A dUTPáz kifejeződés hatása a DNS bázisösszetételére és a ...teo.elte.hu/minosites/ertekezes2012/horvath_andras.pdf · A dUTPáz kifejeződés hatása a DNS bázisösszetételére

A dUTPáz kifejeződés hatása a DNS bázisösszetételére és a

genom épségére

Doktori értekezés

Horváth András

Okleveles biológus

Témavezető: Prof. Vértessy G. Beáta

Az MTA doktora, egyetemi tanár

Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológia Doktori Iskola,

Szerkezeti Biokémia Program

A doktori iskola vezetője: Prof. Erdei Anna

Programvezető: Prof. Nyitray László

Készült: Magyar Tudományos Akadémia, Természettudományi Kutatóközpont,

Enzimológiai Intézet

2012. Budapest

Egyéni szerepem a disszertáció elkészítésében

A doktori értekezésemben közölt egyermények több kutató közös munkájának köszönhető.

Egyes szám első személyben fogalmaztam, amennyiben a leírt kísérletet kizárólag én

végeztem el. Egyes szám többes személyben kívánom jelezni azt, ha az eredmény

megszületésében mások is közreműködtek. A dolgozatban minden közreműködő kollégámat

külön megemlítem.

Tartalomjegyzék

Köszönetnyilvánítás ................................................................................................................... 1

A dolgozatban gyakran használt rövidítések jegyzéke .............................................................. 2

1. Irodalmi áttekintés .................................................................................................................. 7

1.1. A sejtbeli dNTP egyensúlyt kialakító tényezők .............................................................. 7

1.1.1. A dezoxiribonukleotidok de novo szintézise ............................................................ 7

1.1.2. Timidilát bioszintézis ............................................................................................... 9

1.1.3. Menekítő útvonalak ................................................................................................ 12

1.2. A nukleotid metabolizmus hatása a DNS összetételére ................................................ 13

1.2.1. A dNTP arányok és a mutagenezis ........................................................................ 13

1.2.2. Nem konvencionális nukleotidok beépülése a DNS-be ......................................... 15

1.2.3. Nem konvencionális nukleotidok eltávolítása a dNTP készletből ......................... 18

1.2.4. Nem konvencionális nukleotidok eltávolítása a DNS-ből ..................................... 20

1.2.4.1. Direkt javítómechanizmusok ........................................................................... 20

1.2.4.2. Báziskivágó javítás .......................................................................................... 20

1.2.4.3. Hibáspár javítás ............................................................................................... 24

1.2.4.4. Nukleotid kivágó javítás .................................................................................. 26

1.3. A nukleotid metabolizmus szinkronizálása a sejtciklushoz .......................................... 27

1.3.1. Transzkripciós szabályzás ...................................................................................... 27

1.3.2. Poszttranszkripciós szabályzás ............................................................................... 28

1.3.3. A dNTP koncentráció fluktuációjának jelentősége ................................................ 29

1.4. A nukleotid metabolizmus hatása a genom integritására .............................................. 30

1.4.1. A DNS épségének preventív védelme .................................................................... 30

1.4.2. A genom integritását veszélyeztető nukleotid metabolitok .................................... 31

1.5. A DNS károsodás sejtválasz ......................................................................................... 34

1.5.1. A DNS károsodás aktivált sejtciklus leállás ........................................................... 37

1.5.2. A DNS károsodás aktivált nukleotid metabolizmus és javítás ............................... 39

1.5.3. A DNS károsodás által kiváltott sejthalál .............................................................. 40

2. Célkitűzések ......................................................................................................................... 43

3. Anyagok és módszerek ......................................................................................................... 47

3.1. Nukleinsav izolálás és a plazmidok létrehozása............................................................ 47

3.1.1. Felhasznált Escherichia coli törzsek és a pBS-dutP plazmid létrehozása.............. 47

3.1.2. DNS tisztítás ........................................................................................................... 48

3.1.3. Uracil-szubsztituált DNS fragmentumok előállítása PCR-el ................................. 48

3.1.4. Genomi DNS minták előkészítése az uracil PCR-alapú kimutatásához ................ 49

3.1.5. Promóter - riporter rendszerek létrehozása ............................................................ 49

3.1.5.1. EGFP riporter rendszerek ................................................................................ 49

3.1.5.2. Luciferáz riporter rendszerek .......................................................................... 50

3.1.5.3. β-galaktozidáz riporter rendszerek .................................................................. 50

3.1.6. Plazmidok a dUTPáz overexpresszáló muslicatörzsek létrehozásához ................. 51

3.2. Eukarióta sejtvonalak .................................................................................................... 51

3.2.1. Sejtvonalak és fenntartásuk .................................................................................... 51

3.2.2. Drosophila S2 sejtek transzfektálása ...................................................................... 52

3.2.3. A sejtek drogkezelése ............................................................................................. 52

3.3. Muslica törzsek és módszerek ....................................................................................... 52

3.3.1. Gének csendesítése ................................................................................................. 52

3.3.2. dUTPáz túltermelés ................................................................................................ 53

3.3.3. Promóter - riporter rendszereket hordozó transzgenikus törzsek ........................... 55

3.4. Muslica szövetek gyűjtése és festése ............................................................................ 55

3.4.1. Embrió gyűjtés ....................................................................................................... 55

3.4.2. β-galaktozidáz hisztokémia .................................................................................... 55

3.4.3. Immuncitokémia ..................................................................................................... 56

3.4.4. TUNEL próba ......................................................................................................... 57

3.4.5. BrdU próba ............................................................................................................. 58

3.5. Kimutatási módszerek és a felhasznált műszerek ......................................................... 58

3.5.1. Kvantitatív valós idejű PCR ................................................................................... 58

3.5.2. Szcintillációs detekció ............................................................................................ 60

3.5.3. Luciferáz teszt ........................................................................................................ 60

3.5.4. Áramlási citrometria ............................................................................................... 60

3.5.5. Mikroszkópia .......................................................................................................... 61

3.5.6. Alamar sejt életképesség vizsgálat ......................................................................... 61

4. Eredmények bemutatása és kiértékelése .............................................................................. 62

4.1. A DNS uraciltartalmának kvantitatív kimutatása .......................................................... 62

4.1.1. DNS uraciltartalom kimutatása szintetikus DNS-ből ............................................. 65

4.1.2. DNS uraciltartalom kimutatása fiziológiás DNS mintákból .................................. 67

4.2. A dUTPáz expressziós mintázat hatása a muslica genom uraciltartalmára .................. 70

4.2.1. Az ecetmuslica dUTPáz expressziós mintázata ..................................................... 71

4.2.2. Az uracil-DNS stádium- és szövetspecifikus megjelenése .................................... 72

4.2.3. A dUTPáz csendesítés hatása a muslica genom uraciltartalmára .......................... 74

4.3. A muslica dUTPáz expressziós mintázatáért felelős mechanizmus vizsgálata ............. 75

4.3.1. A dUTPáz promóter vizsgálata S2 sejtvonalban .................................................... 78

4.3.2. A dUTPáz promóter stádium-és szövetspecifikus regulálása ................................ 80

4.3.3. A dUTPáz expressziós reguláció jelentősége ......................................................... 84

4.4. A dUTPáz jelentőségének vizsgálata a genom integritásának megőrzésében .............. 86

4.4.1. A dUTPáz csendesítés hatása a muslica genom integritására ................................ 87

4.4.1.1. A dUTPáz csendesítés sejtautonóm hatásának kimutatása ............................. 87

4.4.1.2. A dUTPáz csendesítés okozta fenotípus molekuláris jellemzése .................... 89

4.4.2. A dUTPáz hozzájárulása az 5-fluorodezoxiuridin toleranciához ........................... 93

5. Összefoglalás, konklúzió ...................................................................................................... 96

6. Összegzés ........................................................................................................................... 105

7. Summary ............................................................................................................................ 106

8. Irodalomjegyzék ................................................................................................................. 107

9. Közlemények listája ........................................................................................................... 123

1

Köszönetnyilvánítás

Mindenekelőtt szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Prof. Vértessy

Beátának, aki lehetővé tette, hogy a csoportjában dolgozzak, amiért a téma iránt felkeltette az

érdeklődésemet, és megismertette velem a téma alapjait. Köszönöm, hogy szakértelemmel és

odafigyeléssel irányított, a felmerülő problémák megoldásában segített, és támogatta

részvételemet konferenciákon és szakmai gyakorlatokon.

Szeretnék köszönetet mondani Dr. Muha Villőnek, aki korábbi munkájával számos e

dolgozatban bemutatott eredményt alapozott meg. Ezen túl sokat segített szakmai

tapasztalatok elsajátításában, a felmerülő problémák megoldásában. Jelen dolgozatban

bemutatott eredményekhez is jelentősen hozzájárult muslica minták gyűjtésével és azokon

végzett mérésekkel. Köszönet jár kollégámnak, Róna Gergelynek, aki számos ötlettel és

javaslattal támogatta munkámat, valamint sokat segített a dolgozatban bemutatott

mikroszkópiás eredmények megszületésében. Köszönetet szeretnék mondani Batki Júliának,

aki szakdolgozóként és tudományos diákköri hallgatóként vett részt a munkákban az

irányításom alatt, és végig rendkívüli lelkesedéssel és érdeklődéssel követte az elvégzett

kísérleteket. Köszönetet mondanék Dr. Békési Angélának, aki szintén hozzájárult a téma

alapjaihoz, valamint számos tanácsot adott, lelkesedését rám is átragasztotta. Köszönet jár

még Dr. Merényi Gábornak, aki számos tanácsot adott sejtkultúrák kezeléséhez, és aki az

eredményekhez felhasznált humán sejtvonalakat hozott létre.

Szeretnék köszönetet mondani Dr. Erdélyi Miklósnak és Dr. Vilmos Péternek a

Szegedi Biológiai Központ Genetikai Intézetéből, akik számos, e dolgozatban bemutatott

kísérletekhez felhasznált muslica törzset hoztak létre. Ezen kívül szakértelmükkel számos

genetikai kísérlet kiértékelésében segítettek, a kísérletek elvégzéséhez hasznos tanácsokat

adtak.

Szeretném még megköszönni Dr. Kiss Endre segítségét az ELTE Immunológiai

Tanszékéről, aki az áramlási citometriás méréseket végezte és az eredmények kiértékelésében

is részt vett. Továbbá szetetnék köszönetet mondani Prof. Hilde Nilsen-nek és Dr. James

Sellers-nek az Osloi Egyetemről és az NIH-ről, amiért a kísérleteimhez sejtvonalakat

adományoztak. Szeretenék köszönetet mondani Prof. Jure Piskur-nak, akinek a laborjában

három hónapot tölthettem a Lund-i Egyetemen doktori éveim alatt, és számos tapasztalatot

szereztem.

Végül szeretnék köszönetet mondani Prof. Buday Lászlónak az Enzimológiai Intézet

igazgatójának, aki lehetővé tette, hogy az Intézeti infrastruktúrát kísérleteimhez hasznosítsam.

2

A dolgozatban gyakran használt rövidítések jegyzéke

2-OH-A 2-hidroxiadenin

2-OH-G 2-hidroxiguanin

3-metil-A 3-metiladenin

5FdU 5-fluoro-dezoxiuridin

5FU 5-fluorouracil

5-OH-C 5-hidroxicitozin

5-OH-U 5-hidroxiuracil

7-metil-G 7-metilguanin

8-OH-dATP 8-hidroxi-dezoxiadenozin trifoszfát

8-OH-dGDP 8-hidroxi-dezoxiguanozin difoszfát

8-OH-dGMP 8-hidroxi-dezoxiguanozin monofoszfát

8-OH-dGTP 8-hidroxi-dezoxiguanozin trifoszfát

8-OH-G 8-hidroxiguanin

9-1-1 Rad9, Rad1, Hus1 "clamp loader" komplex

A adenin

ADP adenozin difoszfát

AP-hely bázismentes hely a DNS-ben

APC Anaphase Promoting Complex

APE1 AP endonukleáz 1

APOBEC apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like

enzim család

ARP aldehid reaktív próba

Art8 Arginin metiltranszferáz 8

ATM Ataxia telangiectasia mutated kináz

ATP adenozin trifoszfát

ATR ATM-related kináz

BER Báziskivágó javítás

bp bázispár

BrdU 5-bromo-dezoxiuridin

BSA Bovine serum albumin

C citozin

C. elegans Caenorhabditis elegans

3

CD95 cluster of differentiation 95/FAS receptor

CDA citidin dezamináz

cDNS mRNS reverz transzkripcióval előállított, intronokat nem tartalmazó

DNS

CDP citidin difoszfát

CHO hörcsög ovárium sejtvonal

CNS Central Nervous System - központi idegrendszer

Ct qPCR kvatifikációs ciklus, az a ciklusszám, melynél a felszaporítás

során a DNS koncentráció elér egy bizonyos küszöbértéket

C-terminális karboxi-terminális

D. melanogaster Drosophila melanogaster

dA dezoxiadenozin

dADP dezoxiadenozin difoszfát

dAMP dezoxiadenozin monofoszfát

DAPI 4',6-diamidino-2-fenilindol

dATP dezoxiadenozin trifoszfát

dC dezoxicitidin

dCDP dezoxicitidin difoszfát

dCMP dezoxicitidin monofoszfát

DCTD dezoxicitidin monofoszfát dezamináz

dCTP dezoxicitidin trifoszfát

DCTPP1 dezoxicitidin trifoszfát pirofoszfatáz 1

DDR DNS károsodás sejtválasz

dG dezoxiguanozin

dGDP dezoxiguanozin trifoszfát

dGMP dezoxiguanozin monofoszfát

dGTP dezoxiguanozin trifoszfát

DHF dihidrofolát

DHFR dihidrofolát reduktáz

dIDP dezixiinozin difoszfát

dIMP dezoxiinozin monofoszfát

dITP dezoxiinozin trifoszfát

dNDP dezoxiribonukleotid difoszfát

dNMP dezoxiribonukleotid monofoszfát

4

DNS dezoxiribonukleinsav

dNTP dezoxiribonukleotid trifoszfát

DRE DNA Replication-related Element transzkripciós faktor kötő DNS

motívum

DREF DNA Replication-related Element binding Factor transzkripciós faktor

dRP dezoxiribóz foszfát

DSB dupla szálú DNS törés

dT dezoxitimidin

dTDP dezoxitimidin difoszfát

dTMP dezoxitimidin monofoszfát

dTTP dezoxitimidin trifoszfát

dU dezoxiuridin

dUDP dezoxiuridin difoszfát

dUMP dezoxiuridin monofoszfát

dUTP dezoxiuridin trifoszfát

dUTPáz dezoxiuridin trifoszfát pirofoszfatáz

dXTP dezoxixantozin trifoszfát

E. coli Escherichia coli

EGFP enhanced Green Fluorescent Protein - zöld fluoreszcens fehérje

FANCD2 Fanconi anemia komplementációs csoport D2 fehérje

FBS Foetal bovine serum - marha magzati szérum

G guanin

GDP guanozin difoszfát

GTP guanozin trifoszfát

H2AV H2AX hisztonvariáns muslica homológja

HEK humán embrionális vese sejtvonal

HeLa méhnyakrák sejtvonal

HIV humán immundeficiencia vírus

hmU 5-hidroximetil-uracil

HT29 humán vastagbél karcinóma sejtvonal

ITPáz inozin trifoszfát pirofoszfatáz

LigI DNS ligáz I

LigIII DNS ligáz III

MEF egér embrionális fibroblaszt sejtvonal

5

MGMT 6-oxo-metilguanin transzferáz

MPG 3-metilpurin glikoziláz/3-alkiladenin DNS glikoziláz (AAG)

MRN Mre11, Rad50, Nbs1 komplex

mRNS hírvivő/messenger RNS

MTHF metilén-tetrahidrofolát

MTX metotrexát

MX metoxiamin

NDP ribonukleotid difoszfát

NDPK nukleotid difoszfát kináz

NK nukleotid kináz

NLS sejtmagi lokalizációs szignál

NMP ribonukleotid monofoszfát

NMPK nukleotid monofoszfát kináz

N-terminális amino-terminális

NTP ribonukleotid trifoszfát

OD optikai denzitás

OpiE2 Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrosis vírus promoter

p53R2 p53 indukálható ribonukleotid reduktáz kis alegység

PARP poli-ADP ribóz polimeráz

PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen replikációs kapocs

PCR polimeráz láncreakció

Pfu Pyrococcus furiosus

pH2AX foszforilált H2AX hisztonvariáns

Polβ DNS polimeráz β

qPCR kvantitatív valós idejű PCR

R1 ribonukleotid reduktáz nagy alegység

R2 ribonukleotid reduktáz kis alegység

Rb retinoblasztoma tumor szupreszor fehérje

RdgB inozin trifoszfát pirofoszfatáz Escherichia coli homológja

RecA Az eukarióta Rad51 Escherichia coli homológja

RFC replikációs faktor C

RNAi RNS interferencia

RNázH ribonukleáz H

RNR ribonukleotid reduktáz

6

RNS ribonukleinsav

ROS Reactive oxigen species - reaktív oxigén gyökök

RTX Raltitrexed /Tomudex (TDX)

S. cerevisie Saccharomyces cerevisiae

S. pombe Schizosaccharomyces pombe

S2 Drosophila melanogaster 20-24 órás embrióból származó heterogén

sejtvonal

SHMT szerin-hidroximetil transzferáz

SSB egyes szálú DNS törés

ssDNS egyes szálú DNS

SW620 colorectal adenocarcinoma sejtvonal

T timin

THF tetrahidrofolát

TK1 timidin kináz

TMPK timidilát kináz

TRIS 2-Amino-2-hidroximetil-propán-1,3-diol

TS timidilát szintáz

TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling

U uracil

UDP uridin difoszfát

UTR nem transzált régió

UV ibolyántúli (ultraviola) fény

V93Q valin-glutamin csere a 93. aminosav helyén

W vad típusú allél

WRN Werner szindróma fehérje

WT vad típus

X-gal 5-bromo-4-kloro-indolil-β-D-galaktopiranozid

Y285A tirozin-alanin csere a 285. aminosav helyén

IRODALMI ÁTTEKINTÉS

7

1. Irodalmi áttekintés

Dolgozatomban elsősorban a dUTPáz fiziológiás szerepének megértését célzó

vizsgálatokat szeretném ismertetni. Ehhez szeretném bemutatni a nukleotid metabolizmussal

és a genom stabilitását biztosító rendszerekkel kapcsolatos folyamatokat, melyekben a

dUTPáz az irodalmi adatok alapján részt vehet. Emellett szeretném bemutatni azokat a sejtbeli

rendszereket, amelyek a dUTPáz fiziológiás funkciójával analógiát mutatnak, így a dUTPáz

szerepének megértéséhez támpontot adnak.

1.1. A sejtbeli dNTP egyensúlyt kialakító tényezők

Nagy mennyiségű információ tárolásának hatékony módja az elemi információt tároló

egységek szekvenciális elrendezése. Az élővilágban ezt a polimer ribonukleotidok (RNS), és

dezoxiribonukleotidok (DNS) valósítják meg. Mindkettő kovalensen összekapcsolt cukor-

foszfát láncból, és az elemi információt hordozó bázisokból áll. A DNS generációkon

keresztül, hosszú távon tárolja az információt, ennek megfelelően az RNS-nél jóval

stabilabbnak, kevésbé reaktívnak kell lennie. Ezért ribonukleotid-monofoszfátok (NMP)

helyett a 2’-hidroxil csoporttal nem rendelkező dezoxiribonukleotid-monofoszfátok (dNMP)

építik fel, továbbá a DNS az élővilágban legtöbbször komplementer kettős szálú hélixet alkot.

A DNS és az RNS báziskomponenseinek összetételében csak minimálisan különbözik, ami a

kémiai stabilitást nem befolyásolja: mindkét molekula tartalmazhat adenin, guanin és citozin

bázisokat, a DNS-ben azonban az RNS-re jellemző uracil helyett az 5-metilcsoporttal is

rendelkező timin fordul elő. A DNS szintézisét a DNS polimerázok végzik

dezoxiribonukleotid trifoszfát (dNTP) szubsztrátokból. Az egyes dNTP molekulák

koncentrációja a sejtben szigorúan szabályozott. Ennek megfelelően a dNTP szintézisnek

összhangban kell lennie a DNS szintézisével, amit számos mechanizmus biztosít. A dNTP

metabolizmus főbb útvonalai az 1.1. ábra láthatók. A továbbiakban részletesen bemutatom,

hogy ezen útvonal résztvevői hogyan járulnak hozzá a dNTP szintéziséhez, és milyen

jelentőséggel bírnak a dNTP arányok kialakításában.

1.1.1. A dezoxiribonukleotidok de novo szintézise

A dTTP szintézis kulcslépése a ribonukleotid-difoszfátok (NDP) redukciója

dezoxiribonukleotid-difoszfáttá (dNDP). Ezt a folyamatot a ribonukleotid reduktáz (RNR)

katalizálja 1. (Egyes archea és baktérim ribonukleotid reduktázok az NTP-t fogadják el

szubsztrátként.) Az RNR kétféle alegységből alkot funkcionális heterotetramert: a nagy R1 és


8

a kis R2. A nagy alegység katalizálja a redukciót, amihez a reaktív gyököt a kis alegység

biztosítja 2.

Az RNR aktivitását az R1 alegységen kétféle allosztéria befolyásolja. Az általános

aktivitást szabályzó hurok (a-hely) adenozin trifoszfátot (ATP) vagy dezoxiadenozin

trifoszfátot (dATP) képes kompetitív módon kötni. Bár az ATP sejtbeli koncentrációja jóval

magasabb a dATP-nél, utóbbi affinitása az a-helyre 100-szor nagyobb 3. Mindkét nukleotid

kötődése az R1 alegység hexamerizációját segíti elő, azonban az ATP-vel komplexált forma

inaktív 4. Az a-helyen történő allosztérikus szabályozás tehát lehetővé teszi, hogy az enzim

érzékelje a sejtbeli dNTP koncentrációt, és ahhoz hangolja az aktivitását. Az allosztérikus

specificitást szabályzó két hurok (s-hely) az aktív hely közelében van, és ATP, dATP, dGTP

és dTTP kötésére képes. Az egyes nukleotidok kötődése az s-helyre befolyásolja az NDP

molekulák kötődését és azok enzimatikus redukcióját. Az ATP és a dATP kötődése a citidin

difoszfát (CDP) és az uridin difoszfát (UDP) redukcióját stimulálja, míg a dTTP a guanozin

1.1. ábra. A dezoxinukleotid metabolizmus útvonalai eukarióta sejtekben

CDA: citidin dezamináz, DCTD: dCMP dezamináz, DCTPP1: dCTP pirofoszfatáz 1,

DHF: dihidrofolát, DHFR: dihidrofolát reduktáz, MTHF: metilén-tetrahidrofolát, NDPK:

nukleotid difoszfát kináz, NK: nukleotid kinázok, NMPK: nukleotid monofoszfát kináz,

RNR: ribonukleotid reduktáz, SHMT: szerin hidroximetil transzferáz, THF:

tetrahidrofolát, TS: timidilát szintáz


9

difoszfát (GDP ), a dGTP az adenozin difoszfát (ADP) redukcióját segíti 5. Ennek a

szabályozásnak köszönhetően az egyik dNTP komponens sejtbeli koncentrációjának

egyensúlyitól való eltérése kihatással van a többi dNTP szintézisére. Ezt támasztja alá az a

megfigyelés is, hogy az RNR s-helyét érintő mutációk az élesztősejtek dNTP egyensúlyát

jelentősen felborítják 6.

A dNDP molekulák foszforilálását dNTP-vé a nukleozid difoszfát kináz (NDPK)

katalizálja 7. Ez az enzim nem bázis vagy dezoxiribóz specifikus, tehát részt vesz az NTP

szintézisben is. Feltehetően az NDP kinázokon kívül más nem specifikus kinázok is

elláthatják ezt a funkciót, mint a piruvát kinázok vagy a foszfoglicerát kinázok 7.

1.1.2. Timidilát bioszintézis

A timidinnek nincs ribonukleotid megfelelője, így annak szintézise csak uridin vagy

citidin prekurzorokból lehetséges. Mindkét útvonal dezoxiuridin monofoszfát (dUMP)

intermedieren keresztül valósul meg.

Eukariótákban és Gram pozitív baktériumokban jelentős útvonalat képvisel a

dezoxicitidin monofoszfát (dCMP) konverziója dUMP-vé, amit a dCMP dezamináz (DCTD)

katalizál 8. A ribonukleotid reduktázhoz hasonlóan a DCTD aktivitása is allosztérikusan

szabályozott: a dTTP gátolja, a dCTP viszont serkenti a katalizált reakciót 9. Az eddig vizsgált

emlős sejtvonalakban a dCMP dezamináció bizonyult az elsődleges forrásnak a de novo dTTP

szintézis számára, amihez hozzávetőlegesen 60-80%-ban járul hozzá 10,11

. A DCTD funkció

csökkentése emlős sejtvonalakban a dNTP arányok drasztikus felborulását eredményezi, a

sejtbeli dCTP koncentráció a többszörösére nő, míg a dTTP koncentráció csökken 12,13

. A

DCTD szubsztrátját de novo feltehetően a dCTP pirofoszfatáz 1 (DCTPP1) állítja elő a

dCTP hidrolízisével. Ez a fehérje a dCTP mellett a dATP és a dTTP hidrolízisét is képes

katalizálni 14,15

.

A másik jelentős útvonal a dUMP prekurzort dezoxiuridin trifoszfátból (dUTP) állítja

elő. A dUTP származhat az RNR termékéből (dUDP), amit aztán az NDP kinázok

foszforilálnak, illetve dCTP dezaminálásából, amit a dCTP dezamináz (DCD) végez. Utóbbi

a Gram negatív baktériumokra jellemző 16

. A dUTP hidrolízisét a dUTPáz végzi, amely széles

körben elterjedt az élővilágban. Bizonyos baktériumokban mint a Mycobacterium

tuberculosis, egy bifunkciós dCTP dezamináz - dUTPáz (DCD-DUT) enzim is jelen lehet,

mely dCTP - dUTP - dUMP konverziót katalizál 17

. Mindhárom enzim (DCD, dUTPáz, DCD-

DUT) a dUTPáz szupercsaládba tartozik és számos szerkezeti hasonlóságot mutat 18

. A

katalitikusan aktív enzim három alegységből alakít ki egy homotrimert, ami hármas


10

szimmetriát mutat, körülölelve egy központi csatornát. Az aktív helyek a szomszédos

alegységek határán alakulnak ki, amelyekhez hozzájárulnak az egyes alegységek C-terminális

flexibilis karja is.

A dUTPáz a dUTP foszfát láncát hasítja el az α és β foszfát között. Ezt a reakciót a

magnézium ion a foszfátlánc koordinálásával jelentősen felgyorsítja. A katalízist követően

pirofoszfát és proton szabadul fel. A C-terminális kar konzervált motívuma rendelkezik egy

P-hurok szerű motívummal, ami jellemző a nukleotid hidrolízist katalizáló enzimekre 19

. A

Caenorhabditis nemzetség 20

, valamint korábbi, eddig nem publikált megfigyelésünk alapján

a Drosophila virilis genomjában a dUTPázt kódoló gén háromszoros tandem ismétlődésben

van jelen egy leolvasási keretben, amiről egy polipeptid termék képződik. Ez a termék

monomerként valósítja meg a homotrimerre jellemző szerkezetet. A szerkezetet kialakító

három feltekeredési egység szekvenciája kis mértékben divergens. Ez a divergencia a hármas

szimmetria kismértékű csökkenésével a három feltekeredési egység esetleges specializációját

eredményezheti a homotrimer enzimekhez képest. Egyes organizmusok homodimer

dUTPázokkal rendelkeznek, amelyek nem a trimerikus dUTPázokkal, hanem a DCTPP1-el

mutatnak homológiát 14

. Homodimer dUTPázok találhatók a Trypanosomatida rendbe tartozó

organizmusok genomjában mint a Trypanosoma brucei és a Leishmania major esetében, de

néhány Gram pozitív baktériumban és azok fágjaiban is előfordulnak 14

.

dUTPáz hiányos sejtekben eddig még nem végeztek teljes körű dNTP készletre

vonatkozó vizsgálatot, azok csupán a sejtbeli dUTP és dTTP koncentrációra korlátozódtak.

Vastagbél és tüdőrák sejtvonalakban vizsgálták a dUTPáz expressziós szintek és a sejtbeli

dTTP és dUTP koncentráció összefüggését. A dUTP egyik esetben sem volt kimutatható. A

HT29 sejtvonalban negyedakkora dUTPáz aktivitás mellett feleakkora dTTP koncentráció

volt megfigyelhető az SW620 sejtvonalhoz képest 21

. Ilyen összefüggést azonban nem sikerült

kimutatni a tüdőrák sejtvonalak esetében 22

. A dUTPáz csendesítése tumoros sejtvonalakon

szintén nem járt egyértelmű következményekkel. A legtöbb esetben a dTTP koncentrációja

nem változott jelentős mértékben a csendesített sejtekben, azonban dUTP

koncentrációnövekedést több esetben sikerült kimutatni 23–25

. A dUTPáz csendesítés hatása

tehát feltehetően sejttípus függő. Az, hogy a dUTPáz csendesítés nem volt egyértelmű

hatással a timidilát bioszintézisre alátámasztja, hogy a dCMP dezamináció a domináns

útvonal. A dUTPáz csendesítés hatásának hiányára egy másik lehetséges magyarázat, hogy a

csendesítés ellenére elegendő enzimatikus aktivitás maradt a dTTP koncentráció zavartalan

fenntartásához. Mivel a dUTP nem allosztérikus modulátora a ribonukleotid reduktáznak 26

,

nem várható, hogy annak dUTPáz hiányában megemelkedett koncentrációja a dNTP


11

egyensúly felborulásához vezet. Mivel számos prokariótában nincs jelen a DCTD, ezekben az

élőlényekben a timidilát de novo szintézisében jóval nagyobb szerepe juthat a dUTP-nek és a

dUTPáznak.

A timidilát szintézis szűk keresztmetszete a dUMP, melynek metilációját a timidilát

szintáz (TS) katalizálja egy redukáló kofaktor jelenlétében 27

. A legtöbb élőlényben

kofaktorként és metil-donorként a metilén-tetrahidrofolát (MTHF) szolgál, amelyet az enzim

az uracil metilálását követően dihidrofoláttá alakít (DHF). A prokarióták egy csoportjára

azonban egy nem kanonikus, az előbbivel nem rokon, az ún. flavin-függő timidilát szintáz

(FDTS) jellemző 28

. Ez NAD(P)H redukáló kofaktort és MTHF metil-donort hasznosít,

utóbbit tetrahidrofoláttá (THF) alakítva a reakció során. A DHF regenerálása egy újabb

katalitikus ciklushoz két lépésben zajlik: a dihidrofolát reduktáz (DHFR) alakítja át

tetrahidrofoláttá, amit aztán a szerin-hidroximetil transzferáz (SHMT) alakít tovább

metilén-tetrahidrofoláttá, egy szerin-glicin konverzióval egyidejűleg 29

. Számos eukarióta

egysejtű parazita timidilát szintáz-dihidrofolát reduktáz (TD-DHFR) bifunkciós enzimmel

rendelkezik, mint a Leishmania, Plasmodium és Trypanosoma fajok 27

. A folát metabolizmus

a timidilát bioszintézis mellett kapcsolatban van a DNS metilációval 30

és a purin

bioszintézissel 31

, így megzavarása a dNTP készlet egyensúly felborítása mellett a DNS

metiláció által érintett epigenetikus információ tárolását is összezavarhatja.

Mivel a TS egy kulcsfontosságú folyamatot katalizál, kedvelt kemoterápiás célpont.

Timidilát deficiens egér sejtvonalban a külső timidin forrás megszüntetését követően a dTTP

és dGTP készlet csökkenését és a dATP készlet expanzióját figyelték meg 32

. Az 5-

fluorouracil származékok metabolitja, az 5-fluoro-dUMP irrevezibilis inhibitora a timidilát

szintáznak 33

. Emlős sejtvonalak 5-fluorouracil (5FU) és 5-fluoro-dezoxiuridin (5FdU)

kezelése hasonló hatással van sejtekre, mint a TS hiányos sejtekre a timidin megvonás 32,34

.

Ezen kívül számos esetben a dUTP készlet expanzióját is megfigyelték 5FU és 5FdU kezelést

követően 21,23,35,36

. Számos antimetabolit folátszármazék is létezik, amely hatással van a

timidilát bioszintézisre. Ezek némelyike a folát ciklust zavarja meg, vagy közvetlenül a

timidilát szintázt gátolja. A metotrexát (MTX) és az aminompterin a DHFR ismert inhibitorai,

egyúttal gátolják a metil transzferhez szükséges folát ciklust is. Sejtek mindkét droggal

történő kezelése esetén megfigyelték a dTTP készlet csökkenését és a dUTP készlet

növekedését 30,37–40

. Más antifolát származékok, mint a raltitrexed (RTX vagy más néven

tomudex, TDX) vagy pemetrexed (PTX) a timidilát szintázzal komplexálva gátolják a

szintézist, szintén ugyanilyen hatással vannak a dTTP és dUTP készletre 23,35,38,41

. A ZD-9331

antifolát esetében a dUTP felhalmozódást is megfigyelték a sejtbeli dTTP koncentráció


12

csökkenése és a dUTP koncentráció növekedése mellett 22

. Folát hiányos patkányokban és

folsav megvonásos diétán élő emberek limfocitáiban is növekedett a dUTP koncentráció a

dTTP-hez képest. Csökkentett foláttartalmú médiumon növesztett sejtvonalak az 5FdU

kezelésre nagyobb mértékű dTTP készlet csökkenéssel és dUTP készlet expanzióval

reagáltak. A TS gátlását követően a dUTP készlet növekedését kimutathatóan befolyásolja a

dUTPáz expressziója is 21

. A dUTPáz túltermelés csökkent mértékű, a csendesítés

megnövekedett dUTP készlet expanziót tesz lehetővé 23,36

.

A nukleotid monofoszfát kinázok (NMPK) jellemzően a dNTP bioszintézis menekítő

útvonalában vesznek részt. A timidilát kináz (TMPK) kivételt képez ez alól, ugyanis

elengedhetetlen a dTMP foszforilációjához. A dTMP mellett a dUMP-t is elfogadja

szubsztrátjaként. A keletkező dezoxitimidin difoszfát (dTDP) és dUDP molekulákat a

nukleotid difoszfát kinázok alakítják tovább dTTP-vé és dUTP-vé 42

.

1.1.3. Menekítő útvonalak

A de novo nukleotid metabolizmus mellett a sejtek képesek lehetnek ara is, hogy külső

forrásokat használjanak fel a dNTP szintézishez. Ehhez szükség lehet a megfelelő

transzporterekre és nukleotid kinázokra. A dezoxinukleozid kinázok katalizálják a sejt által

felvett dezoxinukleozidok átalakítását dNMP molekulákká. Az emlősök négyféle

dezoxinukleotid kinázzal rendelkeznek, melyek egymás paralógjai: a timidin kináz (TK1)

timidint; a mitokondriális timidin kináz (TK2) timint és dezoxicitidint; a dezoxicitidin kináz

(dCK) dezoxicitidint, dexoxiadenint és dezoxiguanint; a mitokondriális dezoxiguanozin kináz

(dGK) dezoxiadenint és dezoxiguanint foszforilál 43

. Számos organizmus azonban nem képes

a dezoxinukleotidok ilyen széles palettájának foszforilálására. A prokarióták közül csak a

gram pozitív baktériumok között (pl. a Bacillus subtilis) találunk olyan fajokat, amelyek ilyen

sokféle kinázzal rendelkeznek. Escherichia coli-ban csak egy timidinre specifikus kináz van

jelen 44

. Az ecetmuslica szintén csak egyetlen egy dezoxinukleozid kinázzal rendelkezik, ez

azonban mind a négyféle nukleozidot képes foszforilálni 45

. Az élesztő nem rendelkezik

dezoxinukleozid kinázokkal 6. A dezoxinukleozid kinázok szerepe akkor értékelődhet fel, ha a

dNTP metabolizmus zavara folytán asszimetria lép fel. Timidin kináz túltermeltetés pre-B

limfocita sejtvonalban helyreállítja a dNTP komponensek helyes arányát MTX jelenlétében.

Ez a sejtvonal interleukin-3 függő módon növekszik, megvonását követően a dNTP készlet

komponenseinek aránya felborul, és a dCTP dominál. A timidin kináz túltermelése azonban

interleukin-3 hiányában is helyreállítja a dNTP egyensúlyt 39

. Más esetben azonban a

dezoxinukleozid kinázok egyértelműen kiegészítő szerepet játszak a dNTP szintézisben a de


13

novo szintézis mellett: dezoxicitidin kináz deficiens hörcsög ovárium (CHO) sejtekben

csökkent dCTP koncentráció volt kimutatható 46

. A dezoxinukleozid kinázok fontos szerepet

játszanak a kemoterápiás céllal adagolt nukleozid analógok metabolizmusában is, mint az

5FdU, vagy az antiretrovirális azidotimidin (AZT) 42

.

A menekítő útvonalak kapcsán a már bemutatott TMPK mellett meg kell említeni a

többi nukleotid monofoszfát specifikus kinázokat: az uridilát-citidilát kináz (UMP-CMPK)

széles szubsztrátspecificitással rendelkezik, dUMP, dCTP és dAMP foszforilálására képes.

Emlőssejtek 5-féle adenilát kinázzal rendelkeznek melyek közül elsősorban az AK3-as és az

AK5-ös foszforilál dAMP-t, utóbbi azonban a dCMP-t is elfogadja szubsztrátként. A guanilát

kinázok két csoportra oszthatók, az ún. nukleotid foszforiláló guanilát kinázok (NP-GUK) és

az SH3 motívumot és PDZ domént tartalmazó membrán asszociált guanilát kinázok (MA-

GUK) 42

.

A timidilát bioszintézishez járulhat hozzá a citidin dezamináz (CDA), amely a dCMP

dezaminázhoz hasonlóan az APOBEC enzimcsaládba tartozik. A CDA dezoxicitidint képes

átalakítani dezoxiuridinná, ami aztán a kinázoknak köszönhetően a dUMP vagy a dUTP

készletet gyarapíthatja 47,48

.

1.2. A nukleotid metabolizmus hatása a DNS összetételére

Az eddigiekben bemutatott dNTP bioszintézisben szerepet játszó enzimek a dNTP

készlet komponenseinek koncentrációjának meghatározásával befolyásolni képesek a DNS

szintézist. Mivel a DNS által kódolt információt a bázisok hordozzák, rendkívül fontos a

bázissorrend hibamentes reprodukálása. Ennk biztosítását a dNTP egyensúly fenntartásán túl

további tényezők is lehetővé teszik, melyeket a továbbiakban igyekszem bemutatni.

1.2.1. A dNTP arányok és a mutagenezis

A dNTP készlet komponenseinek aránya a sejtekben nem egyenlő. Szembetűnő, hogy a

legkisebb koncentrációban a dezoxiguanozin trifoszfát (dGTP) van jelen emlős sejtekben 5, S-

fázisú HeLa sejtekben 49

és S-fázisú sarjadzó élesztőben 6. A legnagyobb koncentrációban a

dezoxitimidin trifoszfát (dTTP) van jelen. Ezek az arányok ugyan nem tükrözik az egyes

nukleotidok előfordulását a genomban, feltehetően inkább a DNS polimerázok optimális

működéséhez vannak hangolva. Az arányok meghatározásánál nem vették figyelembe a

komponensek esetleges kompartmentalizációját.

A legtöbb DNS polimeráz (a terminális dezoxinukleotidil-transzferáz kivételével)

templátfüggően szintetizál DNS-t, és ehhez szüksége van egy, már a komplementer szálra


14

hibridizált dezoxinukleotid monofoszfát (dNMP) 3’-hidroxil csoportjára. Az aktív helyre

véletlenszerűen kötődnek be a dNTP molekulák, az egyes nukleotidok a lokális

koncentrációjuknak megfelelően. Az aktív helyre kötött dNTP DNS lánchoz történő

konjugálását megelőzően a polimeráz kétféle mechanizmussal is ellenőrzi a helyes

bázispárosodás kialakulását. Ennek ellenére az egyes dNTP komponensek lokális túlsúlyának

következtében mutagén hatású nukleotid szubsztitúció történhet. Amellett, hogy a DNS

polimerázok a DNS 5’ - 3’ irányba történő szintézisét katalizálják, rendelkeznek egy ún

proofreading 3’ - 5’ exonukleáz doménnel is, ami 35 Å távolságra van az aktív helytől. Ez a

domén képes arra, hogy a polinukleotid lánc 3’ végéről levágja az utolsó nukleotidot,

amennyiben az aktív helyről fluktuál. A fluktuáció annál gyakoribb, minél kevésbé illeszkedik

a komplementer bázishoz. Miután a DNS polimeráz beépít egy nukeotidot és továbbmozdul a

DNS-en, a következő nukleotid beépítéséig van lehetőség kivágni a hibásan beépített

nukleotidot. Tehát minél gyorsabban építi be a polimeráz a következő nukleotidot, annál

kisebb az esély a hiba kijavítására. Amennyiben a következő nukleotidnak megfelelő dNTP

nagy mennyiségben van jelen, annak beépülése gyorsabb, csökkentve ezzel a proofreading

hatékonyságát a korábban beépült nukleotidra nézve. Ezt a jelenséget „következő nukleotid

hatás”-nak (next nucleotide effect) nevezzük 50

.

