rastlanmayan 20
olgunun PCR ile pozitif olduğu saptanmıştır. Bu sonuç, leyişmanyoz tanısında
moleküler çalışmanın önemini bir kez daha ortaya çıkarmıştır.
Piarroux ve ark7 kala azar tanısında hiçbir yöntemin %100 hassasiyet
göstermediğini, en hassas yöntemin PCR olduğunu bildirmişlerdir. Serolojik
yöntemlerinde yüksek derecede hassasiyet gösterdiğini, ancak relapsları tanımada
başarısız olduğunu belirtmişlerdir. Çalışmamızda rK39 hızlı tanı testi ile negatif
bulunan 37 olgunun 16’sının PCR ile pozitif olduğu saptanmıştır.
Chappius ve ark39 iki farklı rK39 hızlı tanı testi ile yaptıkları çalışmada bu testin
visseral leyişmanyoz tanısında oldukça duyarlı ve özgül olduğunu tespit etmişlerdir.
Kullandıkları testlerden biri aynı zamanda sıtma tanısında da kullanılmaktadır ve
bununla elde edilen sonuçlar %97 duyarlı ve %97 özgül iken, sadece kala azar tanısında
kullanılan test ile duyarlılığı %99 ve özgüllüğü %82 olarak bulmuşlar ve rK39’a karşı
oluşan antikorların tedaviden sonra kanda uzun süre bulunduğundan dolayı dalak
aspirasyonunun relapsların tanısını doğrulamak açısından zorunlu olduğunu
bildirmişlerdir.
Nahhas ve ark40 rK39 hızlı tanı testi ile yaptıkları çalışmada 80 olguda testin
pozitif olduğunu, ancak bunların sadece 10’unun semptomatik ve bunların da 3’ünün
mikroskop bakısında amastigot görüldüğünü ve testin hızlı, duyarlı ve seçici olmasından
dolayı asemptomatik olan fakat endemik bölgede yaşayan ve klinik olarak farklı
hastalıkları düşündürebilen olgularda hızlı ve özel bir ekipmana ihtiyaç
duyulmadığından rutinde kullanılabileceğini belirtmişlerdir.
Son zamanlarda, kala azar ile ilgili yayınlarda kala azarın doğru tanısı için
kullanılan yöntemlerin önemi üzerinde durulmaktadır. Erken tanı ve tedavi özellikle
Hindistan gibi tek rezervuarın insan olduğu ülkelerde hem kala azarın hem de kala azar
sonrası deri leyişmanyozunun kontrolu açısından çok önemlidir. Saha koşullarında
rahatlıkla kullanılabilecek duyarlı, seçici, basit ve zahmetsiz bir testin geliştirilmesi
visseral leyişmanyozun kontrolu açısından çok önemlidir. rK39 hızlı tanı testi bu amaç
doğrultusunda atılmış önemli bir adımdır 41.
40
Çalışmamızda mikroskop bakısı pozitif 10 ve mikroskop bakısı negatif 40 olgu
olmak üzere toplam 50 visseral leyişmanyoz ön tanısı ile klinikte izlenen olgulara rK39
hızlı tanı testi uygulanmış ve %60 duyarlı ve %82 özgül bulunmuştur (Çizelge 7).
Carvalho ve ark42 mikroskop bakısı veya kültür ile doğrulanmış 128 olguda
ELISA yöntemi ve rK39 hızlı tanı testini çalışmışlar ve rK39 hızlı tanı testinin ve
ELISA’ nın duyarlılığını sırasıyla %90 ve %89 bulurken, özgüllüğü de %100 ve %98
bulmuşlardır. Kala azar ön tanısı ile izlenen olgularda ilk değerlendirmelerde bu basit ve
hızlı testin %100 seçici olduğundan dolayı daha invaziv metodların yerini alabileceğini
ve hem endemik bölgelerde yaşayan hem de seyahat eden kişilerde güvenle
kullanılabileceğini öne sürmüşlerdir.
Çalışmamız ve önceki yıllarda yapılan altı çalışmayı karşılaştırdığımızda
sonuçlar arasında önemli farklılıklar olduğunu görmekteyiz. Çalışmalarda rK39 hızlı
tanı testinin duyarlılığı %46-%100 arasında değişmektedir. En yüksek
duyarlılığın(%100) Hindistan ve Nepal’ den gelen olgularda olduğu görülmektedir 42-47.
