SECUENCIACION DE ADN

NALLELI VERGARA OLMEDOABDÓN VIRGEN PIMIENTA

GENERALIDADES• Una secuencia de ADN es una sucesión de letras que representa la

estructura primaria de una molécula de ADN.• Las posibles letras son A, C, G, y T, que simbolizan las cuatro

subunidades de nucleótidos de una banda ADN.• Las secuencias se presentan yendo de 5' a 3' (de izq. a derecha).• Para que pueda llamarse secuencia tiene que haber una sucesión de

al menos 4 nucleótidos.

HISTORIA• A principios de los años 70, era muy dificil y costoso

secuenciar fragmentos de solo 5 a 10 nucleotidos. • Walter Gilbert y Frederick Sanger fueron los que dieron un

gran paso en la secuenciacion de ADN. Dieron lectura a las primeras secuencias concretas como la mitocondria humana y el virus Epstein-Barr.

Frederick Sanger y Walter GilbertCompartieron, en 1980, el premio Nóbel de química por haber desarrollado independientemente métodos de secuenciación del ADN . Gilbert, junto a A. Maxam, creó el método químico, en el cual a partir de enzimas de restricción, inducían la rotura química del ADN por bases específicas.Sanger, que anteriormente ganó el premio Nóbel de 1959 por la secuenciación de la proteína insulina, desarrolló el metodo de secuenciación didesoxi, para poder ser identificada. La síntesis se va interrumpiendo con nucleótidos cuyos azucares carecen de OH, con lo cual pudo ir verificando que nucleótidos se iban elongando.

METODO QUIMICO DE SECUENCIACION DEL ADN• Es el metodo de Maxan y Gilbert y fue uno de los metodos

mas usados, se basa en la hidrolisis quimica y en un diseño aplicable a secuencias de ADN de menos de 250 nucleotidos. Se describe en 3 etapas:

• 1.- Marcaje del DNA• 2.- Hidrolisis quimica selectiva de ADN• 3.-Analisis de los productos

METODO ENZIMATICO (SANGER)

• A diferencia del metodo quimico, en este metodo no se degrada el ADN, sino que se acude a la interruccion controlada de la sintesis de una hebra complementaria durante una replicacion in vitro. Esta sintesis es catalizada por una ADN pol que define el carácter enzimatico del metodo. Este metodo tiene la posibilidad de secuenciar fragmentos mas largos y con menor margen de error.

• El metodo se describe en 3 secciones:• 1.- Sintesis enzimatica• 2.-Analisis de los fragmentos• 3.-Automatizacion

1.- Sintesis enzimatica

SINTESIS DE UN ADN COMPLEMENTARIO DE LONGITUD VARIABLE

• Como se emplea una ADN pol para sintetizar las hebras complementarias que queremos secuenciar, la primer caracteristica es que necesitamos un cebador (oligonucleotido que hibrida el extremo 3´de la region que vamos a secuenciar).

• La segunda y principal caracteristica de este metodo de secuenciacion es el uso de didesoxinucleotidos (que son analogos de los desoxinucleotidos) que provocan la detencion de la sintesis de ADN.

Los didesoxinucleotidos compiten con los desoxinucleotiodos en la reaccion de sintesis. Los ddNTPs detienen la sintesis.

2.-Analisis de los fragmentos

SEPARACION DE LOS FRAGMENTOS Y ANALISIS

• Se sigue un procedimiento completamente analogo al analisis del metodo quimico.

3.-Automatizacion

AUTOMATIZACION• Se usa un fluorocromo diferente para cada una de las 4

reacciones de sintesis, que automatiza el metodo. La lectura de la fluoresencia es continua, por lo tanto la electroforesis sigue transcurriendo.

BIBLIOGRAFIA• BIOLOGIA  MOLECULAR E INGENIERIA GENETICA Jose luque Ed. Harcourt Cap. 18 (Secuenciacion del genoma y proyectos genoma) pags. 231-238

• BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR 6ta Edicion Geral Karp ED. Mc Graw Hill Cap. 10 (Naturaleza del gen y del genoma) Sub-tema (Secuenciacion de gemomas: la base genetica del ser humano) pags. 405-410