A hibáspárok kialakulásán keresztül a dNTP aránytalanság rövid inszerciók vagy

deléciók megjelenésének gyakoriságát is növelheti. Ez akkor valósulhat meg, amikor a

hibáspár egyik bázisa egy közeli nukleotiddal alakít ki bázispárt, és ilyen módon egy-két

nukleotidos kihurkolódást stabilizál 51

.

A dGTP készlet nem véletlenül a legalacsonyabb a sejtekben: a dGTP sejtbeli

koncentrációjának mesterséges megemelése nagymértékben növeli a mutációs frekvenciát.

Sokkal kisebb mértékű változást okoz a dCTP vagy a dTTP készletek növelése 13

. Az E. coli

NDPK enzimének kiütése a dCTP koncentráció két nagyságrenddel történő emelkedéséhez, és

a mutációs ráta növekedéséhez vezet. Ebben a törzsben a magas dCTP koncentrációnak

megfelelően számos T:A G:C transzverzió volt megfigyelhető 52

. A törzsben számos

inszerciós-deléciós esemény is megfigyelhető volt, különösen a hibáspár javítómechanizmus

hiányában 53

. A Saccharomyces cerevisiae RNR R1 alegységében a specifitás hurok Y285A

aminosavcseréje a dCTP és dTTP sejtbeli koncentrációját egy nagyságrenddel növeli, ami

nagymértékben fokozza a mutációs rátát 6. A timidilát szintáz inhibitor 5-fluoro-dUMP a

DNS-be is beépülhet timin analógként, azonban a timidin metabolizmus gátlásával

egyidejűleg kiváltott dNTP készlet aránytalanság következtében hibáspárként is beépül az

örökítőanyagba 54

.


15

Érdekes módon a mutációs frekvencia akkor is megnő, ha az amúgy normális arányban

jelen lévő dNTP komponensek koncentrációja magas. Ilyen körülményt idéztek elő E. coli-

ban az RNR túltermelésével, ami a dNTP készlet egy nagyságrenddel való növelése mellett a

mutációs gyakoriságot is jelentősen fokozta. Ez azzal magyarázható, hogy a magas dNTP

koncentráció gyorsabb nukleotid beépítést tesz lehetővé, és a „következő nukleotid hatás”-hoz

hasonlóan, kevesebb idő jut a proofreading számára. Ezt támasztja alá az az in vitro

megfigyelés is, hogy a fiziológiás dNTP készlet koncentrációja optimális a tökéletesen

illeszkedő, de szuboptimális a rosszul illeszkedő 3’-OH szálvég továbbírásához 49

.

A mitokondriumok külön enzimkészlettel rendelkeznek a nukleotid bioszintézishez,

amelynek a mitokondriális genomszintézishez kell igazodnia. HeLa sejtek timidin kezelése a

dTTP és dGTP készlet emelkedését és a dATP készlet csökkenését eredményezi mind a

citoplazmában, mind a mitokondriumban, utóbbiban azonban a dCTP koncentráció is

jelentősen csökken. Hosszabb távú kezelés eredményeként a mitokondriális genomban hosszú

deléciók jelennek meg. A deléciók kialakulására az lehet a magyarázat, hogy a korlátozottan

elérhető dNTP komponenseknek köszönhetően megszakadó DNS szintézis során a 3’-OH

szálvégek letekeredhetnek, és szekvenciahasonlóságot mutató egyéb DNS szakaszokra

hibridizálhatnak. Ilyen deléciók figyelhetőek meg néhány mitokondriumot érintő betegségnél

is, melyek kapcsolatba hozhatók egyes, a nukleotid metabolizmusban részt vevő, gének

mutációjával 49

.

1.2.2. Nem konvencionális nukleotidok beépülése a DNS-be

Ahogy fentebb bemutattam, a dNTP készletek aránytalansága hatással van a DNS

bázisösszetételére. A DNS-ben azonban a négyféle komponensen kívül előfordulhatnak

szokatlan bázisok is, amelyek a konvencionális bázisok metabolikus-enzimatikus útvonal

vagy valamilyen környezeti stressz által módosított származékai. Ezek a bázisok gyakran az

eredetitől eltérő kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek, ami a DNS infomációtartalmára

nézve módosulást jelenthet. A bázismódusulást okozó hatások történhetnek a DNS-en, így

azonban a sejtnek csak egy behatárolt kompartmentumára korlátozódnak. Ellenben a DNS

szintézis prekurzorai a sejt egész oszlanak el, ezért sokkal érzékenyebbek a reaktív

körülményekre. A módosult dNTP a konvencionális nukleotidokkal versenyezve beépülhet a

DNS-be.

Az egyik leggyakoribb bázismódosulás az oxidáció, melyért a sejtben megjelenő

oxidatív gyökök (Reactive Oxigen Species - ROS) felelősek. Az aerob légzés során

felhasznált oxigén 1-4%-a alakul át reaktív oxigén gyökké, de gyökök keletkezhetnek ionizáló


16

sugárzás, közeli UV vagy nitrogén-monoxid (NO) hatására is. A két leggyakoribb oxidált

bázis a 8-hidroxiguanin (8-OH-G), más néven 8-oxoguanin és a 2-hidroxiadenin (2-OH-A). A

8-OH-G és a guanin kétféle, syn és anti konformációt vehet fel, ennek megfelelően alakít ki

bázispárosodást: a 8-OH-G syn konformációban adeninnel, míg anti konformációban

citozinnal, a 2-OH-A pedig syn konformációjú guaninnal. Mindkét syn konformációt

tartalmazó bázispár mutagén. A különböző DNS polimerázok eltérő preferenciával építenek

be oxidált purinokat. A transzléziós DNS polimerázok (Polζ, Polη, Polκ, Polι) és az X típusú

polimerázok (Polβ, Polλ) a többi polimerázhoz képest nagy preferenciával építenek be 8-OH-

dGMP-t a DNS-be dAMP-vel szemben 55

. A citozin oxidált származékai az 5-hidroxicitozin

és az 5-hirdoxiuracil, melyek szintén beépülhetnek premutagén bázisként, előbbi adeninnel

vagy citozinnal, utóbbi citozinnal szemben 56

. Ezen kívül az 5-hidroximetiluracil

timinalalógként szintén beépülhet a DNS-be 57

. A Bacillus subtilis θe fágja 5-

hidroximetiluracil (hmU) szubsztituált genomot tart fenn, amihez egy speciális dTTP és dUTP

hidrolizáló enzim is hozzájárul 58

. Más fágokra is jellemző, hogy szokatlan bázisokat építenek

be a genomjukba: az E. coli T2, T4 és T6 fágok DNS-ében citozin helyett 5-

hidroximetilcitozin van jelen 59

.

A sejtek nukleotid készlete az oxidáción kívül alkiláló ágenseknek is ki lehet téve. A

környezeti faktorokon (pl. dohányzás, ionizáló sugárzások, aflatoxin) kívül ennek egyik

sejtbeli forrása az S-adenozilmetionin (SAM), amely metildonorként hasznosul számos

enzimatikus reakció esetén. Az alkilálódás során keletkező módosult bázisok a 3-

metiladenin, 7-metilguanin, 6-oxo-metilguanin vagy 4-oxo-metiltimin lehetnek. Utóbbi

kettőről kimutatták, hogy a HIV reverz transzkriptáz és az E. coli DNS polimeráz I képes

beépíteni DNS-be 60–62

.

A nukleotid készleten történő módosulások egy további részéért a spontán dezamináció

a felelős. A bázisok dezaminációja során az adeninből inozin, a guaninból xantin és a

citoziből uracil keletkezik. Az inozin és a xantin dezoxiinozin trifoszfát (dITP) illetve

dezoxixantozin trifoszfát (dXTP) szubsztrátként formában vehet részt a DNS szintézisében 63

.

A dUTP egyrészt a dCTP dezamináció, másrészt a dTTP metabolizmus köztitermékéből

származhat, és timin helyett épülhet be DNS-be 64

. Élesztőben kimutatták, hogy a timint

helyettesítő dUMP beépülés aktív transzkripció alatt a legnagyobb mértékű 65

. Léteznek a

genomban timin helyett uracilt felhalmozó fágok, mint a Bacillus subtilis BPS2 és a Yersinia

enterolitica θR1-37 66,67

.

Az archea replikatív polimerázok különlegesek abból a szempontból, hogy ugyan

képesek dUMP-t beépíteni a DNS-be, de az ilyen bázisokat tartalmazó DNS további


17

replikációjára képtelenek 68

. Ezek a DNS polimerázok ugyanis rendelkeznek egy dezaminált

bázis-kötő hellyel, mely nagy affinitással kötődik a DNS-ben található uracil bázisokhoz,

legátolva az enzim polimeráz aktivitását. DNS szintézis során az archea Pyrococcus furiosus

DNS polimeráza (a rekombináns DNS technikákhoz gyakran használt ún. Pfu DNS

polimeráz) a DNS templátban található uracil bázistól 5’ irányban, 4-6 bázis távolságra állítja

le a DNS szintézist 69

. Ennek a távolságnak a megtartásához a polimeráz proofreading

aktivitása is felelős 70

. Az archea DNS polimerázok uracil kötő helye tehát egy jól definiálható

zseb, amely a polimeráz aktív centruma előtt haladva letapogatja a templát bázisait. A zsebet

érintő V93Q mutáció megszünteti az uracillal szembeni diszkriminációt 71

(1.2. ábra). Az

uracil-felismerő zseb és az aktív hely közötti együttműködést mutathatja az, hogy ez a V93Q

mutáció a polimeráz aktivitását a felére csökkenti. Az archea DNS polimerázokat a

templátban található uracil mellett a hipoxantin bázisok is gátolják 72

.

A sejtbeli ribonukleozid trifoszfátok két nagyságrenddel nagyobb koncentrációban

vannak jelen, mint a nekik megfelelő dezoxiribonukleotid trifoszfátok 73

. Bár a DNS

polimerázok nagyfokú szelektivitással rendelkeznek a dNTP felhasználására amit az aktív

hely szerkezete is biztosít, bizonyos valószínűséggel előfordulhat ribonukleotidok beépülése

a DNS-be 74

. Az élesztő egyik replikatív polimerázának (pol ε) konzervált 645 tirozinja és 644

metioninja részt vesz az aktív helyről az NTP-t kizáró sztérikus gát létrehozásában. A 644

metionin leucinra cserélése növeli, míg glicinre cserélése csökkenti a szelektivitást, ennek

megfelelően a polimeráz kevesebb, illetve több NMP-t épít be a DNS-be. Becslések szerint a

1.2. ábra. A Pyrococcus furiosus DNS polimeráz uracil-DNS diszkriminációja

A vad típusú archea DNS polimeráz által katalizált DNS szintézis során a primer elongáció

a templátbeli uraciltól 4 bázisra elakad. Az uracil-felismerő zsebet érintő V93Q mutáció

azonban lehetővé teszi, hogy a templátbeli uracilt a polimeráz ne vegye figyelembe, így a

DNS szintézis zavartalanul folytatódik.


18

humán sejtek replikációja során 7600 nukleotidonként 1 ribonukleotid épül be. Nagyobb

gyakorisággal épülhetnek be NMP molekulák a ribonukleotid reduktáz hidroxiureával történő

gátlása esetén, amelynek köszönhetően a dNTP/NTP koncentrációk aránya csökken. A DNS-

ben jelen lévő ribonukleotidok 2’-OH csoportjának köszönhetően a DNS érzékenyebb lehet a

hidrolízisre. Genomi ribonukleotidokat felhalmozó sejtekről kiderült, hogy nagyobb

gyakorisággal jelennek meg bennük G-A szubsztitúciók és 2-5 bázispáros deléciók.

Ribonukleotidok a templátban gátló hatással lehetnek a DNS szintézisre, amit érdekes módon

befolyásol az NTP kizárásáért felelős sztérikus gát is. Egymás közelségében több

ribonukleotid a templátban a replikációs villa leállásához vezet 75,76

.

Gyulladás során eozinofil illetve neutrofil granulociták által termelt peroxidázoknak

köszönhetően hipobrómos illetve hipoklóros savak keletkeznek. Ezek a nukleotidokkal

reagálva halogénezett bázisokat hozhatnak létre, mint pl. az 5-bromouracil vagy az 5-

klorouracil. Ismert, hogy 5FdU és 5-bromo-dezoxiuridin (BrdU) kezelés esetén 5-fluoro-

dUMP illetve 5-bromo-dUMP épül be a DNS-be 49

. Bár a halogénezett uracilszármazékoktól

adeninnel történő bázispárosodást várunk, humán sejtek 5FdU kezelése esetén az 5FU egy

része hibáspárként, guaninnal szemben épül be 54

. Fiziológiás pH-n a pirimidin gyűrűn

található fluor atom hozzájárulhat ahhoz, hogy az 5FU guaninnal létesítsen bázispárt 33

.

Azonban, mivel az 5FdU metabolit 5-fluoro-dUMP a gátolja a timidin bioszintézist felborítva

ezzel a dNTP készlet arányait, az 5-fluorouracil hibáspárban való jelenléte következhet a

replikáció hűségének csökkenéséből is 77

.

1.2.3. Nem konvencionális nukleotidok eltávolítása a dNTP készletből

Mint ahogy korábban említésre került, a sejtben szétszórtan jelen lévő nukleotid készlet

a legérzékenyebb a környezeti és egyéb reaktív hatásokra. A sejtek számára ezért rendkívül

fontos, hogy preventív módon megakadályozzák a módosult nukleotidok DNS szintézis során

történő felhasználását. Ez általában a dNTP származékok hidrolízisével valósul meg. A

módosult dNTP-k hidrolízisét katalizáló enzimek a 1.1. táblázatban láthatók.

Az oxidált dezoxinukleotidok hidrolizálásáért felelős enzimek egy konzervált

foszfohidroláz (Nudix) motívummal rendelkeznek. E. coli-ban a 8-OH-dGTP hidrolizálását

elsősorban a MutT fehérje végzi. Az Orf135 elsősorban a 2-OH-dATP-t hidrolizálja, de

kisebb mértékben képes hidrolizálni a 8-OH-dGTP-t is. Az Orf17 a 8-OH-dATP, a 8-OH-

dGTP és kisebb aktivitással a 2-OH-dATP hidrolízisét képes katalizálni. Emlősökben az

MTH1 és MTH2 hidrolizálja a 8-OH-dGTP-t, valamint a NUDT5 képes a 8-OH-dGDP

hidrolízisére. Mindegyik enzimatikus reakció esetében a termék az oxidált dNMP. Ezen


19

enzimek hiányában az oxidált bázisok DNS-beli felhalmozódását, és megnövekedett mutációs

rátát figyeltek meg a vizsgált organizmusokban 78,79

. MTH1 aminosavcserék esetén egérben

megnövekedett mértékű spontán tumorképződést figyeltek meg.

E. coli homológ Szupercsalád szubsztrátspecificitás

MTH1 MutT Nudix 8-OH-dGTP

MTH2 MutT Nudix 8-OH-dGTP

NUDT5 Nudix 8-OH-dGDP

ITPáz RdgB HAM1 dITP, dXTP

NUDT16 Nudix dIDP, dITP

dUTPáz dUTPáz dUTPáz dUTP, 5-fluoro-dUTP

DCTPP1 MazG 5-kloro-dCTP, 5-bromo-

dCTP, 2-kloro-dATP, 2-OH-

dATP, 5-metil-dCTP

1.1. táblázat. Módosult nukleotidokra specifikus hidrolázok

Az E. coli RdgB fehérjéjéről kimutatták, hogy a (az eukarióta Rad51-el homológ) RecA

hiányában nélkülözhetetlen a genom integritás megőrzésében. Ennek a fehérjének a

homológjait emlősökben (ITPáz) és Metanococcus jannaschii-ben is azonosították, amelyek

purinok (inozin és xantin) által alkotott nukleotid trifoszfátokra specifikus nukleotid hidroláz

aktivitást mutattak. 63,80

. E. coli-ban az RdgB kiütése megnöveli az inozin beépülési arányát a

genomba, amit jelentősen felerősít az adenoszukcinát szintetáz (purA) és IMP dehidrogenáz

(purB) gének kiütése, melyek az inozin trifoszfát (ITP) illetve a xantozin trifoszfát (XTP)

átalakítását katalizálják ATP és GTP molekulákká. Érdekes módon ezekben a törzsekben a

genom xantin tartalma nem emelkedik kimutathatóan. Saccharomyces cerevisiae-ben sem az

RdgB homológ Ham1, sem a purA homológ ADE12 kiütése nem növeli jelentősen a genom

inozin tartalmát, a kettő együttes kiütése azonban jelentős mértékű beépülést eredményez 81

.

Egérben is létrehoztak ITPáz hiányos törzset, amelyből izolált sejtvonal genomja

megemelkedett mennyiségben tartalmazott dIMP-t. Az enzim jelenléte egérben

esszenciálisnak bizonyult 82

. Ezenkívül az emlős NUDT16 kimutathatóan rendelkezik dIDP

és némi dITP nukleotid hidroláz aktivitással, mely kiegészítheti az ITPáz működését 83

.

A dUTPáz timidilát bioszintézisben betöltött szerepe mellett fontos szerepet játszik a

dNTP készlet dUTP-től való megszabadításában. A hiányában megnőtt a dUTP sejtbeli

koncentráció timint helyettesítő uracil beépülést eredményez. E. coli-ban és élesztőben is

kimutatták az uracil bázisok feldúsulását a DNS-ben dUTPáz hiányában 84,85

. A dUTPáz


20

feltehetően a fluoropirimidinek DNS-be történő beépülését is megakadályozza, képes ugyanis

hidrolizálni az 5-fluoro-dUTP-t 86

.

A halogénezett pirimidin trifoszfátok hidrolíziséhez hozzájárulhat még a DCTPP1 is,

mely széles szubsztrátspecificitással rendelkezik. Hatékonyan katalizálja az 5-bromo-dCTP,

5-kloro-dCTP, 2-kloro-dATP, az oxidált purin trifoszfátok közül a 2-OH-dATP, valamint az

5-metil-dCTP hidrolízisét, de gyenge aktivitást mutat a dUTP és 5-fluoro-dUTP

szubsztrátokra nézve is 15

.

1.2.4. Nem konvencionális nukleotidok eltávolítása a DNS-ből

A sejtek DNS hibajavító mechanizmusai a felelősek a nem szokványos nukleotidok

eltávolításáért. Ezek a nukleotidok vagy rendellenes bázispárosodást alakítanak ki, ami

torzulást okoz a DNS szerkezetében, vagy szerkezetileg-kémiailag más karakterrel

rendelkeznek, mint a szokványos bázisok, ami befolyásolhatja a kölcsönhatást a DNS kötő

fehérjék felszínével. Utóbbi esetben a nagy árok felől a purinok 5, 6, 7, 8-as, és a pirimidinek

4, 5, 6-os pozícióban történő módosulásai, a kis árok felől pedig csupán a purinok 2, 3, 4-es és

a pirimidinek 6-os pozícióban történő módosulásai hozzáférhetők. Az ezekben a pozíciókban

található eltérések befolyásolhatják a hibajavító enzimek dokkolását.

1.2.4.1. Direkt javítómechanizmusok

A direkt javítómechanizmusok a legkíméletesebbek a DNS integritása szempontjából.

Ezek többnyire közvetlenül a módosult bázist alakítják vissza az eredeti, konvencionális

bázissá. Erre példa a 6-oxo-metilguanin átalakítása, melyet E. coli-ban az Ada, emlősökben a

6-oxo-metilguanin transzferáz (MGMT) katalizál. A reakció során a metilcsoport az enzim

aktív helyének egy ciszteinjére kerül, amely módosulás az enzim inaktiválódásához és

ubiquitin-mediált degradálódásához vezet. Alkilált bázismódosulások eltávolítására

specializálódott továbbá az E. coli AlkB, illetve emlős homológjai, az ABH2 és ABH3. Ezek

a 1-metiladenin és 3-metilcitozin javítását végzik 87

.

1.2.4.2. Báziskivágó javítás

A báziskivágó javító mechanizmus során a módosult bázis eltávolítása történik DNS-

ből. A módosult bázisok felismerését számos fajta ún. DNS glikoziláz végzi. Ezek a DNS

hélixen gördülve kifordítják a bázisokat az aktív helyük felé, mely sztérikus preferenciával

rendelkezik az eltávolítandó bázisra nézve. A monofunkcionális DNS glikozilázok egy

katalitikus vízmolekula segítségével elhasítják az N-glikozidos kötést, egy ún. abázikus-, vagy


21

AP-helyet hagyva maguk után. A bifunkcionális DNS glikozilázok a katalízis során az N-

glikozidos kötés mellett DNS cukor-foszfát gerincét is elhasíthatják 3’ irányban egyes

száltörést létrehozva. A bifunkcionális DNS glikozilázok egy része emellett a hátra maradt

dezoxiribóz-foszfát (dRP) eltávolítását is katalizálja. A DNS glikozilázok listája a 1.2.

táblázatban látható.

E. coli homológ katalitikus tulajdonság szubsztrátspecificitás

MUTYH MutY monofunkciós 8-OH-G:A, 2-OH-A

OGG1 Nth bifunkciós 2-OH-G:C

NTH1 Nth bifunkciós 5-OH-C

NEIL1 Nei bifunkciós, dRP eltávolítás 8-OH-G

NEIL2 Nei bifunkciós, dRP eltávolítás 5-OH-U, 5-OH-C

MPG monofunkciós 3-metil-A, 7-metil-G,

xantin

UNG UNG monofunkciós U, 5FU

TDG MUG monofunkciós U:G, T:G

SMUG monofunkciós U, 5FU, hmU

MBD4 monofunkciós U:G, T:G, 5FU:G

1.2. táblázat. DNS glikozilázok emlősökben

A 8-OH-G felismerésére több DNS glikoziláz is specializálódott. Az adeninnel

bázispárt alkotó 8-OH-G-t az E. coli MutY illetve a humán MUTYH monofunkciós DNS

glikoziláz ismeri fel. Ez az enzim a bázispárból az adenint vágja ki, tehát elsődleges funkciója

az oxidált guaninnal szemben beépülő adenin eltávolítása. Így akár a mutációt stabilizálhatja,

amennyiben a 8-OH-G épült be hibásan az adeninnel szemben. A MUTYH a 2-OH-A bázis

eltávolítását is képes katalizálni. A MUTYH működése replikációhoz kapcsolt, kölcsönhat az

RPA és a PCNA fehérjékkel. Emlős sejtekben a DNS-be beépülő 8-OH-G eltávolításáért

túlnyomórészt az E. coli Nth homológja, az OGG1 felelős. Ez egy bifunkciós DNS

glikoziláz, mely a 8-OH-G:C bázispárból az oxidált guanint távolítja el, hiányában jelentősen

megnő a genom 8-OH-G tartalma 88

. A humán sejtek 8-OH-dGTP kezeléselése esetén

megnőtt mutációs rátát a MUTYH csendesítése csökkenti, ami magyarázható annak mutációt

stabilizáló tulajdonságával. Az OGG1 csendesítése nem változtatja érdemben a kezelt

sejtekben megfigyelhető mutációs rátát, noha annak növekedését várnánk 79

. Az E. coli Nth

másik emlős homológja az NTH1 szintén bifunkciós DNS glikoziláz, mely az 5-OH-citozint

vágja ki. Az E. coli Nei enzim emlős homológjai különböző oxidált bázisokra

specializálódtak: a NEIL1 8-OH-G, a NEIL2 5-OH-uracil és 5-OH-citozin bázisokat ismer


22

fel. Mindkét enzim bifunkcionális DNS glikoziláz, azaz a dRP csoport eltávolítását is

katalizálják, végeredményként egy 3’-foszfát és egy 5’-foszfát csoportot hátrahagyva. Előbbit

a polinukleotid-kináz/foszfatáz alakítja át 3’-OH véggé. Muslicában nem találhatóak meg a

Nei ezen homológjai. Az E. coli Nei paralóg MutM fehérjéje szintén bifunkcionális DNS

glikoziláz, mely főleg oxidált purinokat ismer fel 89,90

.

A monofunkcionális 3-metilpurin glikoziláz (MPG) (más néven 3-alkiladenin DNS

glikoziláz (AAG)) széles szubsztrátspecificitással rendelkezik alkilált bázisokra, többek közt

3-metiladeninre és 7-metilguaninra. Az MPG hipoxantin kivágását is képes katalizálni. Bár

szekvenciális hasonlóságot nem mutat, a bakteriális AlkA DNS glikoziláz hasonló

szubsztrátpreferenciával rendelkezik 60,91,92

.

Az uracil kivágására specializálódott DNS glikozilázok mind monofunkciósak, azaz

csak az N-glikozidos kötés elhasítását katalizálják. Az uracil-DNS glikoziláz szupercsalád

osztályai azonban némileg eltérő szubsztrátkörnyezetre specializálódtak 93

. Az 1-es családba

tartozik az E. coli-ban, élesztőben, C. elegans-ban és emlősökben megtalálható UNG. Nincs

jelen azonban teljes átalakulással fejlődő rovarokban. Az UNG képes uracilt illetve 5-

fluorouracilt kivágni egyes és kettős szálú DNS szubsztrátokból. Az uracil-specifikus DNS

glikoziláz aktivitás túlnyomó részéért ez az enzim felelős. Ellentétben a legtöbb élőlénnyel, a

Bacillus subtilis PBS2 fágja uracillal dúsított genomot tart fenn, ennek érdekében a fertőzött

sejtben Ugi fehérjét expresszál, amely az 1-es családba tartozó összes UNG enzimet képes

specifikusan gátolni 94

. Emlősökben az UNG-nak két izoformája van jelen, a mitokondriális

UNG1 és a sejtmagi UNG2. Az UNG a MUTYH enzimhez hasonlóan kölcsönhat a PCNA és

az RPA fehérjékkel, ami arra utal, hogy működése replikációhoz kapcsolt 95

. A 2-es családba

tartozó uracil-DNS glikozilázok elsősorban T:G, U:G vagy 5FU:G hibáspárra specifikusak.

Ide tartozik a bakteriális MUG és az emlős TDG, valamint a muslica Thd1 96

. Ezek

elsősorban a citozin illetve metilcitozin dezaminációval keletkező uracilt vagy timint vágják

ki. Az emlős TDG szerepe azonban elsődlegesen a DNS demetiláció: feltehetően egy

demetilációs komplexben van jelen, amelyben az aktiváció-indukált citozin dezamináz (AID)

a metilcitozint timinné alakítja, végül utóbbiból a TDG inicializált BER állítja helyre a

citozint 97

. A 3-es családba tartozó SMUG hasonló szubsztrátpreferenciával rendelkezik, mint

az UNG, beleértve az egyes és kettős szálú DNS-ben található uracil és 5-fluorouracil bázist.

Azonban további módosult bázisokat is felismer, mint a hmU 98

. Ez az enzim az emlősök

mellett muslicában is jelen van. Az uracil-DNS glikoziláz szupercsaláddal ugyan nem rokon,

de a TDG-hez hasonló aktivitással (U:G, T:G és 5FU:G), rendelkezik a monofunkcionális

MBD4 (vagy más néven MED1) 99

.


23

A monofunkcionális DNS glikozilázok után hátra maradt abázikus helyet az AP

endonukleáz 1 (APE1) ismeri fel, mely egyes száltörést hoz létre a helytől 5’ irányban, 5’-

dRP és 3’-OH szálvégeket hátrahagyva. A nukleotid újraszintézisét a DNS polimeráz β

(Polβ) végzi, mely dRP liáz aktivitással rendelkezik, amelynek köszönhetően a dRP

eltávolításával létre hozza a transzkripcióhoz szükséges 3’-OH helyet 91,100

. A Werner

szindróma fehérje (WRN) a DNS helikázok RecQ családjába tartozik. A BER során

feltehetően a DNS kitekerését végzi, és szintén kölcsönhat a Polβ valamint az APE1

enzimekkel 100,101

. A Polβ nem rendelkezik proofreading doménnel, azonban a WRN-ről

feltételezik, hogy ezt kompenzáló tulajdonsággal bír, ugyanis rendelkezik 3’-5’ exonukleáz

aktivitással 101

. Érdekes, hogy az exonukleáz aktivitást blokkolják a DNS-ben jelen lévő

oxidált bázisok 102

illetve muslicában az uracil bázisok és az abázikus helyek 103

.

A BER útvonal kétféle módon történhet. Az ún. „short patch” vagy rövid BER során

csupán egy nukleotid vágódik ki, és a Polβ csupán az egy javításra szoruló nukleotid

beépítését végzi a DNS-be. Ezt követően a DNS ligáz III (LigIII) állítja helyre a DNS

cukorfoszfát gerincének integritását A „long patch” vagy hosszú BER akkor fordulhat elő, ha

a javítást monofunkcionális DNS glikoziláz inicializálja, és többnyire akkor indokolt, ha a

dRP csoport valamilyen okból (pl. oxidáció vagy egyéb kémiai módosulás) miatt nem

távolítható el a Polβ által. Ekkor FEN1 endonukleáz távolítja el a 3’-dRP csoportot illetve

további 2-8 nukleotidot. A DNS szintézist egy polimeráz cserét követően a DNS polimeráz β,

δ, ε vagy λ fejezi be. Utóbbi nagy hasonlóságot mutat a Polβ-vel, szintén rendelkezik dRP liáz

aktivitással. A DNS polimeráz δ és ε javításbeli szintézise a PCNA és replikációs faktor C

(RFC) jelenlétét is igényli. A Polβ nem igényel PCNA fehérjét a működéséhez, azonban

aktivitását jelentősen megnöveli. A folyamat végén a DNS ligáz I (LigI) kapcsolja össze a

DNS szálakat. Az esetek többségében a rövid útvonalú BER dominál humán sejtekben (75-

90%) 100,104

.

A BER útvonal számos a részt vevő fehérje komplexálódását igényli. Az XRCC1

állványfehérje az APE1 enzimmel hat kölcsön a Polβ és a LigIII vagy LigI mellett. A

komplexlódáshoz ugyan nélkülözhető, de jelentősen hozzájárul a poli-ADP-ribóz polimeráz 1

(PARP-1), mely egyesszáltöréseket és nick-eket ismer fel a DNS-ben, majd aktiválódik. Ez a

fehérje NAD+ szubsztrátot felhasználva kapcsol ADP-ribóz polimereket (PAR) többek közt

önmagára illetve olyan fehérjékre, melyek a kromatin szerkezet kialakításában és a DNS

metabolizmusban vesznek részt. A makromolák PAR-al történő feljelölése végül az XRCC1

toborzását segíti a száltörés helyére. A javítófehérjék komplexálódásában részt vehet még a

p53 fehérje is, melyről leírták, hogy in vitro kölcsönhat az APE1 és a Polβ enzimekkel.


24

Továbbá a Polβ aktivitásának stimulálását írták le a Rad9/Rad1/Hus1 (9-1-1) komplex és a

hősokk fehérje 70 (HSP70) esetében 105

.

Bár nem tekinthető klasszikus BER javítóenzimnek, a DNS-be beépült ribonukleotidok

kivágását inicializáló RNázH által elindított javítási folyamat résztvevői nagy mértékben

átfednek a hosszú báziskivágó javítással. Az RNázH a DNS cukorfoszfát gerincét a ribóztól

5’ irányba elvágja, majd a lézió eltávolítása a FEN1 endonukleáz segítségével fejeződik be. A

két alegységből álló RNázH egyik alegysége a PCNA-val is kölcsönhat, ami replikációhoz

kapcsolt működést tesz lehetővé. Az RNázH hányában jelentősen megnő a genom

ribonukleotid tartalma, és a mutációs rátája 75,76

.

A hipoxantin kivágása E. coli-ban az AlkA DNS glikozilázon kívül megvalósulhat a

szigorúan vett BER-en kívüli útvonalon is. Az Endonukleáz V felismeri a DNS-ben mind a

xantin, mind a hipoxantin bázisokat, és egy bevágást ejt mellettük. A módosult bázisokat

tartalmazó rövid DNS szakasz ezután eltávolításra kerül, majd újraszintetizálódik 106

. Az

Endonukleáz V enzimnek eukarióta homológjait is azonosították, továbbá az egérből

származó enzim aktivitását is kimutatták in vitro hipoxantint tartalmazó DNS szubsztráton 107

.

Mivel a módosult bázisok felismerő enzimeinek szubsztrátspecificitása néhol átfed, a

DNS glikozilázok kiütése többnyire nem végzetes az élőlények számára. Ez alól az egyedüli

kivétel a TDG, mely a demetilációban való érintettsége miatt nélkülözhetetlen emlősökben

108. A DNS glikozilázok által inicializált folyamatok a BER többi javítóenzime

közreműködésével integrálódnak. Ennek megfelelően az integrált javítófázisokban részt vevő

enzimek (APE1, XRCC1, Polβ, FEN1) esszenciálisak egérben 87,104

. A ribonukleotidok

eltávolítása a DNS-ből szintén kiemelt jelentőségű lehet, ugyanis az RNázH kiütése egérben

embrionális letalitáshoz vezet 76

.

1.2.4.3. Hibáspár javítás

A DNS polimerázok által létrehozott hibáspárok a helytelen illeszkedés miatt torzulást

okoznak a DNS-ben. A hibáspár javítás ilyen torzulások felismerésére specializálódott, ami a

replikáció hűségének 50-1000-szeres növekedését is eredményezheti 109

. Azonban a DNS-be

épült módosult bázisok is okozhatnak olyan térszerkezeti változásokat, melyeket a hibáspár

javítómechanizmus hibaként azonosít, például a 8-OH-G esetén 110

. A TDG és az MBD4

szubsztrátjai (T:G vagy U:G) szintén célpontjai lehetnek a hibáspár javításak. Humán sejtek

5FdU kezelését követően kimutatták, hogy a hibáspár javítómechanizmus hiányában az 5-

fluorouracil bázisok nagyobb hányada alakít ki guaninnal bázispárt, mint a működő javítás

esetén 54

. Ez arra utal, hogy a hibáspár javítás az 5-fluorouracil eltávolításában is jelentékeny


25

szerepet játszik. Azonban az 5FU nem biztos, hogy a DNS-ben mutatott kémiai

tulajdonságainak köszönheti a hibáspár javítás általi eltávolítását tekintve, hogy az 5FdU

kezelés következtében csökkent replikációs hűség egyébként is hibáspárokat eredményez

(lásd. 1.2.2. fejezet).

A hibáspár felismerését az E. coli MutS homodimer, eukariótákban a MutS homológ

MSH2-MSH6 vagy az MSH2-MSH3 heterodimer végzi. Utóbbi 1-2 nukleotidos hibáspárnál

nagyobb léziókat ismer fel, és bár a legtöbb eukariótában elterjedt, muslicában hiányzik az

MSH3 gén. A MutS alegységek két különböző doménje aszimmetrikus módon alakítja ki az

aktív helyet, amely eukariótáknál a MutS homológ heterodimerek divergens evolúciójával

valósult meg. A hibáspár felismerését követően kötődik a komplexhez szintén homodimer E.

coli MutL, eukariótákban a MutL homológ MLH1-PMS2 heterodimer. A hibáspár helyes

nukleotidjának meghatározása szempontjából kulcsfontosságú a DNS szál diszkrimináció,

azaz a frissen szintetizálódott DNS szál meghatározása. Baktériumok esetén ez a GATC

szekvencák segítségével történik, melyek idővel metilálódnak az N6 pozícióban a sejtciklus

során. A MutH endonukleáz a frissen szintetizált, ideiglenesen hemimetilált szekvenciákat

ismeri fel, és hasít a nem metilált szálon. Eukariótákban azonban a DNS szál diszkrimináció

mechanizmusa egyelőre tisztázatlan, de a javítás itt is igényel egy, a hibáspártól 5’ vagy 3’

irányban található bevágást. 5’ bevágás esetén PCNA és RFC függő módon az MLH1-PMS2

a hibáspártól 3’ irányba ejt bevágást endonukleáz aktivitásának köszönhetően, 3’ bevágás

esetén azonban ez a komplex nélkülözhető. E. coli-ban bevágást követően a nukleotidokat a

hibáspárral együtt eltávolítja az ExoI vagy ExoX exonukleáz 3’5’ irányban, az ExoVII

vagy RecJ exonukleáz 5’3’ irányban. Eukariótákban az Exo1 mindkét irányban képes

katalizálni a nukleotidok eltávolítását. A visszamaradt egyes szálú DNS-t E. coli-ban az SSB,

eukariótákban az RPA fehérjék stabilizálják. A DNS szál újraszintézisét a replikatív E. coli

DNS polimeráz III illetve az eukarióta DNS polimeráz δ végzi. Végül az E. coli DNS ligáz

illetve az eukarióta LigI köti össze a DNS szálvégeket. A MutS, MutL komplexek illetve

eukarióta homológjaik ATPáz aktivitással rendelkeznek, ennek megfelelően az ATP kötés és

hidrolízis befolyásolja a hibáspár felismerését és processzálását. Az E. coli MutL a DNS

polimeráz III „clamp loader” alegységével, az MLH1 a PCNA-val hat kölcsön, ami

transzkripcióhoz kapcsolt javítást teszlehetővé, illetve eukariótákban hozzájárulhat a szál

diszkriminációhoz. A PCNA fehérjével az MSH2, MSH3 és MSH6 komponensek is

kölcsönhatnak.


26

Az MSH2 és MLH1 gének mutációja gyakori a vastagbél tumorokban, és elsődleges

okozója a HPNCC (hereditary non-polyposis colorectal cancer) és egyéb rákos

megbetegedéseknek 111

.

A hibáspár javítómechanizmus versenghet más javítómechanizmusokkal ugyanazért a

DNS hibáért, amennyiben az szintén egy hibás bázispárosodást hoz létre. Nagy jelentőséggel

bír az, hogy végül melyik mechanizmusra kerül sor. A hibáspár javítás ugyanis több kilobázis

nukleotid eltávolításával jár, ami a sejt számára energetikailag rendkívül megterhelő, és a

genom integritása szempontjából is a legnagyobb veszélyt jelenti. Bizonyos esetekben

azonban kölcsönhatás is lehet a javítómechanizmusok között: a MUTYH DNS glikoziláz az

MSH6 78

, az MBD4 az MLH1 fehérjével képes kölcsönhatni 100

.

1.2.4.4. Nukleotid kivágó javítás

A nukleotid kivágó javítás (nucleotide excision repair - NER) nagyobb, DNS hélixet

torzító módosulások eltávolítására specializálódott, amit nukleotidok közötti keresztkötések és

beékelődő komplexek alakíthatnak ki. A NER-ben résztvevő gének genetikai betegségekért

felelős komplementációs csoportokba tartoznak, mint a xeroderma pigmentosum (XP) és a

Cockayne szindróma (CS). A NER esetében kétféle útvonalról beszélhetünk: a konstitutívan

aktív „global genome” azaz GG-NER-ről és a transzkripcióhoz kapcsolt (transcription-

coupled) TC-NER-ről. A két folyamat a hibák felismerésében különbözik, majd egy közös

útvonalba torkollik. Előbbi során az UV-DDB és XPC-RAD23B, utóbbi esetén az RNS

polimeráz II leállása indikálja a hibát. TC-NER során az E. coli-ban a TCRF, S. cerevisiae-

ben a Rad26, a humán sejtekben a CSA, CSB, XAB2 és HMGN1 fehérjék érzékelik a

transzkripció leállását, indukálják az RNS polimeráz disszociációját, és további NER

fehérjéket toboroznak. Ezt követően mind a GG-, mind a TC-NER azonos útvonalon zajlik le,

mely során a módosulást okozó léziónál a TFIIH széttekeri a DNS-t, és az egyes szálú DNS-

re RPA és XPA fehérjék kötnek. A leválasztott DNS szálat az XPF-ERCC1 és XPG

endonukleázok vágják ki a léziótól 5’ illetve 3’ irányban. A DNS szál újraszintézisét a

replikatív DNS polimeráz δ vagy ε végzi PCNA és RFC függő módon. Ezek mellett a DNS

polimeráz κ részvételére is vannak adatok. A szálvégek összekapcsolását végül a DNS ligáz I

vagy az XRCC1-Ligáz III komplex katalizálja. E. coli-ban a DNS torzulás felismerését az

UvrB végzi UvrA-val komplexálva. Az endonukleáz akivitásért az UvrA és UvrC felelős. A

javítás során E. coli-ban 13, míg eukariótákban 29 nukleotid eltávolítására kerül sor.

Muslicában egyelőre nem sikerült kimutatni TC-NER mechanizmust.


27

A dNTP készletből beépülni képes hibás nukleotidok közül a 8-OH-G esetében vannak

arra utaló jelek, hogy a TC-NER CSA és CSB enzimei részt vesznek annak javításában.

Ennek ellentmond az, hogy a DNS-ben lévő 8-OH-G nem gátolja az RNS polimeráz II-t in

vitro 87,112

.

1.3. A nukleotid metabolizmus szinkronizálása a sejtciklushoz

A DNS szintézis túlnyomórészt a sejtciklus S fázisában történik, ennek az igénynek

megfelelően van szabályozva a dNTP készlet. Replikáció alatt élesztőben háromszorosára,

emlős sejtekben 20-szorosára emelkedik a sejtbeli dNTP koncentráció a G1 fázishoz képest

113. Ezt a sejtek többnyire a nukleotid bioszintézisben részt vevő genek expressziójának

transzkripciós, vagy posztranszlációs módosításával érik el.

1.3.1. Transzkripciós szabályzás

E. coli-ban az RNR expresszió a replikációval összhangban, a DNS szintézis dNTP

igényének megfelelően történik az nrdAB génről. Az rndAB promóteréhez többek közt a

DnaA, a transzkripció incicializálásában kulcsfontosságú fehérje képes kötődni, melynek ATP

kötött formája kis koncentrációban derepresszáló, nagy koncentrációban represszáló hatása

van 114

. S. cerevisiae és Schizosaccharomyces pombe élesztőkben az R1 és R2 expresszió

fluktuációjáért a transzkripció szintjén a Crt1 represszor illetve a MFB aktivátor/Nrm1

represszor faktorok felelősek.

