ISSN 2318-4752 – Volume 1, N1, 2013

O GÊNERO Bacillus E SUA UTILIZAÇÃO PROBIÓTICA

THE Bacillus GENUS AND THEIR PROBIOTIC USE

ARIANE KATIÚSCIA DOS SANTOS MARTINS

1; FLAVIANO DOS SANTOS MARTINS

2;

FLÁVIO HENRIQUE FERREIRA BARBOSA3

RESUMO O interesse na utilização dos probióticos com objetivo de prevenir ou tratar doenças tem sido explorado há muitos anos. Mais recentemente têm sido descritos os mecanismos de ação dos probióticos nas doenças alérgicas e sua interação com o intestino como órgão imunológico. Assim, os probióticos devem ser cuidadosamente estudados antes de uma ampla recomendação. Esses produtos, de um modo geral, são muito seguros, uma vez que são comercializados há muitos anos como suplemento alimentar ou alimento fermentado, e não possuem efeitos colaterais no metabolismo. Evidências científicas definitivas comprovando o potencial dos probióticos na melhora da qualidade de vida de pessoas com distúrbios gastrointestinais é tema promissor e de grande expectativa científica. Apesar das informações apresentadas acima, dentro dos produtos probióticos em uso atualmente, há as bactérias formadoras de esporos, a maioria do gênero Bacillus. Usados primariamente na forma de esporos, esses produtos têm sido úteis na prevenção de desordens intestinais, e a diversidade de espécies utilizadas e suas aplicações é surpreendente. As preparações contendo esporos da bactéria possuem a vantagem de que o esporo pode sobreviver intacto à passagem pelo estômago, além do aumento do tempo de vida útil do produto. Palavras-chave: Probióticos, Bacillus, Microbiota Intestinal. ABSTRACT The interest in the use of probiotics in order to prevent or treat diseases has been explored for many years. More recently they have been described mechanisms of action of probiotics in allergic diseases and their interaction with the gut as immune organ. Thus, the probiotics should be carefully studied before a comprehensive recommendation. These products generally are very safe, since they are marketed for many years as a dietary supplement or food fermented and have no side effects in metabolism. Definitive scientific evidence proving the potential of probiotics to improve the quality of life of people with gastrointestinal disorders is a subject of great expectations and promising scientific. Although the information presented above, within the probiotic products currently in use, there are spore-forming bacteria, most of the genus Bacillus. Used primarily in the form of spores, these products have been useful in the prevention of intestinal disorders and the diversity of species used and their applications is surprising. Preparations containing bacteria spores have the advantage that the spores can survive passage through the stomach intact, and increasing the shelf life of the product.

Keywords: Probiotics, Bacillus, Intestinal Microbiota.

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1 INTRODUÇÃO 1.1 O gênero Bacillus O gênero Bacillus compreende bacilos

gram-positivos formadores de esporos (endósporos), aeróbios ou anaeróbios facultativos. As bactérias deste gênero caracterizam-se por uma intensa atividade metabólica, já que produzem enzimas que degradam muitos substratos orgânicos. O Bacillus cereus é um bacilo grande, aeróbio, mesófilo, com flagelos peritríquios, e produtor de esporos que podem ser centrais ou subterminais. Linhagens de B. cereus são capazes de utilizar vários carboidratos: glicose, frutose, trealose, sacarose, salicina, maltose, manose, m-inositol e lactose. São capazes de hidrolisar amido, caseína e gelatina. São catalase positivos e oxidase variável. Todas as linhagens são produtoras de hemolisinas, sendo conhecidas pelo menos duas: cereolisina (termoestável) e hemolisina termolábil. São também produtores de fosfolipases do tipo C. Essa bactéria multiplica-se bem entre 10°C e 48°C, apresentando um ótimo de temperatura entre 28°C e 35°C. A faixa de pH em que ocorre multiplicação varia de 4,9 a 9,3 (FRANCO e LANDGRAF, 2002).

