UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS

GUÍA LABORATORIO BIOLOGÍA DE ORGANISMOS

PRÁCTICA 1 BIOSEGURIDAD Y MICROSCOPIA

BIOSEGURIDAD

Si bien la palabra seguridad puede evocar términos como "guardias, alarmas y armas de fuego", la bioseguridad abarca mucho más que eso. Se trata de un conjunto de medidas preventivas que tiene como objetivo proteger la salud y la seguridad de las personas frente a diferentes riesgos relacionados con agentes biológicos, físicos, químicos y mecánicos. En los laboratorios de ciencias biológicas, estas medidas incluyen una serie de prácticas para evitar el uso inadecuado de agentes patógenos peligrosos y de toxinas, así como para prevenir su propagación.

Para el trabajo dentro del laboratorio, los estudiantes tienen la obligación de leer y cumplir el siguiente decálogo, lo cual permitirá un mejor desarrollo de las clases y garantizará su seguridad disminuyendo el riesgo de posibles accidentes.

Nota: En la eventualidad de daños generados a equipos, accesorios, instrumentos de medición y vidriería por descuido, mal uso u otra acción diferente al normal funcionamiento, el causante debe cubrir los costos que impliquen el correspondiente arreglo o reemplazo.

Para separar adecuadamente los residuos generados en laboratorios y talleres de la Universidad de los Andes, es importante recordar los siguientes criterios:

Con base en la información anterior, responda las siguientes preguntas:

1. ¿Qué elementos de protección personal deben usarse durante las prácticas de laboratorio en Biología de Organismos? ¿En qué casos? _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2. Mencione dos accidentes que podrían evitarse si se siguen las medidas de bioseguridad mencionadas. ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

MICROSCOPÍA

Un microscopio es un instrumento que permite la observación de objetos muy pequeños que no pueden ser apreciados a simple vista. Existen varios tipos de microscopios y su clasificación se basa en el sistema a través del cual se genera la imagen. De esa manera, los microscopios que utilizan luz y lentes convexos para magnificar la muestra de interés se denominan microscopios ópticos; aquellos que utilizan exclusivamente electrones para iluminar los preparados son llamados microscopios electrónicos y los microscopios de sonda de barrido, por su parte, emplean una sonda para crear un perfil de la muestra a medida que la escanean.

Esta práctica estará enfocada en los microscopios de tipo óptico, de los cuales evaluaremos las partes que lo conforman y las funciones básicas que pueden ajustarse en el instrumento para mejorar las propiedades ópticas según nuestra necesidad.

A continuación se presentan algunas de las pautas para utilizar correctamente un microscopio:

Precauciones a tener en cuenta con los microscopios

SIEMPRE verifique el estado físico del microscopio asignado. Observe cómo están los lentes, el sistema que sostiene la muestra, el sistema lumínico y los tornillos que posibilitan el aumento y la resolución.

SIEMPRE cargue el microscopio al derecho y utilice una mano para sostener el brazo del microscopio y la otra como apoyo para la base.

SIEMPRE conecte el microscopio a la toma naranja. Inserte el cable conector en las aberturas de la mesa que tienen la tapa gris. Antes de desconectar el microscopio asegúrese de que esté apagado.

NUNCA deje muestras en la platina del microscopio. Si al utilizar el microscopio usted ensucia la platina, es importante que la limpie, ya que se puede oxidar.

NUNCA le quite partes al microscopio. Si usted realiza esta acción, deberá enfrentar su correspondiente penalización.

Finalmente, al observar una muestra, tenga CUIDADO de no estrellar los objetivos contra la muestra. Deje siempre LIMPIOS los objetivos y las láminas que use.

PARTES DEL MICROSCOPIO

Un microscopio está compuesto por varios elementos que cumplen diferentes funciones, a saber:

o Un sistema de iluminación, que permite enfocar y controlar la cantidad de luz que recae en la muestra

o Un sistema óptico, que posibilita la observación y la magnificación de la muestra o Un sistema mecánico, que sirve de unión y soporte a los sistemas anteriores

En seguida se presentan detalles de cada una de las partes que conforman los sistemas:

Sistema de iluminación: Proporciona la luz necesaria para observar el objeto en cuestión. Es posible modificar la cantidad y calidad de luz que llega a la muestra. Este sistema está integrado por:

a) Fuente de luz: Es la estructura encargada de suministrar luz al sistema y generalmente se encuentra en la base del microscopio, debajo de la platina. La luz que emite es recibida por el condensador. La luz emitida por la fuente puede ser regulada al mover hacia la izquierda (disminuir) o derecha (aumentar) el tornillo rojo ubicado en la base.

b) Condensador: Está conformado por un conjunto de lentes y su función es enfocar la luz en la muestra a observar.

c) Diafragma: Ubicado encima del condensador, ofrece la posibilidad de controlar el ángulo de luz que llega a la muestra al ampliar o reducir el campo donde incide en la muestra según la necesidad.