Komplex eukariótákban a G1-S fázis átmenet során aktiválódnak a ciklin D-Cdk4/Cdk6

illletve a ciklin E-Cdk2 kinázok melyek hiperfoszforilálják a Retinoblasztóma (Rb) tumor

szupresszort. A hipofoszforilált Rb számos S-fázis specifikus fehérje expresszióját gátolja az

E2F transzkripciós faktorokkal komplexálódva, egyrészt gátolva az E2F transzaktiváló

hatását, másrészt E2F-el és hiszton deacetilázokkal komplexálva represszálni képes bizonyos

géneket. Az Rb ciklin D illetve ciklin E-függő defoszforilálása az E2F által szabályozott

gének aktivációjához vagy derepresszálódásához vezet. Bizonyos vírus onkoproteinek

(adenovírus E1A, papilloma E7, polioma large T antigen, herpeszvírus ciklin-D szerű fehérje)

szintén képesek az Rb gátlásán keresztül aktiválni az E2F transzkripciós faktorokat, ezzel

osztódásra kényszerítve és onkogén transzformáció felé elbillentve sejteket 115

. Az E2F1 által

regulált gének közé tartozik a DNS polimeráz α, PCNA és a pre-replikációs komplex fehérjéi,

mint az Orc6, de számos dezoxinukleotid bioszintézisben szerepet játszó gén is 116

. Az

onkogén illetve virális stimulusra történő E2F aktiválásával kényszerített sejtosztódással a


28

nukleotid bioszintézis nem tud lépést tartani, ehhez szükség van a c-Myc fehérjére is, mely az

E2F faktorok célfehérjéin kívül egyéb szintézishez fontos géneket is aktivál 117

.

Egérben az RNR R1 alegységének expresszióját az YY transzkripciós faktor

szabályozza, mely S-fázis specifikus. Az R2 alegységet kódoló gén promóterét az NF-Y

képes aktiválni, de csak az ahhoz közeli E2F kötőhely derepresszióját követően. S-fázison

kívül a represszió az E2F4-Rb komplex által valósul meg 118

. Muslicában szintén az E2F

helyeken történő derepresszió teszi lehetővé az S-fázis specifikus expressziót, ahol az E2F2

disszociációja stimuláló hatású 119

. Emlősökben az E2F1 szabályozza a DHFR és a TK

expresszióját is 120

. A dUTPáz promóterében egy NFκB kötőlyely, 3 darab Sp1 és egy E2F

kötőhely található, melyek mindegyike aktiváló hatással van a promóterre. Utóbbihoz az

E2F1 asszociálódik 121

.

Az UNG promótere szintén rendelkezik aktiváló Sp1, AP-2 és derepresszálható E2F1

helyekkel, valamint egy represszálható c-Myc kötőhellyel 122,123

. Ennek megfelelően S-fázis

specifikus expressziót mutat 124

. Muslicában E2F2 szabályozza a TS és a dezoxinukleotid

kináz 119

, valamint az MSH2 gének expresszióját is 125

.

Az egér TS bidirekcionális promóterrel rendelkezik, melyről mindkét irányban

keletkeznek transzkriptumok. A promóter rendelkezik egy potenciális Ets, USF és Sp1

transzkripciós faktor kötő helyekkel, azonban az S-fázis specifikus expresszióért egy intron

felelős, mely feltehetően valamilyen poszttranszkripciós szabályzás alá kerül 126

. S-fázisban

specifikus expressziót mutattak még ki humán sejtekben a TMPK 127

és a MUTYH 128

enzimek is.

1.3.2. Poszttranszkripciós szabályzás

Az S-fázis specifikus expresszióhoz bizonyos esetekben poszttranszlációs módosítások

is hozzájárulhatnak. A G1-fázis előtt az RNR R2 alegysége ubiquitinálódik a Cdh1-APC

(anaphase promoting complex) -el való kölcsönhatásának következtében, majd proteolitikusan

degradálódik. Ehhez a folyamathoz az R2 alegységen található KEN-box kulcsfontosságú

113,118. A TK1 szintén rendelkezik ilyen KEN-box-al, és degradálódik a Cdh1-APC által. A

TMPK expresszió Cdc20 vagy Cdh1-APC mediált proteolízis következtében csökken a késői

M-fázisban. E két fehérje proteolitikus szabályzásának hiányában a dTTP készlet

koncentrációja nagymértékben megnő, ami a fiziológiás dGTP arányokat is felborítja 129

.

Az S-fázis specifikus szabályzás egy másik szintje a metabolikus enzimek

nukleocitoplazmás transzportján alapul. Az RNR kis alegysége a sejtmagba transzportálódik,

S. cerevisiae esetében a Dif1, S. pombe esetén az Spd1 fehérjéknek köszönhetően, korlátozva


29

ezzel az RNR komplex összeszerelődését a citoplazmában, ahol az R1 alegység dúsul. S-

fázisban azonban a Dif1 fehérje koncentrációja alacsony, így az RNR kis alegység újra

megjelenhet a citoplazmában. Az Spd1 egyúttal az RNR aktivitását és összeszerelődését is

gátolja a S. cerevisiae Sml1 fehérjéhez hasonlóan 113

. A ribonukleotid redukcióval ellentétben

a timidin metabolizmus enzimeinek működése többnyire a sejtmaghoz kötött, mint például a

S. cerevisiae TS esetében, mely a nukleáris perifériára lokalizálódik 130

. Humán sejtekben

szintén a nukleáris laminához asszociálódik az SHMT, DHFR és a TS S-fázis és a G2/M

átmenet alatt 31

. Többsejtű eukariótákban a dUTPáz többnyire sejtmagi lokalizációt mutat.

Kollégám, Muha Villő kimutatta, hogy muslica embrióban a sejtciklus során mind a nukleáris

lokalizációs szignállal (NLS) rendelkező illetve nem rendelkező izoforma fluktuál a nukleáris

és citoplazmás kompartmentek között. Azonban csak az előbbi halmozódik fel a sejtmagban

az S-fázis alatt 131

.

1.3.3. A dNTP koncentráció fluktuációjának jelentősége

Értelemszerű, hogy az S-fázisra jellemző magas dNTP készlet a replikációs

mechanimzus igényeit elégíti ki, azonban nem világos, hogy miért van szükség az S-fázis

előtti csökkenésre. S. cerevisiae-ben a dATP visszacsatolás mechanizmusában hibás RNR

túltermelése, mely folyamatosan magas dNTP koncentrációt tart fenn, a sejtciklus

késlekedését eredményezi 132

. A humán sejtekben a TK1 és TMPK G1 fázis előtti

degradációjának gátlása, mely dTTP túlsúlyt okoz, szintén gátló hatással van a sejtpopuláció

növekedésére 129

. S. cerevisiae esetében a sejtciklus gátlás nem függ össze a dNTP készlet

aránytalanságával. A vad típusú promóterrel meghajtott, azaz S-fázis specifikus regulációnak

alávetett, azonban allosztérikus helyeken elrontott RNR mutagén hatású a felborított arányok

miatt, de ha a dNTP komponensek egyike sem esik a vad típusú sejtekben mérhető

koncentráció alá, nem okoz késlekedést a sejtciklusban 6. Elképzelhető, hogy a dNTP

koncentrációjának fluktuációja a replikáció pontos időzítéséhez szükséges. Azonban nem

tisztázott, hogy a replikáció előtt milyen módon érzékeli a sejt a nem megfelelő dNTP

koncentrációkat.

A replikáció inicializálása előtt a sejteknek szükségük van egy csúcsra a dNTP

koncentrációban, aminek a megjelenése gátolható az RNR gátló hidroxiurea segítségével S.

cerevisiae-ben. A dNTP csúcs elmaradása gátolja a G1/S átmenetet, azonban a preiniciációs

komplex összeszerelődésére nincs hatással. A replikáció elongációjának megindulása, azaz a

„firing”, tehát különösen magas dNTP koncentrációt igényel 133

.


30

1.4. A nukleotid metabolizmus hatása a genom integritására

A nukleotid metabolizmus zavara esetén beépült bázismódosulások amellett, hogy

mutagének lehetnek, a genom integritására is veszélyt jelenthetnek. Ez megvalósulhat

egyfelől a replikáció elakadása, másfelől éppen a módosult bázisokat eltávolítani hivatott

javítómechanizmusok által, melyek a közvetlen javítómechanizmusoktól eltekintve mindig

egyes száltörések átmeneti megjelenésével járnak. A sejtek sorsa szempontjából nagy

jelentőségű, hogy a beépült módosult bázisokat az átfedő szubsztrátspecificitással rendelkező

javítómechanizmusok közül melyik távolítja el. A felsorolt javítómechanizmusok közül a

hibáspár javítás energiaigénye a legnagyobb, de a genom integritása szempontjából is a

legkockázatosabb a sejt számára. A javítás köztitermékeként kialakuló több kilobázis hosszú

egyes szálú szakaszok nagyobb mértékben vannak kitéve további károsodásnak, ami akár

DNS kettősszáltörések gyakoribb megjelenéséhez is vezethet. A genom integritásának

csökkenése drasztikus hatással lehet a sejtek életciklusára. A DNS fragmentáció vezethet a

sejtek szeneszcenciájához a telomérák rövidülését okozva, vagy a mitokondriális genom

károsodásának következtében a mitokondriumok számának csökkenésével. A nukleáris

genom károsodása okozója lehet karcinogén elváltozásoknak, de bizonyos sejtválaszoknak

köszönhetően a sejtciklus leállását vagy sejthalált is kiválthat.

1.4.1. A DNS épségének preventív védelme

A módosult bázisok nukleotid trifoszfát metabolitjait hidrolizálni képes enzimek a

javítás szempontjából preventív hatásúak, funkciójuk ugyanis megelőzi a

javítómechanizmusok szubsztrátjainak megjelenését a DNS-ben. A preventív nukleotid

hidrolázok és a DNS javítás egyensúlyának vizsgálatára a legegyszerűbb modellek

létrehozására az E. coli-ban került sor. E. coli-ban a MutT hiányából nem következik a genom

fragmentálódása még a RecA elmutálásával együtt sem 134

. A prokarióta sejtekben a 8-OH-

dGTP kialakulása tehát nem olyan jelentős, hogy a DNS szintézis során beépülve

veszélyezteti a genom épségét. Feltehetően egy további külső oxidatív hatás is szükséges

ahhoz, hogy a DNS oxidált bázistartalma olyan mértékű legyen, aminek javítása a genom

fragmentálódásához vezet. Az RdgB azonban, amennyiben nincs jelen működőképes RecA,

valóban a genom szétdarabolódását okozza. A száltörések megjelenéséért ebben az esetben a

xantin és hipoxantin kivágását katalizáló Endonukleáz V felelős 63

. A humán NUDT16

csendesítése HeLa sejtekben szintén a genom fragmentálódásához vezet 83

.

A dUTPáz az eddig vizsgált organizmusokban esszenciálisnak bizonyult. Eddig E. coli-

ban 135

, élesztőben 136

, Caenorhabditis elegans-ban 137,138

, Trypanosoma brucei-ben 139

és


31

Arabidopsis thaliana-ban 140

karakterizálták a dUTPáz deficiencia következményeit. Ezek

többségében igazolták, hogy a dUTPáz hiánya a genom fragmentálódásával jár együtt. Az E.

coli dUTPáz teljes génjének kiütése nem komplementálható más gének kiütésével 141

. Egyéb

dUTPázt gént érintő mutációk a genom fragmentálódásához vezetnek, amit az UNG

kiütésével komplementálni lehet 135,142

. Emellett a S. cerevisiae és C. elegans UNG

homológjai szintén képesek részben komplementálni a dUTPázt érintő letális mutációt illetve

csendesítést 85,136,137

. Tehát a dezaminált purin és pirimidin bázisok dezoxinukleotid trifoszfát

származékai a többi dNTP komponenshez képest jelentős arányban keletkeznek, ami a

megfelelő nukleotid hidrolázok hiányában a genom integritását veszélyeztetik a funkcionális

DNS javítómechanizmusoknak köszönhetően. A Bacillus subtilis PBS2 fág, mely uracil

szubsztituált genomot tart fenn, a baktériumban ismeretlen mechanizmussal gátolja a dUTPáz

aktivitását, és az Ugi fehérje termelésével az UNG működését a genom fragmentálódásának

elkerülése érdekében 94

.

Az, hogy a dUTPáz rezisztenciát biztosít az 5FU és 5FdU toxicitással szemben, arra

utal, hogy a fluoropirimidinek beépülését is megakadályozza a DNS-be 21,86,140,143–146

. Ez

felveti annak a kérdését, hogy a fluorouracil milyen módon okoz genotoxicitást. A dUTPáz

ugyanis az 5-fluoro-dUTP hidrolízisével az 5-fluoro-dUMP keletkezését katalizálja, ami a

timidilát szintáz inhibitora. Ez alapján a rezisztencia mechanizmusa nem a timidilát

bioszintézis gátlásának mérséklésén alapul. A dUTPáz túltermelés egyéb, más mechanizmusú

TS gátlószerek toxicitását is mérsékelni képes 22,40,139,147

.

Érdekes módon a dUTPáz egyéb genotoxikus hatások ellen is védelmet nyújt, melyek

nem hozhatók szoros kapcsolatba az aktivitásával: a dUTPáz túltermelése élesztőben

rezisztenciát biztosít a hidrogén-preoxid és a kadmium toxicitással szemben. A hidrogén

peroxiddal szemben mutatott védő hatás humán sejtekben is kimutatható 148

. Az e

megfigyelések mögött álló mechanizmus egyelőre nem ismert.

1.4.2. A genom integritását veszélyeztető nukleotid metabolitok

A dNTP metabolizmus enzimeinek gátlása nem szokványos bázisok nukleotid trifoszfát

származékainak megjelenéséhez és a dNTP készlet kényes arányainak felborulásához

vezethet. Sok esetben maga a gátló molekula is beépülhet a DNS-be, mint például az 5-fluoro-

dUMP esetén. Sejtek 5FdU vagy antifolát kezelése a timidilát szintáz gátlás következtében a

dNTP készlet komponenseinek felborulását eredményezi. A dTTP koncentráció

csökkenésével párhuzamosan azonban dUTP is beépülhet a DNS-be.


32

Az E. coli-ban történő Ugi expresszió, mely az UNG specifikus inhibitora, némi

rezisztenciát biztosít az 5FdU-val szemben 149

. S. cerevisiae-ben egy timidilát szintázt érintő

mutáció uracil felhalmozódáshoz vezet a magi és a mitokondriális genomban, egyúttal

növekedési defektust eredményez, azonban utóbbi fenotípus menekíthető az UNG kiütésével

150. Ugyanebben az organizmusban az 5FU és az antifolát aminopterin toxicitást is mérsékli az

UNG funkció elvesztése. 5FU kezelés esetén menekítő hatásúnak bizonyult a FEN1

endonukleáz kiütése is, azonban AP endonukleázok kiütése érzékenyítette a sejteket 40,151

.

Továbbá, a C. elegans UNG csendesítése is menekítő hatásúnak bizonyult az 5FU kezelésre

152.

Érdekes módon, az emlős és csirke sejtekben az UNG szerepe eltérő az előbbiekhez

képest: a timidilát szintáz 5FdU-val vagy antifoláttal történő gátlását nem menekíti az UNG

kiütése vagy gátlása 35,153–156

. Elmondható, hogy emlős sejtekben 5FdU kezelés esetén a DNS-

be beépülő uracil és 5FU kivágását elsősorban az UNG katalizálja, azonban ez a katalízis nem

veszélyezteti a genom integritását. Mégis elegendő ahhoz, hogy a drogkezelt sejtek

genomjában ne legyen kimutatható az uracil, és 5FdU hatására csak UNG deficiens sejtek

genomjában tud felhalmozódni az uracil. Feltehetően sejttípustól függő, illetve törzsek közti

egyedi különbséggel magyarázható az az egyedi megfigyelés amely során az UNG

csendesítése menekítő hatással volt HeLa sejtek 5FdUR kezelésére 124

. A többi uracil-DNS

glikoziláz szerepe az eddigieknél is összetettebb lehet: egér embrionális fibroblaszt sejtekben

a SMUG némi védettséget nyújt 5FdU ellen 154

, a TDG pedig érzékenyít 157

. Az MBD4

kiütése egérben csökkenti az apoptotizáló sejtek számát 5FU kezelést követően 158

. Azonban a

SMUG, TDG és MBD4 kiütésének hatása nem volt kimutatható humán sejtvonalakban sem

5FU, sem 5FdU kezelés esetén, elképzelhető tehát, hogy ezek a jelenségek egér specifikusak

156. Hörcsög ovárium eredetű CHO sejtvonalakban az APE1 katalitikusan inaktív formájának

túltermelése érzékenyít 5FU és 5FdU kezeléssel szemben 159

. A metoxiamin (MX) az AP-

helyekkel reagálva gátolja azok további processzálását az APE1 által. Azonban az MX

kezelés hatása az FdU érzékenységre ellentmondásos: Liu és társai azt tapasztalták, hogy

HeLa sejtek érzékenyebbek lesznek, míg Pettersen és társai szintén HeLa sejtekben ennek

ellenkezőjét, rezisztencia növekedést írtak le 156,160

, Az inaktív APE1 domináns negatív hatása

a CHO sejtvonal 5FdU érzékenységére inkább az előbbi megfigyelést támasztja alá. Szintén

ellentmondásos Pettersen és társai megfigyelése Geng és társai megfigyelésével szemben:

Pettersenék a PARP gátlást menekítő hatásúnak találták az 5FdU toxicitással szemben, míg

Geng éppen ellenkező, érzékenyítő hatást figyelt meg 161

. Hozzá kell tenni, hogy Pettersenék

meglehetősen szokatlan dózishatást írtak le ebben az esetben: az FdU kezelés ugyanis


33

alacsonyabb koncentrációknál nagyobb mértékű toxicitást okozott, mint magasabb

koncentrációknál. Ilyen karakterisztikát Geng és társai nem tapasztaltak. Geng és társai

emellett az XRCC1 és az APE1 csendesítését is érzékenyítő hatásúnak találták az 5FdU

toxicitásra nézve, de az 5FU toxicitásra nem. Ennek az lehet az oka, hogy az 5FU és az 5FdU

kezelés eltérő módon lehet toxikus. Mindkét molekula a sejtbe bejutva és metabolizálva

elsősorban az RNS-be épül be, azonban az 5FdU egy része képes a DNS-be is beépülni 156

.

Tehát az 5FU toxicitás elsősorban nem genotoxikus. Ebből a szempontból tehát Pettersen és

Geng eredményei is megegyeznek: egyik DNS javításban részt vevő komponens hiánya sem

változtatja meg az 5FU toxicitást mértékét. Azok a megfigyelések, melyek szerint a BER

komponenseinek kiütése az előbbiekel szemben befolyásolják az 5FU reziszteciát

magyarázhatóak azzal, hogy különböző sejttípusok máshogy metabolizálják az 5FU-t. A

dUTPáz 5FU citotoxicitással szemben mutatott védő hatása az érintett sejtekben az 5FU

genotoxicitásra utal.

A DNS polimeráz β kiütése menekítő hatásúnak bizonyult egér embronális fibroblaszt

sejtek RTX toxicitására nézve 162

. Mivel a hosszú BER nem feltétlenül igényli a DNS

polimeráz β jelenlétét, elképzelhető, hogy a polimeráz β hiányában mutatott rezisztencia a

rövid BER elmaradásának köszönhető, azaz a rövid BER általi javításnak súlyosabbak a

következményei 163

.

A hibáspárpár javítás MSH2 és MLH1 enzimei kulcsfontosságúak lehetnek a timidilát

szintáz esetén tapasztalható toxicitáshoz, kiütésük nagymértékben növeli a rezisztenciát 5FdU

és RTX-re nézve 54,160,161

. A vastagbélrákos elváltozások 10-15%-ára jellemző a hibáspár

javító enzimeket kódoló kromoszómarészének elvesztése vagy epigenetikus csendesítése, ami

ezeknek a sejteknek rezisztenciát biztosít kemoterápiás kezelésekre. Pettersen és társai

azonban a többi megfigyeléssel ellentétben nem tapasztaltak menekítő hatást az MSH2

kiütését követően az 5FdU toxicitásra nézve 156

, ami lehet annak a következménye, hogy

különböző transzformált sejttípusok máshogy reagálhatnak a kezelésre. Pettersenék

kimutatták, hogy az 5FU szubsztitúciók kivágásában a BER-hez képest nem vesz részt

jelentősen a hibáspár javítás. Azonban a TS gátlás következtében felborult dNTP készlet miatt

számos más konvencionális bázis is hibáspárként épülhet be, aminek a hibáspár javítás által

történő javítása nagymértékben veszélyezteti a genom integritását. Elképzelhető, hogy a

Pettersenék által vizsgált sejtvonalak a dNTP aránytalanságból következő toxicitásra

reszisztensek valamilyen módon. Az egér MBD4 uracil-DNS glikoziláz kiütése esetén

tapasztalt 5FU rezisztencia magyarázható annak kölcsönhatásával az MLH1-el, ami

összekapcsolhatja az BER és a hibáspár javítómechanizmusokat 164

.


34

A dezoxitimidin analóg hmU szintén toxikus emlős sejtek számára, azonban a TS

aktivitásra nincs hatással, azaz a dNTP arányokat feltehetően nem befolyásolja jelentősen.

CHO sejtek hmU kezelése során a genom fragmentációjáért a SMUG bizonyult felelősnek

165,166.

Az alkiláló ágensek (pl. metil-, metán szulfonát azaz MMS) toxicitása ellen a közvetlen

javítómechanizmusok (E. coli AlkB, illetve humán ABH2, ABH3, valamint MGMT) védő

hatással vannak, azonban ezek nem is veszélyeztetik a DNS épségét. Az alkilált bázisokra

specializált MPG DNS glikoziláz szintén protektív az alkiláló külső hatások ellen 60

. A

katalitikusan inaktív APE1 az 5FdU mellett számos alkiláló ágenssel valamint hidrogén-

peroxiddal szemben szintén érzékenyít CHO sejteket 159,167

. Tehát az AP-helyek gyors

kijavítása mind a TS gátlás, mind az alkiláló és oxiadív károsodások után is fontos a DNS

épségének megőrzése érdekében. Az XRCC1 kiütése és a PARP gátlás is érzékenyíti a

sejteket az alkiláló szerekkel szemben 105

. Nehéz azonban magyarázatot találni arra, hogy az

UNG kiütése miért érzékenyíti a sejteket a hidrogén peroxid kezeléssel szemben 168

. Érdekes

módon a DNS polimeráz β a TS gátló drogokkal ellentétben az alkiláló ágensekkel szemben

védelmet nyújt 169

. Bizonyos alkilált bázisok kijavítása az 5FU-hoz hasonlóan a hibáspár

javításnak köszönhetően válhat kritikussá, ennek hiányában a sejtek ellenállóbbá válnak a 6-

oxo-metilguanin kiváltott toxicitásra 170

.

1.5. A DNS károsodás sejtválasz

DNS károsodást kiváltó hatások folyamatosan érik a sejteket, melyeket a preventív és

DNS javító enzimek minimalizálni képesek. Kiterjedtebb károsodás azonban komplexebb,

magasabb szintű sejtválaszt igényel, a gyakori hibák ugyanis számos sejtfunkciót

megzavarhatnak. A genom drasztikus károsodása esetén szükséges lehet a sejtciklus leállítása,

a DNS szintézisben és javításban szerepet játszó fehérjék expressziójának stimulálása és

végső esetben a sejthalál aktiválása. A DNS károsodást ezekkel a folyamatokkal az ún DNS

károsodás sejtválasz (DDR - DNA damage response) kapcsolja össze. A DDR számos

komponense része az ún. integrált stresszválasznak (integrated stress response), ami pl. az

endoplazmatikus retikulum stressz alatt váltódik ki 171

. A DDR-t a DNS kettősszáltörések

vagy a DNS replikáció leállás, lassulás vagy DNS javítási köztitermékek során kialakuló

egyes szálú DNS perzisztens megjelenése képes kiváltani. Az ssDNS és DSB által kiváltott

útvonalak a DDR-en belül nagyrészt elkülönülnek, de részben átfedhetnek (1.3. ábra).


35

A DNS kettős száltörés (DSB - DNA double strand break) érzékelése az ún MRN

komplex (Mre11, Rad50, Nbs1) által történik, amely a sérüléshez toborozza az ATM (Ataxia

telangiectasia mutated) kinázt. Ez inaktív állapotban homodimerként van jelen, majd

aktiváció során transz-autofoszforilálódik, és aktív monomerekre disszociál. Az aktiváció

során az ATM az 1981, 367és 1893-as szerin oldalláncokon fosszorilálódik, melyek közül az

utóbbi kettő nélkülözhetetlen a teljes aktiválódáshoz. Az aktiváció során a Tip60 acetil

transzferáz is acetilálja az ATM kinázt. Az ATM a DSB-hez közve számos szubsztrátot

foszforilál, melyek a hiba közelében komplexálódnak, vagy a foszforilációt követően

disszociálnak és további sejtválaszokat aktiválnak. Ide tartozik a H2AX hiszton, az MRN

komplex Nbs1 fehérjéje, az SMC1 kohezin, a homológ rekombinációban szerepet játszó

BRCA1 és CtIP. Az ATM továbbá foszforilálja a p53 MDM2 és MDMX regulátorait

valamint a p53 fehérjét, utóbbit stabilizálva. Az ATM foszorilálja az útvonal másik fő

fehérjéjét, a Chk2-t a 68-as treonin oldalláncán. A Chk2 ezt követően autofoszforilálódik,

disszociál és további szubsztrátokat foszorilál. A Chk2 szintén foszforilálja a p53 és MDMX

fehérjéket és a BRCA1-et, de szubsztrátja az E2F1 transzkripciós faktor is.

1.3. ábra. A DNS károsodás sejtválasz (DDR) útvonalai

A DNS duplaszáltörés (DSB) által aktiválódó ATM/Chk2 (A.) és az egyes szálú DNS

(ssDNS) által aktiválódó ATR/Chk2 (B.) útvonalalak főbb komponensei és szubsztrátjai.

P: foszforiláció, Ac: acetilálódás.


36

Az egyes szálú DNS (ssDNS) megjelenését az RPA (RPA1, RPA2 komplex) detektálja,

mely beburkolja az egyes szálú láncot. Az RPA-ssDNS komplexhez az ATR (ATM-related)

kináz az ATRIP fehérjével együtt kötődik, majd további mediátorok segítségével aktiválódik.

Ilyen mediátorok a TopBP1, melyet az 9-1-1 (Rad9, Rad1, Hus1) „clamp loader” komplex

kapcsol az ssDNS-hez. További mediátor a replikációs villához asszociált Claspin, a Timeless

és a Tipin, melyek a Chk1 kináz kötését és ATM általi foszforilációját segítik. Az ATR és

Chk1 az aktiváció során a egymást is foszforilálja, valamint a Chk1 autofoszforiláción is

átesik. A Chk1 a 317 és 345-ös szerin oldalláncokon foszforilálódik, ami a C-terminális

domén általi gátlást szünteti meg. Az aktivációt kövezően a Chk1 disszociál, és további

szubsztrátokat foszforilál. A H3 hiszton foszforilációja feltehetően a lókuszról történő

transzkripciót represszálja. Ezen kívül a Chk1 foszforilálja a Rad51 és BRCA2 homológ

rekombinációban részt vevő fehérjéket is. Az ATR illetve a Chk1 foszforilálni képes a DNS

szálak közti keresztkötések javításában és homológ rekombinációban részt vevő Fanconi

Anemia ubiquitin ligáz komplex bizonyos komponenseit (FANCA, FANCE), valamint annak

szubsztrátját (FANCD2, FANCI) 172

. A Clk2 fehérje a Chk1 stabilitásához járul hozzá 173

,

valamint az ATR kinázzal kölcsönhatva asszociálja a Fanconi Anemia komplex FANCM és

FAAP24 komponenseit is 174

. Az ATM-hez hasonlóan az ATR is képes a TopBP1 fehérjéhez

asszociálva foszforilálni a H2AX hisztont a 139-es szerin oldalláncon 175

.

Általánosságban tehát elmondható, hogy az ATM/Chk2 a DSB, az ATR/Chk1 a

replikációs késlekedés és ssDNS expozíció során aktiválódik. Azonban a két útvonal részben

átfedhet: kis valószínűséggel az ATM/Chk2 aktiválódhat az ssDNS jelenlétében. A DSB

során az újravágást követően az ATR útvonal is aktiválódik: az ATM és a BRCA1 a DSB-hez

toborozza a CtIP-t. Utóbbi stimulálni képes az Mre11 endonukleáz aktivitását, amely rövid

ssDNS szakaszokat hoz létre. Ezeket a szakaszokat BLM (Bloom syndrome protein) helikáz

és az Exo1 exonukleáz kibővíti, így az ATR is kötődni képes. A két útvonal együttműködése

ilyen módon tehát a DSB homológ rekombináció által történő javítását teszi lehetővé.

Az ATM/Chk2 útvonal bizonyos tumorokban is előfordul, az útvonalat érintő

homozigóta mutációk nem letálisak. Azonban az ATR/Chk1 útvonal létfontosságú osztódó

sejtek számára. Ez azzal magyarázható, hogy ez az útvonal az S-fázis során folyamatos,

alacsony aktivitást mutat, aminek fontos szerepe lehet a replikáció kontrollálásában 176

. A

Chk1 folyamatos jelenléte szupresszálja a Kaszpáz 2-t. A Kaszpáz 2 önmagában elegendő az

apoptózis kiváltására, ennél fogva a Chk1 hiánya sejthalálhoz vezet 177

.

Az RNR gátló hidroxiurea a korlátozott dNTP koncentrációnak köszönhetően a DNS

replikációt gátolja vagy lassítja. Ennek megfelelően az ATR/Chk1 útvonal aktiválódását


37

figyelték meg humán és C. elegans sejtekben 178,179

. Utóbbi organizmusban az útvonal

aktivációja érdekes módon a WRN helikáztól is függ. További érdekesség, hogy a MUTYH

DNS glikoziláz csendesítése esetén az útvonal aktiválása mérsékeltebb 180

. Az onkogén

aktivált sejtosztódás során, amennyiben a dNTP szintézis nem elégséges a replikációhoz,

szintén megfigyelhető a H2AX hiszton forszorilációja 117

.

C. elegansban a dUTPáz hiány okozta letalitást a Chk1 és a Clk2 csendesítése képes

részben kompenzálni, ami az ATR/Chk1 útvonalra utal 137

. Arabidopsis thaliana-ban a

dUTPáz csendesítése a Rad51 expresszió emelkedéséhez és a homológ rekombináció

gyakoriságának növekedéséhez vezet, ami szintén lehet az uracil szubsztituált genom

hiperaktív javításának köszönhetően aktivált DDR következménye 140

.

A TS inhibitorok ATR/Chk1 útvonal aktiváló hatását számos sejtvonalon

karakterizálták. Mivel a dUTPáz és a TS egymással összekapcsolható funkciókkal bír érdekes,

hogy míg a Chk1 hiánya dUTPáz hiány okozta letalitást menekítette C. elegans-ban, humán

és csirke sejtvonalakban a Chk1 kiütése vagy csendesítése érzékenyít az 5FU toxicitással

szemben 181,182

. A Chk1 részletes kiütése a hibáspár javítás hiányában is érzékenyítő hatású

183. Az 5FU már említett sejttípustól függő genotoxikus hatásának lehet köszönhető, hogy

vastagbélrák sejtvonalakban az ATR az előbbiekkel szemben csak az 5FdU toxicitást

mérsékli, míg az 5FU toxicitást nem 161

. A hibáspár javítómechanizmus szükséges a FdU

kezelés indukált Chk1 foszforilációhoz 160

. Mind az 5FdU, mind az RTX antifolát kezelés a

H2AX hiszton foszforilációját váltja ki humán sejtekben 155

. Az RTX az ATR/Chk1 útvonalat

aktiválja, mely során Rad51 expresszió is stimulálódik. A Rad51 védő hatással bír az RTX

toxicitással szemben 184

. Elképzelhető tehát, hogy az timidin bioszintézis gátlás genotoxikus

következményeit a homológ rekombináció mérsékli.

Az alkiláló környezeti hatások szintén az ATR/Chk1 útvonal aktiválódását okozzák.

Ecetmuslicában alkiláló ágensek hatására megfigyelték a Chk1 foszforilációját és a p53

stabilizálódását 185

. Humán sejtekben kimutatták, hogy az alkiláló drogok hatására a hibáspár

javítás komponensei fizikai interakcióba lépnek az ATR/Chk1 útvonal fontos komponenseivel

186. Az oxidatív stressz is képes DDR sejtválaszt kiváltani: magas oxigén koncentráció és

hidrogén peroxid kezelés mind az ATM/Chk2, mind az ATR/Chk1 útvonalat képes aktiválni

187.

1.5.1. A DNS károsodás aktivált sejtciklus leállás

A DNS károsodás érzékelését követően szükséges a replikáció leállítása, hogy a sejt

időt hagyjon a hibák kijavítására. Mind az ATM/Chk2, mind az ATR/Chk1 útvonal képes


38

leállítani a sejtciklust különböző fázisokban. Az ATM/Chk2 útvonal aktiválta p53 a p21

fehérje indukciója által a G1 stádiumban tudja leállítani a sejtciklust. A p21 a ciklin függő

kináz (Cdk) - ciklin komplexekhez kötve gátolja azok aktivitását. Az ATR/Chk1 útvonal nem

képes a G1 fázis stop-ot indukálni annak ellenére, hogy ebben az útvonalban is leírták a p53

aktivációját 176

. Az ATM/Chk2 útvonal aktivációjára utal, hogy 5FU kezeléssel sikeresen

kiváltottak p53 függő G1 fázis leállást emlőrák sejtvonalban 188

. Antifolát kezelés hatására is

megfigyelték sejtek G1 fázisban történő felsúsulát 189

.

Az S fázis alatt azonban mindkét útvonal képes blokkolni a sejtciklust. Az ATM az

Nbs1 foszforilálásával járul hozzá ehhez, továbbá a sejtciklus leállásához szükséges a

FANCD2 ATM általi foszforilációja is 172

. A Cdc25A foszfatázt mind a Chk2, mind a Chk1

képes foszforilálni. A Cdc25A a foszforiált formában inaktív Cdk2-t defoszforilálja, így

utóbbi asszociálni képes a ciklin E és A fehérjékkel. A foszforilált Cdc25A azonban a

degradálódik, így nem tudja aktiválni a Cdk2-t. Az ATR/Chk1 még ismeretlen

mechanizmusok által képes az S-fázisban lelassítani a replikációs villa mozgását és

megakadályozni az inicializált replikációs origókról induló elongációt („firing”). A redukált

dNTP készlettel rendelkező RNR mutáns S. cerevisiae osztódása az S-fázisban leáll, azonban

ez a blokk feloldható a Chk1 funkcionális homológ Rad53 kiütésével 6. A hidroxiurea

elsősorban S-fázis blokkolóként ismert, mely Chk1 foszforilációt vált ki 190,191

. A TS

csendesítése egér sejtvonalban szintén a sejtciklus leállást eredményezi az S-fázis-ban 192

. A

TS 5FU és antifolát általi gátlása hasonló, Chk1 foszforilációtól függő S-fázis blokkot

eredményez, ami a hibáspár javítómechanizmus kiütésével vagy dTTP hozzáadásával

feloldható 181,182,184,193,194

. A NUDT16 csendesítése humán sejtekben enyhe osztódási gátlást

okoz, ami az S-fázisú sejtek felhalmozódását eredményezi 83

.

A G2 fázis leállítását szintén mindkét útvonal képes kiváltani. Mind a Chk2, mind a

Chk1 foszforilálni képes a Cdc25C foszfatázt. A Cdc25C a Cdk1 (vagy más néven CDC2)

ciklin függő kinázt aktiválja. A foszforilált Cdc25C azonban a 14-3-3 fehérjékkel asszociálva

inaktiválódik. A Chk1 emellett foszforilálja, és ezáltal aktiválja a Wee1 kinázt, ami

inaktiválni képes a Cdk2-t. Bár a Chk1 elsősorban sejtmagi fehérje, a centroszómákban is

jelen van, ahol a ciklin B/Cdk1 komplex aktivációját regulálva, kontrollálva ezzel a sejt

belépését az M-fázisba. Az M-fázisba való belépés gátlása igényli a Clk2-FANCM-FAAP24

komplexet, amely funkció független a Fanconi Anemia ubiquitin ligáz szerepétől 174

. A

hasonlóságok ellenére az ATM/Chk2 és az ATR/Chk1 útvonalak eltérő módon váltják ki a G2

leállást. Az ATM/Chk1 egy azonnali G2 blokkot, míg az ATR/Chk1 hatása hosszabban tartó

G2 felhalmozódást okoz 176

. Humán fibroblaszt sejtekben a hidroxiurea kezeléssel a G2-M


39

átmenetet blokkolták, amely az ATR gátlásával feloldható178

. A hidroxiurea muslica

embrióban a Wee1 kináztól függő módon képes gátolni az M-fázisra jellemző kromatin

kondenzációt 191

. Humán vastagbélrák sejtekben 5FdU hatására indukálható egy hibáspár

javítás független S-fázis lassulás és egy hibáspár javítás függő G2/M sejtciklus blokk 160

.

Alkiláló ágensek hatására humán sejtek szintén G2 fázisban fázisú feldúsulást mutatnak 195

.

1.5.2. A DNS károsodás aktivált nukleotid metabolizmus és javítás

A DNS károsodás során a hiba gyors kijavítása és az érintett szakasz újraszintézise

szükséges. Ennek érdekében a DDR gyakran indukálja a dNTP szintézis és a DNS javítás

fehérjéinek termelődését vagy relokalizációját.

A dNTP készlet koncentrációja élesztőben négyszeresére növekszik DNS károsodás

hatására az S-fázishoz képest. Ez többnyire az RNR szabályzása által valósul meg. A S.

cerevisiae ATR homológ fehérjéje (Mec1) aktiválódik DNS károsodás hatására és

foszforilálja a funkcionális Chk1 homológját (Rad53). A Rad53 stimulálja a Dun1 fehérjét

amely foszforiláció által inaktiválja a Crt1 fehérjét, amely represszálni képes az RNR géneket.

Emellett a Crt1 a represszora az FSH3 génnek is, ami feltehetően egy dihidrofolát reduktáz. A

Dun1 emellett az RNR inhibitor Sml1 degradációját is serkenti, valamint a Dif1

foszforilálásával megakadályozza az RNR kis alegységének sejtmagi transzportját. Az S.

pombe ATR homológ fehérjéje (Rad3) hasonló elven regulál. A Rad3 a Cds1 fehérjét

aktiválja, mely az RNR R1 alegység génjét represszáló Nrm1 promóterről történő

disszociációját váltja ki.

Emlős sejtekben p53 hatására sokszorosára indukálódik az R2 paralóg p53R2

expressziója, így az funkcionális RNR komplexet képes alkotni az R1 alegységgel. Ennek

ellenére a dNTP készlet koncentrációjának emelkedése nem figyelhető meg DNS károsodás

hatására 113

. Azonban az RNR a DNS károsodást követően az érintett helyeken

akkumulálódik, ezáltal feltehetően a dNTP koncentráció lokális feldúsulásához járul hozzá.

Az RNR DNS károsodás fókuszpontokhoz történő lokalizációja a Tip60 acetil transzferáz és

az R1 alegység kölcsöhatásától függ 113,196

. Ez a megoldás annak tükrében is előnyösebb lehet

a sejt számára annál, mintha a dNTP készletet az egész sejtben növelné, mert nem módosítja a

dNTP koncentrációk sejtciklustól függő koncentrációját, ami, mint ahogy korábban be lett

mutatva, a G1-S fázis átmenethez létfontosságú (lásd. 1.3.3. fejezet). A

rekomartmentalizációra egy másik példa az NDPK sejtmagba irányuló transzportja UV és

hidrogén peroxid kezelés hatására humán sejtekben 197

. A TS és DHFR aktivitásának


40

stimulálódását is megfigyelték röntgen besugárzást követően egérben 198

. A TS expressziója

5FU kezelés hatására is stimulálódik 199

.

A DDR hatására ATM vagy ATR függő módon stabilizálódik az E2F1, ami az általa

regulált gének átíródását is aktiválja 200

. Ez tapasztalható például humán sejtek 5FU kezelése

esetén 188

. Mivel számos dNTP metabolizmusban érintett gén promótere E2F1 által regulált

(lásd. 1.3.1. fejezet), ezek aktiválása is megtörténhet. Az E2F1 a Chk2 mellett az ATM vagy

az ATR által is foszforilálódhat, azonban a DDR hatására számos más poszttranszlációs

módosuláson is áteshet 201

. A humán dUTPáz promótere rendelkezik aktiválható E2F1

kötőhellyel, azonban érdekes módon az enzim expressziója csökkenést mutat DNS-t károsító

hatásokat követően. Ez annak köszönhető, hogy a dUTPáz promótere a p53 által

represszálható 121,202

. Azonban a p53 175-ös hisztidin oldalláncát érintő mutáció esetén

aktiváló hatás tapasztalható 144

. A humán UNG expresszió E2F1 által szabályzott, azonban

különböző sejttípusok eltérő módon reagálnak az 5FdU kezelésre: bizonyos sejttípusok az

UNG termelődés gyors növekedésével, majd repressziójával (humán fibroblaszt sejtvonalak),

mások az UNG repressziójával (HT29) reagálnak, valamint vannak olyan sejttípusok,

amelyekben nem változik a drogkezelés hatására az UNG kifejeződés (HeLa) 124

. A

különbség annak is betudható, hogy a transzformált sejtek expressziós profilja gyakran

jelentősen eltér a normálistól.

