Alkaline Phosphatase (AP)Presented by: Rimjhim Roy Choudhury

•Hydrolase enzyme: Removal or transfer of phosphoryl groups•Metalloenzymes•Most effective in an alkaline environment.•A 2-fold symmetric dimer (100 Å x 50 Å x 50 Å ), 449 amino acids per monomer• 2 active sites located about 30 Å from each other.•Class: Alpha and beta proteins (α/β) •Mainly parallel beta sheets (beta-alpha-beta units)•Fold: Alkaline phosphatase-like • Core:• 3 layers: α/β/α• mixed beta-sheet of 8 strands, order 43516728, strand 7 is antiparallel to the rest

Structure

• Accepted kinetic scheme for the enzymatic hydrolysis/transphosphorylation of phosphate monoesters by AP (Scheme 1) •E-P : Phosphoseryl enzyme formed with Ser102•E. ROP or E . P : Noncovalent complexes with substrate or product. •The hydrolysis of E-P involves both formation and dissociation of the non-covalent enzyme-phosphate complex (E . P). •If a phosphate acceptor such as ethanolamine or Tris is present in high concentration, then the enzyme transfers the phosphate from the substrate to the alcohol (R2OH)

Kinetic Scheme

Active Site

•Ribbon drawing of a monomer of alkaline phosphatase•Each  active  site  of  the  dimeric enzyme  contains  three  metal-binding  sites  (M1,  M2  and  M3) which consists of metal  triplet  (two Zn2+ and one Mg2+) and their ligands•It consists of a 10-stranded central β-sheet  flanked  by  15  helices  and another  3-stranded  β-sheet,  and  a helix on the top.•This  site  is  located  at  the  carboxyl end  of  the  central  β-sheet  and  all the  ligands  to  the  three metal  ions are provided from one monomer.•The 3 metals are shown as stippled spheres. 

Geometry around metals in phosohate-bound AP (subunit A/ subunit B)

•The  active  site  region  can  be considered  as  Asp101-Ser102-Ala103  and  the metal  triplet  (two Zn2+  and  one  Mg2+)  and  their ligands,  as  well  as  Arg166  and other  amino  acids  in  the immediate vicinity. •The  tetrahedral  phosphate participates  in  interactions  with the  two  active-site  zinc  ions,  the guanidino  nitrogen  atoms  of Arg166 and two water molecules. •The  bidentate  interaction  of Arg166  with  the  phosphate oxygen atoms is planar.•The catalytic metal triad is similar to  that  of  phospholipase  C  from Bacillus cereus  and  P1  nuclease from Penicillium citrinum

The Catalytic Triad

(M1)

(M2)

(M3)

Three Metal Ions Catalysis

•The zinc atom at M2 activates Ser102, which performs  the  initial  attack  on  the  phosphate group of the substrate. •The  zinc  atom  at  M1  activates  a  water molecule,  which  is  well  positioned  for  the apical  attack  of  the  phosphoseryl intermediate.•Study  by  Stec  et  al.  showed  that  Ser102  is orientated  in  an  activating  conformation toward  the  zinc  ion  at  M2  only  when magnesium is present at M3. •In  addition,  the  octahedral  geometry  of  the magnesium  ion  at  M3  properly  positioned  a Mg-bound water molecule that plays the role of  a  general  base  in  the  generation  of  the Ser102  nucleophile,  and  of  a  general  acid  in the  regeneration  of  the  Ser102  hydroxyl group.•Asp153 is a key residue in the stabilisation of the magnesium ion at M3.

(M2)

(M1)

(M3)

(M2)

(M1)

(M3)

(M2) (M2)

(M1) (M1)

(M3) (M3)

Importance

Bacteria:•Generate free phosphate groups for uptake and use.•Helps in uptake of organic compounds in the wildResearch:Molecular biology laboratories.•Prevents DNA ligation, thereby keeping DNA molecules linear.•Allows  radiolabeling for measuring the presence of the labelled DNA. •Enzyme immunoassays•Thermolabile Alkaline phosphatase from shrimp is the most usefulHumans:Alkaline phosphatase isozymes:ALPI – intestinalALPL – tissue non-specific (liver/bone/kidney)ALPP – placental (Regan isozyme)Diagnostic useNormal range is 20 to 140 IU/LElevated levels•Jaundice and hepatitis•Isoenzyme studies using electrophoresis can confirm the source of the ALP. Lowered levels• Hypophosphatasia. •Aplastic anemia, pernicious anemia, children with cretinism•Levels have been observed to increase in men who have undergone heart surgery