Sistema óptico: Permite observar en detalle la muestra de interés. Es posible ajustar la magnificación y la resolución de la imagen por medio de los siguientes componentes:

a) Oculares: Generalmente dos, son estructuras que llevan los rayos de luz desde los objetivos hasta nuestros ojos. Ofrece un aumento de 10X (diez veces el tamaño original del objeto) y está montado sobre una torreta móvil que se ajusta para generar una sola imagen a partir del campo visual de cada ojo. La magnificación total del microscopio corresponde al producto de la magnificación del ocular y la magnificación ofrecida por los objetivos.

b) Revólver: Localizado en la parte inferior del tubo óptico (donde se encuentran los oculares), es la estructura que contiene los lentes objetivos. En los microscopios que usaremos en el laboratorio hay cuatro lentes objetivos, cada uno con una magnificación diferente.

c) Lentes objetivos: Son las estructuras que proporcionan aumento y resolución. Existen varios tipos de lentes, los cuales se clasificación en función de la magnificación. En general, éstos se catalogan en objetivos de bajo poder, mediano poder, alto poder y lentes de inmersión. Alrededor de la parte final de cada objetivo hay un anillo de color en el cual se especifica la capacidad de aumento que puede ofrecer cada lente.

En la siguiente figura se presentan algunas de las características que pueden identificarse para cada lente:

Fig 1: Nomenclatura general presente en los lentes objetivos de un microscopio óptico que indica alguna de sus propiedades ópticas. A. Magnificación ofrecida por el lente, B. Número de apertura (NA), C. Longitud del tubo del lente objetivo, D. Grosor máximo de la laminilla que debe ser usada para ver el espécimen.

Algunos términos importantes para describir las propiedades de los lentes son:

Magnificación:

Número de veces que se multiplica el tamaño del objeto (visualmente hablando). La magnificación está indicada en la parte superior izquierda del lente (Fig 1. A.). En los objetivos de bajo poder, el lente está rodeado por un anillo rojo y la magnificación es de 4X; los de mediano poder ofrecen una magnificación de 10X y tienen anillo amarillo; los de alto poder están en un rango de 40X a 45X y tienen un anillo de color azul cielo; los de inmersión permiten un aumento de 100X y se indican por medio de un anillo blanco. IMPORTANTE, si ustedes quieren ver algún preparado con el lente de inmersión es necesario que le pidan a su instructor el aceite de inmersión, ya que el coeficiente de refracción del aire no es suficiente para concentrar la luz en la muestra.

Resolución:

La resolución se refiere al poder que tiene un instrumento para diferenciar dos objetos cercanos ubicados a corta distancia (Figura 2). Los lentes contribuyen al poder de resolución global del microscopio, aunque también hay otras partes del microscopio óptico que influencian dicha capacidad (más adelante mencionaremos algunas de éstas). La resolución se relaciona con el número de apertura (NA; Figura 1B).

Número de apertura (NA):

Es una medida que indica la capacidad del lente objetivo de recibir la luz proveniente de la muestra e indirectamente se refiere al poder del lente de percibir detalles finos (resolución). Comúnmente el valor de NA está ubicado en la parte superior derecha del lente y tiene valores que van desde 0 hasta 1; en los objetivos de inmersión este valor puede ser mayor a 1 (¿Por qué?).

La relación entre la resolución y el número de apertura se expresa a través de la siguiente ecuación:

Donde R es el poder de resolución, n es el índice de refracción del medio que está entre la muestra y el objetivo (el del aire es = 1), λ la longitud de onda de la luz utilizada y θ el ángulo de apertura del

cono (ver Figura 2). La expresión 2[𝑛 sin 1

2𝜃] equivaldría al NA y reemplazando en la ecuación original

obtendríamos:

El número de apertura es un número puro (sin unidades) y en la ecuación sólo el término λ está expresado en unidades (nanómetros). La expresión matemática revela también una relación inversa entre el número de apertura y R. TENGAN EN CUENTA que entre más pequeño sea el valor de R (debido a que NA es grande), más poder de resolución ofrecerá el lente.