A DNS károsodás hatására az UNG transzkripciós változások mellett a lokalizáció

megváltozásával is reagálhat. A humán UNG N-terminális része a PCNA mellett az ssDNS-t

beburkoló RPA fehérjével is képes kölcsön hatni. Ennek köszönhetően hidroxiurea által

indukált DNS károsodás helyén fókuszpontokban megjelenik 95

.

1.5.3. A DNS károsodás által kiváltott sejthalál

A DNS károsodást követően aktivált DDR a sejtciklus leállításával és a DNS javítás

serkentésével a sejt túlélését segíti, azonban aktivál pro-apoptotikus útvonalakat is. Mind az

ATM/Chk2, mind az ATR/Chk1 útvonal aktiválódása esetén megfigyelhető a p53 aktivációja.

Muslicában a p53 aktiválja az apoptózis indukáló Hid, Grim és Reaper géneket, melyek az

anti-apoptotikus IAP1-et gátolják. Gyakran megfigyelték, hogy a DNS károsodás gyakran p53

függetlenül is képes sejthalált kiváltani. A p53 alternatívája ebben az esetben a p53 családba

tartozó p73 lehet, amely a p53-hoz hasonló módon képes kiváltani apoptózist. Mind a p53,

mind a p73 aktiválódhat az E2F1 transzkripciós faktornak köszönhetően, azonban eltérő

mechanizmussal. Az E2F1 aktiválni képes a p14ARF

expresszióját, amely gátolni képes az

MDM2 mediált p53 degradációt. Az E2F1 emellett a p73 promóterét is képes aktiválni. A p73


41

közvetlenül foszforilálódhat a Chk1 által a 47-es szerin oldalláncon. A p73 további fontos

aktivátora a c-Abl kináz, melyet az ATM képes foszforilálni, de az ATR/Chk1 útvonal is

képes stimulálni. A c-Abl a 99-es treonin oldalláncon foszforilálja a p73-at, de visszahat az

ATM/Chk2 és ATR/Chk1 útvonalakra is 203

.

A p53 és a p73 alapvetően kétféle úton képes apoptózist kiváltani. Az ún. „Extrinsic”

útvonal során a CD95 sejthalál receptor expresszióját illetve sejtfelszíni prezentációját

stimulálják, mely a CD95 ligand kötésével a DISC (death-inducing signaling complex)

komplexet alakítja ki. A DISC a FADD adaptor közvetítésével a Kaszpáz 8 és 10 iniciátor

kaszpázokat aktiválja. Az iniciátor kaszpázok a Kaszpáz 3, 6 és 7 effektor kaszpázokat

stimulálják. Az „Intrinsic” útvonal során a p53 vagy a p73 a Noxa és a PUMA fehérjék által

közvetített módon a Bax fehérje mitokondriális transzlokációját stimulálják. Ennek hatására a

mitokondriumból kiszabadul a Citokróm C, mely az Apaf1 fehérjével és a Kapszpáz 9

iniciátor kaszpázzal komplexálva apoptoszómát hoz létre. Az effektor kaszpázokat ebben az

esetben az apoptoszóma aktiválja 177,204

.

Genotoxikus stressz hatására egyéb lehetséges p53 független útvonalakat is

megfigyeltek. A stressz aktivált mitogén-aktivált kinázok közé tartozó JNK és p38 kinázok az

apoptózis intrinsic útvonalát képesek aktiválni 170,205

. A p38 emellett a p53 hiányában a

STAT1 transzkripciós faktor foszforilálásával a CD95 sejtfelszíni expresszióját is stimulálni

képes 206

. Az p38 vagy a JNK aktiválási mechanizmusa az ATM/Chk2 és ATR/Chk1

útvonalak által nem ismert, azonban az ATR/Chk1 útvonalak esetén megfigyelték 207

. Az

egyik lehetséges mechanizmus a GADD45 fehérjén keresztül képzelhető el. A GADD45 egy

p53 által aktiválható fehérje, azonban a BRCA1 is stimulálhatja 208

.

A kaszpáz 2 az egyetlen sejtmagban folyamatosan jelen lévő prokaszpáz, aktivációjával

p53 független apoptózist lehet kiváltani. Bizonyos DNS károsító hatásokra sikerült kaszpáz 2

függő sejthalált kiváltani, azonban az aktiváció mechanizmusa egyelőre ismeretlen 170

.

A TS csendesítése a p53 stabilizálásához és a Kaszpáz 3 effektor kaszpáz

aktiválódásához vezet humán sejtvonalban 192

. A TS 5FU, 5FdU és antifolát általi gátlása

estén is kimutatható a p53 stabilizálódása, ami az poptózis intrinsic és extrinsic útvonalát is

stimulálja 188,189,209

. Az 5FU többi TS gátló droghoz képest eltérő hatásmechanizmusára utal,

hogy csak az RTX és 5FdU kezelésre történő p53 és CD95 indukciót mérsékli a TS

túltermelése 193

. Az RTX-el kezelt sejtek érzékenyebbek a CD95 aktiválására, azonban 5FU

kezelés esetén ez az érzékenyítés sejttípus függő. A CD95 aktivált apoptózis érzékenyítése TS

gátlás esetén nem feltétlenül a CD95 receptor expressziójának növekedésével, hanem annak

sejtfelszíni prezentálásával valósulhat meg, ami 53 független, STAT1 függő folyamat 206,210

.


42

A FdUR kezelés timidin hozzáadásával szupresszálható, p53 és CD95 független apoptózist is

képes kiváltani 211

. A CD95 mellett egyéb sejthalál receptorok is érzékenyíthetik a sejteket a

TS gátlására: vastagbélrák sejtek interferon gamma kezelése antifolát által kiváltott sejthalálra

érzékenyít 212

. A Chk1 csendesítése szintén érzékenyíti a sejteket az 5FU által kiváltott

apoptózisra, amely során mind az intrinsic, mind az extrinsic útvonal effektor kaszpázai

aktiválódnak, de a kaszpáz 8 aktiválódik előbb 181

.

Bár a genotoxikus stressz többnyire apoptózist vált ki, C. elegans-ban kimutatták, hogy

a dUTPáz csendesítést követően autofágiára is jellemző gének aktiválódnak. A sejthalál

dUTPáz hiányában nem függ a p53-tól, de az Apaf1 és kaszpáz aktivitás szükséges hozzá 138

.

Az alkiláló metil-metánszulfonát muslicában a p53 aktivációját váltja ki 185

. Humán

sejtekben alkiláló ágensek hatására stabilizálódik a p73 és aktiválódik a GADD45α hibáspár

javítás és c-Abl függő módon 195

.

Oxidatív stressz hatására a p53 ATM függő módon stabilizálódik, valamint ATR függő

módon foszforilálódik 187

. Szinglet oxigén és hidrogén peroxid kezelés humán sejtekben a p38

fehérje foszforilációhoz és genom apoptotikus fragmentálódásához vezet. A p38 gátlásável ez

a fragmentáció megszüntethető a szinglet oxigén kezelés esetén. Mindkét esetben az intrinsic

útvonal érintett az apoptózisban, ugyanakkor a kaszpáz 8 is szükséges a sejthalálhoz 213

.

CÉLKITŰZÉSEK

43

2. Célkitűzések

A dNTP metabolizmuson belül a timidilát bioszintézis jól elkülöníthető, mégis

esszenciális komponens. Ennél fogva, különösen a TS útvonalban betöltött megkerülhetetlen

szerepének köszönhetően nagy érdeklődésre tart számot. A TS fontos terápiás célpont,

gátlásával alapvető sejtfunkciók, a DNS replikáció, a sejtosztódás és a sejthalál

befolyásolható. A számos szerteágazó hatás szétválasztása tanulsággal szolgálhat a különböző

sejtfunkciók vizsgálatához és a genom metabolizmus mélyebb megértéséhez. A timidilát

bioszintézis elkülönült útvonalai például felvetik a timinmentes világ lehetőségét, ahol az

RNS-hez hasonlóan a DNS timin bázisai uracillal szubsztituáltak. Néhány bakteriofág szolgál

példaként arra, hogy ez lehetséges élő rendszerekben, de a genomi uracil szubsztitúció

korlátozott megjelenése összetettebb organizmusokban is érdekes lehet. A bevezetés alapján

elmondhatjuk, hogy az uracil genomi felhalmozódását elsősorban két enzim korlátozza, a

dUTPáz és az UNG. Ezek mellett egy kérdéses szereplő lehet a hibáspár javítómechanizmus,

amely gerincesekben a TS gátlással szembeni érzékenység egy fontos komponensének tűnik.

Nagy vonalakban megfogalmazható célom olyan élő rendszerek vizsgálata, melyekben a fenti

szereplők szerepe vizsgálható az uracil-szubsztituált genom fenntarthatósága szempontjából.

Az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) egy olyan teljes átalakulással fejlődő rovar,

melynek egyedfejlődési stádiumai embrionális, három lárvális, báb és felnőtt stádiumokra

osztható. A lárvális struktúrák kialakulása az embrionális stádiumban történik. A lárvák

szövetei a funkcionális differenciált, és a nem differenciált imaginális prekurzor szövetekre

osztható. A differenciált lárvális szövetek bár nem osztódnak, azonban a sejtek az

endoreplikációnak köszönhetően növekednek. Ilyen módon alakulnak ki a lárvális nyálmirigy

politén kromoszómái 214

. Ezzel szemben az imaginális szövetek (például imaginális korongok,

imaginális gyűrűk vagy a bél imaginális szigetei) folyamatos osztódásban vannak, és csak a

báb stádiumban differenciálódnak. A báb stádiumban bekövetkező metamorfózis sokat

tanulmányozott jelenség. Ebben a stádiumban a Hid, Grim és Reaper fehérjék átal irányított

módon a differenciált lárvális szövetek elhalnak.

Az ecetmuslica nem rendelkezik az UNG enzimmel, azaz az uracil felhalmozódását a

DNS-ben csupán a másik két DNS glikoziláz, a SMUG és a Thd1 korlátozhatja. Kollégám,

Békési Angéla kimutatta, hogy muslicában a dUTPáz expresszió csupán bizonyos

egyedfejlődési stádiumokra és szövetekre jellemző 215

. Az embrióban mutatható ki

legnagyobb mennyiségben a dUTPáz fehérje, aztán a lárvális stádiumok alatt drasztikusan

lecsökken. Az ezt követő báb stádiumban újra megerősödik a dUTPáz expressziója, kifejlett

CÉLKITŰZÉSEK

44

állapotban azonban csak a nőstényekben kimutatható. A lárvális stádiumok alatt a dUTPáz

csak az imaginális korongok szöveteiben kimutatható. A kifejlett állatokban az ováriumokban

expresszálódik a dUTPáz, ahol anyai hatással az dUTPáz mRNS az embrióba is eljut 215

. A

lárvális szövetek tehát heterogén módon expresszálják a dUTPázt amellett, hogy az UNG

sincs jelen. Feltételezhetjük, hogy a dUTPázt nem expresszáló differenciált lárvális szövetek

genomjában dúsul az uracil a dUTPázt expresszáló imaginális primordium szövetekéhez

képest. Az ecetmuslica lárvális szövetei ideális modellként szolgálhatnak az uracil-

szubsztituált genom funkcionális vizsgálatához. Dolgozatomban mindezek alapján az alább

megfogalmazott problémák és kérdések megoldását tűztem ki célul:

1. A vizsgálatok kiterjesztéséhez mindenekelőtt szükséges egy megbízható módszer a

genombeli uracil kvantitatív kimutatására, amivel vizsgálható a sejtek dUTPáz illetve uracil-

kivágó javítás hiányos állapota. Célul tűztem ki egy kvantitatív módszer kifejlesztését és

optimalizálását a DNS-ben található uracil bázisok kimutatására.

2. A kifejlesztett módszerrel vizsgálni kívánom a muslicában megfigyelhető dUTPáz

expressziós mintázat hatását a genom uracil tartalmára. Mivel az egyedben a dUTPáz

expresszió térben és időben is változik, különböző egyedfejlődési állapotokat és szöveteket

kívánok összehasonlítani. Ezzel összefüggésben vizsgálni szeretném, hogy a dUTPáz

csendesítésével lehetséges-e növelni az uracil bázisok előfordulási gyakoriságát a

szövetekben.

3. Azok a korábbi kísérletes adatok, amelyek azt mutatják, hogy a dUTPáz expresszió

elsősorban a muslica nem differenciált szöveteire korlátozódik összeegyeztethető azokkal az

irodalmi áttekintésben bemutatott megfigyelésekkel, hogy a dNTP metabolizmus enzmei a

sejtciklus S-fázisában termelődnek. Ezért gyakran a transzkripciót reguláló Rb-E2F rendszer

felelős, mint ahogy a humán dUTPáz esetén is (lásd. 1.3.1. fejezet). Vizsgálni kívánom az

ecetmuslica dUTPáz expressziós mintázatáért felelős transzkripciós regulációs mechanizmust,

vizsgálataimat minél több szövetre igyekszem kiterjeszteni.

A dNTP metabolizmus sejtciklus-függő szabályozásának a célja, mint ahogy az

irodalmi áttekintésben is bemutattam, feltehetően a dNTP koncentráció fluktuációjának

kialakítása, ami a replikáció helyes inicializálását szabályozza (lásd. 1.3.3. fejezet). Ehhez a

folyamathoz nem tisztázott a dUTPáz hozzájárulása. Nem tisztázott azt sem, hogy muslicában

miért lehet megkülönböztetett a dUTP DNS-ből való kizárása szempontjából a differenciált és

CÉLKITŰZÉSEK

45

az osztódó szövet különösen arra való tekintettel, hogy ebben az organizmusban nincs jelen

jól karakterizált uracil-DNS intoleranciát kiváltó mechanizmus. A muslicában megfigyelt

dUTPáz expressziós mintázat egyedfejlődésben betöltött szerepének vizsgálata a gén

csendesítésével vagy kiütésével, illetve a fehérje differenciált szövetekre is kiterjedő

túltermelésével valósítható meg. Kollégáim, Muha Villő és Békési Angéla kimutatták, hogy

az ecetmuslica dUTPáz csendesítése végzetes következményekkel jár a lárvális stádiumok

végén. Hogy ezt a megfigyelést kiegészíthessük, célul tűztem ki olyan állatok

karakterizálását, melyekben a dUTPáz termelődését differenciált szövetekben stimulálom.

4. A dUTPáz expresszió genom integritását védő hatását eddig E. coli, S. cerevisiae,

Trypanosoma brucei, C. elegans és Arabidopsis thaliana organizmusokban vizsgálták.

Utóbbiban és humán sejtekben csupán a TS gátlás viszonylatában sikerült kimutatni a

dUTPáz jelentőségét. Az RNS interferencia segítségével lehetőségünk nyílt muslicában is

tanulmányozni a dUTPáz genom épségét védő hatását. Muha Villő és Békési Angéla

megfigyelése alapján a dUTPáz minden szövetre kiterjedő csendesítése az egyedfejlődés

leállását és letalitást eredményez a késői lárva és a korai báb állapotban. Ez azt jelenti, hogy

bár a dUTPáz hiánya tolerálható a differenciált lárvális szövetekben, a metamorfózison áteső

szövetek számára nélkülözhetetlen. Kérdés, hogy milyen módon eredményezi a dUTPáz

hiánya a fejlődési defektust, és hogy van-e hozzá köze genom integritás csökkenésének a

DNS esetlegesen feldúsult uraciltartalmának köszönhetően. Fel szeretném tehát deríteni a

letalitásért felelős molekuláris mechanizmust.

Az a megfigyelés, hogy a dUTPáz expresszió védelmet nyújt a TS gátló drogokkal

szemben, arra utalhat, hogy a DNS-be épült uracil vagy 5FU okozza a toxicitást. A hibáspár

javítás humán és csirke sejtek érzékenységhez való hozzájárulása (lásd. 1.4.2. fejezet) arra

utal, hogy ezek a bázisok hibáspárként jelennek meg a DNS-ben. A hibáspárokat a dTTP

hiány miatt aszimmetrikus dNTP készlet jelenlétében hozhatják létre a DNS polimerázok,

azonban ilyen körülmények bármilyen bázis hibás beépülését is katalizálhatják. A kérdés

tehát az, hogy a beépült módosult bázisok, vagy a dNTP aránytalanság okozza a TS gátlás

esetén megfigyelhető toxicitást. Előbbi kapcsán a dUTPáz szerepe értelmezhető, de az utóbbi

esetén nem. Ugyanis a TS gátlása céljából gyakran alkalmazott 5FdU kezelés során a

nukleotid metabolizmus során keletkező 5-fluoro-dUTP-t a dUTPáz éppen a TS gátló

molekulává alakítja (lásd. 1.2.3. és 1.4.1. fejezetek). A kérdés megválaszolásához a dUTP

koncentrációt kívánom megnövelni emlős sejtekben a dUTPáz enzimfunkció kiiktatásával

vagy a sejtek nukleozidos kezelésével, és vizsgálni kívánom azt, hogy mindez mindez miként

CÉLKITŰZÉSEK

46

befolyásolja a TS gátlószerek toxicitását. Kísérleteimtől azt várom, hogy a dUTP

koncentráció növelésével kompenzált dNTP hiány hatását a hibáspároktól függetlenül és a

DNS-be épült módusult bázisok tulajdonságaitól függően tudom vizsgálni.

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

47

3. Anyagok és módszerek

3.1. Nukleinsav izolálás és a plazmidok létrehozása

Név Szekvencia Specificitás

pBS-Fw ATAGGGCGAATTGGGTACCG pBlueScript SK+

pBS-Rev AAAGGGAACAAAAGCTGGAGC pBlueScript SK+

d1Fw CGTGCAGAAGATCTTGCGGATTCAGC

Drosophila

melanogaster 2L

kromoszóma;

GeneID:

34528,34529

d2Fw GGGGTACCCGTGCTAAATAGAGGTGTGTTAATCAAC

TAC

d3Fw GGGGTACCGTTGCTTATCAGGGTTGGTTGTGATTGG

d1aRev GGATCCGCAGAATTCTGGTCTGAAAATAACGCGG

d1bRev CGGGATCCGCAGAATTCTGGTCTGAAAATAACGCGG

d2Rev CGGGATCCCTACCAAAAAATCTTAAGTCAGCTTTGC

d3Rev CGGGATCCAATTGGCGGACTTCCAGTGTTGC

DRE1Fw CAACTACAATAGGCTCGATATATCGATAGGGTTGCT

TATC

DRE1Rev GATAAGCAACCCTATCGATATATCGAGCCTATTGTA

GTTG

DRE2Fw CAACTACAATAGTATCGATAGCTCGATAGGGTTGCT

TATC

DRE2Rev GATAAGCAACCCTATCGAGCTATCGATACTATTGTA

GTTG

DRE12Fw CAACTACAATAGGCTCGATAGCTCGATAGGGTTGCT

TATC

DRE12Rev GATAAGCAACCCTATCGAGCTATCGAGCCTATTGTA

GTTG

bgaldFw CGGGATCCGGGTGCCACGAAAATTGTGCAC

bgaldRev GGGGTACCGCAGAATTCTGGTCTGAAAATAACGCGG

DmDut_attB1Fw GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCCAC

CATGCCATCAACCGATTTCG Drosophila

melanogaster 2L

kromoszóma;

GeneID: 34529 DmDut_attB2Rev

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCGTAGC

AACAGGAGCCGG

3.1. táblázat. Klónozáshoz használt primerek

3.1.1. Felhasznált Escherichia coli törzsek és a pBS-dutP plazmid létrehozása

A plazmidok termelése XL1-blue vagy One Shot Omni MAX 2 T1R (Invitrogen)

törzsekben történt. A pDONR221 Gateway entry vektor One Shot ccdB Survival 2 T1R

(Invitrogen) sejtekben lett termelve. Plazmidok uraciltartalmának meghatározásához a pBS-

dutP plazmidot XL1-blue, BL21(DE3) Ung-151, és CJ236 (dut-1, ung-1) termeltem, majd

overnight kultúrából izoláltam. A genom uraciltartalmának meghatározásához XL1-blue,

BL21(DE3) Ung-151, és CJ236 (dut-1, ung-1) törzseket növesztettem a stacioner vagy


48

exponenciális (OD600=0,5) fázisig. A az exponenciális fázisban gyűjtött BL21(DE3) Ung-151

sejtek egy részét 30,7 vagy 61,3 μM 5FdU (Sigma-Aldrich) jelenlétében növesztettem. A

sejtek Luria Broth (LB) médiumban lettek növesztve 37°C-on.

A pBS-dutP plazmid létrehozásához ecetmuslicából izolált genomi DNS-t templátként

használva a d1Fw és d1aRev primerekkel (3.1. táblázat) felszaporítottam a Drosophila

melanogaster dUTPáz géntől (CG4584) 5’ irányban található régiót (a másik érintett gén az

ellentétes orientációjú Art8, azaz CG16840). A termék 5’ végeit Polinukleotid kinázzal

(Fermentas) foszforiláltam, majd EcoRV emésztett pBlueScript SK+ plazmidba építettem

tompa végű ligálással. Restrikciós próbaemésztéssel és szekvenálással meggyőződtem róla,

hogy a fragmens a dUTPáz gén iránya alapján a plazmiddal azonos orientációban épült be. A

klónozáshoz a Fusion High Fidelity DNS polimerázt (Finnzymes) és New England Biolabs

(NEB) restrikciós enzimeket és DNS ligázt használtam.

3.1.2. DNS tisztítás

Plazmidokat kis mennyiségben a Qiagen Plasmid Miniprep Kit-el, nagyobb

mennyiségben a PureYield Plasmid Midiprep System (Promega) -el tisztítottam. Genomi

DNS-t a MasterPure DNA Purification Kit-el izoláltam. DNS fragmentumok gélből történő

izolálása a Qiagen Gel Extraction Kit-el történt. Az DNS koncentrációját Nanodrop ND-1000

spektrofotométerrel (Thermo Scientific) mértem meg.

3.1.3. Uracil-szubsztituált DNS fragmentumok előállítása PCR-el

Különböző dUMP tartalmú DNS fragmentumok előállítása PCR-el történt a pBS-dutP

plazmidrot templátként használva 50 μl végtérfogatban. A reakcióhoz a RedTaq DNS

polimerázt (Sigma-Aldrich) és 200-200 nM pBS-Fw és pBS-Rev primereket használtam (3.1.

táblázat). A reakcióban 200-200 nM dATP, dGTP, dCTP és 200 nM dUTP+dTTP keverék

volt jelen (Fermentas). A dUTP/dNTP arány a következő volt a különböző mintákban: 0; 0,1;

0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 2; 3; 4; és 5%. Hogy az izotóptartalom segítségével is ellenőrizni tudjam

a dUTP beépülést, a 0,1 és 0,2% dUTP/dNTP arányú minták egy részében a dUTP 10%-a, a

0,4; 0,8; 1; 2; 3; 4 és 5% dUTP/dTTP arányú minták egy részében pedig a dUTP 1%-a

triciummal jelölt dUTP[5-3H] (American Radiolabeled Chemicals Inc.) volt. A PCR reakció

körülményei a következők: 95°C 30 másodperc; majd ezt követően 35 ciklusban 95°C 30

másodperc; 55°C 1 perc; 72°C 1 perc; végül 72°C 10 perc. A PCR terméket gélből

tisztítottam, koncentrációját Nanodrop ND-1000 spektrofotométerrel (Thermo Scientific)

megmértem.


49

3.1.4. Genomi DNS minták előkészítése az uracil PCR-alapú kimutatásához

A genom uraciltartalmának PCR alapú kimutatásához az E. coli a glicerinaldehid-

foszfát dehidrogenáz (GAPDH), az egér dUTPáz és a muslica dUTPáz - Art8 génjeit

kívántam felszaporítani. Ahhoz, hogy a reakciókhoz feldúsítsam a templátként hasznosítható

fragmentumokat, a genomi DNS-t olyan restrikciós enzimekkel kezeltem, amelyek a

genomban körbeveszik a felszaporítandó régiót. Ezért az E. coli genomi DNS-t NdeI, az egér

genomi DNS-t EcoRI, a muslica genomi DNS-t NheI enzimekkel emésztettem. Az emésztett

genomot 1%-os agaróz gélen elválasztottam, majd abból a felszaporítandó fragmentumnak

megfelelő méretű frakciót izoláltam. Ez az E. coli esetén kb. 5; egér esetén 1,5; muslica esetén

4-5 kilobázisos tartomány volt.

3.1.5. Promóter - riporter rendszerek létrehozása

3.1.5.1. EGFP riporter rendszerek

pEGFPd: A promóter nélküli riporter létrehozásához a pEGFP-N3 (Clontech) plazmidot

NheI és NdeI enzimekkel emésztettem, a szálvégeket Klenow enzimmel feltöltöttem, és

ligáltam. Az így kapott plazmidban el lett távolítva a CMV promóter jelentős része.

pEGFPd-dutP: A pBS-dutP plazmidból KpnI és BamHI restrikciós enzimek

segítségével izoláltam a dUTPáz feltételezett promóter szekvenciáját, és azt a pEGFPd

plazmidba klónoztam ugyanazokat a restrikciós endonukleázokat használva.

pEGFPd-dutPb: A pEGFP-dutP plazmidot BglII enzimmel emésztettem, a vektort

izoláltam majd a végeket újrazártam.

pEGFPd-dutP2, pEGFPd-dutP3: A pBS-dutP plazmidról a d2Fw illetve d3Fw forward

és d1bRev reverz primerek segítségével (3.1. táblázat) felszaporított fragmentumot KpnI és

BamHI hasítóhelyekkel építettem be a pEGFPd plazmidba.

pEGFPd-dutPx1 és pEGFPd-dutPx2: A pBS-dutP plazmidról a d1Fw forward, és a

p2Rev illetve p3Rev primerekkel (3.1. táblázat) felszaporított fragmenst KpnI és BamHI

hasítóhelyekkel építettem be a pEGFPd plazmidba.

pEGFPd-dutP-DRE1, pEGFPd-dutP-DRE2, pEGFP-dutP-DRE12: A pEGFPd-dutP

plazmidon QuickChange helyspecifikus mutagenezist hajtottam végre a DRE1Fw és

DRE1Rev, valamint a DRE2Fw és DRE2Rev primerpárokkal (3.1. táblázat). Az egyik

mutagenezis során kapott pEGFPD-dutP-DRE1 plazmidot további mutagenezissel, DRE12Fw


50

és DRE12Rev primerpárok felhasználásával mutagenizáltam, és alakítottam át pEGFPd-

DRE12 plazmiddá.

3.1.5.2. Luciferáz riporter rendszerek

pRL-Opi: A pIZ/V5-His plazmidból BamHI és SalI restrikciós enzimek segítségével

izoláltam az OpiE2 promótert, majd azt a BglII és SalI emésztett pEGFP-N3 plazmidba

ligáltam. Az így kapott pEGFP-N3-OpiE2 plazmidból NheI és BamHI enzimekkel kivágott

fragmentumot ligáltam az NheI, BglII emésztett pRL-TK (Promega) plazmiddal.

pGL3: Promega promóter nélküli plazmid.

pGL3-dutP, pGL3-dutP2, pGL3-dutP3, pGL3-dutPx1, pGL3-dutPx2, pGL3-dutP-

DRE1, pGL3-dutP-DRE2, pGL3-dutP-DRE12 : A pEGFPd-dutP, pEGFPd-dutP2, pEGFPd-

dutP3, pEGFPd-dutPx1, pEGFPd-dutPx2, pEGFPd-dutP-DRE1, pEGFPd-dutP-DRE2 és

pEGFPd-dutP-DRE12 plazmidokból a promótert kódoló fragmentumot KpnI és BamHI

enzimekkel kivágtam, és a KpnI, BglII enzimekkel emésztett pGL3 plazmidba ligáltam

pGL3-dutPb: A pGL3-dUTP plazmidot KpnI és BglII enzimekkel emésztettem, és a

vektort izoláltam, majd újrazártam.

3.1.5.3. β-galaktozidáz riporter rendszerek

pCAUG-dutP, pCAUG-dutP-DRE12: A pEGFPd-dutP és pEGFP-dutP-DRE12

plazmidokat templátként felhasználva a bgaldFw és bgaldRev primerpár segítségével (3.1.

táblázat) PCR reakcióban felszaporítottam a dUTPáz feltételezett promóterét. A

fragmentumot BamHI és KpnI emésztést követően az ugyanezekkel az enzimekkel emésztett

p{CaSpeR-AUG-betagal} plazmidba építettem így megkapva a p{CaSpeR-AUG-betagal}-

dutP és p{CaSpeR-AUG-betagal}-dutP-DRE12 plazmidokat, melyeket a továbbiakban

röviden pCAUG-dutP és pCAUG-dutP-DRE12 plazmidoknak fogok hívni.

pCAUG-dutP2: A pEGFPd-dutP plazmidot templátként felhasználva a d2Fw és

bgaldRev primerpárral (3.1. táblázat) PCR reakcióban felsokszorosítottam, majd BamHI és

KpnI enzimekkel emésztettem. Az így kapott fragmentumot az ugyanezekkel az enzimekkel

emésztett p{CaSpeR-AUG-betagal} plazmidba ligáltam. A keletkező p{CaSpeR-AUG-

betagal}-dutP2 plazmidot a továbbiakban pCAUG-dutP2-ként fogom rövidíteni.

A plazmidok szekvenciájának helyességét restrikciós endonukleázokkal és

szekvenálással teszteltem.


51

3.1.6. Plazmidok a dUTPáz overexpresszáló muslicatörzsek létrehozásához

Ecetmuslica genomi DNS-t felhasználva PCR reakcióval felszaporítottam a dUTPázt

kódoló gént a DmDut_attB1Fw - DmDut_attB2Rev primer párokkal (3.1. táblázat). A

primerekkel a dUTPázt kódoló fragmentumokhoz attB1 és attB2 Cre által felismerhető

rekombinációs helyeket és Kozak-szekvenciát fúzionáltam. Az így kapott fragmentumokat

pDONR221 entry vektorba rekombináltam a Gateway BP Clonase II Kit-el (Invitrogen), majd

One Shot Omni MAX 2 T1R E. coli törzsbe transzformáltam. Az izolált kolóniákból tisztított

plazmidot restrikciós próbával és szekvenálással ellenőriztem. Ezt követően az ilyen módon

kapott pDONR221-DmDut plazmidot pTWF plazmiddal rekombináltam Gateway LR

Clonase II Kit-el, majd One Shot Omni MAX 2 T1R E. coli törzsbe transzformáltam és

kitisztítottam. A kapott pTWF-DmDut plazmid szekvenciáját restrikciós enzimekkel és

szekvenálással ellenőriztem. A pTWF vektorba integrált fehérjéhez egy 3xFLAG peptid van

fúzionálva.

3.2. Eukarióta sejtvonalak

3.2.1. Sejtvonalak és fenntartásuk

A muslica embrió eredetű S2 sejteket (James Sellers, NIH) Schneider médiumban

(Sigma-Aldrich) tartottam fenn 10% hőinaktivált FBS szérummal (Gibco) és 1% Pen/Strep

antibiotikummal (Gibco) kiegészítve 27°C-on. Az egér embrionális fibroblaszt (Mouse

Embryonal Fibroblast - MEF) sejtvonalakat (Hilde Nilsen, University of Oslo) vad típusú,

illetve ung(-/-)

egérből nyerték ki 153

. A kétféle sejtvonalat Sigma DMEM/F12 Ham

médiumban (Sigma-Aldrich) tartottam fenn kiegészítve 0,5 mM nátrium-piruváttal, 1%

NEAA ( 100x non-essential amino acids, Gibco) oldattal, 10% hőinaktivált FBS szérummal

(Gibco) és 1% Pen/Strep antibiotikummal (Gibco). T-REx-HeLa sejteket (Invitrogen) Sigma

DMEM/F12 Ham médiumban (Sigma-Aldrich) tartottam fenn 10% hőinaktivált szérummal

(Gibco) és 1% Pen/Strep antibiotikummal (Gibco) kiegészítve. A pCDNA6/TR Tet

represszorral szabályozható, dUTPáz csendesített HeLa sejteket Merényi Gábor állította elő

86. Ezeket a sejteket a T-Rex-HeLa sejtekével azonos módon, azonban tetracilkin-mentes FBS

szérummal (Clontech) kiegészítve tartottam fenn, hogy ne legyen jelen dUTPáz csendesítést

indukálni képes tetraciklin a médiumban. A dUTPáz csendesítő RNS-t és a Tet represszort

kódoló plazmidokat 2 ug/ml puromicin és 6 ug/ml blasticidin szelekcióval tartottam fenn a

sejtekben. A dUTPáz csendesítést 1μg/ml tetraciklin hozzáadásával indukáltam Az emlős

sejtvonalakat 37°C-on 5% CO2 inkubátorban növesztettem.


52

3.2.2. Drosophila S2 sejtek transzfektálása

Az S2 sejteket a transzfektálás előtt egy nappal 24-lyukú lemezre helyeztem, egy lyukba

2x105 - 1,5x10

5 sejtet rakva. Másnap a médiumot 280 μl friss médiumra cseréltem. 3 órával

később 18 μl HBS oldatot (21 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5,5 mM Dextróz, 49,5 mM KCl,

0,7 mM Na2HPO4, pH=7,1) és 1,1 μg plazmidot raktam egy mikrocentifuga csőbe, majd

vortexeltem. Ezután 1,1 μl 2,5 M CaCl2 oldatot raktam a csőbe és ismért megkevertem. 20

perc múlva az elegyet folyamatos rázás mellett a 24-lyukú lemezen lévő sejtekre

csöpögtettem. Másnap a transzfektáló médiumot friss médiumra cseréltem.

Az EGFP-t kódoló riporter plazmidokat puromicin rezisztenciát kódoló pSUPER.puro

plazmiddal együtt transzfektáltam. A transzfektálást követően a sejteket 40 μg/ml

puromicinnel szelektáltam, ennek köszönhetően a riporter plazmiddal rendelkező sejtek

feldúsultak.

3.2.3. A sejtek drogkezelése

MEF sejteket 25 vagy 75 cm2 flaskában 4 napig növesztettem 1; 20; vagy 100 μM

5FdU (Sigma-Aldrich) jelenlétében. HeLa sejtvonalak 5FdU dózishatásának

meghatározásához a sejteket 96 lyukú lemezre raktam (2000 sejt/lyuk) a kezelés előtt egy

nappal. A kezelés során a sejteket 3 napig 5FdU, dU, dT, vagy ezek kombinációjával

kezeltem. A médiumot a droggal együtt naponta friss médiumra cseréltem annak elkerülése

érdekében, hogy a tetracilkin bomlása ne eredményezzen csökkenést a dUTPáz siRNS

indukálásában.

3.3. Muslica törzsek és módszerek

3.3.1. Gének csendesítése

A dUTPáz összes szövetben történő csendesítéséhez 21883 vagy 21884

csendesítőallélokal rendelkező hímeket kereszteztem Act-Gal4 szűz nőstényekkel (3.2.

táblázat). A keresztezésből kétféle utód származhat: dUTPáz siRNS/W; Act-Gal4/W; vagy

dUTPáz siRNS/W; CyO, GFP/W (a W vad típusú allélt jelöl). A kétféle utódot lárvális

stádiumban a GFP expressziónak köszönhetően Leica DM IL LED Fluo fluoreszcens

mikroszkóp alatt különítettem el.

A dUTPáz szárny szövetekben történő csendesítéséhez a 21883 vagy 21884 hímeket

25706 vagy 25752 driver törzsekből származó szűz nőstényekkel kereszteztem (3.2. táblázat).


53

A driver törzsek közül előbbi a szárny dorzális felszínén, utóbbi az engrailed expressziós

mintázatnak megfelelően a szárny poszterior felében indukál expressziót. A driver törzsek

által kialakított expressziós mintázatot az actMoeCherry törzzsel történő keresztezéssel

teszteltem. Az e törzs genomjában kódolt Moesin-Cherry fúziós fehérje termelődését a kikelt

utódok lárváiban fluoreszcens mikroszkóppal ellenőriztem.

3.3.2. dUTPáz túltermelés

Az ecetmuslica dUTPázt kódoló pTWF-DmDut plazmid P-elem inszerciós helyekkel

rendelkezik, melyek transzpozáz jelenlétében véletlenszerű integrációval beépülni képesek az

ecetmuslica genomba. A pTWF-DmDut és a transzpozáz forrás plazmid embrió csíravonalba

történő injektálását kolleborációs partnereink, Erdélyi Miklós és Vilmos Péter végezték, akik

a sikeresen transzformált DmDut20 és DmDut29 stabil törzseket létrehozták (3.2. táblázat).

Továbbá ezeket a törzseket keresztezték a 21883 és a 21884 törzsekkel, így olyan vonalakat is

létrehoztak, melyek mind a dUTPáz csendesítő, mind a dUTPáz túltermelésére képes

allélokkal is rendelkeznek (21883, DmDut20; 21883, DmDut29; 21884, DmDut20 és 21884,

DmDut29 törzsek).

A dUTPáz túltermelés indukálásához DmDut20, DmDut29 hímeket vagy ezek dUTPáz

csendesítőallélokkal rendelkező kombinációit Act-Gal4 vagy 25706 driver törzsekből gyűjtött

szűz nőstényekkel kereszteztem (3.2. táblázat). Az Act-Gal4 keresztezésből kikelt lárvák

közül a GFP fluoreszcencia hiánya alapján válogattam ki azokat az egyedeket, amelyekben

jelen van a Gal4 forrás.


54

Törzs neve Genotípus Eredet

W1118 vad típus Szegedi Drosophila

Törzsközpont Oregon-R vad típus

Act-Gal4 W; Act-Gal4/CyO, GFP

25706 MS1096; UAS-Dcr2 Bloomington Stock Centre

25752 UAS-Dcr2; en-Gal4

21883 W; P{GD11362}v21883 VDRC

21884 W; P{GD11362}v21884

actMoeCherry W; UAS-actMoeCherry

Erdélyi Miklós, SZBK,

Genetikai Intézet

DmDut20 W; SM6b/Sp; DmDut20/TM3(Sb)

DmDut29 W; SM6b/Sp; DmDut29/TM3(Sb)

21883, DmDut20 W; P{GD11362}v21883; DmDut20




6193-1/1 W; W; dutPu2-Bgal/TM3(Sb)

BestGene

6193-1/2 W; dutP2-Bgal/CyO



6193-1/5 W; W; dutP2-Bgal/TM3(Sb)




6193-1/9 W; W; dutP2-Bgal/TM3(Sb)

6193-2/1 W; dutP-Bgal/CyO

6193-2/3 W; W; dutP-Bgal/TM3 (sb)







6193-3/2 W; DRE12-Bgal/CyO



6193-3/7 DRE12-Bgal/FM7i



3.2. táblázat. A dolgozat témájához felhasznált Drosophila törzsek jegyzéke

Genotípus jelölése: 1. kromoszóma; 2. kromoszóma; 3. kromoszóma. A különböző

allélokkal rendelkező kromoszómapárokat ferde vonallal, az azonos kromoszómán lévő

géneket vesszővel választottam el. A CyO, TM3 (Sb), SM6b, FM7i kromoszómális

balanszerek homozigóta formában letális és domináns szelekciós markerekkel ellátott

allélokal rendelkeznek. A W vad típusú allélokat jelöl.


55

3.3.3. Promóter - riporter rendszereket hordozó transzgenikus törzsek

A pCAUG-dutP, pCAUG-dutP2 és pCAUG-dutP-DRE12 plazmidok P-elem inszerciós

helyekkel rendelkeznek, melyek transzpozáz jelenlétében véletlenszerű integrációval az

ecetmuslica genomba képesek integrálódni. Az embrionális csíravonalba történő integrálást és

a transzformált törzsek létrehozását a BestGene cég végezte. Így az egyes promóter-riporter

kombinációkra számos független törzset kaptunk. 8 db. pCAUG-dutP, 9 db. pCAUG-dutPu2

és 6 db. pCAUG-dutP-DRE12 törzs állt rendelkezésünkre, melyekben a transzgén különböző

genomi pozíciókba integrálódott (3.2. táblázat).

Hogy elkerüljem a β-galaktozidáz riporter fehérje anyai hatásnak köszönhető jelenlétét

az embriókban, hím promóter-riporter transzgénnel rendelkező egyedeket W1118 szűz

nőstényekkel kereszteztem, és az ilyen nőstények által lerakott petéket vizsgáltam.

3.4. Muslica szövetek gyűjtése és festése

3.4.1. Embrió gyűjtés

10-20 db. szűz nőstényt és hím egyedeket, tenyésztőtápot (100 ml-ben: 2 g agar; 10 g

szacharóz; 10 g élesztő; 400 μl propionsav, 40 μl foszforsav, 500 μl 0,5 g/ml etanolban oldott

Nipagin) tartalmazó csőbe helyeztem. A tenyésztőtápot tartalmazó csöveket naponta

cseréltem, a petéket összegyűjtöttem, majd vízzel felére hígított háztartási nátrium-hipoklorid

oldatban dekorionizáltam. Ezt követően az embriókat NaCl-Triton pufferrel (0,7% NaCl,

0,04% TritonX-100) kétszer mostam.