Venezuella’ daki olgularda %88 oranında, Sudan ve diğer bölgelerden olan olgularda
ise daha düşük duyarlılık tespit edilmiştir 44-46.
rK39 hızlı tanı testi ile elde edilen bu farklı sonuçlar birkaç hipotez ile
açıklanmaktadır. L.donovani kompleksinin alt türlerinden dolayı test sonuçları farklı
olabilmektedir. Aynı zamanda bu alt türler arasında bölgesel farklılıklar da
olabilmektedir. Başka bir olası durum olgular arasındaki genetik farklılıklar veya ırksal
alt gruplar olabileceği ihtimali ile açıklanmaktadır. Konağın immun cevabında rol alan
genetik faktörler de sonuçlar arasında bu değişkenliğe neden olabilmektedir 42.
Carvahallo ve ark42 çalışmalarında ayrıca visseral leyişmanyoz tedavisi
tamamlanan hastalarda rK39 antijenine karşı oluşan antikorların 6 aya kadar anlamlı
oranda (%46) pozitif kalabildiğini de belirtmişlerdir.
Zijlstra ve ark48 pozitif rK39 hızlı tanı testi sonucu aldıkları olguların K39
antijenine karşı oluşan antikor titrelerini ELISA ile çalışmışlar ve bunlardan elde
ettikleri sonuçları rK39 negatif sonuç aldıkları olguların ELISA sonuçları ile
karşılaştırdıklarında anlamlı farklılık (p<0.0001) bulmuşlar ve bu sonucun hastalığın
şiddeti ve süresi gibi epidemiyolojik faktörlere bağlı olabileceğini belirtmişlerdir.
Son yıllarda visseral leyişmanyoz tanısında PCR yöntemi sıkça tercih edilmekte
olup bununla ilgili pek çok araştırma yapılmıştır.
41
Lachaud ve ark35 PCR, kültür ve serolojik yöntemleri karşılaştırmak üzere
yaptıkları 237 kala azar hastasını kapsayan çalışmada PCR yönteminin kültürden,
mikroskop bakısından ve serolojik yöntemlerden daha duyarlı olduğunu bulmuşlardır.
Olguların periferik kanından yapılan PCR ve kültür yöntemini karşılaştırdıklarında
duyarlılık sırasıyla %97 ve %55 iken, kemik iliği aspiratları ile yaptıkları PCR ve
kültürde sırasıyla %100 ve %81 duyarlılık saptamışlardır. 19’u aynı zamanda AIDS
olan toplam 23 hastayı hem tedavi sırasında hem de tedaviden sonra 3 yıla kadar takip
etmişler, 7 hastada çalışma devam ederken relaps görülmüş ve bu relapsların 6’sı ilk
olarak PCR ile tespit edilmiştir. Bu bulguların neticesinde kan örnekleri ile yapılan PCR
yönteminin hem bağışıklığı baskılanmış hem de baskılanmamış hastalarda tanı için
yeterli olacağı kanısına varmışlar ve tedavi sonrası bağışıklığı baskılanmış hastaların
PCR yöntemi ile sistematik olarak takip edilmesini önermişlerdir.
Salotra ve ark36 L.donovani’nin kinetoplast DNA’sına özgü PCR ile hastaların
periferik kanından parazit DNA’sını araştırdıkları çalışmalarında %96 duyarlılık
bulmuşlar ve bu yöntemin yaklaşık 0.1 paraziti dahi tespit edebildiğini ileri
sürmüşlerdir. Çalışmalarında periferik kanın kullanımını daha az invaziv ve dalak veya
kemik iliği aspirasyonundan daha güvenli olduğu için tercih ettiklerini belirtmişlerdir.
Ancak az sayıda da olsa ellerindeki kemik iliği aspirasyonları ile yaptıkları PCR
duyarlılığını ise %100 bulmuşlar ve bunu da kemik iliğinde parazit yoğunluğunun
periferik kana oranla daha fazla oluşu ile ilişkilendirmişlerdir.
L.donovani’nin etken olduğu visseral leyişmanyozun tanısı için kan örnekleri ile
yapılan PCR çalışmalarında %45-%94 arasında değişen oranlarda duyarlılık olduğu
tespit edilmiştir 37,49-52.
L.infantum’un etken olduğu visseral leyişmanyozun tanısı için kan örnekleri ile
yapılan PCR çalışmalarında ise %64-%97 arasında değişen oranlarda duyarlılık olduğu
gösterilmiştir 35,50,53,54.
Çalışmamızda, mikroskop bakısı pozitif 10 ve mikroskop bakısı negatif 40 olgu
olmak üzere toplam 50 kala azar ön tanısı ile izlenen hasta kanları ile PCR çalışılmış ve
duyarlılık %90 bulunmuştur. Çalışmamızda ayrıca bu 50 hastaya rK39 dipstick testi
uygulanmış ve 13 hastada rK39 pozitif ve 37 hastada rK39 negatif bulunmuştur. rK39
negatif 37 hastanın 16’sında ve rK39 pozitif 13 hastada PCR ile pozitif sonuç elde
edilmiş ve PCR duyarlılığı %100 ve özgüllüğü %56.8 bulunmuştur (Çizelge8 ve 9).
