Propiedades Hidrodinámicas y

estructura cuaternaria de la proteína de shock

térmico 90. Efecto de cationes divalentes

Heat Shock Protein 90

• 1-2% de las proteinas.

• Sobreexpresada en situaciones de stress.

• Proteina de andamiaje

• Actividad chaperona

• Delecion es letal

Funciones

• Interacciona con proteinas kinasas de señalizacion intracelular y con receptores nucleares de esteroides

Funciones

• Previene agregacion molecular de conformeros inactivos.

• Ayuda juntoa otras HSP a renaturar proteinas dañadas

Isoformas de HSP90

• y codificada por genes separados, homólogaas en un 85%

• La dimerización por el C terminal otorga funcionalidad.

• N y C terminal unidos por un probable sitio de regulación

• N terminal contiene un sitio común de unión a ATP

• Solo el dominio N terminal ha podido ser cristalizado.

Antecedentes

• HSP90 predomina como oligómero y dímero. Ambos procesos mediados por el C terminal.

• La oligomerizacion de HSP90 es asociada a la actividad chaperona de ésta.

• Oligomerizacion por calor es inhibida por nucleótidos y geldanamicina y es activada por varios cofactores como los iones divalentes.

• No se ha descrito como el Mg puede contribuir cambios estructurales ,.

Objetivo

• Investigar la influencia de los iones divalentes Mg++ y Ca++ en la estructura de HSP90 en condiciones nativas.

Cromatografia de Exclusión por Tamaño

Sephacryl

Curva de Calibración Columna

Kav es proporcional al peso molecular (MW) en la gama de resolución

Ecuación para Cálculo de Resolución

Vr : Volumen de elusión de la molécula de interésVo: Volumen VacíoVc: Volumen de la Columna

Cromatografia de Exclusión por Tamaño

Masa Dímero Esperada

Peso Molecular no Esperado

Equilibrio de la sedimentación

0,1 mg/ml

0,5 mg/ml

0,01 mg/ml

Modelo Monómero-Dímero

Modelo Dímero, especies diméricas

Peso moleculares dentro de 144000-175700 Da

S* Staffords* considera los diversos tiempos de la sedimentación de las curvas originales del índice de refracción. El tiempo usado para computar s * es el medio armónico de los tiempos que corresponden al par que es restado.

d) Diagrama de los gk(s *) contra s * obtenidos transformando dSk/dt en dSk/ds *

g(s *) la representación, que es muy sensible para la detección de la especie múltiple

Una sola especie dimerica

Efecto de catión divalente en la velocidad de sedimentación de HSP90

Molecula simetrica

Aumenta concentracionAumenta V Sedimentacion

Agregación Baja V Sedimentacion

Ausencia de Cationes No ocurre agregacion

Efecto de catión divalente en la estructura de HSP90 Equilibrio de la Sedimentación

Monomero monomero-dimero

Monomero monomero-dimero-trimero

Monodimero. Tetrámero

Efecto de entrecruzamiento y del catión divalente en la estructura de HSP90

Dominios de HSP 90 involucrados en el proceso de oligomerización

N Terminal

Conclusiones

• PAGE nativa demostró que Hsp90 era esencialmente un dímero.

• Hidrodinamia del dímero Hsp90 se desvió de el de una proteína globular rígida, según cromatografía y velocidad de la sedimentación de proteína nativa y croos-link.

• Eq. De sedimentación confirmó dímero de kDa 164• En la presencia de cationes, el equilibrio de la

sedimentación demostró que Mg2+ y Ca2+ indujeron la autoasociación de Hsp90 en un sistema del monomer-dimer-monomer-dimer-tetramer.