3.4.2. β-galaktozidáz hisztokémia

Az embriókat 2 ml 18,81 mM NaH2PO4; 81,17 Na2HPO4; 4% formaldehid oldat és 2 ml

n-heptán szuszpenziós elegyben 350 rpm rázatás mellett szobahőn 20 percig üvegcsőben

fixáltam. Ezt követően az embriókat NaCl-Triton pufferrel (0,7% NaCl, 0,04% TritonX-100)

kétszer mostam, és 5 percig rehidratáltam. Majd az embriókat 37°C-os X-gal festőoldatba

helyeztem (3,16 mM NaH2PO4; 6,84 mM Na2HPO4; 150 mM NaCl; 1 mM MgCl2; 3 mM

K4[Fe(CN)6]; 3 mM K3[Fe(CN)6]; 0,3% Triton X-100). Az X-gal festőoldatban 50-szeresére

hígítottam 100 mg/ml DMF (N,N-dimetilformamid)-ban oldott X-gal szubsztrátot (5-bromo-

4-kloro-indolil-β-D-galactopiranozid). A festés egy órán át tartott 37°C-on. Az X-gal

festőoldat eltávolítása után az embriókhoz 2 ml n-heptánt és 2 ml jéghideg metanolt adtam,

majd erőteljesen ráztam, hogy a vitellin membránt eltávolítsam. Ezután az n-heptán – metanol

elegyet eltávolítottam és elpárologtattam, az embriókat 100%; 75%; 50%; 25% és 0% etanol -


56

PBS (130 mM NaCl2; 7 mM Na2HPO4; 3 mM NaH2PO4; pH=7,2) elegy sorozatban

rehidratáltam.

Muslica lárvális és felnőtt szövetek festéséhez harmadik lárvastádiumú vagy kifejlett

állatokat gyűjtöttem. A lárvákból PBS-ben sztereomikroszkóp és 0,05 mm x 0,01 mm csipesz

segítségével a központi idegrendszer (Central Nervous System – CNS), imaginális szárny

diszkusz, középbél és here szöveteket kiboncoltam. A felnőtt állatokból a heréket vagy az

ováriumot boncoltam ki. A szöveteket PBS-ben oldott 1% glutáraldehidben fixáltam 15

percig szobahőmérsékleten. Ezután kétszer 10 percig mostam Na-P/0,2TX oldatban (72 mM

Na2HPO4; 28 mM NaH2PO4; 0,2% Triton-X100; pH=7,2). Ezután a szöveteket 37°C-os X-gal

festő oldatba helyeztem (7,2 mM Na2HPO4; 2,8 mM NaH2PO4; 150 mM NaCl; 1 mM MgCl2;

3 mM K3[Fe(CN)6)]; 3 mM K4[Fe(CN)6]). Az X-gal festőoldatban 50-szeresére hígítottam

100 mg/ml DMF-ben oldott X-gal szubsztrátot. A festés 37°C-on 15 percig tartott. Az X-gal

festőoldat eltávolítása után a szöveteket PBS-el mostam.

3.4.3. Immuncitokémia

Muslica lárvális szövetek festéséhez harmadik lárvastádiumú állatokat gyűjtöttem. A

lárvákból PBS-ben sztereomikroszkóp és 0,05 mm x 0,01 mm csipesz segítségével a CNS,

imaginális szárny diszkusz, középbél, nyálmirigy és here szöveteket kiboncoltam. A

szöveteket 4% formaldehidet és 2,5% Tween-20 detergenst tartalmazó PEM oldatban (100

mM PIPES; 1 mM MgCl2; 1 mM EGTA; pH=6,9) fixáltam 50% n-heptán emulzióban 1 órán

át szobahőmérsékleten. Ezután a szöveteket háromszor 10 percig mostam 50 mM TRIS; 150

mM NaCl; 0,5% Tween-20; pH=7,4 oldatban. Majd a szöveteket blokkoló 0-ban (1,5% BSA

(Bovine Serum Albumin); 0,1% Tween-20; 1% TritonX-100; 0,001% NaN3; 250 mM NaCl; 7

mM Na2HPO4; 3 mM NaH2PO4; pH=7,2) és 2,5% FBS-el valamint 2,5% kecske szérummal

kiegészített blokkoló 0-ban inkubáltam szobahőmérsékleten 2-2 órán át. A dUTPáz és

3xFLAG elleni festés esetén az antitesteket blokkoló 1-ben (5% FBS; 1% BSA; 0,01%

Tween-20; 0,1% Triton X-100 és 0,001% NaN3-al kiegészített PBS) higítottam (anti dUTPáz

1:10000 (Prof. Erdei Annától, ELTE Immunológiai Tanszék, nyúl poliklonális); anti FLAG

1:1000 (Sigma, egér monoklonális)). Ebben az oldatban festettem a szöveteket 4°C-on egy

éjszakán át. A festést követően a szöveteket újabb blokkoló 2-ben (1,5% BSA; 0,05% Tween-

20; 0,5% TritonX-100; 0,001% NaN3; 250 mM NaCl; 7 mM Na2HPO4; 3 mM NaH2PO4;

pH=7,2) háromszor 2 órán át, majd blokkoló 1-ben egy éjszakán át mostam. A másodlagos

antitesteket blokkoló 1-ben higítottam ki 1:1000 arányban. A másodlagos antitesttel történő


57

festés két órán át sötétben szobahőmérsékleten történt. Ezután a mintákat blokkoló 2-ben

háromszor 35 percig mostam.

A foszfo-H2AX festés esetén a festést megelőzően blokkoló A-ban (1% BSA; 2,5%

FBS; 2,5% kecske szérum; 0,1% Tween-20 és 1% Triton X-100-al kiegészített PBS)

inkubáltam a mintákat, majd a festés blokkoló B-ben (1% BSA; 5% FBS; 0,01% Tween-20 és

0,1% Triton X-100-al kiegészített PBS) történt. Az anti foszfo-H2AX antitestet 1:250

hígításban használtam (Millipore, Ser139, egér monoklonális). A festés után négyszer 1 órán

át blokkoltam a mintákat blokkoló C-ben (1% BSA; 5% FBS; 0,01% Tween-20; 0,1% Triton

X-100-al kiegészített PBS). A másodlagos antitesttel történő festés blokkoló B-ben történt. A

másodlagos festés után a mintákat háromszor 30 percig blokkoló C-ben inkubáltam.

A festések után a szöveteket kétszer mostam PBS-ben és 10 percig 1:10000 higított

1μg/ml Hoechst 33342 (Molecular Probes) vagy 1μg/ml DAPI (4′6′-diamidino-2-fenilindol)

(Sigma-Aldrich) sejtmagi festékkel festettem. A használt másodlagos antitestek: kecskében

termelt Alexa 488 konjugált anti nyúl és Alexa 546 konjugált anti egér (Invitrogen).

3.4.4. TUNEL próba

Késői 3. lárva stádiumú muslica egyedeket gyűjtöttem és kiboncoltam az imaginális

szárny diszkuszokat. A szöveteket 1% formaldehid; 0,1 M PIPES; 2 mM MgSO4; 1 mM

EDTA; 1% Triton X-100; pH=6,9 oldatban fixáltam 30 percig szobahőmérsékleten. Ezután a

szöveteket háromszor 10 percig mostam 50 mM TRIS; 150 mM NaCl; 0,5% Tween-20;

pH=7,4 oldatban, 50% n-heptán szuszpenzióban. Majd a szöveteket háromszor mostam PBT

pufferben (PBS + 0,1% Triton X-100) és kétszer PBT5X pufferben (PBS + 0,5% Triton X-

100). A sejteket permeabilizáltam 0,1 M nátrium-citráttal kiegészített PBT-ben 30 percig 65

°C-on. Ezután a szöveteket 10 percig inkubáltam 0,1 M TRIS; pH=7,5; 3% BSA; 20% FBS

oldatban. Ezt követően a mintákat mostam kétszer PBT5X és háromszor PBT pufferben.

Majd 10 percig előinkubáltam TUNEL reakciópufferben (30 mM TRIS; 140 mM nátrium-

kakodilát; 1 mM CoCl2; pH=6,6). A TUNEL reakció egy órán át tartott 5 μM Cy5 konjugált

dUTP (GE Healthcare) és 0,2 U/μl terminális dezoxinukleotidil transzferáz (TdT) (New

England Biolabs) jelenlétében 25°C-on TUNEL reakciópufferben. A reakció leállításához a

reakciópuffert lecserétem PBT5X pufferre. Ezt háromszoros PBT, majd egyszeres PBS mosás

követte.


58

3.4.5. BrdU próba

Késői 3. lárva stádiumú muslica egyedeket gyűjtöttem, kiboncoltam az imaginális

szárny diszkusz és CNS szöveteket, majd Schneider médiumba helyeztem őket. A próbához

Roche 5-Bromo-2’-deoxy-uridine Labeling and Detection Kit I -et használtam. A médiumba

10 μM Bróm-dezoxiuridint (BrdU) mértem, majd egy órán keresztül szobahőmérsékleten

inkubáltam. Az inkubálást követően a szöveteket egyszer mostam Schneider médiummal. A

szöveteket Carnoy oldattal (etanol - ecetsav - kloroform 6:3:1 arányú elegye) fixáltam 20

percig szobahőmérsékleten. Ezt 30 perc 7:3 arányban etanolt és 50 mM glicint (pH=2)

tartalmazó oldattal történő kezelés követte -20 °C-on. A mintákat 50%, 30% és 0% etanol -

PBT puffer (PBS + 0,1% Triton X-100) keverékben rehidratáltam. Majd a szöveteket 5 percig

mostam a kithez mellékelt Washing buffer-el. Az anti-BrdU festés a kithez mellékelt

Incubation solutionban történt 4°C-on egy éjszakán át. Ezután 6-szor 10 percig mostam a

mintákat PBT pufferben. A fluoreszceinnel jelölt anti-egér Ig másodlagos antitestet 0,3%

BSA-t tartalmazó PBS-ben oldottam fel a kit gyártója által javasolt koncentrációban. A festés

2 órán át szobahőmérsékleten tartott. Majd a mintákat kétszer 10 percig PBT-ben mostam.

Hoechst oldatot 10000-szeresére hígítottam PBT pufferben, melyben ezután a szöveteket

további 10 percig festettem. Végül a mintákat PBS-ben mostam.

3.5. Kimutatási módszerek és a felhasznált műszerek

3.5.1. Kvantitatív valós idejű PCR

A kvantitatív valós idejű PCR (qPCR) reakciót 10 μl végtérfogatban Stratagene

MX3000P készülékkel végeztem, melyben 1 μl mérendő DNS vagy cDNS minta volt jelen.

Minden egyes mintából kétszeres vagy tízszeres higítási sort készítettem és mértem, így

meghatároztam azt a koncentrációtartományt, amelyben a Ct (kvantifikációs ciklus) és a

templát koncentráció logaritmusa lineáris. Ez többnyire 5-10 higítási lépést foglalt magába. A

Pyrococcus furiosus (Pfu) DNS polimerázzal végzett reakciók összetétele: 0,5 U/μl PfuTurbo

Hotstart (vad típusú Pfu DNS polimeráz) vagy PfuTurbo Cx Hotstart (V93Q mutáns Pfu DNS

polimeráz) (Stratagene); 0,175 - 0,175 μM primer (Eurofins MWG Operon, HPLC

tisztaságú); 200 μM dNTP mix (Fermentas); 20-szorosára hígított EvaGreen (Biotium); 30

nM Passive Reference Dye (Stratagene) és 5-szörösére hígított a gyártó által a DNS

polimerázhoz javasolt reakciópuffer. Reakciókörülmények: 95°C 2 perc; 40 ciklusban 95°C

15 másodperc; 57°C 10 másodperc; 72°C 50 másodperc (544 bp felaszaporítása esetén) vagy


59

70 másodperc (hosszabb termékek esetén). A Taq polimerázzal végzett reakciók összetétele:

2-szeresére hígított ImmomMix PCR mastermix (Bioline); 0,175 - 0,175 μM primer (Eurofins

MWG Operon, HPLC tisztaságú); 200 μM dNTP mix (Fermentas); 20-szorosára hígított

EvaGreen (Biotium); 30 nM Passive Reference Dye (Stratagene). Reakciókörülmények: 95°C

10 perc; 40 ciklusban 95°C 15 másodperc; 57°C 10 másodperc; 72°C 70 másodperc. A

különböző arányban uracilt tartalmazó PCR-el előállított DNS templátokat kétféle

primerpárral vizsgáltam, melyekkel egy 544 bázispáros (PUbsd-Fw, PUbsd-R544 primerek)

vagy 1057 bázispáros (PUbsd-FW, PUbsd-R544 primerek) terméket szaporítottam fel. A

genom uraciltartalmát E. coli esetén a gdh565 - Fw, gdh565_Rev; MEF sejtvonalak esetén a

MEFdut-1168Fw - MEFdut-1168Rev, muslica minták esetén a PUbsd-FW - PUbsd-R985

primerpárok segítségével határoztam meg 565, 1168 illetve 985 bázispáros szakaszt

felszaporítva (3.3. táblázat).

Név Szekvencia Specificitás

PUbsd-Fw TCGGGATGACTTTTGGGTTCTG Drosophila melanogaster, 2L

kromoszóma; GeneID:

34528,34529 PUbsd-R544 AGTGACCAAACTACAGATCCACG

PUbsd-R985 CGCGGTTTAACACAGCGTCGG

PUbsd-R1057 CCGCTCTAGAACTAGTGGATC pBlueScript SK+

MEFdut-1168Fw GCAGGCACAGTGTGATGAAGG Mus musculus,2. kromoszóma;

GeneID: 110074 MEFdut-1168Rev GTGGCTTTAACCCACTGGTGAC

gdh656_Fw GACGGTCATCTGATCGTTAACG Escherichia coli; GeneID:

947679 gdh656_Rev ACTACGTCATCTTCGGTGTAGC

3.3. táblázat. Kvantitatív PCR-hez felhasznált primerek

A DNS uraciltartalmának meghatározása a következőképpen történt: a vad típusú Pfu

DNS polimerázzal mért Ct értékeket a minták hígítási értékeinek logaritmusával ábrázoltam

és egyenest illesztettem. Az egyenes meredekségéből kiszámítható a Pfu DNS polimeráz

hatékonysága (M = log(D) / log(1+E), ahol M az egyenes meredeksége, D az alkalmazott

hígítás, E a PCR hatékonysága, azaz mennyivel növekszik ciklusonként a felszaporítandó

DNS mennyisége.) Emellett a DNS teplátbeli uracilra intoleráns Pfu DNS polimerázzal mért

referencia (azaz uracil tartalomra nézve 0-nak tekintett) mintához tartozó hígítási lépések Ct

értékekeit ábrázoltam az uracil-DNS toleráns polimerázzal mért megfelelő Ct értékekkel és

egyenest illesztettem. Az egyenes által meghatározott függvénnyel az uracil toleráns DNS

polimerázzal mért Ct értékek behelyettesítésével kiszámoltam, hogy a referenciához

hasonlítani kívánt minták milyen Ct értéket adnának a vad típusú Pfu DNS polimerázzal, ha


60

nem lenne jelen uracil (Ct0

Pfu). A Ct0

Pfu értékeket kivontam a megfelelő vad típusú Pfu DNS

polimerázzal mért Ct értékekből (CtPfu). Az így kapott Ct különbségből (ΔCt) és a vad tíusú

Pfu DNS polimeráz hatékonyságából kiszámoltam a megfelelő templát koncentrcióbeli arányt

(R = (E+1)ΔCt

). Ez az arány azt mutatja meg, hogy a reakcióban jelen lévő kezdeti DNS

teplátok közül mennyit volt képes a vad típusú Pfu DNS polimeráz felszaporítani, azaz

mennyi templát nem taramazott uracilt a felszaporítandó szakaszon. Annak a valószínűsége,

hogy egy s hosszú DNS templát nem tartalmaz uracilt (1-U)s, ahol az U az uracil szubsztitúció

előfordulási valószínűsége. Ez alapján egy mintában az U = 1 - R1/s

. Az adatokat Origin 8.0

szoftverrel értékeltem ki. A minták átlagos uraciltartalmát és standard hibáját (standard error)

3 - 10 párhuzamos adatból számoltam ki.

3.5.2. Szcintillációs detekció

A dUTP[5-3H] jelenlétében szintetizált DNS-t 5 ml Optifluor Liquid Scintillation

Counting Coctail-ban oldottam fel. A tricium aktivitást PerkinElmer Wallac 1049 folyadék

szintillátorral mértem meg. A mérés kalibrálásához dUTP[5-3H] hígítási sort használtam.

3.5.3. Luciferáz teszt

A luciferáz aktivitás meghatározásához a Promega Dual-Luciferase Reporter Assay

kitet használtam. S2 sejteket 24 lyukú lemezen pGL3 (szentjánosbogár luciferáz) és pRL

(Renilla luciferáz) riporter plazmidokkal kotranszfektáltam. Minden egyes transzfekciót

párhuzamosan háromszor végeztem. Másnap a sejteket a kithez mellékelt Passive Lysis

Buffer-ben felszuszpendáltam és 15 percig szobahőmérsékleten rázattam. A lizátumot 20-20

μl-enként triplikátumokban Greiner Lumitrac 600 High binding 96-lyukú lemezre mértem.

Ezután a lyukakhoz 100-100 μl Luciferase Assay Buffer II-ben feloldott Luciferase Assay

Substrate-ot adtam. A szentjánosbogár luciferáz lumineszcencia megmérése után a lizátumhoz

100-100 μl Stop & Glo Buffer-ben oldott Stop & Glo szubsztrátot adtam, majd megmértem a

Renilla luciferáz lumineszcenciát is. A lumineszcenciát PerkinElmer Wallac-VICTOR2 1420

plate reader-el határoztam meg lyukanként 5 másodperc beolvasási idővel.

3.5.4. Áramlási citrometria

A puromicin szelekcióval feldúsított EGFP riportert termelő S2 sejteket 0,5%

formaldehiddel kiegészített PBS-ben fixáltam (pH=7,4) 10 percig szobahőmérsékleten.

Ezután a sejteket kétszer mostam PBS-ben és végül PBS-ben felszuszpendáltam. A sejtek

EGFP fluoreszcenciáját az ELTE Immunológiai Tanszékén Kiss Endre mérte meg BD


61

FACSCalibur áramlási citométer segítségével. A mért EGFP hisztogramokból meghatátoztam

az autofluoreszcenciánál magasabb fluoreszcenciát mutató sejtek arányát (GF) és átlagos

fluoreszcenciáját (Fmean). Majd az Fmean érték a GF értékkel történő összeszorozásával

normalizálva meghatároztam a sejtpopulációra jellemző fluoreszcenciát. A promóter-EGFP

konstrukciók fluoreszcenciáját mindig a dutP-EGFP konstrukció esetén mért

fluoreszcenciához hasonlítottam. A kísérlet során egy promóter-EGFP rendszerhez három

párhuzamosan létrehozott sejtvonal fluoreszcenciáját határoztam meg.

3.5.5. Mikroszkópia

A vizsgált szöveteket Mowiol beágyazóba (6 g glicerol; 2,4 g Mowiol 4-88 (Sigma); 6

ml víz; 12 ml 0,2 M TRIS; pH=8,5; 2,5% DABCO (1,4-diazobicyclo-[2.2.2]-oktán))

ágyaztam. A β-galaktozidáz riporter fehérjét expresszáló muslica szöveteket a Leica DMLS

mikroszóppal és Spot RT colour digital kamerával (Diagnostic Instruments) vizsgáltam. Az

immuncitokémiával, TUNEL vagy BrdU próbával festett muslica szöveteket Zeiss LSM 710

konfokális mikroszkóppal fényképeztem. A mikroszkópia során kapott képeket ImageJ

szoftverrel analizáltam.

3.5.6. Alamar sejt életképesség vizsgálat

A 96 lyukú lemezen növesztett sejteken lévő 100 μl tápoldathoz 10 μl Alamar Blue

reagenst (Biosource) adtam, majd 4 órán keresztül 37°C-on inkubáltam. Ezt követően a

rezazurin redukciót BioTek SynergyMX plate reader-el mértem 530 nm gerjesztés mellett az

590 nm emissziót detektálva.

EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE

62

4. Eredmények bemutatása és kiértékelése

4.1. A DNS uraciltartalmának kvantitatív kimutatása

A DNS-ben megjelenő károsodások és módosult bázisok kimutatására számos közvetett

és közvetlen módszer létezik. A közveten módszerek során a módosulás a minta megfelelő

előkészítése után valamilyen analitikai módszerrel (pl. tömegspektrometriával) mutatható ki.

A közvetett módszerek során a bázismódosulást tartalmazó DNS-t valamilyen azt felismerő

enzimmel kezelik, tehát a szenzor szerepét ez specifikus enzim látja el. Ezután a kezelt termék

analízisére kerül sor. Erre példa az DNS uraciltartalom UNG enzimmel történő kimutatása,

amikor a kivágott uracil bázisokat vagy a DNS-ben hagyott bázismentes helyeket

tömegspektrométerrel 155,216–218

, aldehid reaktív próbával (ARP) 84

, vagy az bázismentes

helyek további emésztését követően a DNS frakcionálással mutatják ki 153,194,219

. Ezeken kívül

bizonyos DNS módosulásokat PCR alapú technikákkal is ki lehet mutatni. Az ilyen

kimutatási módszerek a DNS polimerázok hibákkal szembeni érzékenységét használják ki.

Valós idejű kvantitatív PCR (qPCR) technikák lehetővé teszik a DNS hibák DNS

polimerázokkal történő közvetlen kimutatását. Ilyen módszereket dolgoztak ki többek között a

DNS-beli 8-oxoguanin 220,221

, valamint egyéb oxidáció vagy alkiláció okozta DNS

károsodások kimutatására 222–226

. Továbbá DNS károsodások mellett a citozin metiláció

kimutatására is létezik PCR alapú módszer 227

. A DNS-ben előforduló uracil bázisok

kimutatására a szokványos qPCR-ben használatos DNS polimerázok azonban nem

alkalmasak. Mint ahogy az irodalmi áttekintésben bemutatásra került (lásd. 1.2.2. fejezet és

1.2. ábra), atöbbi DNS polimerázzal ellentétben, a Pyrococcus furiosus (Pfu) DNS polimeráza

elakad az uracil bázist tartalmazó DNS replikálása során. A Pfu DNS polimerázt és

módosított változatait széles körben használják DNS fragmentumok PCR-ben kevés hibával

történő felszaporítására. Köszönhetően azonban annak, hogy a DNS-ben található uracil

blokkolja a Pfu DNS polimerázt, csupán az uracilt nem tartalmazó DNS templátokat képes

felsokszorosítani. A polimeráznak ezt az uracil-DNS diszkrimináló tulajdonságát az

alábbiakban bemutatott módon kívántam kihasználni a DNS uraciltartalmának kimutatására.

A módszer részletes leírását és fiziológiás mintákon való alkalmazását a Nucleic Acids

Research folyóiratban is közzétettük (lásd. Közlemények listája).

A qPCR széles körben elterjedt pontos módszer egy mintában található templát

koncentrációjának meghatározására. Az ilyem mérésekhez felhasznált Taq polimeráz

valamint a Pfu DNS polimeráz V98Q módosított változata (lásd. 1.2.2. fejezet és 1.2. ábra) az

egy mintában található összes integrált DNS templát felszaporítására képes. Az ilyen


63

polimerázokkal végzett qPCR tehát az összes templátmennyiségről ad információt. Ezzel

szemben a vad típusú Pfu DNS polimeráz felhasználásával csupán az uracil-mentes DNS

templátok koncentrációját mérhetjük meg. Mivel a biológiai eredetű DNS-ben az uracil

megjelenése várhatóan véletlenszerű (néhány kivételtől eltekintve, pl. az Aktiváció Indukált

Citozin Dezamináz azaz AID helyspecifikus aktivitása esetén), a DNS-ben jelenlévő uracil

bázisok arányát jellemezhetjük az egy bázisra eső uracil szubsztitúció gyakoriságával (U).

Egy s-bázis hosszú DNS szakasz a következő valószínűséggel nem tartalmaz uracil bázisokat:

(1)

A véletlenszerű eloszlásból következik, hogy egy PCR során felhasznált mintában jelen lévő

DNS templátok a PS,U valószínűséggel megegyező arányban nem tartalmaznak uracilt:

(2)

Az uracil-mentes templát koncentráció a qPCR reakcióban a vad típusú Pfu DNS polimeráz,

az összes templát a V93Q mutáns Pfu vagy Taq polimeráz által katalizált reakcióban

határozható meg. Hangsúlyozni kell, hogy e feltételezés szerint a reakcióban jelen lévő uracil-

DNS nem csökkenti a Pfu DNS polimeráz hatékonyságát, azaz az uracil-mentes DNS

templátokat zavartalanul képes átírni a polimeráz az uracil-DNS jelenlétében.

Az általam kidolgozni kívánt rendszerben a vizsgálandó mintákat hígítási sorozatban

használtam. A kvantitatív valós idejű PCR során kapott kvantifikációs ciklus értékek

korrelálnak a DNS templátkoncentráció logaritmusával (1.1. ábra A). A különböző hígítási

pontok Ct értékeit a hígítás léptékének logaritmusával ábrázolva egy egyenest kapunk,

aminek meredeksége arányos a PCR hatékonyságával, azzal az értékkel (E), amennyivel

minden egyes ciklus során növekszik a DNS koncentrációja (lásd. 3.5.1. fejezet). A PCR

hatékonysága 100%, amennyiben ciklusonként a DNS teplát koncentráció kétszeresére

növekszik. A 4.1. ábra A-panelén látható, hogy a PCR hatékonysága nem függ a DNS

uraciltartalmától sem a Pfu vad típusú (WT) DNS polimerázt, sem a Pfu V93Q polimerázt

használva, az uraciltartalmú és referencia minták hígítási soraiból nyert egyenesek

meredeksége ugyanis megegyezik. A kétféle polimeráz azonban eltérő hatékonysággal

szaporítja fel a DNS mintákban található DNS-t.


64

Minden méréshez szükséges referencia minta használata, melynek a DNS-beli uracil

tartalmát nullának tekintjük, illetve a mérendő mintát ahhoz hasonlítjuk. A Pfu V93Q DNS

polimerázzal kapott két minta egyenese közötti Ct tengely mentén megfigyelhető eltoldódás a

mintákban található összes DNS templát koncentráció különbségéről árulkodik. A vad típusú

Pfu DNS polimerázzal kapott Ct eltolódáshoz azonban mind a koncentrációkülönbség, mind

az uracil-mentes DNS teplátok arányaiban mutatkozó különbség hozzájárul. Ezért a vad

típusú Pfu DNS polimerázzal mért Ct különbséget normalizálnunk kell a Pfu V93Q DNS

polimerázzal kapott Ct különbséggel:

(3)

A (3) egyenletben az EWT és EV98Q a vad típusú és V93Q Pfu DNS polimerázok hatékonysága,

a ΔCtWT és ΔCtV93Q a vad típusú és V93Q Pfu DNS polimerázok felhasználásával mért minták

közti Ct különbség. Amennyiben a Pfu V93Q és vad típusú Pfu DNS polimerázokkal a két

mintán mért Ct értékeket egymásnak megfeleltetve ábrázoljuk (4.1. ábra B), a CtWT tengely

mentén tapasztalható eltolódásért a vizsgálandó minta referencia mintához képest magasabb

DNS templátbeli uraciltartalma felelős. Az eltolódás mértéke egy olyan Ct különbség, mely

adott CtV93Q értékekhez, azaz bemérési koncentrációkhoz tartozó uraciltartalombeli

különbségről ad információt. Ebből a Ct különbségből a vad típusú Pfu DNS polimeráz

hatékonysága ismeretében kiszámolható az [uracil-mentes templát] / [összes templát] arány

és a DNS uraciltartalma (lásd. 3.5.1. fejezet).


65

4.1.1. DNS uraciltartalom kimutatása szintetikus DNS-ből

A fentiekben leírt kísérleti megközelítést Taq DNS polimerázzal különböző

dUTP/dNTP arány mellett PCR során szintetizált DNS fragmentumokon kívántam tesztelni.

Várakozásaim szerint az alkalmazott dUTP koncentráció arányos lesz a DNS-be beépülő

uracil bázisokkal. A DNS fragmentumokat 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 2; 3; 4; és 5%

dUTP/dNTP arányok jelenlétében szintetizáltam.

Mivel a (2) egyenlet alapján a mérési módszer érzékenysége függ a templát hosszától, a

szintetizált uracil-DNS mintákból többféle hosszúságú templát szakaszt kívántam

felszaporítani. A hosszabb szakaszon végzett szintézis ugyanis nagyobb valószínűséggel

ütközik templátbeli uracilba, ami a [uracil-mentes templát] / [összes templát] arányt

csökkenti, azaz érzékenyebbé teszi a detekciót. A qPCR során kétféle primerpárt használtam,

melyekkel 544 vagy 1057 bázispár hosszú fragmentumok felszaporítása lehetséges.

Referenciaként azt a mintát használtam, melynek szintézise során nem volt jelen dUTP. A 4.2.

ábra A-panelén látható, hogy a CtWT eltolódás mértéke a referencia mintához képest a minták

4.1. ábra.

(A.) A Pfu V93Q DNS polimerázzal (Pfu V93Q) és a vad típusú Pfu DNS polimerázzal

(Pfu WT) mért referencia (ref) és uracil-DNS tartalmú minták Ct értéke a higítás

logaritmusával ábrázolva. Az egyenesek meredeksége a PCR hatékonyságával arányos.

(B.) A vad típusú Pfu DNS polimerázzal (CtWT) és V93Q mutáns Pfu DNS polimerázzal

(CtV93Q) mért referencia (ref) és uracil-DNS tartalmú minták Ct értékei egymásnak

megfeleltetve a különböző hígítási pontokban. A szürke nyíl az uracil-DNS tartalmú minta

referenciához képest történő eltolódását mutatja a CtWT tengely mentén.


66

szintézisekor használt dUTP koncentrációnak megfelelő módon növekszik. A 4.2. ábra B-

panelén látható, hogy CtWT eltolódás nagyobb mértékű, amennyiben hosszabb DNS

fragmentumot szaporítunk fel a qPCR során. Ez annak köszönhető, hogy egy hosszabb

szakaszon nagyobb valószínűséggel tartalmaz uracil bázist egy templát, azaz a vad típusú Pfu

DNS polimeráz jóval kevesebb uracil-mentes DNS templátot fog tudni hasznosítani.

A dUTP jelenlétében szintetizált minták egy részénél tricium jelölt dUTP-t használtam,

hogy a termékekből szcintillációs detekcióval, egy független módszerrel ki tudjam mutatni a

beépült dUMP-t. A minták ilyen módon kapott DNS-beli uracil tartalmát össze tudtam

4.2. ábra.

(A.) Különböző dUTP koncentrációk jelenlétében szintetizált fragmentumok hígítási

pontjainak V93Q mutáns (CtV93Q) és vad típusú (CtWT) Pfu DNS polimerázzal mért Ct

értékei egymásnak megfeleltetve. Jelölések: 0 (fekete négyzet); 0,2 (piros kör); 0,6 (zöld

fordított háromszög); 1 (üres kör); 2 (kék négyzet); 3 (szürke kör); 4 (narancs fordított

négyzet); 5 (üres háromszög) % dUTP/dNTP arányok mellett szintetizált minták. A

mérések 544 bp fragmentum kvantitatív valós idejű PCR-ben történő felszaporításával

születtek (B.) Referencia (négyzetek) és 0,6% dUTP/dNTP arány mellett szintetizált DNS

minták (körök) hígítási pontjainak megfelelő mért Ct értékek. A kvantitatív PCR során 544

bp fragmentum felszaporításával mért értékek (folytonos vonal, fekete négyzet illetve kör)

jóval kisebb mértékű CtWT eltolódást mutatnak, mint az 1057 bp fragmentum

felszaporításával mért értékek (szaggatott vonal, üres négyzet illetve kör).


67

hasonlítani a qPCR segítségével mért értékkel. A kétféle módszerrel és különböző

primerpárokkal mért DNS-beli uraciltartalom nagymértékű egyezést mutat (4.3. ábra).

Megállapíthatjuk tehát, hogy a DNS uraciltartalom kimutatását megcélzó kísérleti

rendszer lehetővé teszi az uracil szubsztitúció valóshoz közeli mértékének kimutatását. A

rövid szintetikus DNS fragmentumok qPCR-ben történő vizsgálata után fiziológiás mintákra

is ki akartam terjeszteni a módszert, ami jóval komplexebb kezelést és kiértékelést igényelhet.

4.1.2. DNS uraciltartalom kimutatása fiziológiás DNS mintákból

A Pfu DNS polimerázon alapuló módszer fiziológiás mintákon való teszteléséhez olyan

organizmusokra volt szükségem, melyekben a timidilát bioszintézis vagy a dUMP beépülés

prevenciója hibás, ami a sejtekben DNS-beli uracil megjelenésének forrása lehet. Ezen kívül

az uracil-kivágó kapacitásában defektusos organizmusokat is vizsgálni kívántam.

4.3. ábra.

A különböző dUTP koncentrációk jelenlétében szintetizált DNS fragmentumok

uraciltartalma különböző módszerekkel mérve. Fekete négyzetek: tricium-jelölt dUMP

beépülésből számolt uraciltartalom 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1; 2; 3; 4; és 5% dUTP/dNTP

mellett szintetizált mintákban. Narancs kör: 544 bp felszaporításával kvantitatív valós

idejű PCR-el mért uraciltartalom 0; 0,2; 0,6; 1; 2; 3; 4; és 5% dUTP/dNTP mellett

szintetizált mintákban. Szürke háromszög: 1057 bp felszaporításával kvantitatív valós

idejű PCR-el mért uraciltartalom 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 és 2; % dUTP/dNTP mellett

szintetizált mintákban.


68

A dUTPáz mutáns E. coli csupán az UNG mutáció mellett fenntartható (dut-1, ung-1).

Ezen kívül rendelkezésemre állt egy UNG mutáns ung-151 törzs. Kontrollként az XL1-blue

törzset használtam. Ezekkel a törzsekkel plazmidot termeltettem, melyet egy éjszakán át

növesztett kultúrából izoláltam. A plazmidokból vad típusú és V93Q mutáns Pfu DNS

polimerázok segítségével uracil tartalmat mértem, referenciaként az XL1-blue-ból izolált

plazmidot használtam fel. Míg az ung-151 törzsből izolált plazmid esetén nem tapasztaltam

kimutatható változást az uraciltartalomra nézve, a (dut-1, ung-1) törzs jelentős mértékű CtWT

eltolódást mutatott (4.4. ábra A). Az ebbből a törzsből izolált plazmid 1 millió bázisából

5490±85 uracil.

Az E. coli törzsekben a genom uraciltartalmát is meg akartam határozni. A három

törzsből, melyeket egy éjszakán át történő növesztés után (stacioner fázis) vagy

exponencionális fázisban gyűjtöttem, genomi DNS-t izoláltam. Az exponenciális fázisig

növesztett ung-151 kultúrához 30,7 vagy 61,3 μM 5FdU-t adtam. Annak érdekében, hogy

4.4. ábra.

(A.) Stacioner fázisú XL1-blue, ung-151 és (dut-1, ung-1) tözsekből izolált plazmidok vad

típusú és V93Q Pfu DNS polimerázokkal mért Ct értékei hígítási pontonként. A kvantitatív

valós idejű PCR során 544 bp felszaporítására került sor. Referenciaként az XL1-blue

trözsből izolált plazmidot használtam. CtWT eltolódást csupán a (dut-1, ung-1) -ből izolált

plazmid mutatott. (B.) Stacioner és exponenciális fázisban gyűjtött XL1-blue, ung-151 és

(dut-1, ung-1) tözsekből izolált genomi DNS uraciltartalma. Referenciaként a stacioner

fázisú XL1-blue genomi DNS-t használtam.


69

feldúsítsam a templátként hasznosítani kívánt DNS fragmentumok arányát a mintákban, a

genomi DNS-t restrikciós endonukleázzal emésztettem, azt a frakciót, amelyben a templát

nagy mennyiségben jelen van, agaróz gélből izoláltam. Érdekes módon, a (dut-1, ung-1)

törzsből származó mintákból a vad típusú Pfu DNS polimerázzal csak többszörös hígítást

követően sikerült DNS fragmentumot felszaporítani, azaz magas koncentrációban a minta

gátolta a reakciót. Ez azzal magyarázható, hogy a nagy mennyiségben jelen lévő nem

templátként funkcionáló urailt tartalmazó DNS a polimerázhoz kötött, gátolva azt. A gátlás

csak több hígítási lépés után szűnt meg, amelynél elegendő szabad Pfu DNS polimeráz

hasznosulhatott a reakcióhoz. A mintákat tehát egy hígítási sorban érdemes vizsgálni, így meg

tudjuk határozni azt a tartományt, ahol a Ct és a templát koncentráció logaritmusának

összefüggése lineáris. Az E. coli törzsek genomi DNS-ében mért uracilmennyiség a 4.4. ábra

B-panelén látható. Referenciaként a stacioner fázisú XL1-blue genomi DNS-ét használtam.

Ehhez képest a stacioner fázisú ung-151 kutúra csupán alig kimutatható mértékben dúsított fel

uracilt a genomjában (90±61 uracil/millió bázis). A stacioner fázisú (dut-1, ung-1) törzs

jelentős mennyiségű uracilt halmoz fel genomi DNS-ében (8063±167 uracil/millió bázis). Az

exponenciális fázisú XL1-blue törzsben nem figyelhető meg kimutatható mértékű genomi

uraciltartalom dúsulás. Azonban az exponenciális fázisú ung-151 törzs genomjában millió

bázisonként 537±37 uracil jelenik meg, ami 30,7 és 61,3 μM FdU kezeléssel tovább növelhető

653±55 illetve 770±54 értékre. Míg az exponenciális fázisú növekedés az UNG defektus

mellett a genomi uracil növekedéséhez vezet, az exponenciális fázisú (dut-1, ung-1) törzs

genomjában millió bázisonként 6850±174 uracil fordul elő, ami bár szintén magas, a stacioner

fázisban mért értéknél érdekes módon alacsonyabb (szemben az ung-151 törzsek által

mutatott tendenciával).

Az E. coli törzsekben mért genomi uraciltartalom összehasonlítható más kutatók által

kapott eredményekkel. ARP módszerrel detektált (dut-1 ung-1) E. coli törzsek genomi

uraciltartalma 3000-től 7700 uracil/millió bázisig terjedően volt kimutatható 84

. Az általam

kidolgozott módszer további pontosítást tesz lehetővé, ugyanis jóval szűkebb tartományban

sikerült az uracil felhalmozódás mértékét meghatározni. Szintén egyezést mutat

eredményeimmel az, hogy az ung-151 törzs exponenciális fázisban növesztve nagyobb

mennyiségű uracilt halmoz fel genomjában mint stacioner fázisban 84

.

Spontán immortalizált, vad típusú és UNG kiütött egérből izolált embrionális fibroblaszt

sejtvonalakat (MEF) használva lehetőségem volt vizsgálni az UNG hatását a genom

összetételére eukariótákban is. Referenciaként a vad típusú MEF sejteket használtam. Az ung(-


70

/-) sejtek genomjában nem emelkedett meg kimutatható mértékben a genom uraciltartalma. A

sejtek 5FdU-val történő kezelése után azonban az ung(-/-)

sejtek genomjában millió

bázisonként 341±87 uracil jelent meg. A vad típusú sejtek genomjának az összetételét az

5FdU nem befolyásolta (4.5. ábra).

Az a megfigyelés, hogy az 5FdU kezelés DNS-beli uracil felhalmozódást az UNG

aktivitástól függő módon növeli, korábban is leírták ugyanezekben a sejtvonalakban és UNG

gátolt HEK sejtekben 153,155

. Azonban egyes irodalmi adatokkal ellentétben nekem nem

sikerült kimutatni a kezeletlen ung(-/-)

MEF sejtekben megemelkedett genomi uraciltartalmat.

Ebben a kérdésben az irodalmi adatok sem egységesek: míg bizonyos esetekben az UNG

kiütése vagy mutációja önmagában elegendő volt a genomi uraciltartalom növeléséhez

153,228,229, más esetekben semmilyen hatás nem volt tapasztalható

155.

4.2. A dUTPáz expressziós mintázat hatása a muslica genom

uraciltartalmára

Kollégám, Békési Angéla korábbi eredményei alapján bemutatta, hogy a dUTPáz

expressziója ecetmuslicában csupán néhány szövetre korlátozódik. A dUTPáz fehérje

jelenléte kimutatható embrionális állapotban és az embrió eredetű S2 sejtvonalban, a lárvális

stádiumban pedig az imaginális korongokra korlátozódik. A felnőtt állatokban csupán az

4.5. ábra.

Vad típusú és UNG kiütött egerekből származó embrionális fibroblaszt sejtek (MEF)

genomi uraciltartalma kezelés nélkül és 100 μM 5FdU kezelés után.


71

ováriumban van jelen, hím egyedekben pedig nem kimutatható a fehérje 215

. Tekintve, hogy a

muslicában nincs jelen az UNG, a dUTPázt nem kifejező szövetek feltehetően hasonló genom

metabolizmust mutathatnak, mint a (dut-1, ung-1) E. coli, azaz a genom uraciltartalmának

emelkedése várható. Ez érvényes lehet a dUTPáz differenciált lárvális szövetekre, melyek a

lárva fejlődése során a sejttérfogat növelésével és endoreplikációval tartanak lépést az egyed

növekedésvel. Ezekben a szövetekben ugyanis a DNS szintézis dUTPáz hiányában történik. A

dUTPáz expressziós mintázat és annak genom összetételét befolyásoló hatásának

vizsgálatához az expressziós mintázat részletes vizsgálatát és a muslica szövetek genombeli

uraciltartalmának kimutatását kívántuk megvalósítani. Vizsgálataink eredményeit a PLoS

Genetics folyóiratban is közzétettük (lásd. Közlemények listája).