Structural alignment generated by pairwise comparison of the structures of ECAP, TAP, SAP, and PLAP

Blue  stars  indicate  residues involved  in  metal  binding  or being involved in catalysis and specificity.•AP from E. coli (ECAP)•AP from Human placenta (PLAP) •AP from Shrimp (SAP)•AP from Antarctic Bacterium (TAP)

M. de Backer, S. McSweeney, H.B. Rasmussen, B.W. Riise, P. Lindley, E. Hough, The 1.9 Å crystal structure of heat-labile shrimp alkaline phosphatase, J. Mol. Biol. 318 (2002) 1265–

1274.

•The  enzyme  is  used  extensively  in vitro to dephosphorylate DNA or dNTPs•Can  be  inactivated  by  a  short  rise  in temperature to 65˚C.•Species that live in such environments must  somehow  be  adapted  to  survive at these reduced temperatures.•A lower temperature has a number of implications  for  the  functioning  of proteins. •The  increased  viscosity  of  water, which  reduces  the  diffusion  rates  of substrate  and  product,  leads  to  lower reaction rates.•Reduced  thermal  motions  affect  the enzyme’s  overall  stability,  kinetics  and ligand binding.

...continued

Cold Adaptation

Cold-active enzymes have :•An increased catalytic efficiency at lower temperature, •A reduced thermal stability•Increased molecular flexibility.

Features:•APs usually contain a magnesium ion in the third metal-binding site, while a zinc ion is observed in SAP.•The  arginine  residue  in  SAP  (Arg162)  corresponding  to  ECAP  Arg166  is  oriented differently; it points away from the metal ions •Modification of the arginine residue leads to a  lower substrate affinity, but not to a   significant decrease of the activity.•SAP  has  a  surplus  of  negatively  charged  amino  acid  residues  and  a  relatively  low number of proline residues, while the frequency of aromatic residues is higher

•The  sequences  of  SAP  and  ECAP  have  24%  identical,  16%  strongly similar and 11% weakly similar residues. •SAP and PLAP share 41% of their residues, 19% strongly•similar and 12% weakly similar. •The active site residues are conserved among these three sequences, except  for  three  residues;  Asp153  and  Lys328  are  histidines  in  SAP (His149  and His316)  and  PLAP  (His153  and His317),  and  PLAP  has  a T155S substitution (ECAP-Thr155, SAP-Thr151, PLAP-Ser155)

...continued

...continued

•The  overall  charge  of  -80 for  the  functional  dimer  is distributed  such  that  the protein  surface  is   predominantly  negatively charged. •The  active  site  is  the  only clear  positively  charged patch on the surface. •As  a  result,  the  negatively charged  substrate  (a phosphomonoester)  must be  strongly  directed   towards the active site.

Surface potential representation

Cold-adaptation in SAP was largely traced to extensive negative potential on its surface

•Appleburry,  M.  L.,  Johnson,  B.  P.  &  Coleman,  J.  E.  (1970).  Phosphate binding to alkaline phosphatase. J. Biol. Chem. 245, 4968-4976.•Kim,  E.  E.  &  Wyckoff,  H.  W.  (1991).  Reaction  mechanism  of  alkaline phosphatase  based  on  crystal  structures  two metal-ion  catalysis.  J. Mol. Biol. 218, 449-464.•Kathleen  M.  Holtz,  Evan  R.  Kantrowitz  (1999).  The  mechanism  of  the alkaline  phosphatase  reaction:  insights  from  NMR,  crystallography  and site-specific mutagenesis. FEBS Letters 462, 7-11•Boguslaw Stec, Kathleen M. Holtz & Evan R. Kantrowitz (2000). A revised mechanism  for  the  alkaline  phosphatase  reaction  involving  three  metal ions. J. Mol. Biol. 299, 1303-1311•M. de Backer,  S. McSweeney, H.B.  Rasmussen,  B.W. Riise,  P.  Lindley,  E. Hough  (2002).  The  1.9  Å  crystal  structure  of  heat-labile  shrimp  alkaline phosphatase. J. Mol. Biol. 318, 1265–1274.

THANK YOU…

References