Identificação de produtos de oxidação de cepas de Gluconobacter

Jintana Kommanee, Somboon Tanasupawat, Pattaraporn Yukphan, Duangtip Moonmangmee,

Nuttha Thongchul, Yuzo Yamada

Apresentação: Mauren Silveira

Identification and OxidationProducts of Gluconobacter StrainsIsolated from Fruits and Flowers in

Thailand

International Journal of Biology Vol. 4, No. 1; January 2012

Published by Canadian Center of Science and Education

Received: October 20, 2011 Accepted: November 4, 2011 Published: January 1, 2012

www.ccsenet.org/ijb

INTRODUÇÃO

Bactérias Promotoras de Crescimento em Plantas (BPCPs): Pseudomonas, Bacillus,Burkholderia, Streptomyces, Rhizobium, Bradyrhizobium, Acetobacter e Herbaspirilum, Agrobacteriumradiobacter e Enterobacter cloacaeBacillus sp. –melancia-promoção do crescimentoProdução de auxina, citocinina e etileno por GluconobacterPaenibacillus macerans e Bacillus pumilus biocontrole sobre Xanthomonas vesicatoria e Alternaria solani no tomateAntimicrobiano de Bacillus sobre M. luteus e A. niger (antagonismo)

BACTÉRIAS ACÉTICAS Família Acetobacteriaceae são catalase +, oxidase –

Produtoras de ácido a partir de glicose

Colônias opacas de crescimentos 25-30°C e pH 5.5

Glicólise ausente devido à ausência de

fosfofrutoquinase

As desidrogenases ligadas à membrana funcionam melhor para oxidação do substrato entre pH 3.0 – 6.0

O pH ótimo para desidrogenases citosólicas está entre pH 8.0-11.00

São insuperáveis na OXIDAÇÃO incompleta de vários hidratos de carbono

ACETOBACTER X GLUCONOBACTERACETOBACTERSuperoxidantesÁlcool Cetona e Ácidos CO2 e H2ONão produz pigmentos

GLUCONOBACTERSub-oxidanteÁlcool Cetona e ÁcidosProduz pigmento marrom

O Gênero Gluconobacter • Gram negativas• Sozinhas ou pares• Não formam esporos• Móveis ou não• Aeróbias• Colônias pálidas• 25-30ºC• pH 3,6..5,5-6,5• Catalase +• Oxidase –• Não há liquefação• Não produz Indol a partir de triptofano• Oxida etanol em ác. Acético e não reoxida o ácido por faltar succinato

desidrogenase• Não oxida acetato em lactato pra H2O e CO2 (falta enzima Ciclo ác.

Tricarboxílico)• O ácido é formado a partir da D-glicose e da D- xilose pela via fosfato-

pentose• Prefere açúcar ao álcool• Fontes de carbono: D-manitol>Sorbol>Glicerol>D-frutose>D-Glicose• Meio padrão de isolamento: Etanol de Frateur• Precisam de vitaminas do complexo B (tiamina, ácido pantotênico e

nicotínico)

5 espécies: G.japonicus, G.oxydans, G.frateurii, G.albidus e G.thailandicus

INTERESSE BIOTECNOLÓGICOBIO-AROMÁTICO 2-

FENIL-ALDEÍDOÁCIDO ACÉTICODIIDROXIACETONAL-SORBOSEL-RIBOSE (droga anti-viral)

MIGLITOLDEXTRAN-

DEXTRINASED-TAGATOSEALDEÍDOS QUIRAIS

Concentrações de substrato alta poderia provavelmente ser tolerados devido ao desenvolvimento de mecanismos de adaptação celular durante a fase exponencial lag e mais cedo

DIIDROXIACETONAA PARTIR DO GLICEROLAÇÚCAR SIMPLES DE 3

CARBONOSCONHECIDO COMO

GLICERONAREAÇÃO DE MAILLARD

ENTRE O GRUPO AMINO DA QUERATINA E O GRUPO HIDROXILA DA DHA

METOTREXATOANTIFOLATO

DR. SIDNEY FARBER PEDIU AO DR. Y. SUBBAROW

SINTETIZAR O METATREXATO PARA USAR NO

TRATAMENTO DE LEUCEMIA INFANTIL (1940) ÁCIDO PENTANEDIÓICO

L -SORBOSEHexo-CETOSEA PARTIR DO D-SORBITOLOXIDAÇÃO REGIOSELETIVA D-GLUCOSE—HIDROGENAÇÃO QUÍMICA—D-SORBITOL

—G.OXYDANS-- L-SORBOSE + ACETONA--DIACETONA L-SORBOSE—OXIDAÇÃO--

ÁCIDO 2-CETO-L GULÔNICO

ÁCIDO ASCÓRBICO TEM VÁRIOS ISÔMEROS (CARBONOS C4 E C5 ASSIMÉTRICOS)

APENAS O ISÔMERO L É ATIVO.