4.2.1. Az ecetmuslica dUTPáz expressziós mintázata

Annak érdekében, hogy a dUTPáz expresszió és a genom uraciltartalmának

összefüggését muslicában teljes körűen jellemezni tudjuk, szerettem volna kiterjeszteni

Békési Angéla vizsgálatait további muslica szövetekre a dUTPáz expressziót illetően. Vad

típusú W1118 állatokból szöveteket gyűjtöttem és fixáltam. Az dUTPáz elleni

immuncitokémiát és a minták konfokális mikroszkóppal történő fényképezését Róna Gergely

végezte. A korábban is bemutatott imaginális korong és kifejlett ovárium szövetek mellett

dUTPáz expressziót sikerült kimutatni a CNS szöveteiben, a középbélben található

ventriculus és a nyálmirigy imaginális gyűrűjében, valamint a here primordiumokban (4.6.

ábra).


72

4.2.2. Az uracil-DNS stádium- és szövetspecifikus megjelenése

Mivel a dUTPáz expressziója a muslica egyedfejlődés során változik, valamint bizonyos

stádiumokban az egyed különböző szöveteiben heterogén eloszlású, az uracil-DNS

megjelenését stádium és szövetspecifikus módon kívántuk vizsgálni. Kollégám, Muha Villő

vad típusú, Oregon-R állatokból embrió, első, második, hramadik stádiumú lárva, báb és

kifejlett imágó egyedeket gyűjtött. Ezen túl harmadik lárva stádiumú állatokból imaginális

korong és nyálmirigy szöveteket izolált. A szövetekből genomi DNS-t izoláltunk, melynek az

uraciltartalmát megmértük. Referenciaként az embrióból izolált genomi DNS-t használtuk. A

4.7. ábra A-panelén látható, hogy a lárva stádiumok alatt a genom uraciltartalma az állat

méretének növekedésével párhuzamosan folyamatosan nő (Lárva 1: 307,3±14; Lárva 2:

378,2±10,7; 811,1±25,4 uracil/millió bázis). A báb állapotra azonban csökken a genom

uraciltartalma (477,9±30,6 uracil/millió bázis). A kifejlett állatra azonban az embrióhoz

képest továbbra is magas genomi uraciltartalom jellemző (389,1±15,7 uracil/millió bázis).

4.6. ábra.

Vad típusú ecetmuslicába szövetekben immuncitokémiával kimutathatott dUTPáz

expresszió.


73

A harmadik lárva stádiumú imaginális korongok genomi DNS-ében nem mutatható ki

jelentős mértékű uracil felhalmozódás. A nyálmirigyben azonban drasztikusan magas genomi

uraciltartalmat mértünk (1607,3±309,3 uracil/millió bázis), ami ugyan nem olyan mértékű,

mint ami a (dut-1, ung-1) E. coli-ban tapasztalható, de eukarióta organizmusokban az eddig

mért legmagasabb (4.7. ábra B).

A dUTPáz expressziót mutató embrionális szövetek genomi DNS-éről Muha Villő

kimutatta, hogy az XL1-blue vad típusú E. coli törzsben növesztett plazmidhoz képest nem

mutatható ki benne uracil. Ez az UNG deficiens emlős sejtvonalak kapcsán felmerült

ellentmondást (lásd. 4.1.2. fejezet) abba az irányba billenti el, hogy az UNG enzimnek a

normális dUTPáz expresszió mellett nem kell jelentős mennyiségű uracilt eltávolítania a

DNS-ből. Emellett abban is megerősített minket, hogy az embrió genomi DNS kiváló

referenciaként szolgál muslica szövetek genomi uraciltartalmának meghatározásához.

Figyelemreméltó, hogy az imaginális korongok genomi uraciltartalma alacsony, ami a

korábbi adatokkal illetve a 4.6. ábra. összevetve feltehetően a magas dUTPáz expressziónak

köszönhető. Ezzel párhuzamosan, a szintén dUTPáz expressziót mutató embrióban sem

mutatható ki genomi uracil. A lárva stádiumok alatt a differencilt szövetek

endoreplikációjának köszönhetően emelkedik a muslica genom uraciltartalma. Ez a báb

4.7. ábra.

(A.) Vad típusú ecetmuslica egyedfejlődési stádiumaira jellemző genomi uraciltartalom. E:

embrió, L1, L2, L3: első, második és harmadik stádiumú lárva, P: báb, I: imágó. (B.)

Harmadik stádiumú vad típusú állatokból izolált imaginális korong és nyálmirigy genomi

uraciltartalma.


74

állapottól kezdve szakad meg, amikor a lárvális differenciált szövetek a hid, grim és reaper

által mediált programozott sejthalálnak köszönhetően degradálódnak, arányuk csökken az

állatban. A kifejlett állatban megfigyelhető, az embrióhoz képest még mindig magas genomi

uraciltartalom azzal magyarázható, hogy a báb állapot során differenciálódó szövetekben

idővel megszűnik a dUTPáz expresszió.

4.2.3. A dUTPáz csendesítés hatása a muslica genom uraciltartalmára

Annak érdekében, hogy ellenőrizzük, valóban a dUTPáz expresszióval összefüggésben

tapasztalható-e a muslica szövetekben megfigyelhető uracil-DNS mintázat, szerettük volna

vizsgálni a dUTPáz csendesítés hatását a genom összetételére. A csendesítési kísérletet Muha

Villő hajtotta végre, aki 21883 dUTPáz csendesítőallélokkal rendelkező állatokat, melyekben

a csendesítő RNS (RNAi) az élesztő UAS promóterével meghajtható, Act-Gal4 driver törzzsel

keresztezett össze (Anyagok és módszerek 3.2. táblázat). Utóbbi aktin promóter által

meghajtott Gal4 élesztő transzkripciós faktorral rendelkezik. Azok az utódok, melyekben az

UAS-RNAi és az Act-Gal4 allélok egyszerre jelen vannak, minden szövetre kiterjedően

csendesítik a dUTPáz expressziót. Muha Villő ilyen harmadik lárva stádiumú egyedekből

imaginális korongokat gyűjtött, a szövetekből genomi DNS-t izolált. A megfelelő

mintaelőkészítés után megmértük a DNS uraciltartalmát. Referenciaként vad típusú embrió

genomi DNS-t használtunk. A csendesített imaginális korongokban jelentősen megnő a

genom uraciltartalma (1097,6±55,7 uracil/ millió bázis) (4.8. ábra), ami egy nagyságrendbe

esik a vad típusú nyálmirigyben mért értékkel.


75

A dUTPáz csendesített imaginális korongban tapasztalt DNS összetételbeli változás

megerősíti azt a feltételezést, hogy a differenciált szövetek genomi uraciltartalma a dUTPáz

expresszió hiányának köszönhetően emelkedik. Hangsúlyozni kell azonban, hogy a dUTPáz

hiányában a genomi uracil felhalmozódásához feltehetően az UNG hiánya is hozzájárul.

4.3. A muslica dUTPáz expressziós mintázatáért felelős mechanizmus

vizsgálata

Az a megfigyelés, hogy a dUTPáz többnyire nem differenciálódott, osztódásban lévő

szövetekben fejeződik ki, hasonló regulációs mechanizmust sejtet, mint a számos dNTP

metabolizmusban részt vevő enzimek, pl. az RNR, a TS és a humán dUTPáz esetén. Vizsgálni

szerettem volna, hogy az ecetmuslica dUTPázban is van-e hasonló transzkripciós szintű

regulációs mechanizmus. Továbbá vizsgálni kívántam, hogy organizmus szintjén milyen

jelentősége van ennek a szabályozásnak, azaz mennyire fontos a muslica számára az uracilt

tartalmazó és nem tartalmazó DNS párhuzamos fenntartása a különböző szövetekben.

Az eddigi genom szekvenálási projektek során meghatározott Drosophila fajok DNS

szekvenciája alapján lehetséges a muslica dUTPáz gént potenciálisan reguláló genomi régiók

összehasonlítására. A Drosophila melanogaster dUTPázt kódoló gén (CG4584) a 2.

4.8. ábra.

Vad típusú és dUTPáz csendesített harmadik lárvastádiumú állatokból izolált imaginális

korongok genomi uraciltartalma.


76

kromoszóma bal karján található. A géntől 5’ irányban az Arginin metiltranszferáz 8 fordított

orientációban helyezkedik el, aminek köszönhetően a két gén transzkripcióját reguláló régiók

átfedhetnek (4.9. ábra A, 4.10. ábra B). Mind a 12 genom szekvenciája alapján

elmondható, hogy a dUTPáz gén 5’ szomszédja egy ellentétes orientációjú gén. A

melanogaster csoportban, melybe a D. melanogaster is tartozik, négy fajban is az Arginin

metiltranszferáz 8 található ebben a genomi pozícióban. További 8 fajban azonban egy Ran

GTPáz aktiváló fehérje, és egy fajban egy feltételezett oxidoreduktáz a dUTPáz gén 5’

szomszédja (4.9. ábra B).

A Drosophila melanogaster dUTPáz start kodonját kódoló régiótól (+1 pozíció) -289 - -

282 és -281 - -274 bázis távolságra lévő pozícióban egymás mellett található két azonos

palindrom szekvencia (TATCGATA), melyek az ún. „DNA Replication-related Element

binding Factor” (DREF) potenciális felismerő helyei (DRE) 230

. A 12 Drosophila faj

feltételezett dUTPáz promóterének szekvenciáját MAFFT 6 programmal összeillesztettem (E-

4.9. ábra.

(A.) A Drosophila melanogaster dUTPázát kódoló gén (CG4584) genomi környezete.

Art8: Arginin metiltranszferáz 8. (B.) A 12 ismert genommal rendelkező Drosophila faj

dUTPázát kódoló génjétől 5’ irányban, ellentétes orientációban található gének. Forrás:

FlyBase.org.

A


77

INS-i paraméter használatával) 231

. Ez alapján a DRE hely némi konzerváltságot mutat 10

Drosophila fajban (4.10. ábra A). A DREF transzkripciós faktor szabályozza a muslica DNS

polimeráz α és PCNA expresszióját is 232

. A DREF funkciója emlősökben is konzervált,

számos egyéb osztódással kapcsolatos gént is regulál, és többek között az E2F transzkripciós

faktorral is kooperál. A sejteket érő differenciációs szignálok gátolják a DREF transzaktiváló

hatását. Erre példa a Cut transzkripciós faktor, mely antagonisztikus módon tud kötni a DRE

motívumokhoz represszálva az osztódással kapcsolatba hozható géneket 233

. Az illesztés

alapján további konzerváltságot mutató régiókat a 4.10. ábra B-panelén jelöltem, az egyik a

transzkripció iniciációs régiót is magába foglalja.

A Drosophila melanogaster dUTPázának feltételezett promóterét promóter-riporter

rendszerekben kívántam vizsgálni. A riporter gén aktivitása alapján következtetni tudok a

4.10. ábra.

(A.) 10 Drosophila faj dUTPáz feltételezett promóterében található konzervált potenciális

DRE kötőhelyek. Szürkével kiemelve a DRE motívumok. (B.) A Drosophila melanogaster

dUTPáz feltételezett promóterének felépítése. A DRE motívumokat zöld, az egyéb

konzerváltságot mutató régiót szürke téglalapokkal jelöltem.

D. melanogaster -289 ---tatcgata----tatcgatagggttg

D. simulans -148 ---tattgata----tatcgataa-----

D. sechellia -147 ---tattgata----tatcgataa-----

D. yakuba -278 ---tatcgata----tatcgatag---tg

D. erecta -286 ---tatcgatatacatatcgat--gaatg

D. pseudoobscura -315 attgagatggcagtgcttcgataa-----

D. persimilis -316 attgagatggcagtgcttcgataa-----

D. mojavensis -391 ------gtggcggcttatcgataa-----

D. virilis -445 ------gtggtggtccaccgatat-----

D. grimshawi -381 ------gtggtggtccgccgatat-----

A


78

promóter működésére. Vizsgálni kívántam a feltételezett promóter különböző régióinak

szerepét, beleértve a két DRE motívumot a dUTPáz szövet és stádiumspecifikus expressziós

mintázatának kialakításában. Emelett tanulmányozni kívántam az expressziós mintázat

egyedfejlődésben betöltött szerepét a fejlődési mintázat megzavarásával. A muslica dUTPáz

expressziós mintázatot kialakító mechanizmust érintő vizsgálataim eredményei egyelőre

publikációra való előkészítés alatt állnak.

4.3.1. A dUTPáz promóter vizsgálata S2 sejtvonalban

A feltételezett dUTPáz promóter vizsgálatához a transzkripciós start szekvenciát kódoló

régiótól számított -3 -tól -1048 bázispár hosszú fragmentumot EGFP és luciferáz riporter

rendszerekbe helyeztem. A továbbiakban erre a szakaszra teljes hosszú dUTPáz promóterként

(dutP) fogok hivatkozni, noha elképzelhető, hogy távolabbi régiók is részt vesznek a dUTPáz

transzkripciójának szabályozásában, vagy épp ellenkezőleg, jóval rövidebb szakasz elegendő

lehet a szabályozáshoz. A feltételezett promóter különböző mértékben rövidített változatait is

létrehoztam, és riporter rendszerbe illesztettem. A dutPb és dutP2 konstrukciókban részben

vagy teljesen el lettek távolítva a DRE kötő helyektől 5’ irányban található régiók, a dutP3

konstrukcióban további rövidítéssel a két DRE hely is el lett távolítva. A 3’ irányból rövidített

régiók közül a dutPx2 konstrukció esetén a dUTPáz 5’ UTR szekvenciája, a dutPx1 esetén

pedig további 52 bázispárnyi régió lett eltávolítva. A DRE1 konstrukciót teljes hosszú

dUTPáz prómóter alkotja azzal a különbséggel, hogy a dUTPáz aminosavszekvenciát kódoló

régiótól távolabbi DRE motívum irányított mutagenezissel el lett rontva. Ehhez a

TATCGATA motívum első két nukleotidját GC-re módosítottam. Az irodalmi adatok alapján

ez a mutáció elegendő a kötőhely inaktiválásához 230

. A DRE2 konstrukcióban a kódoló

régióhoz közelebbi, a DRE12 konstrukcióban pedig mindkét DRE motívumot elrontottam

(4.11. ábra).

A promóter-EGFP riporter rendszereket S2 sejtekbe transzfektáltam és stabil

sejtvonalakat hoztam létre, melyekben a plazmidot hordozó sejtek feldúsultak. A promóter

aktivitását az EGFP aktivitás alapján áramlási citométerrel vizsgáltam. Az eredmények a 4.11.

ábra A-panelén láthatóak. A DRE motívumoktól 5’ irányban található régiók eltávolítása nem

eredményezte a promóter aktivitásának jelentős csökkenését. Azonban amennyiben a két DRE

hely is el lett távolítva, a promóter aktivitása drasztikusan lecsökkent közel a promóter nélküli

rendszer szintjére. A DRE motívumok külön-külön történő elrontása is jelentősen

csökkentette a promóter aktivitását, a két elem közül fontosabbnak azonban a dUTPáz

aminosavszekvenciát kódoló régiótól távolabbi DRE1 motívom bizonyult. Mindkét DRE


79

motívum elrontása eredményezi a legdrasztikusbb aktivitás csökkenést. A dUTPáz promóter

3’ irányból történő rövidítése is jelentős aktivitás csökkenéssel jár: az 5’ UTR eltávolítása

nagy mértékben csökkenti az aktivitást, ami a további rövidítés esetén közel a promóter

nélküli konstrukció szintjére esik.

4.11. ábra.

A dUTPáz feltételezett promóterének különböző rövidített és mutagenezissel elrontott

verziói riporter rendszerekben. A két DRE motívumot zöld körökkel, az elrontott helyeket

pedig szürke körökkel jelöltem. (A.) A promóter-EGFP riporter rendszerek aktivitása a

rendszert stabilan hordozó S2 sejtvonalakban. (B.) A promórer-luciferáz riporter

rendszerek aktivitása S2 sejtekben. A kétféle megközelítéssel kivitelezett promóter -

riporter rendeszer közel azonos eredményeket adott.


80

A promóter luciferáz riporter rendszereket szintén S2 sejtekben vizsgáltam. Mivel

ebben az esetben a kevés sikeresen transzfektált sejt is mérhető jelet ad, nem volt szükség a

plazmiddal rendelkező sejtek feldúsítására. Referenciaként az Orgyia pseudotsugata

multicapsid nucleopolyhedrosis virus OpiE2 promóterét használtam. A promóter konstrukciók

a luciferáz rendszerben hasonló eredményt adtak, mint promóter-EGFP rendszerek (4.11. ábra

B). Csupán annyi különbség figyelhető meg, hogy a DRE helyeket érintő mutációk

drasztikusabbak és az 5’ UTR eltávolítása kevésbé csökkenti a promóter aktivitását. Érdekes,

hogy míg a DRE motívumoktól 5’ irányban található régiók eltávolítása az EGFP riporter

rendszerekben enyhe csökkenést, addig a luciferáz riporter rendszerekben enyhe növekedést

eredményezett a promóter aktivitásában.

4.3.2. A dUTPáz promóter stádium-és szövetspecifikus regulálása

A dUTPáz promótert az embrió eredetű S2 sejteken kívül szövetekben is vizsgálni

szerettem volna. Ezért létrehoztam olyan riporter rendszereket, melyekben a promóter az E.

coli eredetű β-galaktozidáz riporter gént hajtja meg. Ezek a rendszerek P-elem transzpozon

integrációs helyekkel rendelkeznek, melyeknek köszönhetően muslica embrióba injektálva a

genomba beépíthetők, és transzgenikus törzsek létrehozására alkalmasak. Háromféle

promóter-β-galaktozidáz riporter rendszert hoztam létre, melyek a teljes hosszú (dutP), a DRE

motívumoktól 5’ irányban csonkított (dutP2) és teljes hosszú, de elrontott DRE motívumokkal

rendelkező promóter fragmentummal rendelkeznek. Mindhárom konstrukcióból számos

párhuzamos transzgenikus törzset hoztunk létre (4.12. ábra és Anyagok és módszerek 3.2.

táblázat). Minden törzsbe véletlenszerű integrációval épültek be a promóter-riporter

rendszerek.

4.12. ábra.

A dUTPáz promóter-β-galaktozidáz riporter rendszerek, és a belőlük létrehozott

párhuzamos transzgenikus törzsek száma.


81

A promóter-riporter rendeszer működésének embrióban történő vizsgálatában Batki

Júlia is közreműködött. Minden egyes törzsből hím egyedeket gyűjtöttünk, és vad típusú

W1118 szűz nőstényekkel kereszteztük. A keresztezésből származó embriókban ennek

köszönhetően nem kerül be anyai hatású β-galaktozidáz riporter fehérje. Az embriókat

összegyűjtöttük, és X-gal feséssel teszteltük a β-galaktozidáz aktivitást. Az embriók mellett

négyféle harmadik lárvastádiumú szövetet (CNS, szárny imaginális korong, középbél, here

primordium), felnőtt állatból ovárium és here szöveteket is gyűjtöttem és festettem. Az egy

konstrukcióhoz tartozó párhuzamos törzsekből 1-1 kiragadott vonalra jellemző festési

mintázat a 4.13. ábra látható. Az összes törzs szöveti festéseinek eredményeit összefoglalva a

4.14. ábra mutatja, ahol a promóter aktivitását indikáló szöveti festés erősségét is jelöltem.

4.13. ábra.

A dUTPáz promóter-β-galaktozidáz riporter rendszerek expressziós mintázata embrionális,

lárvális és felnőtt szövetekben. A β-galaktozidáz riporter fehérje aktivitását az X-gal

szubsztrát hidrolízisével járó kék elszíneződés indikálja. Az ábrán a párhuzamosan

létrehozott törzsek szöveteinek 1-1 reprezentatív festése lett bemutatva. Az összes törzs

szöveti festéseinek eredményei a 4.14. ábra láthatók.


82

A promóter aktivitása a CNS, imaginális korong és a középbélben található ventriculus

imaginális gyűrű szövetekben DRE függőnek bizonyult, a DRE12 törzsekben elvétve fordul

4.14. ábra.

A dUTPáz promóter-β-galaktozidáz riporter rendszerek aktivitása embrionális, harmadik

lárva stádiumú CNS, imaginális korong, ventriculus, here primordium, kifejlett ovárium és

here szövetekben. Minden egyes sor külön törzset jelöl, melyek a teljes hosszú (dutP),

DRE motívumoktól 5’ irányban rövidített (dutP2) vagy mutáns DRE motívumokkal

rendelkező promóter-riporter konstrukciók párhuzamos törzsei. Az X-gal festés alapján

megfigyelt β-galaktozidáz aktivitás mértékét kék színskálával jelöltem, ahol a sötétebb kék

nagyobb aktivitást, azaz aktívabb promóterműködést jelent. A nem festődött szöveteket

szürke színnel jelöltem.


83

elő festődés ezekben a szövetekben. A dutP2 törzsekben a dutP törzsekhez képest ritkábban

fordul elő festődés, és gyengébb, mint a teljes hosszú promóterrel rendelkező konstrukciók

esetén. Ez arra utalhat, hogy a DRE motívumoktól 5’ irányban található régió ezekben a

szövetekben magasabb promóter aktivitást tesz lehetővé. A CNS esetén a legintenzívebb

festődés az optikai lebenyben figyelhető meg, de a központi agy egyéb részein is

megfigyelhető promóter aktivitás (4.13. ábra).

A harmadik stádiumú lárvából izolált here primordiumok DRE és a DRE motívumoktól

5’ irányban található régióktól független promóter aktivitást mutatnak. Hasonló expressziós

mintázatot tapasztaltam az kifejlett állatok gonádjainak esetén is. Mindez arra utalhat, hogy a

a dUTPáz promótere gonádspecifikus reguláló régiókat is tartalmaz. A legegyszerűbb

feltételezés alapján ezek a régiók nem igénylik a DRE motívumokat, és azoktól 3’ irányban

találhatóak. Egy másik lehetőség, hogy a DRE motívumok, és a DRE motívumoktól 5’

irányban található régiók együttesen stimulálják ezekben a szövetekben a promóter

aktivitását. Ennek vizsgálatához létre kell hoznunk olyan promóter-riporter transzgén

törzsekrt, melyekben mind a DRE helyek, mind az azoktól 5’ irányban található régiók el

vannak távolítva. Mind a here primordium, mind a kifejlett állatokból izolált here az apikális

osztódási centrumokban mutatja a legintenzívebb festődést (4.13. ábra). Érdekes, hogy a

kifejlett állatokból izolált herék annak ellenére mutattak erős promóter aktivitást, hogy a

dUTPáz fehérje nem mutatható ki a szövetben. Vilmos Péter in situ hibridizációval kimutatta,

hogy a dUTPáz mRNS szinten sincs jelen a felnőtt állatok heréiben. A dUTPáz gén

feltehetően represszálódik ebben a szövetben, amiért az általam vizsgált 1048 bázispár hosszú

fragmentumon kívüli regulációs hely lehet felelős. Az a kifejlett állatok heréin kívül minden

más szövet a dUTPáz fehérje expressziós mintázatának megfeleltethető promóter aktivitást

mutat (lásd. 4.7. ábra.).

Bár az embrionális eredetű S2 sejtekben jól karakterizálható és DRE-függő módon

működött a vizsgált dUTPáz promóter szakasz, a promóter-riporter allélokat hordozó

transzgén állatok embrionális szöveteire ez nem mondható el. A létrehozott transzgén törzsek

jelentős része egyáltalán nem mutatott promóter aktivitást az embrionális stádiumokban (4.14.

ábra). A többi törzs látszólag a DRE és DRE motívumoktól 5’ irányban található régióktól

független módon kapcsolta be a riporter gént. A festődést mutató egyedek csupán gyenge

aktivitást mutatnak, ami a 13. embrionális stádiumtól jelenik meg. A festődés főleg az embrió

dorzális és anterior régióira korlátozódik, előbbiben szegmentáció is megfigyelhető (4.13.

ábra). A nem egyértelmű festődés és a nagymértékű variancia annak lehet a következménye,

hogy a különböző genomi környezet nagyobb mértékben befolyásolyásolja a riporter


84

expresszióját, mint a promóterben található regulációs helyek. Feltehető azonban, hogy az

embrió számára nem fontos a dUTPáz termelése, ugyanis mint ahogy Békési Angéla

kimutatta, az embrióba jelentős mennyiségű dUTPáz mRNS transzportálódik az anyai

hatásnak köszönhetően 215

.

4.3.3. A dUTPáz expressziós reguláció jelentősége

Láthattuk, hogy a dUTPázt expresszáló szövetek minimalizálják az dUMP beélpülését a

DNS-be. Tekintve azonban, hogy a dUTPázt nem expresszáló szövetek tolerálni képesek a

módosult bázisok felhalmozódását a genomjukban kérdéses, hogy a dUTPáz expressziós

mintázat milyen szerepet tölt be az egyed életciklusában. A kérdés megfordítva: van-e

valamilyen élettani jelentősége a DNS-ben megjelenő uracil bázisoknak. E kérdések

megválaszolására olyan muslicatörzsek vizsgálata alkalmas, melyekben a dUTPáz expressziót

megzavarjuk. Muha Villő és Békési Angéla a dUTPáz csendesített muslicák karakterizálása

során megfigyelték, hogy a dUTPáz expresszió teljes állatban történő korlátozása a korai báb,

de legkésőbb az 5. báb stádiumban letalitást okoz. Tehát a dUTPáznak legkésőbb a megfigyelt

letálfázis alatt fontos szerepe van feltehetően a genom uraciltartalmának alacsonyan

tartásában. Az expressziós mintázat megzavarása a csendesítés mellett a fehérje

túltermelésével is megvalósítható. Vizsgálni szerettem volna tehát, hogy a dUTPáz

kifejeződés bekapcsolása milyen hatással van az egyébként nem expresszáló szövetekre.

Erdélyi Miklós és Vilmos Péter segítségével olyan törzseket hoztunk létre, amelyekbe

az élesztő Gal4 transzkripciós faktorral meghajtható, UAS promóterrel rendelkező dUTPáz

allélt integráltuk. A bevitt gén a D. melanogaster dUTPáz nukleáris izoformájának cDNS-ét

foglalja magába. A konstrukció által kódolt fehérje C-terminálisához egy 3xFLAG epitóp tag-

et is fúzionáltunk, hogy expresszióját el tudjuk különíteni az endogén dUTPáz

kifejeződésétől. Két párhuzamos transzgenikus törzset kaptunk, melyekbe a transzgén a

véletlenszerű integrációnak köszönhetően eltérő genomi pozíciókba épült be (DmDut20 és

DmDut29, lásd. Anyagok és módszerek 3.2. táblázat). A dUTPáz túltermelés indukálásához a

törzseket Act-Gal4 vagy MS1096 törzsekkel kereszteztem. Előbbi aktin promóterének

köszönhetően az összes sejtben, utóbbi pedig a szárny diszkusz kifejlett szárny dorzális

felszínét kialakító régiójában és a nyálmirigyekben termeli a Gal4 transzkripciós faktort.

Elviekben tehát mindkét keresztezésből származó utód képes termelni a dUTPázt a

nyálmirigyben, amely alap esetben nem mutat expressziót.

Hogy ellenőrizzem, az indukált egyedek valóban termelik a transzgén fehérjét, a Gal4 és

a dUTPáz-3xFLAG allélokat egyszerre hordozó egyedekből harmadik stádiumú lárvákat


85

gyűjtöttem, melyekből nyálmirigyet izoláltam. A szöveteket immuncitokémiával dUTPáz és

FLAG elleni antitestekkel festettem. Míg a vad típusú nyálmirigy csupán az imaginális

gyűrűben mutat festődést, a bekapcsolt expressziójú transzgén állatokból izolált nyálmirigy

egyéb részei is festődnek (4.15. ábra).

Megállapítható tehát, hogy a dUTPáz fehérje valóban kifejeződik a nyálmirigyben, azaz

a termelődést nem befolyásolja érdemben egy esetleges poszttranszkripciós vagy

poszttranszlációs szabályozás.

A teljes állatban illetve a nyálmirigyben dUTPázt túltermelő állatokat megvizsgálva

nem tapasztaltunk a normális egyedektől eltérő fenotípust, sem egyedfejlődési defektust vagy

letalitást. Az állat szöveteinek morfológiája, beleértve a nyálmirigyet a vad típuséval

4.15. ábra.

A muslica dUTPáz-3xFLAG fúziós fehérje túltermelése harmadik stádiumú nyálmirigy

szövetekben. Az első sorban a vad típusú állatok endogén dUTPáz expressziója látható,

ami csupán az imaginális gyűrűre korlátozódik. A második és harmadik sorban az Act-

Gal4 illetve MS1096 driver konstrukciókkal meghajtott dUTPáz-3xFLAG termelődése

látható, ami a teljes nyálmirigy szövetre kiterjed.


86

megegyező volt. Mindez arra utal, hogy a dUTPáz repressziónak nincs létfontosságú élettani

funkciója az érintett szövetekben.

4.4. A dUTPáz jelentőségének vizsgálata a genom integritásának

megőrzésében

Az irodalmi áttekintésben bemutatott E. coli, S. cerevisiae és C. elegans példák

demonstrálják, hogy a dUTPáz a DNS uraciltartalmának minimalizálásával fontos szerepet

játszik a genom integritásának megőrzésében (lásd. 1.4.1. fejezet). Ezekben az

organizmusokban az uracil-DNS fragmentálásáért és az ezzel járó letalitásért elsősorban az

UNG felelős. Ezzel szemben az emlős sejtek egyedi genom metabolizmusára utalhat az, hogy

életképességüket a dUTPáz csendesítés az eddigi megfigyelések alapján nem csökkenti. A

dUTPáz jelentősége ezekben a sejtekben abban nyilvánul meg, hogy védelmet nyújt a

genotoxikus TS gátló drogokkal szemben. Kérdés, hogy a muslica dUTPáz csendesítése

milyen módon vezet letalitáshoz a korai báb stádiumban, és a letalitás lehet-e az átalakulásban

lévő szövetek genom fragmentálódásának következménye, mint ahogy a többi dUTPáz

hiányos organizmusban is feltételezhető. Ebben az esetben a genom fragmentálódás nem

várható az UNG enzimtől, ugyanis az nincs jelen muslicában. Muha Villő kimutatta, hogy az

embrió szövetek és az embrionális eredetű S2 sejtek tolerálják a nagy mennyiségű uracilt

tartalmazó plazmidok jelenlétét sőt, a rajta kódolt géneket átírni is képesek, ami egybevág

azzal, amit az UNG hiányában várhatunk. Azonban a dUTPáz csendesítés esetén a báb

stádiumban tapasztalható letalitás arra utal, hogy az UNG hiánya ellenére is létezik uracil-

DNS intoleranciát kiváltó mechanizmus muslicában. Ennek az ellentmondásnak a feloldása

érdekében részletesen vizsgálni kívántam a dUTPáz csendesítés által okozott letalitás

molekuláris hátterét.

Ellentmondásosnak tűnik a TS gátló drogok citotoxicitása is abból a szempontból, hogy

milyen enzimek befolyásolják velük szemben a rezisztenciát. Az alapján, hogy a hibáspár

javítás hiánya rezisztenciát biztosít, a dNTP aránytalansát, az alapján pedig, hogy a dUTPáz

csendesítés érzékenyít, az uracil vagy 5FU DNS-be történő beépülését feltételezhetjük a

toxicitás kiváltójának. A két megfigyelés összeegyeztetése érdekében a dUTPáz TS gátló

drogokkal szemben mutatott védő hatását olyan humán sejtvonalakon kívántam vizsgálni,

melyekben a dNTP arányokat nukleozidok hozzáadásával is igyekeztem befolyásolni.


87

4.4.1. A dUTPáz csendesítés hatása a muslica genom integritására

A dUTPáz csendesítésének hatásait muslicában szövetekre korlátozott és molekuláris

szinten kívántam vizsgálni. A szöveti szintű vizsgálatokhoz szükséges a közvetett hatások

kizárása, amelyre a teljes állatot érintő csendesítés nem ad lehetőséget. Molekuláris szinten

vizsgálni kívántam azt, hogy a csendesítés milyen hatással van a genom integritására valamint

azt, hogy a dUTPáz hiányában a DNS-ben megjelenő uracil milyen sejtválaszokat vált ki. A

vizsgálataim során kapott eredmények túlnyomó részét a PLoS Genetics folyóiratban

közöltük le, további része pedig a Fly folyóiratnál elbírálás alatt áll (lásd. Közlemények

listája).

4.4.1.1. A dUTPáz csendesítés sejtautonóm hatásának kimutatása

A csendesítés során megfigyelt letalitás a csendesítőallél teljes állatban történő

expressziójával volt kiváltható. Szándékomban állt azonban a csendesítés lokális, sejt

autonóm hatásának vizsgálata is. A dUTPáz csendesítőallélok szövet specifikus

expresszálásával kizárhatóak a közvetett és a komplex homeosztázist érintő hatások. A

szövetspecifikus csendesítés indukálásához a 21883 vagy 21884 dUTPáz csendesítőallélokkal

rendelkező törzseket engrailed-Gal4 vagy MS1096-Gal4 driver törzsekkel kereszteztem

(Anyagok és módszerek 3.2. táblázat). Az engrailed promóter a szárny diszkusz a kifejlett

szárny poszterior régióját kialakító részében, míg az MS1096 promóter a szárny diszkusz a

kifejlett szárny dorzális régióját kialakító részében indukálja a dUTPáz csendesítését (4.16.

ábra A). A keresztezésből kikelt kifejlett UAS-RNAi és engrailed-Gal4 allélokat hordozó

kifejlett állatok penetráns deformált szárny fenotípust okoztak. A deformált szárny csupán az

anterior régióban volt ép, a poszterior régió teljesen degradálódott (4.16. ábra B). Azok a

kifejlett egyedek, amelyek az UAS-RNAi és MS1096-Gal4 allélokat hordozzák szintén nagy

arányú szárny deformáltságot mutatnak. Ebben az esetben a szárny deformáltsága felfelé hajló

szárnyak formájában nyilvánult meg, továbbá a csendesített állatok egy kisebb részében

szárny hólyagosodás is megfigyelhető volt (4.16. ábra C). A felfelé hajló szárny a dorzális

szárnyfelszín csökkenésének eredménye lehet, melyet a differenciálódó szárny dorzális

régiójában bekövetkező degradáció okozhatott. A szárnyban megjelenő hólyagok a két

szárnyfelszínt létrehozó sejtrétegek közötti kapcsolódások defektusára utal.


88

Elmondható tehát, hogy a dUTPáz csendesítés valóban sejt autonóm módon képes a

szövetek degradációját kiváltani. Vizsgálni kívántam, hogy a megfigyelt sejt autonóm

fenotípus menekíthető-e a dUTPáz túltermelésével. Ehhez Erdélyi Miklós és Vilmos Péter

olyan muslica törzseket hozott létre, melyekben a 21883 vagy 21884 csendesítőallélok a

DmDut20 vagy DmDut29 UAS-dUTPáz-3xFLAG allélokkal lettek kombinálva (Anyagok és

4.16. ábra.

(A.) A lárvális szárny diszkusz kifejlett szárnyat kialakító régiói. Az engrailed promóter a

poszterior, az MS1096 promóter a dorzális régióban indukál expressziót. (B.) A

csendesítőallélok (21883 és 21884) valamint a kontrollként használt fluoreszcens

MoeCherry engrailed specifikus expressziójának hatása a szárny fenotípusra. A deformált

szárny a poszterior régió degradálódásának köszönhető. (C.) A csendesítőallélok és azok

dUTPáz túltermelő allélokkal való kombinációinak indukálása MS1096 specifikus módon.

Az ábrán a megfigyelt szárnyfenotípusok előfordulási aránya látható. A deformált szárny

felfelé hajlását a dorzális szárnyfelszín degradációja okozhatta.


89

módszerek 3.2. táblázat). Ezeket a törzseket az MS1096-Gal4 driver törzzsel kereszteztem. A

kapott utódokban az MS1096-Gal4 egyszerre indukálja a csendesítő és a dUTPáz-3xFLAG

transzgén expresszióját. Mint ahogy a 4.16. ábra C-panelén látható, a dUTPáz túltermelése

minden kombinációban megszüntette a csendesítésre jellemző fenotípust és maradéktalanul

helyreállította a normális szárny fenotípust.

4.4.1.2. A dUTPáz csendesítés okozta fenotípus molekuláris jellemzése

A degradált szárny fenotípus hátterében állhat fokozott sejthalál vagy csökkent

sejtosztódási ráta a fejlődő szárny primordiumban. Hogy ezeket a lehetséges okokat

vizsgálhassam aktin-Gal4 driverekkel indukált dUTPáz csendesített harmadik lárva

stádimumú állatok szöveteit TUNEL vagy BrdU próbával festettem. A TUNEL próba során a

sejtbeli DNS szabad 3’ végek jelölése történik, melyek nagy mennyiségen a genom

fragmentálódásának köszönhetően jelennek meg. Ez a módszer elterjedt az apoptózissal járó

DNS fragmentáció kimutatására. A BrdU próba során a frissen izolált szövetet BrdU-val

kiegészített médiumba helyezzük. A szövet S-fázisban lévő sejtjei a BrdU molekulákat

metabolizálják és beépítik a genomjukba. A DNS-be beépült bromo-uracil antitest festéssel

kimutatható. A módszer a szövetek S-fázisú, azaz aktív osztódást mutató sejtjeinek

kimutatására alkalmas.

Vad típusú és dUTPáz csendesített szárny diszkuszokat TUNEL próbával festettem.

Mint ahogy a 4.17. ábra A- és B-panelén látható, a csendesített imaginális prekurzor

szövetben jóval több TUNEL pozitív sejt mutatható ki. A festés tehát növekedett DNS

fragmentációra utal a dUTPáz hiányos szövetekben. Ezt kétféle mechanizmus

eredményezheti: egy potenciális uracil-DNS felismerő és hasító enzimrendszer, vagy az

apoptózis során a kaszpázok által aktivált DNS degradáció. Mivel a sejtenként detektált erős

festődést nem várnánk a DNS uraciltartalma alapján, inkább a közvetett mechanizmus által

kiváltott sejthalált feltételezhetünk. Utóbbi esettben elmondhatjuk, hogy a dUTPáz hiánya

képes apoptózist kiváltani Drosophila sejtekben.


90

A sejtosztódási mintázat vizsgálatához vad típusú és dUTPáz csendesített állatok CNS,

szem és szárny imaginális szöveteit festettem BrdU próba segítségével. Mint ahogy a 4.18.

ábra látható, a csendesített és a vad típusú szövetek között nincs kimutatható különbség. Az

osztódási ráta tehát nem mutat csökkenést a dUTPáz csendesített harmadik lárvastádiumú

imaginális szövetekben.

4.17. ábra.

(A.) Vad típusú (W1118) és dUTPáz csendesített (RNAi, felhasznált csendesítőallél:

21883) harmadik stádiumú lárvák szárny diszkuszainak festése TUNEL próbával. A festés

a fragmentált genommal rendelkező sejteket mutatja ki. (B.) A TUNEL pozitív sejtek

átlagos száma vad típusú és dUTPáz csendesített szárny diszkuszokban.


91

A DNS kettős száltörések vagy a sejtben hosszabb ideig exponált egyes szálú DNS a

DNS károsodás sejtválasz (DDR) ATM vagy ATR kinázait aktiválja. A sejtválasz során

mindkét kináz foszforilálni képes a DNS károsodás közelében található H2AX hisztont. A

foszfo-H2AX hiszton a sejtekben a DNS károsodás fókuszpontjait indikálja. Muslicában a

H2AX fehérjének a H2AV hiszton variáns felel meg. Hogy kimutassam, vajon a dUTPáz

csendesítés hatására aktiválódik-e a DNS károsodás sejtválasz, vad típusú és csendesített

harmadik lárva stádiumú lárvából izolált szárny imaginális korongokat immuncitokémiával,

foszfo-H2AX elleni antitesttel festettem. Míg a vad típusú szövetekben nem sikerült kimutatni

H2AV foszforilációt, a csendesített szövetekben számos foszfo-H2AV fókuszpontot

figyelhetünk meg (4.19. ábra).

4.18. ábra.

Vad típusú (W1118) és dUTPáz csendesített (RNAi, felhasznált csendesítőallél: 21883)

harmadik lárvastádiumú állatokból izolált központi idegrendszer (CNS) és imaginális

diszkuszok festése BrdU próbával. A próba az S-fázisú sejtek jelölésével a szövetek

sejtosztódási mintázatát mutatja ki. A csendesített szövetek nem mutatnak a vad típustól

eltérő osztódási mintázatot. Osztódási zóna figyelhető meg a CNS optikai lebenyében és a

szem imaginális korong morfogenetikus sávjában.


92

Elmondható tehát, hogy a dUTPáz csendesítés a DDR aktiválódásához és a genom

fragmentálódásához vezet a harmadik lárvastádiumú imaginális szövetekben. Mint ahogy az

irodalmi áttekintésben bemutattam, a DDR sejthalált kiválthat (lásd. 1.5.3. fejezet).

Elképzelhető, hogy a megfigyelt fragmentációért is a DDR által kiváltott apotózis felelős. Bár

a DDR sejciklus leállást is kiválthat (lásd. 1.5.1. fejezet), sejtosztódási mintázatot érintő

változást nem sikerült kimutatni dUTPáz hiányában. Mivel a teljes állatot érintő dUTPáz

4.19. ábra.

Vad típusú (W1118) és dUTPáz csendesített (RNAi, felhasznált csendesítőallél: 21883)

harmadik lárvastádiumú állatokból izolált szárny imaginális diszkuszok festése anti-

foszfo-H2AX (pH2AX) antitesttel. A csendesített szövetekben a muslica H2AX homológ

hiszton variáns fókuszpontokban történő foszforilálódása látható. A felvételeken a szárny

diszkusz zseb (wing pouch) és kapocs (hinge) régiója látható kinagyítva. Az ábrán látható

skála 50 μm távolságot jelöl.