42
Campino ve ark55 immun sistemi çeşitli hastalıklar nedeniyle baskılanmış
hastalarda filtre kağıdına emdirilmiş kan ile PCR çalışmışlar ve tam kan ile çalışan
Mathis ve ark53 ile benzer sonuçlar elde etmişlerdir.
Osman ve ark51 ise filtre kağıdına emdirilen kan ile yapılan PCR’da elde edilen
pozitif sonuçların EDTA’lı tüplerde saklanan tam kan örneklerinden daha fazla
olduğunu tespit etmişlerdir.
Costa ve ark 56 ise 13 HIV pozitif hastadan EDTA’lı tüplere alınan 44 örnek ile
PCR çalışmışlar ve %98 duyarlılık tespit etmişlerdir.
Leyişmanyoz tedavisinin başarılı olarak sonuçlanması uygun ilaç seçimi ile
mümkündür. İlaçların seçimi esnasında birçok faktör göz önüne alınmalıdır. Tedaviyi
etkileyen faktörlerin en önemlilerinden biri olan Leishmania’ nın türü, ilaç seçiminde de
önemli bir rol oynar. İnsanda infeksiyon etkeni olabilen 15’den fazla Leishmania
türünün ilaçlara gösterdiği duyarlılığın farklı olması, Leishmania türlerinin
biyokimyasal ve moleküler özelliklerinin farklı olmasından kaynaklanmaktadır24,25.
Dünyanın birçok ülkesinde olduğu gibi ülkemizde de leyişmanyoz halk sağlığını
yakından ilgilendiren bir sorundur. Hastalığın kliniği ve tedaviye alınan yanıtlar
farklılık gösterebilmektedir. Bu nedenle, Leishmania türlerinin doğru tanımlanması
endemik bölgelerde klinik iyileşme ve tedaviye yanıt olasılığını arttırmaktadır. Örneğin
bazı türlerde ancak kombinasyon tedavisi ile iyileşme sağlanabilmektedir.
Çalışmamızda elde ettiğimiz PCR pozitif olgulara RFLP uygulayarak tür tayini yapmayı
ve böylelikle kliniğin çalışmalarına destek olmak amaçlandı. Çalışmamızda Fme-Rme
primerleri kullanarak PCR pozitif bulduğumuz olgulara Eae I enzimi ile kesim
uygulandı ve sonuçta 7 örnek Marfurt ve ark21 yaptıkları çalışmadaki referans suşlarla
karşılaştırıldı, 3’ünün L.infantum ve 4’ünün L.donovani olduğu görüldü (Şekil 7 ve8).
Marfurt ve ark21 yaptıkları çalışmada Fme-Rme primerleri ile Leishmania
parazitinin ITS I gen bölgesini çoğaltmışlar ve bu bölgeyi Hae III ve Eae I enzimleri ile
keserek elde ettikleri sonuçlara göre tiplendirme yapmışlar ve tiplendirme için en uygun
gen bölgesinin ITS I olduğu fikrini ileri sürmüşlerdi.
Serin ve ark57 2007 yılında miniekzon gen bölgesini çoğaltarak yaptıkları
çalışmada RFLP profillerinin L.enrietti, L.tarentolae ve L.gerbilli’ye özgü olduğunu ilk
defa tespit etmişler ve miniekzon PCR-RFLP yöntemini türlerin ayrımını yapmada
basit, duyarlı ve seçici bir yöntem olduğunu bir defa daha onaylamışlardır.
43
Marfurt ve ark58 yaptıkları diğer bir çalışmada miniekzon gen bölgesini
çoğaltmışlar ve elde ettikleri sonuçları kültür, seroloji ve iki farklı gen bölgesi ile
yaptıkları başka bir moleküler çalışma ile karşılaştırmışlar, miniekzon yöntemi en
yüksek duyarlılık (%89.7) gösterirken diğerlerinin duyarlılığı sırasıyla %70.6, %57.1,
%51.7 ve %79.3 olarak bulunmuştur. Miniekzon PCR-RFLP yöntemini diğer moleküler
yöntemlere kıyasla daha güvenilir ve doğru bulduklarından bu yöntemin tanıyı
kolaylaştırabileceği gibi tanı ve tedavide gelişmeleri de destekleyebileceğini öne
sürmüşlerdir.