A maioria das linhagens de B. cereus é capaz de produzir uma série de metabólitos extracelulares, dos quais alguns estão relacionados com seu mecanismo de virulência. Entre estes metabólitos destacam-se a toxina diarréica e a toxina emética, responsáveis por duas formas distintas de gastroenterite. Ambos os tipos de intoxicação resultam da ação das enterotoxinas no lúmem do trato gastrointestinal (GRANUM et al., 1997; KOTIRANTA et al., 2000). Segundo vários autores, estas síndromes só se manifestam quando um alimento contém número elevado de células viáveis de B. cereus (entre 10

7 e 10

9 células).

As espécies do gênero são encontradas em uma diversidade de hábitats, e incluem espécies com significância ambiental, industrial e clínica. B. cereus é largamente distribuído na natureza, sendo o solo o seu reservatório natural. Por esta razão, contamina facilmente alimentos como vegetais, cereais, condimentos, dentre outros. A bactéria é também encontrada na superfície de carne bovina, suína e de frango, certamente devido à contaminação com o solo. Bacillus cereus é um problema sério também em laticínios (queijos e sorvetes), sendo seus esporos muito comuns em leite em pó. No Brasil, B. cereus tem sido isolado de vários tipos de alimentos: queijos, farinhas, amidos, alimentos desidratados, carne moída, com índices de positividade entre 18% e 97%. Vários estudos têm demonstrado que B. cereus faz parte da microbiota fecal de indivíduos normais, havendo algumas indicações que sua presença é mais comum nos meses de verão, e dependente dos hábitos alimentares. Entretanto, B. cereus não

coloniza o intestino, não persistindo por longos períodos (FRANCO e LANDGRAF, 2002).

A ocorrência, no intestino, de esporos ou células vegetativas de Bacillus spp. pode ser proveniente de alimentos contendo o microrganismo ou ingeridos como probióticos. Em humanos, espécies de Bacillus são freqüentemente identificadas em grandes números no intestino, muito superior do que seria esperado se essas espécies fossem derivadas de matéria vegetal ingerida, indicando ser ele um membro transitório da microbiota intestinal. Há muitos relatos de espécies de Bacillus sendo isoladas de peixes e crustáceos, assim como em camarão (GATESOUPE, 1999). É importante lembrar que Bacillus spp. pode ser encontrado na superfície de piscinas, lagos e rios, e muitos peixes, crustáceos e moluscos ingerem Bacillus spp. dessa matéria orgânica. Muitos membros de espécies do grupo B. cereus sensu lato são freqüentemente encontrados em invertebrados. Bacillus cereus tem sido identificado no intestino de numerosos insetos, incluindo pulgões, larvas de mosquitos e baratas (JENSEN et al., 2003; FEINBERG et al., 1999).

1.2 Bacillus como probiótico Apesar das informações apresentadas

acima, dentro dos produtos probióticos em uso atualmente, há as bactérias formadoras de esporos, a maioria do gênero Bacillus. Usados primariamente na forma de esporos, esses produtos têm sido úteis na prevenção de desordens intestinais, e a diversidade de espécies utilizadas e suas aplicações é surpreendente. As preparações contendo esporos da bactéria possuem a vantagem de que o esporo pode sobreviver intacto à passagem pelo estômago, além do aumento do tempo de vida útil do produto. Os probióticos contendo B. cereus que são comercializados estão listados no quadro 1. Alguns deles foram estudados e testados em ensaios clínicos. O mais conhecido é

comercializado com o nome Bactisubtil (Merell) e contém uma linhagem proveniente do Instituto Pasteur de Paris (IP 5832). O produto foi testado há bastante tempo em ensaios clínicos com recém-nascidos (GANCZARSKI et al., 1960; VANDEKERKOVE, 1979). Mais recentemente, outras linhagens de Bacillus foram utilizadas para reduzir os efeitos secundários dos tratamentos antimicrobianos contra Helicobacter pylori (NISTA et al., 2004) e para tratamento antitumoral (MALKOV et al., 2005). Além do B. cereus, outras espécies têm sido utilizadas como probióticos, como Bacillus licheniformis, B. pumilus, B. clausii, B. coagulans, B. thuringiensis, dentre outras (HONG et al., 2004).