93

csendesítés letálfázisa a korai báb állapotokat érinti, elképzelhető, hogy a festésekkel

kimutatott jelenségek ebben a stádiumban mutatkoznak meg legnagyobb mértékben.

Lehetséges tehát, hogy a sejtosztódási mintázat a báb állapot alatt már eltér a normálistól,

azaz az osztódás leállásának szerepe a csendesített szövetek degradációjában nem kizárható.

4.4.2. A dUTPáz hozzájárulása az 5-fluorodezoxiuridin toleranciához

A dUTPáz csendesítés hatását a TS gátlással összefüggésben is szerettem volna

vizsgálni. Ismert, hogy a dUTPáz védi a sejteket a TS gátló metabolitok, mint pl. az 5-fluoro-

dUTP genotoxikus hatásaitól (lásd. 1.4.2. fejezet). UNG kiütött E. coli és egér MEF és

sejtekben kimutattam, hogy az 5FdU kezelés a genom uraciltartalmának növekedéséhez vezet

(lásd. 4.1.2. fejezet), ami a TS gátlás következtében megnőtt dUTP készlet expanziójával

magyarázható. A sorba beilleszthető a Muha Villő által kimutatott, Drosophila S2 sejtek

drogkezelése esetén megfigyelhető genomi uracilfelhalmozódás is, ami szintén UNG enzim

hiányában történik. Míg az E. coli-ban, S. cerevisiae-ben és C. elegans-ban elsősorban az

UNG aktivitás, emlős sejtekben inkább a hibáspár javítás felelős a genotoxikus hatás

következtében tapasztalható DNS száltörések megjelenéséhez (lásd. 1.4.2. fejezet). A

hibáspár javítás részvétele arra utal, hogy a TS gátlás a dNTP komponensek arányainak

felborulásához vezet, az aránytalan készletek jelenlétében pedig gyakori hibát vétenek a DNS

polimerázok a replikáció során. Nem világos azonban, hogy a dUTPáz ezt a folyamatot

milyen módon mérsékli, enzimaktivitása során ugyanis az 5FdU metabolit 5-fluoro-dUTP

hidrolízisét katalizálja 5-fluoro-dUMP-vé, ami éppen a TS inhibitora. A hidrolízissel egyúttal

az 5-fluoro-dUMP DNS-be történő beépülését is megakadályozza. A kérdés tehát az, hogy a

módosult nukeotidok bepülése, vagy a dNTP koncentrációk TS gátlásnak köszönhetően

megborult aránya váltja-e ki az 5FdU toxicitást.

A kérdés tisztázásához dUTPáz csendesített humán sejtvonalakat kívántam felhasználni.

Ezekben a sejtvonalakban vizsgálni kívántam, hogy a dezoxiuridin (dU) képes-e menekíteni

az 5FdU toxicitását feltételezve azt, hogy vagy a dU metabolit dUMP kompetitív módon

kiszorítja az 5-fluoro-dUMP-t a TS aktív helyéről, vagy a dUTP kompetitív módon csökkenti

az 5-fluorouracil feldúsulását a DNS-ben. A dUTPáz csendesítés esetén a dU kezelés miatt

feltehetően feldúsult dUTP hatása vizsgálható, ami a TS gátlás esetén akár a dTTP hiányát is

mérsékelheti. A drogkezelések hatását a sejtek életképességének követésével kívántam

vizsgálni.

Mint ahogy a 4.20. ábra A-panelén látható, a vad típusú és a dUTPáz csendesített sejtek

eltérő érzékenységet mutatnak az 5FdU toxicitásra nézve. A dUTPáz csendesített sejtek két


94

nagyságrenddel érzékenyebbek a drogkezelésre. Ezzel szemben a dU kezelés semmilyen

kimutatható hatással nincs a sejtvonalak életképességére (4.20. ábra B). A két sejtvonalban

vizsgáltam a dU és dezoxitimidin (dT) hatását az 5FdU toxicitásra. A vad típusú és dUTPáz

csendesített sejteket a IC50 koncentrációban kezeltem 5FdU droggal. A drogkezelés hatását

különböző koncentrációjú dU vagy dT hozzáadásával próbáltam komplementálni. A

várakozásoknak megfelelően, a dT mérsékelte az 5FdU toxicitást. Ezzel szemben az 5FdU

kezelés dU-val történő kiegészítése a dUTPáz csendesítésétől független módon tovább

csökkentette a sejtek életképességét (4.20. ábra C és D).

4.20. ábra.

(A.) 5-fluoro-dezoxiuridin (5FdU) hatása vad típusú és dUTPáz csendesített HeLa sejtek

életképességére. (B.) Dezoxiuridin (dU) hatása vad típusú és dUTPáz csendesített HeLa

sejtek életképességére. (C.) Dezoxitimidin (dT) és dU hatása vad típusú, 200 μM 5FdU

jelenlétében növesztett HeLa sejtek életképességére. (D.) dT és dU hatása dUTPáz

csendesített, 2 μM 5FdU jelenlétében növesztett HeLa sejtek életképességére. Mindkét

sejtvonal esetén elmondható, hogy a dT mérsékli, a dU pedig fokozza az 5FdU toxikus

hatását.


95

Eredményeink alapján tehát elmondható, hogy a dU kezelés önmagában nem

genotoxikus még a dUTPáz csendesítése esetén sem, noha elképzelhető, hogy a csendesítés

nem elegendő a sejtbeli dUTPáz aktivitás teljes megszüntetéséhez, és a jelentősen

lecsökkentett enzimaktivitás elegendő védelmet biztosít az uracil DNS-beli

felhalmozódásával szemben. Ebben az esetben a dUTPáz funkcióvesztés csupán génkiütött

sejteken vizsgálható. Továbbá annak ellenére, hogy a dU timin analóg bázissal rendelkezik, a

dT-vel szemben nem mérsékli, hanem épp ellenkezőleg, fokozza az 5FdU toxicitását. A dU

tehát valószínűleg a továbbra is fennálló dNTP aránytalanság miatt a DNS-be hibáspárként

épülhetett be, ezáltal fokozva a hibáspár javítás által közvetített toxicitást.

Eredményeinket nem támasztja alá Pettersen és társai megfigyelése, akik hasonló

kísérletben a dU 5FdU toxicitást részlegesen mérséklő hatását mutatták ki 156

. Pettersenék

több sejtvonalat is vizsgáltak, de a mérséklő hatást csak az egyiken sikerült kimutatni, a másik

két sejtvonalon semmilyen hatás nem volt tapasztalható. A megfigyelések közötti eltérést

eredményezhetik a sejtvonalak közötti egyedi különbségek, melyek a drogok felvételét és

konverzióját érinthetik. Hozzá kell tenni, hogy Pettersenék sejtvonalaiban megfigyelhető

5FdU toxicitást más irodalmi adatokkal ellentétben a hibáspár javítás sem befolyásolta, és az

AP-helyek kijavításának és a PARP enzimek gátlása menekítette. Tehát ezekben a sejtekben a

DNS javítási profil is eltérő lehet, ami a kísérlet kimenetelét befolyásolhatta.

ÖSSZEFOGLALÁS, KONKLÚZIÓ

96

5. Összefoglalás, konklúzió

Az elsőként kitűzött cél a DNS-beli uracil kvantitatív kimutatása volt. Ezt az archea

eredetű Pfu DNS polimeráz qPCR-ben való felhasználásával sikerült megvalósítani.

Független módszerrel is ellenőriztem, hogy a módszer valós képet ad az uracil bázisok

előfordulási valószínűségéről DNS-ben (4.3. ábra). Kimutattam, hogy a qPCR-ben

felszaporított fragmentum méretének növelésével a módszer érzékenysége is növelhető (4.2.

ábra B), tehát a várt uraciltartalomnak megfelelően optimalizálható. Elmondható, hogy

fiziológiás mintákban is kimutatható a Pfu DNS polimerázzal detektált DNS összetételbeli

különbség dUTPáz, TS gátlás vagy UNG hiányának következtében. A mért változás minden

esetben magyarázható a génkiütés vagy az enzimgátlás következtében módosult genom

összetételének megváltozásával. A genomi DNS mintaelőkészítése több lépést igényel, mint a

rövid DNS fragmentumoké. Egyrészt szükséges a DNS bizonyos mértékű feldarabolása, a

genomi DNS oldatból történő közvetlen mérés ugyanis nehezen reprodukálható az oldat

inhomogenitása miatt. Másrészt a qPCR-ben vizsgálni kívánt fragmentumot fel kell dúsítani.

Ezzel a lépéssel részben megszabadulunk a nem templátként jelen lévő uracil-DNStől is, ami

gátolja a Pfu DNS polimerázt a PCR reakcióban. A qPCR-en alapuló módszer fontos

jellemzője, hogy az uracil bázisok előfordulási gyakoriságát nem a teljes genomra, hanem

csak primerekkel kijelölt régióra határozza meg. A mért adatok genomra való kiterjesztéséhez

azzal a feltételezéssel kell élnünk, hogy a teljes genomban is a vizsgált szakaszon megfigyelt

uracil előfordulás jellemző. Tekintetbe véve a genom heterogenitását, ez a feltételezés nem

minden esetben tartható. A módszer azonban ennek ellenére is alkalmas arra, hogy a genom

összetételét akár különböző módon befolyásoló hatásokat vizsgáljunk. A behatárolt genomi

régiókra tervezett mérésekkel éppen a genom heterogenitása vizsgálható az uracil előfordulási

gyakoriságára nézve, amennyiben több genomi szakaszon is elvégezzük a mérést. E módszer

publikálását követően mások is sikeresen alkalmazták a Pfu DNS polimerázt uracil-DNS

kimutatására: ezzel a megközelítéssel sikerült kimutatni az uracil bázisok feldúsulását

immnunsejtekben átíródott HIV reverz transzkriptumban 234

.

E. coli mellett a musclia példák alapján is elmondhatjuk, hogy túlnyomórészt a dUTPáz

felelős a DNS uraciltartalmának alacsonyan szinten való tartásában: mint ahogy az dUTPáz

hiánya E. coli-ban UNG mutáns háttéren nagy mértékű DNS-beli uracil felhalmozódást okoz

(4.4. ábra.), muslicában a szöveti dUTPáz expresszió (4.6. ábra.) illetve annak csendesítése

befolyásolja a genom uraciltartalmát (4.7. ábra.és 4.8. ábra.). Ez alátámasztja azt, hogy a


97

sejtbeli dTTP mellett jelentős mennyiségű dUTP is keletkezik, ami a dUTPáz hiányában nagy

eséllyel hasznosul a DNS szintézis során. Ezzel szemben az UNG hiányos organizmusok

genomi uraciltartamát a vad típussal összevetve (4.4. ábra. és 4.5. ábra.) elmondható, hogy az

UNG alapvetően nem befolyásolja a genom uraciltartalmát. Ez alól csupán az exponenciális

növekedést mutató E. coli volt kivétel. Mint ahogy a MEF sejtek esetén megfigyelhető, az

UNG hatása akkor nyilvánul meg, ha a timidilát metabolizmus zavart szenved, például TS

gátlás esetén (4.5. ábra). Mindezek alapján feltételezetjük, hogy az UNG egy olyan tényező,

amely alapvetően a DNS-beli uraciltartalom expanzióját akadályozza meg.

Mindenképpen ki kell emelni, hogy jelen ismereteink szerint az ecetmuslica az egyetlen

olyan eukarióta organizmus, amely uracil szubsztituált genomot tart fenn bizonyos

szöveteiben. Ugyan az imaginális szövetekben is lehetséges az uracil genomi feldúsítása a

dUTPáz csendesítésével (4.8. ábra.), azonban a letalitás alapján ez csak a báb állapotig

fenntartható. Bár Muha Villő kísérletei alapján tudjuk, hogy embrionális sejtek is képesek

tolerálni az uracil-DNS-t, a genomi uracil-szubsztitúció hatása az embrionális szöveti

fejlődésre egyelőre nem ismert. Az anyai hatásnak és a Gal4 - UAS rendszer korlátainak

köszönhetően ugyanis a dUTPáz embrionális szövetekben való jelenlétét nem sikerült

csökkenteni. Embrióban a dUTPáz genom védő szerepét ováriumban történő csendesítéssel

vagy kondicionális génkiütéssel lehetne vizsgálni a jövőben.

Az uracil-DNS mintázat és a dUTPáz expresszió összevetése alapján elmondhatjuk,

hogy a dUTP kizárása a replikációból elsősorban a nem differenciált sejtekben szükséges. Az

endoreplikációt mutató lárvális differenciált szövetek nem igénylik a dUTPáz jelenlétét.

Emlős differenciált sejtekre is jellemző a csökkent dUTPáz expresszió. Bizonyos DNS- és

retrovírusok melyek differenciált sejtekben replikálódnak vagy reverz transzkriptálódnak,

gyakran saját dUTPázt kódoló génnel rendelkeznek, amivel kompenzálni képesek a magas

sejtbeli dUTP koncentrációt. A szintén nem osztódó T-sejtekben és makrofágokban

replikálódó HIV ezzel szemben éppen a magas celluláris dUTP koncentrációban azaz

alacsony dUTPáz expresszióban érdekelt, ugyanis az ilyen körülmények között reverz

transzkriptált DNS kevésbé hajlamos autointegrációra. Mindez arra is utal, hogy a HIV

integrázra szintén jellemző az uracil-DNS diszkrimináció 234

.

A másik kiemelt célom az volt, hogy feltárjam, a muslica szövetek milyen

mechanizmussal regulálják a dUTPáz expresszióját. Embrió eredetű S2 sejtek és a lárva

imaginális szöveteiben vizsgálva a dUTPáz promóterét arra a következtetésre jutottam, hogy

két potenciális DRE motívum lehet felelős az osztódó sejtekre specifikus dUTPáz


98

kifejeződésért. Elmondhatjuk, hogy míg számos dNTP metabolizmusban részt vevő gén

sejtciklus függő regulációjáért az E2F transzkripciós faktor felelős (párhuzamba a humán

dUTPáz állítható), a muslica lárva imaginális szöveteiben és az embrió eredetű S2 sejtekben

ezt a feladatot a DREF veheti át. A CNS bár differenciált funkciókkal bír, mint ahogy a 4.18.

ábra mutatja, nagyszámú osztódásban lévő sejtet is tartalmaz, ami indokolja a dUTPáz

expresszió jelenlétét. A 4.13. ábraval való összevetés alapján elmondható, hogy az optikai

lebenyben legintenzívebb a sejtosztódás és a dUTPáz promóter aktivitása. Az S2 sejtekben

végzett kísérletek azt mutatták, hogy mindkét DRE motívum hozzájárul a promóter

aktivitásához, noha a két elem közvetlenül egymás mellett helyezkedik el, ami a két DREF

egyidejű kötését megakadályozhatja. Elképzelhető, hogy az egyszeres DRE motívumhoz

képest a kétszeres hely a DREF nagyobb frekvenciával történő dokkolását teszi lehetővé.

A DRE motívumok szerepét nem minden szövetben sikerült kimutatni. A lárvális és

imágó gonádok DRE független erős expressziót mutattak, ami arra utal, hogy ezekben a

szövetekben a dUTPáz promóter aktiválódását más, gonád specifikus mechanizmusok

stimulálják. Ez a megkülönböztetés érthető annak tükrében, hogy a csíravonalak genomi

DNS-ének több generáción keresztül kell stabilnak lennie. Ellentmondást tapasztaltam az

imágó here dUTPáz expresszió és a dUTPáz promóter aktivitása között: míg az endogén

dUTPáz termelődés nem kimutatható ebben a szövetben, az általam vizsgált promóter-riporter

rendszer bekapcsolódott. Ennek az ellentmondásnak az lehet az oka, hogy az általam

létrehozott promóter-riporter rendszer nem foglalt magába minden transzkripciót reguláló

elemet. Mindenesetre érdekes, hogy ugyan osztódási centrumok találhatók benne, a here

szövet nélkülözi a dUTPáz fehérjét. A jövőben talán érdemes lehet megvizsgálni ebben a

szövetben is az esetleges genomi uracil felhalmozódás mértékét. Elképzelhető, hogy a

megtermékenyített zigótában az anyai kromoszómák uracil-mentesek, míg az apai

kromoszómák uracil szubsztituáltak.

A gonádokon kívül az embrionális szövetekben sem sikerült kimutatni a DRE-függő

dUTPáz promóter aktivitást. Elképzelhető azonban, hogy a vizsgálat szöveti felbontása nem

volt megfelelő, és bizonyos sejttípusok DRE függő módon expresszálják a dUTPázt

embrióban, tekintve, hogy az S2 sejtekben is kimutatható volt ennek a motívumnak a

jelentősége. Az S2 sejtek végső stádiumú embrionális szövetből származnak. Elképzelhető,

hogy ilyen stádiumú embriók részletekbe menő vizsgálata több információt nyújtana DRE

szerepét illetően a dUTPáz embrionális transzkripciós szabályozásáról. A vizsgált promóter-

riporter rendszerek véletlenszerűen, feltehetően a genomi integrációtól főggő módon mutattak

aktivitást. Azok a törzsek, amelyekben a riporter gén aktivitása kimutatható volt, csupán a 13.


99

stádiumtól kezdtek mutatni többnyire gyenge expressziót. A gyenge vagy nem kimutatható

promóter aktivitásra az is magyarázatot adhat, hogy az embriónak nincs szüksége a dUTPáz

nagymértékű kifejezésére, hiszen hiszen elegendő mennyiségű dUTPáz géntermék anyai

hatásra is bejut az embrióba.

Kérdésként merült fel, hogy a dUTPáz differenciált szövetekben való repressziójának a

lárvális szövetekben van-e valamilyen élettani szerepe. Ez lehet például a metamorfózis során

megkülönböztetendő degradálódásra szánt szövetek kijelölése vagy egyéb, a differenciált

szövetek homeosztázisa szempontjából kedvező funkció. A dUTPáz ezekben a szövetekben

történő túltermelése azonban nem okozott semmilyen megfigyelhető fenotípust. Ez arra utal,

hogy az organizmus számára az expressziós mintázat differenciált kialakítása csupán a

fehérjetermelő erőforrások kímélése szempontjából előnyös, tekintettel a nem expresszáló

lárvális szövetek időszakos szerepére. A differenciált lárvális szövetek genomja feltehetően a

dNTP metabolizmus elhanyagolásával is képes feladatát ellátni. A kérdés részletesebb

megválaszolásához a továbbiakban még ki szeretnénk mutatni azt, hogy a dUTPáz

kifejeződés bekapcsolásával valóban sikerült-e csökkenteni a genom uraciltartalmát

nyálmirigyben. Érdekes lenne jövőben még azt is megvizsgálni, hogy vajon a muslica az

egyéb genom integritását őrző mechanizmusait is kikapcsolja-e ezekben a szöveteiben, pl.

megfigyelhető-e a DNS-beli uracil felhalmozódásához hasonlóan fokozott 8-oxoguanin

felhalmozódás vagy ribonukleotid beépülés. A sejtek öregedése gyakran összefüggésbe

hozható oxidált bázisok DNS-ben történő felhalmozódásával. Ebből a szempontból különösen

érintett lehet a mitokondriális genom, amely különösen kitett oxidatív hatásoknak. Érdekes

volna megvizsgálni, hogy vajon az öregedés folyamatához hozzájárulhat-e a DNS-beli uracil

felhalmozódása. A dUTPáz túltermelése differenciált sejtekben ilyen kérdésekre is választ

adhat a továbbiakban.

Mint ahogy az irodalmi áttekintésben bemutattam, a dNTP fluktuáció nélkülözhetetlen a

sejtciklus zavartalan lefolyásához. Számos dNTP metabolizmusban részt vevő enzim

expressziója lecsökken az S fázison kívül, ami a replikáció normális inicializálásához

szükséges S-fázis előtti dNTP koncentráció csökkenést eredményezi (lásd. 1.3.3. fejezet). A

dUTPáz expresszió sejtciklusfüggő fluktuációjáról nincs adat, azonban mivel a túltermelő

törzsek nem mutattak aberráns fenotípust, feltételezhető, hogy a dUTPáz nem járul hozzá

jelentős mértékben a dNTP fluktuációhoz. Nem kizárható azonban az sem, hogy a sejtbeli

dUTPáz aktivitás valamilyen poszttranszlációs mechanizmusnak köszönhetően mindezek

ellenére fluktuál a sejtciklus során.


100

Annak ismeretében, hogy a muslica nem rendelkezik UNG fehérjét kódoló génnel

rejtélyesnek tűnt, hogy a dUTPáz csendesítése és genomi uracil felhalmozódása az imaginális

prekurzor szövetekben miért nem indifferens az állat számára. A teljes állatban történő

dUTPáz csendesítés báb letalitást eredményező hatása nehezen értelmezhető az organizmus

komplexitásának köszönhetően. Ezért a letalitás megmagyarázása céljából szövetspecifikus

csendesítést alkalmaztam, mellyel kimutattam, hogy valóban sejtszintű intoleranciáról van

szó. Egyértelmű összefüggést állapíthatunk meg tehát a dUTPáz expresszió és a szöveti

degradáció között. Ez alapján az 5.1. ábra. A dUTPáz expressziós mintázat következményei

muslicában látható modellt állíthatjuk fel.

TUNEL próbával kimutattam, hogy az imaginális prekurzor szövetek sejtjei fokozott

mértékű DNS fragmentálódással reagálnak a dUTPáz csendesítésére (4.17. ábra). Az általunk

alkalmazott mikroszkópiás felbontás valószínűleg csupán az apoptózist kísérő kaszpáz

indukált DNáznak köszönhető DNS fragmentáció kimutatását tette lehetővé, azaz nem

mondható ki, hogy közvetlenül az uracil-DNS processzálódását figyeltük meg. Mindezek

mellett sikerült kimutatnunk a H2AV foszforilációt dUTPáz csendesített szövetekben (4.19.

ábra). A H2AV foszforiláció a DNS kettős száltörés aktivált ATM vagy a huzamosabb ideig

megjelnő egyes szálú DNS által aktivált ATR kinázoknak köszönhető (lásd. 1.5. fejezet).

Jelen esetben az ATR útvonal aktiválódása valószínűbb, tekintve, hogy a dNTP metabolizmus

zavara az érintett javítómechanizmusok ismeretében elsősorban egyes száltöréseket, esetleg

DNS polimeráz leállást eredményezhet. A dUTPáz csendesítés C. elegans-ban is az ATR

útvonalhoz tartozó Chk1 és Clk2 gének csendesítésével volt részben menekíthető 137

. A

gyakori egyes száltörések a DNS-ben azonban bizonyos valószínűséggel kettős száltörések

megjelenéséhez is vezethetnek, tehát kisebb valószínűséggel ugyan, de az ATM útvonal is

aktiválódhat dUTPáz hiányában. Jelen ismereteink szerint a C. elegans mellett a muslica az

egyetlen organizmus, amelyben a dUTPáz hiány következtében kiváltott DDR sejtválaszt

kimutatták.


101

Mint ahogy az irodalmi áttekintésben bemutatásra került, a DDR sejtciklus blokkot

képes kiváltani (lásd. 1.5.1. fejezet). Ennek ellenére nem sikerült a dUTPáz csendesített

imaginális szövetekben perturbált osztódási mintázatot kimutatni (4.18. ábra). Ha figyelembe

vesszük, hogy a harmadik lárva stádiumú szárny diszkuszban még csak kis számú foszfo-

5.1. ábra. A dUTPáz expressziós mintázat következményei muslicában

Az ábrán korábbi ismereteink és a dolgozat főbb eredményeinek összefoglalása látható. A

lárva stádiumok alatt a pirossal jelölt szövetek mutatnak dUTPáz expressziót. Ezek

többnyire nem differenciált imaginális prekurzor szövetek, a gén kifejeződése pedig

dolgozatban bemutatott eredmények alapján a gonádoktól eltekintve a DNS replikáció

kapcsolt elem (DRE) által szabályozott. Eredményeink alapján elmondható, hogy a

dUTPáz expressziót nem mutató differenciált vagy csendesített nem differenciált szövetek

uracilt halmoznak fel genomjukban. Emellett a dUTPáz kifejezése szükséges ahhoz, hogy

a nem differenciált szövetek a metamorfózis során a kifejlett állat szöveteit kialakítsák.

dUTPáz hiányban a szövetek degradálódnak, amiért az imaginális prekurzor szövetek

esetén feltehetően az uracil-DNS által kiváltott DNS károsodás sejtválasz (DDR) felelős.

A dUTPázt nem kifejező differenciált szövetek szintén degradálódnak, azonban ez a

folyamat a dUTPáztól független.


102

H2AV pozitív sejt volt jelen, elképzelhető, hogy ennyi sejt osztódásának leállása még nem

kimutatható a BrdU próbával. Akár a sejtciklus blokk, akár intenzív sejthalál áll a dUTPáz

csendesített imaginális szövetek degradálódása hátterében, azt a báb állapotban kellene

vizsgálni. Ez talán a csendesített szövetek metamorfózisának ex vivo vizsgálatával lesz

megvalósítható.

Továbbra sem ismert, hogy mi lehet az a mechanizmus, ami a dUTPáz csendesítés

letálfázisa (azaz a késői lárva illetve báb stádium) alatt vagy az imaginális korongokban az

uracil-DNS intoleranciáért felelős lehet. A BER enzimek közül a muslicában az egyedül jelen

lévő két uracil-DNS glikoziláz, a SMUG és a TDG homológ Thd1 lehet képes az uracil-DNS

processzálására. Utóbbi elsősorban hibáspárban lévő uracil bázisokat vág ki a DNS-ből, és

csak jóval kisebb aktivitással processzál A:U bázispárokat 96

. Amennyiben a dUTPáz hiánya

súlyos dNTP aránytalanságot is maga után von, a dUMP hibáspárként is beépülhet, ami a

Thd1 és a hibáspár javítás enzimeinek aktiválódására teheti érzékennyé a genom épségét. A

BER komponensként is funkcionáló WRN helikáz a BER során nem szükségszerűen

hasznosuló exonukleáz aktivitással is rendelkezik (lásd. 1.2.4.2 fejezet). A muslicában

található WRN exonukleáz aktivitását azonban gátolja a DNS-ben jelen lévő uracil 103

. Bár a

DDR sejtválasszal nehéz összefüggésbe hozni felmerülhet, hogy a helikáz ezen tulajdonsága

hozzájárulhat-e az uracil-DNS intoleranciához. Ezen kérdés megválaszolásához érdemes lehet

a dUTPáz és a WRN genetikai kölcsönhatását megvizsgálni csendesítő vagy mutáns allélok

felhasználásával.

Az 5FdU a timidilát bioszintétis jól ismert gátlószere, toxicitásának mechanizmusa

gerincesekben azonban vizsgálatra szorul. Emlős és csirke sejtekben kétféle komponens

befolyásolja az 5FdU szenzitivitást: a hibáspár javítás és a dUTPáz expresszió. A hibáspár

javítás kiütése esetén megfigyelhető rezisztencia a dNTP készlet aránytalanságának, a

dUTPáz csendesítés esetén megfigyelhető szenzitivitás pedig az 5-fluoro-dUMP beépülésének

köszönhető toxicitásra utal. A két mechanizmus azért látszik ellentmondásosnak, mert az

aránytalan dNTP készlet jelenlétében szintetizált DNS-be beépülő bármely nukleotid

hajlamos lehet hibáspárt kialakítani, nem egyértelmű tehát, hogy miért lenne kiemelt

jelentőségű ezek közül az 5-fluoro-dUMP. Amennyiben csupán az 5-fluoro-dUMP beépülése

toxikus, feltételezhető hogy dU kezelés a dUTP koncentráció növelésével csökkenteni képes a

toxicitást, mérsékelve a beépülés mértékét. Emellett a dU metabolit dUMP az 5-fluoro-

dUMP-vel versengve a TS gátlását is mérsékelheti, helyreállítva a normális dNTP arányokat.


103

A dU timin analógként is kompenzálhatja a dTTP hiányát. Az ilyen módon komplementált

rendszerben reméltük, hogy vizsgálható az uracil szubsztitúció hatása humán sejtekben is.

Ezekből a feltételezésekből kiindulva vizsgáltuk a dU vagy a dU és 5FdU kombinált kezelés

hatását. Kísérleteink során dUTPáz csendesített humán sejtvonalat is felhasználtunk,

feltételezve, ezekben a sejtekben a dUTPáz nem befolyásolja a dU és 5FdU metabolizmust.

Az 5FdU toxicitást a dU kezelés a várakozásokkal ellentétben nem mérsékelte, hanem

tovább növelte fügetenül a dUTPáz csendesítétől. Ez egyrészt arra utal, hogy a dUMP nem

volt képes a TS gátlást mérsékelni, noha a dUTPáz csendesített sejtek esetén három

nagyságrenddel több dU volt jelen a médiumban, mint 5FdU, és a TS hasonló nagyságrenddel

képes 5-fluoro-dUMP-t kötni, mint dUMP-t 235

. Másrészt, az eredmények arra is utalnak,

hogy az 5-fluoro-dUMP mellett a dUMP DNS-be történő beépülése is toxikus, amennyiben a

TS gátova van. A dU kezelés önmagában nem befolyásolta a sejtek életkésességét még a

dUTPáz csendesítés esetén sem. Elképzelhető, hogy a dUTPáz a csendesített sejtvonalban is

hatékonyan akadályozta meg az uracil falhalmozódását a DNS-ben. Ennek a tisztázásához a

kezelt sejtek genomi uraciltartalmának megmérése szükséges. Amennyiben bebizonyosodik,

hogy a dUMP beépülés önmagában nem veszélyezteti a sejt életképességét, kimondhatjuk,

hogy csak az aránytalan dNTP komponensek jelenlétében szintetizált uracil vagy 5FU-t

tartalmazó hibáspárok feldúsulása és kijavítása veszélyezteti a genom integritását humán

sejtekben. Az aránytalan dNTP készlet mellett a DNS polimeráz hajlamos lehet a

leggyakrabban előforduló dNTP komponenst hibáspárba beépíteni, TS gátlás esetén pedig ez

a komponens a dUTP vagy 5-fluoro dUTP lehet. A dUTPáz ebben az esetben az 5-fluoro-

dUTP vagy dUTP túlsúly mérséklésében játszhat fontos szerepet. Ez összeegyeztethető

azokkal a megfigyelésekkel, hogy a TS gátló antifolátok toxicitását is csökkenti a dUTPáz

túltermelése 22,147

. Ezekben az esetekben a TS gátlás következtében szintén kialakuló dNTP

aránytalanság mellett a dUTP hibáspárként történő beépülését akadályozhatja a dUTPáz. A

fluoropirimidinek által kiváltott genotoxicitás hatásmechanizmusára Meyers és társai

állítottek fel egy modellt, melyben a DNS-ben megjelenő hibáspár és annak javítása kap

kiemelt szerepet 33

. Ez a modell a fenti ismeretek tükrében az 5.2. ábrán látható módon

egészíthető ki azzal, hogy a felborult dNTP egyensúly a magas dUTP koncentráció mellett

eredményezi a toxikus hibáspárok megjelenését. A dUTPáz szerepe ebben a folyamatban

tehát a szubsztrátok távoltartása a DNS polimeráztól, ilyen körülmények között ugyanis csak

mutációkkal terhelt DNS szintézis lehetséges. Az, hogy a dU kezelés kapcsán

eredményeinkkel ellentondásos irodalmi adat is létezik 156

arra utal, hogy a fenti modell nem

általánosítható minden sejtvonalra, mivel egyéni eltérések előfordulhatnak a drogok


104

metabolizmusát és a DNS javítási profilt illetően. Szükséges tehát minél több sejtvonalon

elvégezni a kísérleteket, hogy teljes körű képet kapjunk. A különböző tumorok metabolikus és

DNS javító profilja alapján hatékonyabb stratégia dolgozható ki a terápiás kezelésre. Az a

megfigyelés, hogy a TS gátlás dU kiegészítésével a toxicitás szempontjából hatékonyabbá

tehető, szintén tanulságos lehet tumoros sejtek kemoterápiás kezelése kapcsán.

Mindent összefoglalva, eredményeim az irodalmi adatokkal összevetve azt mutatják,

hogy a dUTPáz létfontosságú osztódó sejtek genom integritásának megőrzésében. Ezen túl a

dUTPáz a normális dUTP/dTTP egyensúlyának beállítása mellett az aránytalan dNTP készlet

toxicitását is képes lehet mérsékelni. Ennek köszönhetően jelentősége potenciálisan

kapcsolatba hozható a karcinogenezis és a sejt öregedés folyamataival.

5.2. ábra. A timidilát szintáz gátlás által kiváltott genotoxicitás feltételezett

hatásmechanizmusa emlős sejtekben

Az ábrán az irodalmi adatok és a dolgozatban bemutatott emlős sejteken végzett kísérletek

eredményeinek összefoglalása látható. A timidilát szintáz gátlás során a hibáspárok DNS-

be történő nagy arányú beépüléséhez két tényező szükséges: a felborult dNTP egyenúly és

a magas dUTP (vagy 5-fluoro-dUTP) koncentráció. A dUTPáz szerepe az utóbbi tényező

minimalizálása, ezáltal csökkenti annak a lehetőségét, hogy a DNS polimeráz

szubsztráthoz férjen hozzá. Ezáltal a DNS polimeráz a felborult dNTP egyensúly mellett

kevesebb bázist tud a DNS-be hibásan beépíteni. A beépült hibáspárok főleg a hibáspár

javítómechanizmusnak köszönhetően jelentenek veszélyt a DNS épségére, de van irodalmi

példa a báziskivágó javítás által közvetített intoleranciára is (lásd. 1.4.2. fejezet). A

folyamat a DNS károsodás sejtválaszt váltja ki, ami sejtciklus leállást vagy sejthalált vált

ki. Az ábra a Meyers és társai által feltételezett modell kiegészítése 33

.

105

6. Összegzés

A pontos és stabil DNS szintézis a dNTP készlet precíz szabályozását igényi. A

szabályozás magába foglalja a sejtciklus vagy DNS javítás függő DNS szintézis dNTP

igényének kielégítését, a dNTP komponensek arányának fenntartását és a módosult

nukleotidok készletből történő eltávolítását. A szabályozás megzavarása DNS hibák

megjelenését eredményezi, melyek a genom épségét veszélyeztetik a báziskivágó javítás

(BER) vagy a hibáspár javítás mechanizmusoknak köszönhetően. A folyamat során

aktiválódik a DNS károsodás sejtválasz, ami a sejtciklus leállását vagy sejthalált képes

kiváltani. A dNTP metabolizmuson belül elkülöníthető a timidilát metabolizmus, mely

lehetővé teszi, hogy a DNS az RNS-el ellentétben uracil helyett timin bázisokkal kódolja a

genetikai információt. Ezt alapvetően három komponens teszi lehetővé: a timidilát szintáz a

dTTP szintézisben betöltött szerepével, a dUTPáz a dUTP készlet hidrolizálásával és a BER

enzim UNG a DNS uracil bázisainak eltávolításával. Többnyire az utóbbi komponens hiánya

teszi lehetővé, hogy uracil-DNS hosszabb távon is létezhessen a sejtekben.

Az e dolgozatban bemutatott, általam kifejlesztett archea replikatív polimerázok uracil-

DNA diszkrimináló tulajdonságán alapuló módszer alkalmasnak bizonyult a fenti

komponensek defektusai következtében a DNS-ben felhalmozódó uracil kimutatására.

Korábbi adataink alapján ismertük, hogy az ecetmuslica a három komponens közül az UNG

enzimmel nem rendelkezik és a dUTPáz csak bizonyos stádiumokban és szövetekben

expresszálódik. Kimutattuk, hogy ennek megfelelően a DNS uraciltartalma a dUTPáz

expressziótól függ. Vizsgáltam a dUTPáz expressziós mintázatáért felelős transzkripció

regulációs mechanizmust. Eredményeim arra utalnak, hogy a muslica dUTPáz promóterében

található DRE motívum felelős az osztódó sejtekre korlátozódó expresszióért, ugyanakkor

lehet egy ettől független gonádspecifikus szabályozás is.

Az eddig vizsgált organizmusokban a dUTPáz hiánya letálisnak bizonyul. Ez

elmondható az ecetmuslicáról is. Azonban míg a többi organizmusban a letalitásért az UNG

felelős, musclicában e mögött az UNG hiányának ismeretében más mechanizmus állhat.

Kimutattam, hogy a dUTPáz csendesítés sejtautonóm szöveti degradációhoz vezet a báb

állapot alatt. Ezen túl a csendesített osztódó szövetekben a genomi DNS uraciltartalmának

növekedését, DNS fragmentációt és a DNS károsodás sejtválasz aktiválódását is kimutattuk.

A dUTPáz genom integritását fenntartó funkcióját dUTPáz csendesített és timidilát

szintáz gátolt humán sejtvonalban is vizsgáltam. Az eredmények további lehetőségeket vetnek

fel a tumor sejtvonalakban kiváltható genotoxicitással kapcsolatban.

106

7. Summary

Accurate and stable DNA synthesis requires the precise regulation of dNTP pool. This

regulation involves i) meeting the requirements of cell cycle or DNA repair dependent DNA

synthesis, ii) the maintenance of the proper ratio of dNTP components, and iii) the elimination

of the modified nucleotides from the pool. Perturbed regulation results in the appearance of

DNA lesions compromising genome integrity mostly by base excision (BER) or mismatch

repair. Under perturbed conditions, DNA damage response is activated that induces cell cycle

arrest or cell death.

dNTP metabolism includes the thymidylate boisythesis pathway that, unlike in RNA,

allows the usage of urail bases instead of thymine in genetic information of DNA. Three

components have key functions in this regard: i) thymidylate synthase is involved in dTTP

synthesis, ii) dUTPase eliminates dUTP pool, and iii) the BER enzyme UNG excise uracil

bases from DNA. Knock out of the latter component usually allows persistent appearance of

uracil-DNA in cells.

In this study I introduce a novel method that allows detection of uracil accumulation in

DNA of organisms perturbed in the components above. This method is based on the uracil-

DNA discriminating feature of archea DNA polymerases. From previous observations we

learned that the fruit fly lacks UNG from the three components and possess only a statio-

temporal expression of dUTPase. We showed that the uracil content of DNA depends only on

dUTPase expression in this organism. I also examined the transcriptional regulatory

mechanism that forms dUTPase expression pattern. My results suggest that DRE motifs

located in dUTPase promoter may be responsible for expression in proliferating cell types, but

there might be a DRE independent gonad-specific regulation as well.

Defects of dUTPase have shown to be lethal in any organisms examined so far,

including fruit fly. While UNG was proven to be responsible for lethality in most of the

organisms, a different mechanism must be responsible for that in fruit fly, since they lack

UNG. I showed that dUTPase silencing causes cell autonomous tissue degradation during

pupal stages. Furthermore, we showed genomic uracil accumulation, DNA fragmentation and

DNA damage response activation in silenced proliferating tissues.

I examined the genome integrity protecting function of dUTPase in dUTPase silenced

and thymidylate synthase inhibited human cell line as well. Our results propose further

potentials to induce genotoxicity in tumor cell lines.

107

8. Irodalomjegyzék

1. Kolberg, M., Strand, K. R., Graff, P. & Andersson, K. K. Structure, function, and

mechanism of ribonucleotide reductases. Biochimica et biophysica acta 1699, 1–34

(2004).

2. Holmgren, A. & Sengupta, R. The use of thiols by ribonucleotide reductase. Free

radical biology & medicine 49, 1617–28 (2010).

3. Fairman, J. W. et al. Structural basis for allosteric regulation of human ribonucleotide

reductase by nucleotide-induced oligomerization. Nature structural & molecular

biology 18, 316–22 (2011).

4. Logan, D. T. Closing the circle on ribonucleotide reductases. Nature structural &

molecular biology 18, 251–3 (2011).

5. Hofer, A., Crona, M., Logan, D. T. & Sjöberg, B.-M. DNA building blocks: keeping

control of manufacture. Critical reviews in biochemistry and molecular biology 47, 50–

63 (2012).

6. Kumar, D., Viberg, J., Nilsson, A. K. & Chabes, A. Highly mutagenic and severely

imbalanced dNTP pools can escape detection by the S-phase checkpoint. Nucleic acids

research 38, 3975–83 (2010).

7. Lacombe, M. L., Milon, L., Munier, A., Mehus, J. G. & Lambeth, D. O. The human

Nm23/nucleoside diphosphate kinases. Journal of bioenergetics and biomembranes 32,

247–58 (2000).

8. Weiner, K. X., Weiner, R. S., Maley, F. & Maley, G. F. Primary structure of human

deoxycytidylate deaminase and overexpression of its functional protein in Escherichia

coli. The Journal of biological chemistry 268, 12983–9 (1993).

9. Ellims, P. H., Kao, A. Y. & Chabner, B. A. Deoxycytidylate deaminase. Purification

and some properties of the enzyme isolated from human spleen. The Journal of

biological chemistry 256, 6335–40 (1981).

10. Jackson, R. C. The regulation of thymidylate biosynthesis in Novikoff hepatoma cells

and the effects of amethopterin, 5-fluorodeoxyuridine, and 3-deazauridine. The Journal

of biological chemistry 253, 7440–6 (1978).

11. Bianchi, V., Pontis, E. & Reichard, P. Regulation of pyrimidine deoxyribonucleotide

metabolism by substrate cycles in dCMP deaminase-deficient V79 hamster cells.

Molecular and cellular biology 7, 4218–24 (1987).

12. Weinberg, G., Ullman, B. & Martin, D. W. Mutator phenotypes in mammalian cell

mutants with distinct biochemical defects and abnormal deoxyribonucleoside

triphosphate pools. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America 78, 2447–51 (1981).