Hide ve Banuls59 sistein proteaz B(cpb) gen bölgesini çoğaltarak yaptıkları
çalışma ile sadece L.donovani ve L.infantum ayrımını yapmışlar ve diğer trypanasoma
ailesi türleri için çoğaltma yapmadığını belirtmişlerdir.
Sonuç olarak çalışmamızda direk mikroskop bakısının gerek örnek alımındaki
hatalar gerekse parazitin az sayıda olmasından kaynaklanan nedenler yüzünden
duyarlılığı düşük bulunmuştur. PCR yöntemi ile çok az sayıdaki parazit dahi
saptanabildiğinden tanıda duyarlılık artmaktadır. Serolojik yöntemler de yüksek
duyarlılık ve özgüllük gösterebilmektedir, ancak antikor düzeyi eşik değerin altındaki
olgularda yalancı negatif sonuçlar görülebilmektedir. Oysa PCR ile çok az sayıda
parazit dahi olsa parazit DNA’sı saptanabilmektedir. Buna karşın nadir de olsa gerek
uygun örnek alınmamasından dolayı gerekse PCR inhibitörlerine bağlı olarak yanlış
negatif sonuçlar alınabilmektedir. Nitekim çalışmamızda mikroskop bakısında
amastigot görülen bir olguda PCR yöntemi ile negatif sonuç alınmıştır. Ayrıca
çalışmamızda PCR-RFLP yöntemi ile Leishmania türlerinin tanımlandırılabileceği
sonucu elde edilmiştir. PCR-RFLP ile tür tayini hastalığın epidemiyolojisi, tedavisi ve
kontrolü açısından çalışmalarımızda yol gösterici olacaktır.
44
6.SONUÇLAR VE ÖNERİLER
Ülkemizde başta Ege ve Akdeniz bölgesinde olmak üzere hemen hemen her
bölgede endemik olarak görülen kala azar tedavi edilmediği takdirde ölümle
sonuçlanabildiğinden dolayı başarılı ve doğru tedavi en az tanının doğru konması kadar
önemlidir. Leyişmanyoz tedavisinin başarılı olarak sonuçlanması da ancak uygun ilaç
seçimi ile mümkündür.
Bu bilgiler doğrultusunda çalışmamızda öncelikle leyişmanyoz tanısında
kullanılan üç farklı yöntem karşılaştırıldı. Mikroskop bakısı ile elde edilen sonuçlar
tatmin edici değildi, gerek örneklerin uygunsuz alınmasından gerekse periferik kanda
parazit sayısının az olmasından dolayı 50 hasta grubu ile yapılan çalışmada 10 olguda
amastigotlar saptandı.
Ayrıca, Leishmania K39 antijenine karşı oluşan antikorları saptamaya yarayan
rK39 hızlı tanı testi de bütün hastalara uygulandı ve 13 olguda rK39 pozitif, 37 olguda
rK39 negatif bulundu. Bütün olgulara ayrıca PCR yöntemi uygulandı ve rK39 pozitif
olan 13 olgunun ve rK39 negatif olan 16 olgunun bu yöntem ile pozitif olduğu tespit
edildi. Tanıda kullandığımız bu üç yöntemi karşılaştırdığımızda PCR yöntemi rK39’a
oranla %100 duyarlı ve %56.8 özgül ve mikroskobiye kıyasla %90 duyarlı ve %50
özgül bulundu. Bölgemizde çoğunlukla hasta grubumuzu oluşturan kişilerin de tedavi
amacıyla başvurdukları kliniklerde tanıya destek olmak amacıyla laboratuvarda bu
yöntemin rutin kullanılması gerektiği sonucuna varıldı.
Visseral leyişmanyoz tedavi edilmediğinde öldürücü olabildiğinden tedavide
başarı etkenin tanımlanmasını da gerektirmektedir. Son yıllarda yapılan bazı
çalışmalarda deri leyişmanyoz etkeni olarak bilinen L.tropica’nın visserotropik olduğu,
başka bir araştırmaya göre de L.infantum’un hem deri hem de visseral leyişmanyozdan
sorumlu olduğu görülmüştür. Bu yüzden çalışmamızda PCR-RFLP yöntemi ile klinikte
kala azar ön tanısı ile izlenen olgularda hastalığa neden olan türlerin tipleri tanımlandı
ve bu türlerin 3 hastada L.infantum, 4 hastada ise L.donovani olduğu görüldü; bu
sonuçlar bugüne kadar hastalık ile ilgili bilgilerimizle paraleldi.
45
Çalışma sonunda, PCR-RFLP ile tür tayini yaparak türe özgü tedavi
yaklaşımlarının belirlenmesi için kliniğe destek olunabileceği sonucuna varıldı.