Os produtos utilizados para seres humanos enquadram-se dentro de dois grandes grupos: comercializados como medicamentos ou comercializados como suplementos alimentares. Os medicamentos são utilizados no tratamento das

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disfunções intestinais, particularmente diarréias em crianças (principalmente infecções por rotavírus) ou como complementos no uso de antimicrobianos. Além do Bactisubtil® (B. cereus IP5832), podemos citar Biosporin® (B. subtilis e B. licheniformis), Biosubtyl `Nha Trang´ (B. pumilus), Biosubtyl `Da Lat´(B. cereus), Subtyl (B. cereus) e Bibactyl (B. subtilis) (HUYNH et al., 2004). As espécies utilizadas como suplementos alimentares têm o objetivo de aumentar o bem-estar do usuário, restituir a microbiota natural intestinal, dentre outras funções. Como exemplo podemos citar o produto comercial Natto, que constitui-se de soja fermentada pelo B. subtilis var. natto. Este produto tem propriedades probióticas, como estimulação do sistema imune, produção de vitamina K2 e atividade anti-cancerígena (INOOKA et al., 1986; TSUKAMOTO et al., 2001; HOSOI et al., 1999; HOSOI et al., 2000 apud HONG et al., 2004).

Os esporos da bactéria, uma vez no estômago, sofrem transformações assim como os alimentos. Eles devem ser ativados no estômago e no intestino através da ação de enzimas (HONG et al., 2004).

Experimentalmente, é possível examinar o destino dos esporos através da ingestão. Em seres humanos esse estudo foi realizado com quatro voluntários, aos quais foi dada uma dose fixa de 10

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esporos de Bacillus stearothermophilus (KLIJN et al., 1995 apud HONG et al., 2004). Nos primeiros quatro dias após a ingestão, o número de UFC/g de fezes de B. stearothermophilus foi mantido em nível constante, após o qual as contagens diminuíram significativamente pelo oitavo dia. Em um estudo preliminar, B. stearothermophilus foi encontrado presente nas fezes por dias seguidos após a dose inicial (VESA et al., 2000 apud HONG et al., 2004). De maneira interessante, neste estudo a cinética de trânsito de B. stearothermophilus foi similar ao probiótico Lactobacillus plantarum, o qual mostrou evidência de colonização ou, pelo menos, retenção no trato gastrointestinal. Esses estudos revelaram que o tempo de trânsito (ou longevidade) do B. stearothermophilus no trato gastrointestinal humano foi de 8 a 10 dias, algo maior que o tempo de trânsito calculado experimentalmente de um marcador sólido no intestino (GRAFF et al., 2001 apud HONG et al., 2004).

Em outro estudo com humanos, 10 voluntários receberam duas pastilhas contendo 1,67 x 10

10 esporos de Bacillus polyfermenticus SCD

uma vez por dia durante 14 dias (KYU-YONG et al., 2002 apud HONG et al., 2004). Neste trabalho contagens de B. polyfermenticus SCD ainda eram detectadas 4 semanas após a última dose. Esses resultados diferem substancialmente daqueles de B. stearothermophilus, uma vez que se os esporos não têm interação com o trato gastrointestinal e simplesmente passam através dele, era de se esperar que não fossem observadas contagens de B. polyfermenticus SCD após 22 a 24 dias. Embora o modo como a dose foi administrada seja diferente,

duas explicações podem ser propostas. Primeiro, a diferença pode ser espécie-específica e talvez os esporos de B. polyfermenticus SCD sejam capazes de aderir ao epitélio intestinal retardando seu trânsito. Alternativamente, os esporos podem estar proliferando dentro do trato gastrointestinal e aptos a colonizar temporariamente. Para proliferar, os esporos devem ter capacidade de germinação e multiplicação. A passagem do produto probiótico Paciflor

® C10 (B. cereus CIP 5832) foi também

determinada em cães recebendo 106 esporos por

grama de refeição (BIOURGE et al., 1998 apud HONG et al., 2004). Esporos e células vegetativas foram primariamente detectadas em fezes 24hs após ingestão e poderia não ser detectada após 3 dias, mostrando nenhuma evidência de colonização (HONG et al., 2004).