Figura 2. Esquema básico que muestra cómo la luz recorre el sistema óptico y lumínico del microscopio. La letra θ corresponde a la apertura angular.

Sistema mecánico: El sistema mecánico del microscopio óptico es el que une y soporta el sistema lumínico y óptico. De este sistema hacen parte las estructuras donde se ubican los ejemplares a estudiar y los mecanismos con los cuales se controlan la cantidad/calidad de luz y la resolución. Tales estructuras son:

a) Área ocular: Está conformada por los oculares, los tubos ópticos y la torreta. En el interior de ésta hay un conjunto de lentes que dirigen los rayos de luz de la imagen virtual creada por los lentes del objetivo hacia el observador. La distancia entre el conjunto de partes y la muestra a observar puede ser modificada utilizando los tornillos de enfoque (localizados en la base), obteniendo como resultado final un cambio en la resolución del sistema. Más adelante haremos énfasis en los tornillos de enfoque.

b) Brazo: Es el punto de unión entre el área ocular, la platina y la base. En esta estructura se encuentran también los tornillos de enfoque. Por lo general, los microscopios ópticos tienen cuatro tornillos; dos macrométricos y dos micrométricos, en los costados laterales inferiores del brazo. Los tornillos macrométricos (los grandes) posibilitan un enfoque grueso (es decir, generan grandes cambios de distancia entre el área ocular y el espécimen); en cambio, los tornillos micrométricos (los pequeños, ubicados encima de los tornillos macrométricos) dan un enfoque fino (el cambio de distancia es mucho menor). Este último es ideal para enfocar la muestra de manera óptima.

c) Platina: Es una lámina plana con una abertura en el centro, acompañada de pinzas para sostener la preparación que se va a observar y una estructura que permite el movimiento de la platina hacia los costados (el carro). Hay dos tornillos ubicados en la parte inferior derecha de la platina, los cuales permiten desplazarla en el eje horizontal.

d) Base: Como su nombre lo indica, es el sistema que soporta todas las estructuras del microscopio. En ésta se encuentra el tornillo que controla la cantidad de luz que deseamos que llegue a la muestra y el botón para encender la fuente de luz.

EJERCICIO EN LABORATORIO: MICROSCOPÍA

Siga las instrucciones y resuelva las siguientes preguntas:

1. Utilice la guía y la información que se presentó durante la sesión teórica del laboratorio para identificar y localizar cada parte del microscopio en el siguiente diagrama y escribir el nombre de cada una en el espacio correspondiente.

2. A medida que aumenta la magnificación, también lo hace la resolución, pero la relación no es lineal: La resolución siempre aumenta en menor medida que la magnificación. ¿Por qué razón aumentar la magnificación sin un incremento en la resolución no sería ventajoso para estudiar especímenes? ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Siga cuidadosamente el procedimiento que se describe a continuación y responda las preguntas correspondientes. Tenga presente que para un desempeño óptimo del microscopio, usted deberá ajustar la iluminación y el enfoque apropiadamente. En una lámina limpia ponga una letra y después ubique el preparado en la platina. Para fijar la letra puede usar una gota de agua y una laminilla, si es necesario. Utilice los diferentes tipos de lentes objetivos para ver la muestra. Para desplazar los objetivos gire hacia la derecha o a la izquierda el revólver; hecho esto, un click le indicará que ha cambiado de lente objetivo. Recuerde que para usar el objetivo de inmersión, necesita aceite de inmersión. En esta instancia es importante recordar qué estructuras controlan los parámetros lumínicos, ópticos y mecánicos del microscopio y cómo los cambios en éstos afectan la calidad de la observación.

3. ¿Qué estructura permite modificar la distancia entre los objetivos y la platina? ¿De qué

sistema del microscopio hace parte dicha estructura? _______________________________________________________________________________

4. Defina qué es contraste y mencione que posibles sistemas y estructuras modifican esta propiedad.

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5. ¿En qué beneficiaría cambiar el contraste de observación al estudiar un espécimen?

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6. ¿En qué posición se muestra la letra “e” vista a través del microscopio?