Gerek hastalığa doğru tanı koymada gerekse türe özgü tedavi yaklaşımlarında
önemli adımların atılması için daha fazla sayıda hasta grubu ile çalışmalar yapılmalıdır.
-
46
7.KAYNAKLAR
1. Reithinger R, Dujardin JC., Molecular Diagnosis of Leishmaniasis: Current Status and Future Applications. Journal of Clinical Microbiology 2007: 21-25
2. World Health Organization web sayfası (http://www.who.int/tdr/diseases/Leish,Progress 2003-
2004,17thProgrammeReport) Erişim Tarihi: 05.12.2007 3. Özbel Y, Töz ÖS, Leishmaniosis, Özcel MA. Tıbbi Parazit Hastalıkları 1. Baskı, İzmir: Mete
Basım Matbaacılık Hizmetleri, 2007: 198-230 4. Sundar S, Rai M. Laboratory Diagnosis of Visceral Leishmaniasis. Clinical and Diagnostic
Laboratory Immunology 2002: 951-958 5. Unat EK, Yücel A, Altaş K, Samastı M. Unat’ın Tıp Parazitolojisi 5. Baskı, İstanbul: Doyum
Matbaası, 1995: 564-586 6. Gangneux JP, Merotti J, Lorenzo F, Sarfati J, Blanche H. Bui H, Pratlong F, Garin YJF,
Derovin F. Prospective Value of PCR Amplification and Sequencing for Diagnosis and Typing of Old World Leishmania Infections in an Area of Nonendemicity. Journal of Clinical Microbiology. 2003: 1419-1422
7. Piarroux R, Gambarelli F, Dumon H, Fontes M, Dunan S, Mary C, Toga B, Quilici M.
Comparison of PCR with Direct Examination of Bone Marrow Aspiration, Myeloculture and Serology for Diagnosis of Visceral Leishmaniasis in Immunocompromised Patients. Journal of Clinical Microbiology. 1994: 746-749
8. Saygı G. Temel Tıbbi Parazitoloji, Sivas: Esnaf Ofset Matbaacılık, 1998: 47-55 9. Unat EK, Yaşarol Ş. Leishmaniasis: Kala-azar ve Şark Çıbanı Ege Üniversitesi Matbaası Bornova-
İzmir, 1981: 1-45 10. Ashford RW, Bates PA. Leishmaniasis in the Old World, Cox F, Kreier J, Wakelin D.
Topley&Wilson’s Microbiology and Microbial İnfections. 9th Ed. Oxford University Press, Inc. New York 1998: 215-240
11. Özcel MA, İnci A, Turgay N, Köroğlu E. Tıbbi ve Veteriner İmmunoparazitoloji, Türkiye
Parazitoloji Derneği. 2007: 21: 155-166 12. Davidson NR. Leishmaniasis, Cohen J, Powderly W. Infectious Diseases 2th Ed, Edinburg, Mosby.
2004: 1621-1626
47
13. Özcel MA, Özbilgin A. Güney Doğu Anadolu Projesini Tehdit Eden Parazit Hastalıkları. Altıntaş N. Leishmaniosis. Bornova-İzmir: Ege Üniversitesi Basımevi, 1995: 97-127
14. Alkan Z, Özbel Y, Özensoy S, Atambay M. Moleküler Biyolojik Yöntemler, Özcel MA, Altıntaş
N. Parazit Hastalıklarında Tanı, Türkiye Parazitoloji Derneği.1997:15:373-411 15. Marti-Sanchez J, Pineda JA, Morillas-Marquez F, Garcia-Garcia JA, Acedo C, Macias J.