Os primeiros estudos indicando que os esporos podem germinar no trato gastrointestinal vieram de experimentos usando alças ilíacas de coelhos. Estudos mais completos in vivo têm usado modelos murinos. Diferentes doses de esporos (de 10

8 a 10

10) de B. subtilis linhagem PY79, foram

administradas a grupos de camundongos (Balb/c). Em cada caso, os camundongos foram abrigados individualmente e, usando gaiolas com grades no fundo, as fezes totais puderam ser coletadas em intervalos de 1-2 dias. Estes estudos mostraram que as primeiras contagens de esporos foram detectadas 3hs pós-dose e ainda, mais importante, após 18hs o número de esporos excretados foi maior do que administrado. Por volta de 5 a 7 dias nenhuma contagem significativa de esporos pode ser detectada, ainda que contagens cumulativas mostraram um aumento no total de UFC. Uma vez que as contagens totais foram maiores que a dose administrada, a única explicação é de que os esporos germinaram, multiplicaram e novamente esporularam (HONG et al., 2004).

Primeiramente, o esporo é uma forma de vida dormente e, presumivelmente, a região superior do intestino delgado seria rica em nutrientes que poderiam induzir a germinação, um processo que não requer a síntese de proteínas de novo. Além disso, como já foi mencionado, sabe-se que esporos de algumas espécies de Bacillus são reconhecidas como sendo capazes de germinarem e multiplicarem no trato gastrointestinal, mais notavelmente B. cereus. Estudos recentes em aves domésticas e suínos têm demonstrado a capacidade germinativa de B.cereus var toyoi, a linhagem comercial presente no produto Toyocerin®. Nestes estudos uma rápida germinação no intestino superior dos animais foi observada, atingindo níveis de 90% da dose de esporos administrada. Interessantemente, nestes estudos nem sempre foi possível observar um aumento no número de esporos excretados nas fezes, indicando que as condições fisiológicas do hospedeiro (por exemplo, dieta) podem afetar a germinação e/ou a multiplicação dos esporos (HONG et al., 2004).

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Estudos in vitro demonstraram a resistência dos esporos aos fluidos intestinais, revelando que nem todos os esporos são resistentes à simulação do suco gástrico e aos biliares. Especificamente, esporos de uma linhagem de B. cereus utilizada no produto Biosubtyl®, mostraram-se extremamente sensíveis ao suco gástrico simulado e aos sais biliares, considerando que esporos de outras linhagens de B. cereus apresentaram-se completamente resistentes (DUC et al., 2004 apud HONG et al., 2004). Uma explicação para esses resultados inesperados é que os esporos podem estar sujeitos à ativação da germinação induzida por ácido (FAILLE et al., 2002; KEYNAN et al., 1969 apud HONG et al., 2004). A germinação dos esporos é um processo extremamente rápido, de modo que a germinação ácido-induzida poderia produzir uma grande quantidade de células vegetativas, as quais podem ser mortas pelo suco gástrico. Há vários estudos revelando que as células vegetativas do gênero Bacillus são sensíveis às condições do trato gastrointestinal e o estômago, em particular, representa uma grande barreira. Os esporos, por outro lado, são resistentes a tais condições. Se os esporos germinarem, sobreviverem e multiplicarem, a bactéria deve encontrar uma maneira de escapar da toxicidade dos fluidos presentes no lúmen do trato gastrointestinal. A passagem através do trato gastrointestinal até o intestino delgado poderia diluir os efeitos tóxicos dos sais biliares, mas em contrapartida, poderia liberar as células num ambiente anaeróbico do cólon. Possivelmente, o

alimento é suficiente para conferir alguma proteção. Alternativamente, a adesão à mucosa intestinal e a formação de biofilmes com a microbiota intestinal poderia proporcionar um nicho temporário (HONG et al., 2004).

Com relação à colonização das bactérias do gênero Bacillus no intestino, vários estudos mostraram que todos os probióticos compostos de espécies de Bacillus mostraram grande retenção no intestino de camundongos, sugerindo que eles poderiam persistir por longo período. Como isto poderia ocorrer ainda não está muito claro, mas talvez resulte da adesão das células vegetativas ao epitélio da mucosa, assim como em linhagens patogênicas de B. cereus. No caso desta espécie, alguns elementos poderiam estar envolvidos na adesão da bactéria ao epitélio intestinal. Na célula vegetativa, a camada S presente na parte mais externa da célula, tem sido implicada na adesão, assim como na resistência à fagocitose (KOTIRANTA et al., 2000; SLEYTER, et al., 1993 apud HONG et al., 2004). No esporo, estruturas como exosporium e pilus são responsáveis pela adesão ao epitélio intestinal. No caso de B. cereus, esporos de diferentes linhagens demonstraram aderirem-se a muitos tipos de superfícies. Além disso, linhagens desta espécie mostraram-se mais hidrofóbicas que outras espécies de Bacillus (RONNER et al., 1990 apud HONG et al., 2004). Quanto maior a hidrofobicidade do esporo, maior sua aderência ao epitélio (ANDERSON et al., 1998 apud HONG et al., 2004).