¿Por qué sucede esto? ¿Por que qué no lo vemos así al observarlo a simple vista? ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

7. De acuerdo con el aumento al que realizó la observación, ¿cuál es el tamaño aparente de la

“e”? ________________________________________________________________________

OBSERVACIÓN DE LÁMINAS:

El microscopio es una herramienta muy útil para la observación de diferentes tipos de muestras, entre ellas tejidos, organismos completos, células o propiedades específicas de algún material. En la siguiente sección se observarán varias muestras y a partir de ello se responderán las siguientes preguntas:

1. Observe cada una de las láminas demostrativas, haga un esquema de la imagen observada y especifique el tipo de muestra.

Aumento: Aumento: Aumento:

Tipo de muestra: Tipo de muestra: Tipo de muestra:

2. Si suponemos que el tamaño real de la muestra “Amoeba proteus” es de 50 μm, ¿cuál sería su

tamaño aparente pasando por los lentes de 5X, 10X y 40X? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________

Para resolver las próximas preguntas necesitará preparar dos muestras. Siga minuciosamente las indicaciones que se presentan a continuación.

Muestra de agua: Deposite una pequeña gota de agua de charco en el centro de una lámina limpia. Después cubra la muestra con la laminilla, poniendo primero uno de los extremos de la laminilla en el

borde de la gota de agua, bajándola paulatinamente para evitar la formación de burbujas. Si alguna porción del preparado no es cubierta con la laminilla, retírela cuidadosamente con un pedazo de papel para evitar contaminar la platina y tener una mejor área de observación. Primero observe la gota de agua con el lente de menor magnificación y posteriormente con los demás, hasta llegar al lente de mayor aumento. PRECAUCIÓN, tenga cuidado de no estrellar el objetivo con la muestra o montaje.

Muestra de material vegetal: Con ayuda de una cuchilla y con mucho cuidado realice cortes tan finos como sea posible al material vegetal; ubíquelos en el centro de la lámina colocando sobre la muestra una pequeña gota de agua limpia. Ubique la laminilla y realice la observación como se describió anteriormente. Esquematice lo observado y especifique el aumento empleado.

Aumento: Aumento:

1. Mencione tres razones por las cuales debe ubicarse una laminilla sobre un montaje húmedo _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2. ¿Qué nueva información o detalles puede notar cuando cambia de aumento para la observación de los organismos (en la muestra de agua) y de las células (en el material vegetal)? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3. ¿Cuál es el aumento total que se obtiene al observar un objeto en el microscopio con cada uno de los siguientes objetivos?

a) 4X ________ b) 10X _______ c) 43X_______

4. Defina con sus propias palabras los siguientes términos: a) Poder de resolución

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b) Magnificación ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. ¿Qué parte del microscopio determina, en últimas, el poder de resolución del mismo? _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

6. Considere que usted está interesado en comprar un lente objetivo que ofrezca un buen poder de resolución y el vendedor, que nada sabe de microscopía, le muestra los siguientes objetivos:

¿Cuál escogería usted? ________________

¿Por qué? __________________________

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ESTEREOSCOPIO

Los estereoscopios permiten visualizar objetos y organismos muy pequeños para ser estudiados a simple vista, pero muy grandes para ser estudiados bajo un microscopio. Su magnificación suele oscilar entre 5x hasta más de 60x. Una ventaja destacable que ofrece es que la muestra se puede observar en 3D. Adicionalmente, no se requiere hacer cortes o preparados ya que, a diferencia de lo que sucede en el microscopio, no es necesario que la luz atraviese la muestra para poder observarla.

Este tipo de equipos permite establecer distancias entre la muestra y el objetivo que van desde un par de centímetros a decenas de ellos, lo que lo hace muy útil en botánica, mineralogía, microelectrónica, medicina y biología. Es fundamental en aplicaciones que requieren manipular la muestra, donde la visión estereoscópica es esencial.

A continuación se muestra una imagen en la que están señaladas las partes del estereoscopio. Observe atentamente las diferencias entre este instrumento y un microscopio y trate de especular sobre la razón de éstas.

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Elija 3 muestras de su interés para observar bajo el estereoscopio. Manipule la muestra aprovechando las ventajas del equipo y tratando de observar detalles que no pueden ser apreciados a simple vista. Señálelos en su dibujo.

Aumento: Aumento: Aumento:

Tipo de muestra: Tipo de muestra: Tipo de muestra:

Calcule el tamaño aparente de cada una de las 3 muestras observadas, de la misma manera que lo hizo con las muestras vistas a través del microscopio.