Detection of Leishmania Infantum Kinetoplast DNA in Peripheral Blood From Asymptomatic Individuals at Risk for Parenterally Transmitted Infections: Relationship Between Polymerase Chain Reaction Results and Other Leishmania Infection Markers. Am. J. Trop. Med. Hyg.2004: 545-548
16. Lachaud L, Chabbert E, Dubessay P, Reynes J, Lamothe J, Bastien P. Comparison of Various
Sample Preparation Methods for PCR Diagnosis of Visceral Leishmaniasis Using Peripheral Blood. Journal of Clinical Microbiology. 2001:613-617
17. Spanakos G, Patsoula E, Kremastinou T, Saroglou G, Vakalis N. Development of a PCR-based
Method for Diagnosis of Leishmania in Blood Samples. Moleculer and Cellular Probes. 2002: 415-420
18. Disch J, Caligiorne RB, Maciel F, Oliveira MC, Orsini M, Dias-Neto E, Rabello A. Single-Step
Duplex kDNA-PCR for Detection of Leishmania Donovani Complex in Human Peripheral Blood Samples. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2006: 395-400
19. Özensoy S, Özbel Y, Turgay N, Alkan MZ, Gül K, Gilman-Sachs A, Chang KP, Reed SG,
Özcel MA. Serodiagnosis and Epidemiology of Visceral Leishmaniasis in Turkey. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1998: 363-369
20. www.namp.gov.in Erişim Tarihi: 25.12.2008 21. Marfurt J, Niederwieser I, Makia ND, Beck HP, Felger I. Diagnostic Genotyping of Old and
New World Leishmania Species by PCR-RFLP. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2003: 115-124
22. Aksoy K, Kayrın L, Tuli A. Tanıda Moleküler Genetik Yöntemler. Adana: 9.Biyokimya Yaz
Okulu, 2006 23. White BA. PCR Protocols: Current Methods and Applications for DNA Amplification, Humana
Press, Totwa New Jersey. 1993 24. Rosenthal E, Marty P. Recent Understanding in the Treatment of Visceral Leishmaniasis. J
Postgrad Med. 2003: 49: 61-68 25. Croft SL. Monitoring Drug Resistance in Leishmaniasis. Trop Med Int Health. 2001: 605-899 26. Delibaş BS, Akısü Ç. Diğer Kan ve Doku Protozoon Hastalıklarının Tedavisi. Ed Akısü Ç,
Korkmaz M, Tıbbi Parazitolojide Tedavi. Tıbbi Parazitoloji Derneği, Ege Üniversitesi, Yayın No:20 27. Singh RK, Pandey HP, Sundar S. Visceral Leishmaniasis (Kala-azar): Challenges Ahead. Indian
J. Med. Res. 123. 2006: 331-344
48
28. Sundar S, Rai M. Advances in the Treatment of the Leishmaniasis. Curr. Opin Infect Dis. 2002: 15: 593-598
29. Schönian G, Fari ME, Lewin S, Schweynoch Carola, Presber W. Molecular Epidemiology and
Population Genetics in Leishmania. Med. Microbiol Immunol. 2001: 61-63 30. Cortes S, Mauricio I, Almeida A, Cristovão JM, Pratlong F, Dedet JP, Campino L. Application
of kDNA as a Molecular Marker to Analyse Leishmania Infantum Diversity in Portugal. Parasitology International. 2006: 277-283
31. Dilmeç F, Matur A, Alhan E, Aksaray N. Çukurova Bölgesi Visseral Leishmania Etkenlerinde
Total DNA Restriksiyon Endonükleaz Profilleri. Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi. 1999: 158-164
32. Özensoy S, Özbel Y, Atay MG, Ertabaklar H, Şakru N, Taylan A, Hökelek M. İnsan ve
Köpeklerden Alınan Klinik Örneklere Leishmania Tanısı için Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) Uygulanması. Türkiye Parazitoloji Dergisi. 2002: 239-244
33. Reithinger R, Quinnell RJ, Alexender B, Dovies CR. Rapid Detection of Leishmania Infantum
Infection in Dogs: Comparative Study Using on Immunochromatographic Dipstick Test, Enzyme-Linked Immunosurbent Assay, and PCR. Journal of Clinical Microbiology. 2002: 2352-2356
34. Serin MS, Dağlıoğlu K, Bagirova M, Allahverdiyev A, Uzun S, Vural Z, Kayar B, Tezcan S,
Yetkin M, Aslan G, Emekdaş G, Köksal F. Rapid Diagnosis and Genotyping of Leishmania Isolates from Cutaneous and Visceral Leishmaniasis by Microcapillary Cultivation and Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism of Miniexon Region. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2005: 209-214