Quadro 1. Os probióticos contendo B. cereus que são comercializados atualmente.

Produto Alvo Produtor Comentários

Bactisubtil® Humanos Originalmente produzido por Marion Merrell Dow Laboratories

Cápsula contendo 1x10

9 esporos de B.

cereus IP 5832

Biosubtyl Humanos Biophar Company, Da Lat, Vietnam Sachê (1g) contendo 10

6 – 10

7 esporos de

B. cereus adicionado de tapioca

Biovicerin® Humanos Geyer Medicamentos S. A. Porto Alegre, R. S.

B. cereus linhagem GM em suspensão de 10

6 esporos/mL

Esporafeed Plus® Suínos Norel, S. A. Madrid, Espanha 1x109 esporos de B.

cereus (CECT 953)

Paciflor® C10 Bezerros, aves domésticas, coelhos e suínos

Intervet International B. V. Wim de Körverstraat 35 NL-5831 AN Boxmeer (Holanda)

2x108 – 5x10

9 esporos

de B. cereus CIP5832 (ATTC 14893)

Subtyl Humanos Mekophar, Pharmaceutical Factory, Ho Chi Minh, Vietnam

Cápsula contendo 106

– 107 esporos de B.

cereus var vietnami

Toyocerin® Bezerros, aves domésticas, coelhos e suínos. Possível uso em aquacultura

Asahi Vet S. A., Tokyo (Head Off.), Japão

B. cereus var toyoi (NCIMB-40112/CNCM-1012)

HONG et al., 2004.

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2 CONSIDERAÇÕES FINAIS No Brasil é comercializado um probiótico

denominado BIOVICERIN® que, segundo a bula do produto “é constituído exclusivamente por cultura viva de B. cereus esporulados na proporção de 5 milhões de endósporos por flaconete. “O BIOVICERIN® atuaria através do mecanismo de antagonismo bacteriano, produzindo substância antimicrobiana (biocerina), competindo por nutrientes com os microrganismos patogênicos causadores da diarréia, competindo por sítios de adesão na mucosa intestinal e modificando os receptores de toxinas. Através da produção de vitaminas do complexo B e enzimas, BIOVICERIN® favoreceria a reconstituição da microbiota necessária para o normal desempenho das funções intestinais.

Os trabalhos de Goodlow, Johnson e outros, sobre o poder antagônico do B. cereus, revelado in vitro pela produção de uma substância antibiótica, a biocerina, que atua sobre diversas bactérias patogênicas do intestino humano, levaram a experimentar a administração de B. cereus in vivo. Nesse sentido, os trabalhos de Guida, demonstraram que o B. cereus atua como agente terapêutico nas enterocolites crônicas e agudas, provocadas por infecção de origem endógena (E. coli puro ou associado a antígenos somáticos, semelhantes aos de Salmonella e Shigella) e de origem exógena (como Salmonella, Shigella e outros)”.

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1 – Dra. Ariane Katiúscia dos Santos Martins,

Bióloga – Microbiologista, Departamento de

Microbiologia, ICB, Universidade Federal de Minas

Gerais.

2 – Dr. Flaviano dos Santos Martins, Professor

Doutor Adjunto II / Biólogo – Microbiologista,

Departamento de Microbiologia, ICB, Universidade

Federal de Minas Gerais.

3 – Dr. Flávio Henrique Ferreira Barbosa, Professor

Doutor Adjunto II / Biólogo – Microbiologista,

Colegiado de Farmácia, PPG Ciências da Saúde e

Ciências Farmacêuticas, Laboratório de

Bromatologia e Microbiologia de Alimentos,

Fundação Universidade Federal do Amapá –

UNIFAP, flavio.barbosa@unifap.br

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