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS ACÉTICAS

22 AMOSTRAS DE FRUTAS NATIVAS DA TAILÂNDIA

2 AMOSTRAS DE FLORES (PETÚNIAS)

3-5 DIAS EM MEIO GEY LÍQUIDO(GLICOSE/ETANOL/ EXTRATO DE

LEVEDURA) pH 4.0

MEIO GEY ÁGAR + 0,3% CaCO AAB PRODUZEM HALO

CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA

2 DIAS EM MEIO ÁGAR GYPG

(glicose/peptona/glicerol)

pH 6.8 30°C

GRAM NEGATIVOS

CARACTERIZAÇÃO FISIOLÓGICA E BIOQUÍMICA

CARACTERIZAÇÃO QUIMIOTAXONÔMICA

CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICAAMPLIFICAÇÃO DO GENE ITS 16S-23S rRNA POR PCR

PRIMERS:

((1522F-16S) (posição 1522-1540 no 16S rRNA

E.coli)

((38R-23S) (posição 38-22 no 23S rRNA

E.coli)

(715 Bp)

ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO:

BstNI, MboII e MboIBstNI, MboII e MboI SEQUENCIAMENTO: PRIMERS:

1522F, 38R, Talaf, Talar

RESULTADO SEQUENCIAMENTO

PRODUÇÃO DA L-SORBOSE A PARTIR DO D-SORBITOL

30°C-48H

ANÁLISE QUANTITATIVA DE PRODUÇÃO DE L-SORBOSE FEITA PELA

REAÇÃO DO RESORCINOL

REAÇÃO SIMPLES OBSERVADA PELA PRESENÇA DE CETOSE IDENTIFICADA

PELO DESENVOLVIMENTO DA COLORAÇÃO VERMELHO-CEREJA NO MEIO

pH 6.3-4.7

39,68 g/L39,68 g/L24 h-200rpm 30°C Meio Batata líq

PRODUÇÃO DE L-SORBOSE POR G. frateurii

Notícia boa: 100% do D-sorbitol biotransformado em L-

sorbose em 24 horas, das 48 horas padrão, em 30°C chegando a produzir 39.68 g/L de L-sorbose

Notícia má: Em estudo anterior (2000) da mesma equipe,

outra cepa de G. frateurii (CHM 54) produziu em 48 horas 50 g/L de L-sorbose

PRODUÇÃO DE DHA A PARTIR DO GLICEROL

5% glicerol e 1% extrato de levedura pH5.030°C /4 dias

ANÁLISE QUANTITATIVA DE PRODUÇÃO DE DHA:

REAÇÃO DA DIFENILAMINA

BatataShaker30°C24hr

DESENVOLVIMENTO DA COR AZUL NO

MEIO

200 mL

pH ideal favorece ativação de enzimas e impede que outras degradem o produto formado

10ML/ BATATA 24HR

1 ML1 ML

50G/L GLICEROL

ANÁLISE QUANTITATIVA DE PRODUÇÃO DE DHA:

REAÇÃO DA DIFENILAMINA

Melhor:42,52 g/L

PRODUÇÃO DE DHA POR G.oxydans –PHD27C

on

cen

traç

ão g

/L D

HA

OD

600

(nm

)

Hora de bioconversãoCrescimento celular

DHA

44,1g/L44,1g/L

CONCLUSÃODos isolados selvagens de Gluconobacter obtidos em frutas e petúnias

da Tailândia para produção de L-sorbose e Diidroxiacetona (DHA), os mais produtivos foram G. frateurii para L-Sorbose e G. oxydans para DHA, ambos isolados da fruta Longan. Apesar da produção em bancada do L-sorbose se mostrar pouco rentável, a produção de DHA se mostrou satisfatória, indicando nível máximo durante a fase estacionária de crescimento da cultura.

Na produção do L-Sorbose houve uma alteração grande de pH do meio e como a enzima D-Sorbitol desidrogenase ligada a membrana, que funciona melhor em pH alcalino, é crucial para a biotransformação, talvez tenha sido um dos fatores que limitou a concentração do produto. Apesar do rendimento ter sido de 100%, há na literatura dados que comprovam que o aumento da L-Sorbose no meio impede o consumo de O2 pelas células de Gluconobacter.

Na produção de DHA o valor de 44,1 g/L na capacidade da cepa PHD27 em transformar o glicerol sob condições ótimas de crescimento na escala laboratorial pode indicar uma cepa selvagem candidata à produção eficiente e competitiva comparada às atualmente utilizadas em escala industrial.

RENDIMENTO BIOLÓGICO INDUSTRIAL

RENDIMENTO QUÍMICO INDUSTRIAL

Este trabalho foi escolhido Este trabalho foi escolhido por apresentar pesquisa de por apresentar pesquisa de novos microrganismos novos microrganismos selvagens voltados à selvagens voltados à produção de compostos produção de compostos com valor agregado no com valor agregado no mercado e substratos mercado e substratos baratos.baratos.

OBRIGADA