35. Lachaud L, Dereure J, Chabbert E, Reynes J, Mauboussin JM, Oziol E, Dedet JP, Bastien P.
Optimized PCR Using Patient Blood Samples For Diagnosis and Follow-Up of Visceral Leishmaniasis, With Special Reference to AIDS Patients. Journal of Clinical Microbiology. 2000: 236-240
36. Salotra P, Sreenivas G, Pogue GP, Lee N, Nakhasi HL, Ramesh V, Negi NS. Development of a
Species-Specific PSR Assay for Detection of Leishmania donovani in Clinical Samples from Patients with Kala-Azar and Post Kala-Azar Dermal Leishmaniasis. Journal of Clinical Microbiology. 2001: 849-854
37. Katakura K, Kawazu SI, Naya T, Nagakura K, Ito M, Aikawa M, Qu JQ, Guan LR, Zuo XP,
Chai JJ, Chang KP, Matsumoto Y. Diagnosis of Kala-Azar by Nested PCR Based on Amplification of the Leishmania Mini-Exon Gene. Journal of Clinical Microbiology. 1998: 2173-2177
38. Maurya R, Singh K, Kumar B, Salotra P, Rai M, Sundar S. Evaluation of PCR for Diagnosis of
Indian Kala-Azar and Assessment of Cure. Journal of Clinical Microbiology. 2005: 3038-3041 39. Chappuis F, Mueller Y, Nguimfack A, Rwakimari JB, Couffignal S, Boelaert M, Cavailler P,
Loutan L, Piola P. Diagnostic Accuracy of Two rK39 Antigen-Based Dipsticks and the Formol Gel Test for Rapid Diagnosis of Visceral Leishmaniasis in Northeastern Uganda. Journal of Clinical Microbiology. 2005: 5973-5977
49
40. Al-Nahhas S, Shabaan M, Hammoud L, Al-Taweel A, Al-Jorf S. Visceral Leishmaniasis in the
Syrian Arab Republic: Early Detection Using rK39. La Revue de Santé de la Méditerranée Oriantele. 2003: 856-862
41. Salotra P, Singh R. Rapid&Reliable diagnostic Tests for Visceral Leishmaniasis. Indian J Med Res.
2005: 464-467 42. Carvalho SFG, Lemo EM, Corey R, Dietze R. Performance of Recombinat K39 Antigen in the
Diagnosis of Brazilian Visceral Leishmaniasis. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2003: 321-324 43. Sundar S, Reed S, Singh V, Kumar P, Murray H. Rapid Accurate Field Diagnosis of Indian
Visceral Leishmaniasis. Lancet. 1998: 563–565 44. Sundar S, Pai K, Sahu M, Kumar V, Murray, HW. Immunochromatographic Strip-Test
Detection of Anti-K39 Antibody in Indian Visceral Leishmaniasis. Ann Trop Med Parasitol 2002: 19–23
45. Bern C, Jha SN, Joshi AB, Thakur GD, Bista MB. Use of the Recombinant K39 Dipstick Test
and the Direct Agglutination Test in a Setting Endemic for Visceral Leishmaniasis in Nepal. Am J Trop Med Hyg. 2000: 153–157
46. Delgado O, Feliciangeli MD, Coraspe V, Silva S, Perez A, Arias J. Value of a Dipstick Based on
Recombinant rK39 Antigen for Differential Diagnosis of American Visceral Leishmaniasis from Other Sympatric Endemic Diseases in Venezuela. Parasite. 2001: 355–357
47. Burns JM Jr, Shreffler WG, Benson DR, Ghalib HW, Badaro' R, Reed SG. Molecular
Characterization of a Kinesin-Related Antigen of Leishmania chagasi that Detects Antibody in African and American Visceral Leishmaniasis. Proc Nat Acad Sci USA. 1993: 775–779
48. Zijlstra E, Daifalla N, Kager P, Khalil E, El-Hassan, Reed S, Ghalib H. K39 Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay for Diagnosis of Leishmania donovani Infection. Clin Diagn Lab Immunol. 1998: 717–720
49. Andresen K, Gasim S, Elhassan AM, Khalil EAG, Barker DC, Theander TG, Kharazmi A.
Diagnosis of Visceral Leishmaniasis by Polymerase Chain Reaction Using Blood, Bone Marrow and Lymph Node Samples From Patients From the Sudan. Trop Med Int Health. 1997 440-444
50. Nuzum E,White F, Thakur J, Dietze R, Wages J,Grogl M, Berman J. Diagnosis of Symptomatic
Visceral Leishmaniasis by Use of the Polymerase Chain Reaction on Patient Blood. J Infect. Dis. 1995: 751-754
51. Osman OF, Oskam L, Zijlstra EE, Kroon NC, Schoone GJ, Khalil EAG, Hassan M, Karger
PA. Evaluation of PCR for Diagnosis of Post-Kala-Azar Dermal Leishmaniasis. Journal of Clinical Microbiology. 1997: 2454-2457
52. Singh N, Curran MD, Rastogi AK, Middleton D, Sundar S. Diagnostic PCR with Leishmania
donovani Using Sequences from the Variable Region of Kinetoplast Minicircle DNA. Trop Med Int Health. 1999: 448-453
50
53. Mathis A, Deplazes P. PCR and In Vitro Cultivation for Detection of Leishmania spp. In Diagnostic Samples from Human and Dogs. Journal of Clinical Microbiology. 1995: 1145-1149
54. Fissore C, Delaunay P, Ferrua B, Rosenthal E, Del Guidice P, Aufeuvre JP, Le Fichoux Y,
Marty P. Convenience of Serum for Visceral Leishmanisis Diagnosis by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 2004: 5332-5333
55. Campino L, Cortes S, Pires R, Oskam L, Abranches P. Detection of Leishmania in
Immunocompromised Patients Using Peripheral Blood Spots on Filter Paper and the Polymerase Chain Reaction. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2000: 396-398
56. Costa JM, Durand R, Deniau M, Rivollet D, Izri M, Houin R, Vidaud M, Bretagne S. PCR
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Diagnosis of Leishmaniasis in Human Immunodeficiency Virus Infected Patients. Journal of Clinical Microbiology. 1996: 1831-183
57. Serin MS, Waki K, Chang KP, Aslan G, Direkel Ş, Otag F, Kayar B, Köksal F, Emekdaş G.
Consistence of Miniexon Polymerase Chain Reaction –Restriction Fragment Length Polymorphism and Single-Copy Gene Sequence Analyses in Discriminating Leishmania Genotypes. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2007: 295-299
58. Marfurt J, Nasereddin A, Niederwieser I, Jaffe CL, Beck HP, Felger I. Identification and
Differentiation of Leishmania Species in Clinical Sampes by PCR Amplification of the Miniexon Sequence and Subsequent Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis. .Journal of Clinical Microbiology. 2003: 3147-3153
59. Hide M, Banuls AL. Species-Specific PCR Assay for L.infantum/ L.donovani Discrimination. Acta
Tropica. 2006: 241-245
51
8. EKLER
EK.1:AYDINLATILMIŞ ONAM KALA-AZARLI HASTALARDA ETKEN TÜRLERİN PCR-RFLP
YÖNTEMİ İLE TANIMLANMASI
Değerli katılımcı,
Ülkemizde ve bölgemizde bazı paraziter hastalıklar hala önemli bir halk sağlığı
problemi olmaya devam etmektedir. Bu hastalıkların kontrolü ve yayılımının önlenmesi
büyük bir önem taşımaktadır. Aksi takdirde ölümle sonuçlanabilecek ciddi durumlar
yaşanabilmektedir. Onay vermeniz koşuluğuyla katılacağınız bu çalışmada sizden kan
örneği ve kemik iliği alınacaktır. Böylece hastalığınıza neden olan parazit
infeksiyonunun tanısı konulucaktır.
Ayrıca kişisel bilgileriniz ve hastalığınızla ilgili 5 dakikalık bir anket yapılacaktır.
Çalışmalar sonucunda elde edilen bilgiler infeksiyonun tedavisinin yönlendirilmesi
amacıyla tarafınıza bildirilecektir.
Çalışmaya devam edilebilmeniz için bu bilgiler ışığında ve diğer sorularınızın
aydınlatılması sonucunda ONAY vermeniz gerekmektedir.
İlgili çalışma konusunda tarafıma her türlü bilgi aktarıldı. Sorduğum sorulara yeterli
cevap aldım. Vücudumdan kan örneği ve kemik iliği alınmasını kabul ediyorum. Kendi
isteğimle çalışmaya katılmayı kabul ediyorum.
Katılımcının adı, soyadı:
Katılımcının imzası
52
Ç.Ü.T.F. PARAZİTOLOJİ ANABİLİM DALI ANKET FORMU ANKET NO:
1. ADI:
2. SOYADI:
3. YAŞI
4. CİNSİYETİ: ERKEK( ) KADIN( )
5. TEL NO:
6. ADRESİ:
7. ATEŞ VAR( ) YOK( )
8. KANSIZLIK VAR( ) YOK( )
9. İSHAL VAR( ) YOK( )
10.KİLO KAYBI VAR( ) YOK( )
11.İŞTAH KAYBI VAR( ) YOK( )
12.DALAK BÜYÜKLÜĞÜ VAR( ) YOK( )
13.KARACİĞER BÜYÜKLÜĞÜ VAR( ) YOK( )
14.LENF NODU BÜYÜKLÜĞÜ VAR( ) YOK( )
53
9.ÖZGEÇMİŞ
1971 yılında Adana’da doğdu. İlköğrenimini Adana Hayriye Kemal Kusun
İlkokulu’nda, ortaöğrenimini Adana Kurttepe Anadolu Lisesi’nde, lise öğrenimini
Gaziantep Fen Lisesi’nde tamamladı. 1996 yılında Ankara Üniversitesi Tıp
Fakültesi’nden mezun oldu. 2003 yılında Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri
Enstitüsü Parazitoloji Anabilim Dalı’nda doktora eğitimine başladı. Halen Adana’da bir
aile sağlığı merkezinde görev yapmaktadır. Evli ve iki kız çocuğu annesidir.