13. Darè, E., Zhang, L. H., Jenssen, D. & Bianchi, V. Molecular analysis of mutations in

the hprt gene of V79 hamster fibroblasts: effects of imbalances in the dCTP, dGTP and

dTTP pools. Journal of molecular biology 252, 514–21 (1995).

14. Moroz, O. V et al. Dimeric dUTPases, HisE, and MazG belong to a new superfamily of

all-alpha NTP pyrophosphohydrolases with potential “house-cleaning” functions.

Journal of molecular biology 347, 243–55 (2005).

108

15. Nonaka, M., Tsuchimoto, D., Sakumi, K. & Nakabeppu, Y. Mouse RS21-C6 is a

mammalian 2’-deoxycytidine 5'-triphosphate pyrophosphohydrolase that prefers 5-

iodocytosine. The FEBS journal 276, 1654–66 (2009).

16. Siggaard, J. H. B. et al. Concerted bifunctionality of the dCTP deaminase-dUTPase

from Methanocaldococcus jannaschii: a structural and pre-steady state kinetic analysis.

Archives of biochemistry and biophysics 490, 42–9 (2009).

17. Helt, S. S. et al. Mechanism of dTTP inhibition of the bifunctional dCTP

deaminase:dUTPase encoded by Mycobacterium tuberculosis. Journal of molecular

biology 376, 554–69 (2008).

18. Johansson, E. et al. Structures of dCTP deaminase from Escherichia coli with bound

substrate and product: reaction mechanism and determinants of mono- and

bifunctionality for a family of enzymes. The Journal of biological chemistry 280,

3051–9 (2005).

19. Vértessy, B. G. & Tóth, J. Keeping uracil out of DNA: physiological role, structure and

catalytic mechanism of dUTPases. Accounts of chemical research 42, 97–106 (2009).

20. Baldo, A. M. & McClure, M. A. Evolution and horizontal transfer of dUTPase-

encoding genes in viruses and their hosts. Journal of virology 73, 7710–21 (1999).

21. Canman, C. E., Lawrence, T. S., Shewach, D. S., Tang, H. Y. & Maybaum, J.

Resistance to fluorodeoxyuridine-induced DNA damage and cytotoxicity correlates

with an elevation of deoxyuridine triphosphatase activity and failure to accumulate

deoxyuridine triphosphate. Cancer research 53, 5219–24 (1993).

22. Webley, S. D., Hardcastle, A., Ladner, R. D., Jackman, a L. & Aherne, G. W.

Deoxyuridine triphosphatase (dUTPase) expression and sensitivity to the thymidylate

synthase (TS) inhibitor ZD9331. British journal of cancer 83, 792–9 (2000).

23. Wilson, P. M., Labonte, M. J., Lenz, H.-J., Mack, P. C. & Ladner, R. D. Inhibition of

dUTPase Induces Synthetic Lethality with Thymidylate Synthase-Targeted Therapies

in Non-Small Cell Lung Cancer. Molecular cancer therapeutics 11, 616–28 (2012).

24. Studebaker, a W., Lafuse, W. P., Kloesel, R. & Williams, M. V Modulation of human

dUTPase using small interfering RNA. Biochemical and biophysical research

communications 327, 306–10 (2005).

25. Koehler, S. E. & Ladner, R. D. Small interfering RNA-mediated suppression of

dUTPase sensitizes cancer cell lines to thymidylate synthase inhibition. Molecular

pharmacology 66, 620–6 (2004).

26. Andersson, J., Westman, M., Hofer, A. & Sjoberg, B. M. Allosteric regulation of the

class III anaerobic ribonucleotide reductase from bacteriophage T4. The Journal of


27. Ivanetich, K. M. & Santi, D. V. Recent Studies on Thymidylate Synthase. Annals of the

New York Academy of Sciences 569, 201–210 (1989).

28. Escartin, F., Skouloubris, S., Liebl, U. & Myllykallio, H. Flavin-dependent thymidylate

synthase X limits chromosomal DNA replication. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America 105, 9948–52 (2008).

29. MacFarlane, A. J. et al. Nuclear localization of de novo thymidylate biosynthesis

pathway is required to prevent uracil accumulation in DNA. The Journal of biological

chemistry 286, 44015–22 (2011).

109

30. Fenech, M. Folate (vitamin B9) and vitamin B12 and their function in the maintenance

of nuclear and mitochondrial genome integrity. Mutation research 1–13

(2011).doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.11.003

31. Anderson, D. D., Woeller, C. F., Chiang, E.-P., Shane, B. & Stover, P. J. Serine

hydroxymethyltransferase anchors de novo thymidylate synthesis pathway to nuclear

lamina for DNA synthesis. The Journal of biological chemistry 287, 7051–62 (2012).

32. Yoshioka, A. et al. Deoxyribonucleoside triphosphate imbalance. 5-

Fluorodeoxyuridine-induced DNA double strand breaks in mouse FM3A cells and the

mechanism of cell death. The Journal of biological chemistry 262, 8235–41 (1987).

33. Meyers, M. et al. A role for DNA mismatch repair in sensing and responding to

fluoropyrimidine damage. Oncogene 22, 7376–88 (2003).

34. Elstein, K. H. et al. Nucleoside-mediated mitigation of 5-fluorouracil-induced toxicity

in synchronized murine erythroleukemic cells. Toxicology and applied pharmacology

146, 29–39 (1997).

35. Grogan, B. C., Parker, J. B., Guminski, A. F. & Stivers, J. T. Effect of the thymidylate

synthase inhibitors on dUTP and TTP pool levels and the activities of DNA repair

glycosylases on uracil and 5-fluorouracil in DNA. Biochemistry 50, 618–27 (2011).

36. Wilson, P. M. et al. Novel opportunities for thymidylate metabolism as a therapeutic

target. Molecular cancer therapeutics 7, 3029–37 (2008).

37. Blount, B. C. & Ames, B. N. DNA damage in folate deficiency. Baillière’s clinical

haematology 8, 461–78 (1995).

38. Chen, V. J. et al. Preclinical cellular pharmacology of LY231514 (MTA): a

comparison with methotrexate, LY309887 and raltitrexed for their effects on

intracellular folate and nucleoside triphosphate pools in CCRF-CEM cells. British

journal of cancer 78 Suppl 3, 27–34 (1998).

39. Oliver, F. J., Collins, M. K. & López-Rivas, A. Overexpression of a heterologous

thymidine kinase delays apoptosis induced by factor deprivation and inhibitors of

deoxynucleotide metabolism. The Journal of biological chemistry 272, 10624–30

(1997).

40. Tinkelenberg, B. a, Hansbury, M. J. & Ladner, R. D. dUTPase and uracil-DNA

glycosylase are central modulators of antifolate toxicity in Saccharomyces cerevisiae.

Cancer research 62, 4909–15 (2002).

41. Curtin, N. J., Harris, a L. & Aherne, G. W. Mechanism of cell death following

thymidylate synthase inhibition: 2’-deoxyuridine-5'-triphosphate accumulation, DNA

damage, and growth inhibition following exposure to CB3717 and dipyridamole.


42. Van Rompay, a R., Johansson, M. & Karlsson, A. Phosphorylation of nucleosides and

nucleoside analogs by mammalian nucleoside monophosphate kinases. Pharmacology

& therapeutics 87, 189–98 (2000).

43. Sandrini, M. P. B. & Piskur, J. Deoxyribonucleoside kinases: two enzyme families

catalyze the same reaction. Trends in biochemical sciences 30, 225–8 (2005).

44. Bouzon, M. & Marlière, P. Human deoxycytidine kinase as a conditional mutator in

Escherichia coli. Comptes rendus de l’Académie des sciences. Série III, Sciences de la

vie 320, 427–34 (1997).

110

45. Legent, K. et al. In vivo analysis of Drosophila deoxyribonucleoside kinase function in

cell cycle, cell survival and anti-cancer drugs resistance. Cell cycle (Georgetown, Tex.)

5, 740–9 (2006).

46. Meuth, M. Deoxycytidine kinase-deficient mutants of Chinese hamster ovary cells are

hypersensitive to DNA alkylating agents. Mutation research 110, 383–91 (1983).

47. Liou, J.-Y., Krishnan, P., Hsieh, C.-C., Dutschman, G. E. & Cheng, Y.-C. Assessment

of the effect of phosphorylated metabolites of anti-human immunodeficiency virus and

anti-hepatitis B virus pyrimidine analogs on the behavior of human deoxycytidylate

deaminase. Molecular pharmacology 63, 105–10 (2003).

48. Jansen, R. S., Rosing, H., Schellens, J. H. M. & Beijnen, J. H. Deoxyuridine analog

nucleotides in deoxycytidine analog treatment: secondary active metabolites?

Fundamental & clinical pharmacology 25, 172–85 (2011).

49. Mathews, C. K. DNA precursor metabolism and genomic stability. FASEB journal :

official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology

20, 1300–14 (2006).

50. Zhang, X. & Mathews, C. K. Natural DNA precursor pool asymmetry and base

sequence context as determinants of replication fidelity. The Journal of biological

chemistry 270, 8401–4 (1995).

51. Bebenek, K., Roberts, J. D. & Kunkel, T. a The effects of dNTP pool imbalances on

frameshift fidelity during DNA replication. The Journal of biological chemistry 267,

3589–96 (1992).

52. Lu, Q., Zhang, X., Almaula, N., Mathews, C. K. & Inouye, M. The gene for nucleoside

diphosphate kinase functions as a mutator gene in Escherichia coli. Journal of


53. Miller, J. H. et al. Escherichia coli strains (ndk) lacking nucleoside diphosphate kinase

are powerful mutators for base substitutions and frameshifts in mismatch-repair-

deficient strains. Genetics 162, 5–13 (2002).

54. Meyers, M. et al. DNA mismatch repair-dependent response to fluoropyrimidine-

generated damage. The Journal of biological chemistry 280, 5516–26 (2005).

55. Katafuchi, A. & Nohmi, T. DNA polymerases involved in the incorporation of

oxidized nucleotides into DNA: their efficiency and template base preference. Mutation

research 703, 24–31 (2010).

56. Purmal, A. A., Kow, Y. W. & Wallace, S. S. 5-Hydroxypyrimidine deoxynucleoside

triphosphates are more efficiently incorporated into DNA by exonuclease-free Klenow

fragment than 8-oxopurine deoxynucleoside triphosphates. Nucleic acids research 22,

3930–5 (1994).

57. Vilpo, J. A. & Vilpo, L. M. Metabolism, incorporation into DNA, and interactions with

1-beta-D-arabinofuranosylcytosine of 5-hydroxymethyl-2’-deoxyuridine in human

promyelocytic leukemia cells (HL-60). Cancer research 48, 3117–22 (1988).

58. Dunham, L. T. & Price, A. R. Mutants of Bacillus subtilis bacteriophage phi e

defective in dTTP-dUTP nucleotidohydrolase. Journal of virology 14, 709–12 (1974).

59. Wyatt, G. R. & Cohen, S. S. The bases of the nucleic acids of some bacterial and

animal viruses: the occurrence of 5-hydroxymethylcytosine. The Biochemical journal

55, 774–82 (1953).

111

60. Sedgwick, B., Bates, P. a, Paik, J., Jacobs, S. C. & Lindahl, T. Repair of alkylated

DNA: recent advances. DNA repair 6, 429–42 (2007).

61. Hizi, a, Kamath-Loeb, a S., Rose, K. D. & Loeb, L. a Mutagenesis by human

immunodeficiency virus reverse transcriptase: incorporation of O6-

methyldeoxyguanosine triphosphate. Mutation research 374, 41–50 (1997).

62. Preston, B. D., Singer, B. & Loeb, L. a Mutagenic potential of O4-methylthymine in

vivo determined by an enzymatic approach to site-specific mutagenesis. Proceedings of

the National Academy of Sciences of the United States of America 83, 8501–5 (1986).

63. Bradshaw, J. S. & Kuzminov, A. RdgB acts to avoid chromosome fragmentation in

Escherichia coli. Molecular microbiology 48, 1711–25 (2003).

64. Longo, M. C., Berninger, M. S. & Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to

control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93, 125–8

(1990).

65. Kim, N. & Jinks-Robertson, S. dUTP incorporation into genomic DNA is linked to

transcription in yeast. Nature 459, 1150–3 (2009).

66. Kiljunen, S. et al. Yersiniophage phiR1-37 is a tailed bacteriophage having a 270 kb

DNA genome with thymidine replaced by deoxyuridine. Microbiology (Reading,

England) 151, 4093–102 (2005).

67. TAKAHASHI, I. & MARMUR, J. Replacement of thymidylic acid by deoxyuridylic

acid in the deoxyribonucleic acid of a transducing phage for Bacillus subtilis. Nature

197, 794–5 (1963).

68. Wardle, J. et al. Uracil recognition by replicative DNA polymerases is limited to the

archaea, not occurring with bacteria and eukarya. Nucleic acids research 36, 705–11

(2008).

69. Greagg, M. a et al. A read-ahead function in archaeal DNA polymerases detects

promutagenic template-strand uracil. Proceedings of the National Academy of Sciences

of the United States of America 96, 9045–50 (1999).

70. Russell, H. J., Richardson, T. T., Emptage, K. & Connolly, B. a The 3’-5' proofreading

exonuclease of archaeal family-B DNA polymerase hinders the copying of template

strand deaminated bases. Nucleic acids research 37, 7603–11 (2009).

71. Fogg, M. J., Pearl, L. H. & Connolly, B. a Structural basis for uracil recognition by

archaeal family B DNA polymerases. Nature structural biology 9, 922–7 (2002).

72. Gill, S., O’Neill, R., Lewis, R. J. & Connolly, B. a Interaction of the family-B DNA

polymerase from the archaeon Pyrococcus furiosus with deaminated bases. Journal of


73. Zhang, W. et al. Analysis of deoxyribonucleotide pools in human cancer cell lines

using a liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry technique.

Biochemical pharmacology 82, 411–7 (2011).

74. Székvölgyi, L. et al. Ribonucleoprotein-masked nicks at 50-kbp intervals in the

eukaryotic genomic DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America 104, 14964–9 (2007).

75. Nick McElhinny, S. A. et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation

into DNA. Nature chemical biology 6, 774–81 (2010).

112

76. Reijns, M. A. M. et al. Enzymatic Removal of Ribonucleotides from DNA Is Essential

for Mammalian Genome Integrity and Development. Cell

(2012).doi:10.1016/j.cell.2012.04.011

77. Li, L. S. et al. DNA mismatch repair (MMR)-dependent 5-fluorouracil cytotoxicity and

the potential for new therapeutic targets. British journal of pharmacology 158, 679–92

(2009).

78. Nakabeppu, Y., Oka, S., Sheng, Z., Tsuchimoto, D. & Sakumi, K. Programmed cell

death triggered by nucleotide pool damage and its prevention by MutT homolog-1

(MTH1) with oxidized purine nucleoside triphosphatase. Mutation research 703, 51–8

(2010).

79. Kamiya, H. Mutagenicity of oxidized DNA precursors in living cells: Roles of

nucleotide pool sanitization and DNA repair enzymes, and translesion synthesis DNA

polymerases. Mutation research 703, 32–6 (2010).

80. Lin, S. et al. Cloning, expression, and characterization of a human inosine triphosphate

pyrophosphatase encoded by the itpa gene. The Journal of biological chemistry 276,

18695–701 (2001).

81. Pang, B. et al. Defects in purine nucleotide metabolism lead to substantial

incorporation of xanthine and hypoxanthine into DNA and RNA. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America 109, 2319–24 (2012).

82. Abolhassani, N. et al. NUDT16 and ITPA play a dual protective role in maintaining

chromosome stability and cell growth by eliminating dIDP/IDP and dITP/ITP from

nucleotide pools in mammals. Nucleic acids research 38, 2891–903 (2010).

83. Iyama, T., Abolhassani, N., Tsuchimoto, D., Nonaka, M. & Nakabeppu, Y. NUDT16 is

a (deoxy)inosine diphosphatase, and its deficiency induces accumulation of single-

strand breaks in nuclear DNA and growth arrest. Nucleic acids research 38, 4834–43

(2010).

84. Lari, S.-U., Chen, C.-Y., Vertéssy, B. G., Morré, J. & Bennett, S. E. Quantitative

determination of uracil residues in Escherichia coli DNA: Contribution of ung, dug,

and dut genes to uracil avoidance. DNA repair 5, 1407–20 (2006).

85. Guillet, M., Van Der Kemp, P. A. & Boiteux, S. dUTPase activity is critical to

maintain genetic stability in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic acids research 34,

2056–66 (2006).

86. Merényi, G. et al. Cellular response to efficient dUTPase RNAi silencing in stable

HeLa cell lines perturbs expression levels of genes involved in thymidylate

metabolism. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids 30, 369–90 (2011).

87. Hakem, R. DNA-damage repair; the good, the bad, and the ugly. The EMBO journal

27, 589–605 (2008).

88. Paz-Elizur, T. et al. DNA repair of oxidative DNA damage in human carcinogenesis:

potential application for cancer risk assessment and prevention. Cancer letters 266, 60–

72 (2008).

89. Hazra, T. K. et al. Oxidative DNA damage repair in mammalian cells: a new

perspective. DNA repair 6, 470–80 (2007).

90. Fromme, J. C., Banerjee, A. & Verdine, G. L. DNA glycosylase recognition and

catalysis. Current opinion in structural biology 14, 43–9 (2004).

113

91. Jacobs, A. L. & Schär, P. DNA glycosylases: in DNA repair and beyond. Chromosoma

121, 1–20 (2012).

92. Krokan, H. E., Nilsen, H., Skorpen, F., Otterlei, M. & Slupphaug, G. Base excision

repair of DNA in mammalian cells. FEBS letters 476, 73–7 (2000).

93. Lee, H.-W., Dominy, B. N. & Cao, W. New family of deamination repair enzymes in

uracil-DNA glycosylase superfamily. The Journal of biological chemistry 286, 31282–

7 (2011).

94. Wang, Z. & Mosbaugh, D. W. Uracil-DNA glycosylase inhibitor gene of bacteriophage

PBS2 encodes a binding protein specific for uracil-DNA glycosylase. The Journal of


95. Torseth, K. et al. The UNG2 Arg88Cys variant abrogates RPA-mediated recruitment of

UNG2 to single-stranded DNA. DNA repair 11, 559–69 (2012).

96. Hardeland, U., Bentele, M., Jiricny, J. & Schär, P. The versatile thymine DNA-

glycosylase: a comparative characterization of the human, Drosophila and fission yeast

orthologs. Nucleic acids research 31, 2261–71 (2003).

97. Cortellino, S. et al. Thymine DNA glycosylase is essential for active DNA

demethylation by linked deamination-base excision repair. Cell 146, 67–79 (2011).

98. Kavli, B. et al. hUNG2 is the major repair enzyme for removal of uracil from U:A

matches, U:G mismatches, and U in single-stranded DNA, with hSMUG1 as a broad

specificity backup. The Journal of biological chemistry 277, 39926–36 (2002).

99. Krokan, H. E., Drabløs, F. & Slupphaug, G. Uracil in DNA--occurrence, consequences

and repair. Oncogene 21, 8935–48 (2002).

100. Nemec, A. a, Wallace, S. S. & Sweasy, J. B. Variant base excision repair proteins:

contributors to genomic instability. Seminars in cancer biology 20, 320–8 (2010).

101. Harrigan, J. a et al. The Werner syndrome protein operates in base excision repair and

cooperates with DNA polymerase beta. Nucleic acids research 34, 745–54 (2006).

102. Bukowy, Z. et al. WRN Exonuclease activity is blocked by specific oxidatively

induced base lesions positioned in either DNA strand. Nucleic acids research 36,

4975–87 (2008).

103. Mason, P. a et al. The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease,

DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites :

Analysis of DmWRNexo activity in vitro. Age (Dordrecht, Netherlands)

(2012).doi:10.1007/s11357-012-9411-0

104. Nilsen, H. & Krokan, H. E. Base excision repair in a network of defence and tolerance.

Carcinogenesis 22, 987–98 (2001).

105. Horton, J. K. & Wilson, S. H. Hypersensitivity phenotypes associated with genetic and

synthetic inhibitor-induced base excision repair deficiency. DNA repair 6, 530–43

(2007).

106. Kow, Y. W. Repair of deaminated bases in DNA. Free radical biology & medicine 33,

886–93 (2002).

107. Moe, A. et al. Incision at hypoxanthine residues in DNA by a mammalian homologue

of the Escherichia coli antimutator enzyme endonuclease V. Nucleic acids research 31,

3893–900 (2003).

114

108. Cortázar, D. et al. Embryonic lethal phenotype reveals a function of TDG in

maintaining epigenetic stability. Nature 470, 419–23 (2011).

109. Germann, M. W., Johnson, C. N. & Spring, A. M. Recognition of damaged DNA:

structure and dynamic markers. Medicinal research reviews 32, 659–83 (2012).

110. Rai, P. Oxidation in the nucleotide pool, the DNA damage response and cellular

senescence: Defective bricks build a defective house. Mutation research 703, 71–81

(2010).

111. Li, G.-M. Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell research 18, 85–

98 (2008).

112. Fousteri, M. & Mullenders, L. H. F. Transcription-coupled nucleotide excision repair in

mammalian cells: molecular mechanisms and biological effects. Cell research 18, 73–

84 (2008).

113. Niida, H., Shimada, M., Murakami, H. & Nakanishi, M. Mechanisms of dNTP supply

that play an essential role in maintaining genome integrity in eukaryotic cells. Cancer

science 101, 2505–9 (2010).

114. Herrick, J. & Sclavi, B. Ribonucleotide reductase and the regulation of DNA

replication: an old story and an ancient heritage. Molecular microbiology 63, 22–34

(2007).

115. Poznic, M. Retinoblastoma protein: a central processing unit. Journal of biosciences

34, 305–12 (2009).

116. Hallstrom, T. C. & Nevins, J. R. Balancing the decision of cell proliferation and cell

fate. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 8, 532–5 (2009).

117. Bester, A. C. et al. Nucleotide deficiency promotes genomic instability in early stages

of cancer development. Cell 145, 435–46 (2011).

118. Chabes, A. L., Björklund, S. & Thelander, L. S Phase-specific transcription of the

mouse ribonucleotide reductase R2 gene requires both a proximal repressive E2F-

binding site and an upstream promoter activating region. The Journal of biological

chemistry 279, 10796–807 (2004).

119. Cayirlioglu, P., Ward, W. O., Silver Key, S. C. & Duronio, R. J. Transcriptional

repressor functions of Drosophila E2F1 and E2F2 cooperate to inhibit genomic DNA

synthesis in ovarian follicle cells. Molecular and cellular biology 23, 2123–34 (2003).

120. Johnson, D. G., Schwarz, J. K., Cress, W. D. & Nevins, J. R. Expression of

transcription factor E2F1 induces quiescent cells to enter S phase. Nature 365, 349–52

(1993).

121. Wilson, P. M., Fazzone, W., LaBonte, M. J., Lenz, H.-J. & Ladner, R. D. Regulation of

human dUTPase gene expression and p53-mediated transcriptional repression in

response to oxaliplatin-induced DNA damage. Nucleic acids research 37, 78–95

(2009).

122. Aas, P. A., Peña-Diaz, J., Liabakk, N. B., Krokan, H. E. & Skorpen, F. Overexpression

of transcription factor AP-2 stimulates the PA promoter of the human uracil-DNA

glycosylase (UNG) gene through a mechanism involving derepression. DNA repair 8,

822–33 (2009).

123. Haug, T. et al. Regulation of expression of nuclear and mitochondrial forms of human

uracil-DNA glycosylase. Nucleic acids research 26, 1449–57 (1998).

115

124. Fischer, J. a, Muller-Weeks, S. & Caradonna, S. J. Fluorodeoxyuridine modulates

cellular expression of the DNA base excision repair enzyme uracil-DNA glycosylase.


125. Dimova, D. K., Stevaux, O., Frolov, M. V & Dyson, N. J. Cell cycle-dependent and

cell cycle-independent control of transcription by the Drosophila E2F/RB pathway.

Genes & development 17, 2308–20 (2003).

126. Ash, J., Liao, W. C., Ke, Y. & Johnson, L. F. Regulation of mouse thymidylate

synthase gene expression in growth-stimulated cells: upstream S phase control

elements are indistinguishable from the essential promoter elements. Nucleic acids

research 23, 4649–56 (1995).

127. Huang, S. H. et al. Human dTMP kinase: gene expression and enzymatic activity

coinciding with cell cycle progression and cell growth. DNA and cell biology 13, 461–

71 (1994).

128. Boldogh, I. et al. hMYH cell cycle-dependent expression, subcellular localization and

association with replication foci: evidence suggesting replication-coupled repair of

adenine:8-oxoguanine mispairs. Nucleic acids research 29, 2802–9 (2001).

129. Ke, P., Kuo, Y., Hu, C. & Chang, Z. Control of dTTP pool size by anaphase promoting

complex/cyclosome is essential for the maintenance of genetic stability. Genes &

development 19, 1920–33 (2005).

130. Poon, P. P. & Storms, R. K. Thymidylate synthase is localized to the nuclear periphery

in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The Journal of biological chemistry 269, 8341–

7 (1994).

131. Muha, V., Zagyva, I., Venkei, Z., Szabad, J. & Vértessy, B. G. Nuclear localization

signal-dependent and -independent movements of Drosophila melanogaster dUTPase

isoforms during nuclear cleavage. Biochemical and biophysical research

communications 381, 271–5 (2009).

132. Chabes, A. & Stillman, B. Constitutively high dNTP concentration inhibits cell cycle

progression and the DNA damage checkpoint in yeast Saccharomyces cerevisiae.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104,

1183–8 (2007).

133. Koç, A., Wheeler, L. J., Mathews, C. K. & Merrill, G. F. Hydroxyurea arrests DNA

replication by a mechanism that preserves basal dNTP pools. The Journal of biological

chemistry 279, 223–30 (2004).

134. Rotman, E. & Kuzminov, A. The mutT defect does not elevate chromosomal

fragmentation in Escherichia coli because of the surprisingly low levels of

MutM/MutY-recognized DNA modifications. Journal of bacteriology 189, 6976–88

(2007).

135. Tye, B. K., Chien, J., Lehman, I. R., Duncan, B. K. & Warner, H. R. Uracil

incorporation: a source of pulse-labeled DNA fragments in the replication of the

Escherichia coli chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America 75, 233–7 (1978).

136. Gadsden, M. H., McIntosh, E. M., Game, J. C., Wilson, P. J. & Haynes, R. H. dUTP

pyrophosphatase is an essential enzyme in Saccharomyces cerevisiae. The EMBO

journal 12, 4425–31 (1993).

116

137. Dengg, M. et al. Abrogation of the CLK-2 checkpoint leads to tolerance to base-

excision repair intermediates. EMBO reports 7, 1046–51 (2006).

138. Erdélyi, P. et al. Shared developmental roles and transcriptional control of autophagy

and apoptosis in Caenorhabditis elegans. Journal of cell science 124, 1510–8 (2011).

139. Castillo-Acosta, V. M., Estévez, A. M., Vidal, A. E., Ruiz-Perez, L. M. & González-

Pacanowska, D. Depletion of dimeric all-alpha dUTPase induces DNA strand breaks

and impairs cell cycle progression in Trypanosoma brucei. The international journal of

biochemistry & cell biology 40, 2901–13 (2008).

140. Dubois, E. et al. Homologous recombination is stimulated by a decrease in dUTPase in

Arabidopsis. PloS one 6, e18658 (2011).

141. el-Hajj, H. H., Zhang, H. & Weiss, B. Lethality of a dut (deoxyuridine triphosphatase)

mutation in Escherichia coli. Journal of bacteriology 170, 1069–75 (1988).

142. Warner, H. R., Duncan, B. K., Garrett, C. & Neuhard, J. Synthesis and metabolism of

uracil-containing deoxyribonucleic acid in Escherichia coli. Journal of bacteriology

145, 687–95 (1981).

143. Ladner, R. D. et al. dUTP nucleotidohydrolase isoform expression in normal and

neoplastic tissues: association with survival and response to 5-fluorouracil in colorectal

cancer. Cancer research 60, 3493–503 (2000).

144. Pugacheva, E. N. et al. Novel gain of function activity of p53 mutants: activation of the

dUTPase gene expression leading to resistance to 5-fluorouracil. Oncogene 21, 4595–

600 (2002).

145. Canman, C. E. et al. Induction of resistance to fluorodeoxyuridine cytotoxicity and

DNA damage in human tumor cells by expression of Escherichia coli

deoxyuridinetriphosphatase. Cancer research 54, 2296–8 (1994).

146. Hochhauser, S. J. & Weiss, B. Escherichia coli mutants deficient in deoxyuridine

triphosphatase. Journal of bacteriology 134, 157–66 (1978).

147. Parsels, L. A. et al. Mechanism and pharmacological specificity of dUTPase-mediated

protection from DNA damage and cytotoxicity in human tumor cells. Cancer

chemotherapy and pharmacology 42, 357–62 (1998).

148. Williams, D. et al. Evidence for a second messenger function of dUTP during Bax

mediated apoptosis of yeast and mammalian cells. Biochimica et biophysica acta 1813,

315–21 (2011).

149. Wang, Z. & Mosbaugh, D. W. Uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage

PBS2: cloning and effects of expression of the inhibitor gene in Escherichia coli.

Journal of bacteriology 170, 1082–91 (1988).

150. Chien, C.-Y., Chou, C.-K. & Su, J.-Y. Ung1p-mediated uracil-base excision repair in

mitochondria is responsible for the petite formation in thymidylate deficient yeast.

FEBS letters 583, 1499–504 (2009).

151. Seiple, L., Jaruga, P., Dizdaroglu, M. & Stivers, J. T. Linking uracil base excision

repair and 5-fluorouracil toxicity in yeast. Nucleic acids research 34, 140–51 (2006).

152. Kumar, S., Aninat, C., Michaux, G. & Morel, F. Anticancer drug 5-fluorouracil induces

reproductive and developmental defects in Caenorhabditis elegans. Reproductive

toxicology (Elmsford, N.Y.) 29, 415–20 (2010).

117

153. Andersen, S. et al. Incorporation of dUMP into DNA is a major source of spontaneous

DNA damage, while excision of uracil is not required for cytotoxicity of

fluoropyrimidines in mouse embryonic fibroblasts. Carcinogenesis 26, 547–55 (2005).

154. An, Q., Robins, P., Lindahl, T. & Barnes, D. E. 5-Fluorouracil incorporated into DNA

is excised by the Smug1 DNA glycosylase to reduce drug cytotoxicity. Cancer

research 67, 940–5 (2007).

155. Luo, Y., Walla, M. & Wyatt, M. D. Uracil incorporation into genomic DNA does not

predict toxicity caused by chemotherapeutic inhibition of thymidylate synthase. DNA

repair 7, 162–9 (2008).

156. Pettersen, H. S. et al. UNG-initiated base excision repair is the major repair route for 5-

fluorouracil in DNA, but 5-fluorouracil cytotoxicity depends mainly on RNA

incorporation. Nucleic acids research 39, 8430–44 (2011).

157. Kunz, C. et al. Base excision by thymine DNA glycosylase mediates DNA-directed

cytotoxicity of 5-fluorouracil. PLoS biology 7, e91 (2009).

158. Sansom, O. J. et al. MBD4 deficiency reduces the apoptotic response to DNA-

damaging agents in the murine small intestine. Oncogene 22, 7130–6 (2003).

159. McNeill, D. R., Lam, W., DeWeese, T. L., Cheng, Y.-C. & Wilson, D. M. Impairment

of APE1 function enhances cellular sensitivity to clinically relevant alkylators and

antimetabolites. Molecular cancer research : MCR 7, 897–906 (2009).

160. Liu, A., Yoshioka, K.-I., Salerno, V. & Hsieh, P. The mismatch repair-mediated cell

cycle checkpoint response to fluorodeoxyuridine. Journal of cellular biochemistry 105,

245–54 (2008).

161. Geng, L., Huehls, A. M., Wagner, J. M., Huntoon, C. J. & Karnitz, L. M. Checkpoint

signaling, base excision repair, and PARP promote survival of colon cancer cells

treated with 5-fluorodeoxyuridine but not 5-fluorouracil. PloS one 6, e28862 (2011).

162. Li, L., Connor, E. E., Berger, S. H. & Wyatt, M. D. Determination of apoptosis, uracil

incorporation, DNA strand breaks, and sister chromatid exchanges under conditions of

thymidylate deprivation in a model of BER deficiency. Biochemical pharmacology 70,

1458–68 (2005).

163. Wyatt, M. D. & Wilson, D. M. Participation of DNA repair in the response to 5-

fluorouracil. Cellular and molecular life sciences : CMLS 66, 788–99 (2009).

164. Cortellino, S. et al. The base excision repair enzyme MED1 mediates DNA damage

response to antitumor drugs and is associated with mismatch repair system integrity.


15071–6 (2003).

165. Mi, L. J., Chaung, W., Horowitz, R., Teebor, G. W. & Boorstein, R. J. Excessive base

excision repair of 5-hydroxymethyluracil from DNA induces apoptosis in Chinese

hamster V79 cells containing mutant p53. Carcinogenesis 22, 179–86 (2001).

166. Boorstein, R. J. et al. Definitive identification of mammalian 5-hydroxymethyluracil

DNA N-glycosylase activity as SMUG1. The Journal of biological chemistry 276,

41991–7 (2001).

167. McNeill, D. R. & Wilson, D. M. A dominant-negative form of the major human abasic

endonuclease enhances cellular sensitivity to laboratory and clinical DNA-damaging

agents. Molecular cancer research : MCR 5, 61–70 (2007).

118

168. Pulukuri, S. M. K., Knost, J. A., Estes, N. & Rao, J. S. Small interfering RNA-directed

knockdown of uracil DNA glycosylase induces apoptosis and sensitizes human prostate

cancer cells to genotoxic stress. Molecular cancer research : MCR 7, 1285–93 (2009).

169. Horton, J. K., Joyce-Gray, D. F., Pachkowski, B. F., Swenberg, J. a & Wilson, S. H.

Hypersensitivity of DNA polymerase beta null mouse fibroblasts reflects accumulation

of cytotoxic repair intermediates from site-specific alkyl DNA lesions. DNA repair 2,

27–48 (2003).

170. Roos, W. P. & Kaina, B. DNA damage-induced cell death by apoptosis. Trends in

molecular medicine 12, 440–50 (2006).

171. Malzer, E. et al. Impaired tissue growth is mediated by checkpoint kinase 1 (CHK1) in

the integrated stress response. Journal of cell science 123, 2892–900 (2010).

172. Moldovan, G.-L. & D’Andrea, A. D. How the fanconi anemia pathway guards the

genome. Annual review of genetics 43, 223–49 (2009).

173. Collis, S. J. et al. HCLK2 is essential for the mammalian S-phase checkpoint and

impacts on Chk1 stability. Nature cell biology 9, 391–401 (2007).

174. Collis, S. J. et al. FANCM and FAAP24 function in ATR-mediated checkpoint

signaling independently of the Fanconi anemia core complex. Molecular cell 32, 313–

24 (2008).

175. Lukas, J., Lukas, C. & Bartek, J. More than just a focus: The chromatin response to

DNA damage and its role in genome integrity maintenance. Nature cell biology 13,

1161–9 (2011).

176. Smith, J., Tho, L. M., Xu, N. & Gillespie, D. a The ATM-Chk2 and ATR-Chk1

pathways in DNA damage signaling and cancer. Advances in cancer research 108, 73–

112 (2010).

177. Eimon, P. M. & Ashkenazi, A. The zebrafish as a model organism for the study of

apoptosis. Apoptosis : an international journal on programmed cell death 15, 331–49

(2010).

178. Stiff, T. et al. Nbs1 is required for ATR-dependent phosphorylation events. The EMBO

journal 24, 199–208 (2005).

179. Lee, S.-J., Gartner, A., Hyun, M., Ahn, B. & Koo, H.-S. The Caenorhabditis elegans

Werner syndrome protein functions upstream of ATR and ATM in response to DNA

replication inhibition and double-strand DNA breaks. PLoS genetics 6, e1000801

(2010).

180. Hahm, S.-H. et al. Knock-down of human MutY homolog (hMYH) decreases

phosphorylation of checkpoint kinase 1 (Chk1) induced by hydroxyurea and UV

treatment. BMB reports 44, 352–7 (2011).

181. Xiao, Z., Xue, J., Sowin, T. J., Rosenberg, S. H. & Zhang, H. A novel mechanism of

checkpoint abrogation conferred by Chk1 downregulation. Oncogene 24, 1403–11

(2005).

182. Robinson, H. M. R. et al. Chk1-dependent slowing of S-phase progression protects

DT40 B-lymphoma cells against killing by the nucleoside analogue 5-fluorouracil.

Oncogene 25, 5359–69 (2006).

119

183. Jardim, M. J. et al. Reduced ATR or Chk1 expression leads to chromosome instability

and chemosensitization of mismatch repair-deficient colorectal cancer cells. Molecular

biology of the cell 20, 3801–9 (2009).

184. Yang, Z., Waldman, A. S. & Wyatt, M. D. DNA damage and homologous

recombination signaling induced by thymidylate deprivation. Biochemical

pharmacology 76, 987–96 (2008).

185. Ravi, D. et al. A network of conserved damage survival pathways revealed by a

genomic RNAi screen. PLoS genetics 5, e1000527 (2009).

186. Liu, Y. et al. Interactions of human mismatch repair proteins MutSalpha and

MutLalpha with proteins of the ATR-Chk1 pathway. The Journal of biological

chemistry 285, 5974–82 (2010).

187. Das, K. C. & Dashnamoorthy, R. Hyperoxia activates the ATR-Chk1 pathway and

phosphorylates p53 at multiple sites. American journal of physiology. Lung cellular

and molecular physiology 286, L87–97 (2004).

188. Hernández-Vargas, H. et al. Transcriptional profiling of MCF7 breast cancer cells in

response to 5-Fluorouracil: relationship with cell cycle changes and apoptosis, and

identification of novel targets of p53. International journal of cancer. Journal

international du cancer 119, 1164–75 (2006).

189. Webley, S. D., Welsh, S. J., Jackman, a L. & Aherne, G. W. The ability to accumulate

deoxyuridine triphosphate and cellular response to thymidylate synthase (TS)

inhibition. British journal of cancer 85, 446–52 (2001).

190. Karnani, N. & Dutta, A. The effect of the intra-S-phase checkpoint on origins of

replication in human cells. Genes & development 25, 621–33 (2011).

191. Fasulo, B. et al. Chk1 and Wee1 kinases coordinate DNA replication, chromosome

condensation, and anaphase entry. Molecular biology of the cell 23, 1047–57 (2012).

192. Shirasaki, T. et al. Effects of small interfering RNA targeting thymidylate synthase on

survival of ACC3 cells from salivary adenoid cystic carcinoma. BMC cancer 8, 348

(2008).

193. Longley, D. B. et al. The role of thymidylate synthase induction in modulating p53-

regulated gene expression in response to 5-fluorouracil and antifolates. Cancer

research 62, 2644–9 (2002).

194. Yang, T.-Y. et al. Pemetrexed induces both intrinsic and extrinsic apoptosis through

ataxia telangiectasia mutated/p53-dependent and -independent signaling pathways.

Molecular carcinogenesis 1–12 (2011).doi:10.1002/mc.21842

195. Wagner, M. W. et al. Role of c-Abl kinase in DNA mismatch repair-dependent G2 cell

cycle checkpoint arrest responses. The Journal of biological chemistry 283, 21382–93

(2008).

196. Niida, H. et al. Essential role of Tip60-dependent recruitment of ribonucleotide

reductase at DNA damage sites in DNA repair during G1 phase. Genes & development

24, 333–8 (2010).

197. Yoon, J. et al. Characterization of the 3’ --> 5' exonuclease activity found in human

nucleoside diphosphate kinase 1 (NDK1) and several of its homologues. Biochemistry

44, 15774–86 (2005).

120

198. Batra, V., Kesavan, V. & Mishra, K. P. Modulation of enzymes involved in folate

dependent one-carbon metabolism by gamma-radiation stress in mice. Journal of

radiation research 45, 527–33 (2004).

199. Ligabue, A., Marverti, G., Liebl, U. & Myllykallio, H. Transcriptional activation and

cell cycle block are the keys for 5-Fluorouracil induced up-regulation of human

thymidylate synthase expression. PloS one 7, e47318 (2012).

200. Carcagno, A. L. et al. E2F1 transcription is induced by genotoxic stress through

ATM/ATR activation. IUBMB life 61, 537–43 (2009).

201. Biswas, A. K. & Johnson, D. G. Transcriptional and nontranscriptional functions of

E2F1 in response to DNA damage. Cancer research 72, 13–7 (2012).

202. Lankat-Buttgereit, B., Lenschen, B., Schmidt, H. & Göke, R. The action of Pdcd4 may

be cell type specific: evidence that reduction of dUTPase levels might contribute to its

tumor suppressor activity in Bon-1 cells. Apoptosis : an international journal on

programmed cell death 13, 157–64 (2008).

203. Wang, X. et al. A positive role for c-Abl in Atm and Atr activation in DNA damage

response. Cell death and differentiation 18, 5–15 (2011).

204. Zawacka-Pankau, J., Kostecka, A., Sznarkowska, A., Hedström, E. & Kawiak, A. p73

tumor suppressor protein: a close relative of p53 not only in structure but also in anti-

cancer approach? Cell cycle (Georgetown, Tex.) 9, 720–8 (2010).

205. Reinhardt, H. C., Aslanian, A. S., Lees, J. a & Yaffe, M. B. p53-deficient cells rely on

ATM- and ATR-mediated checkpoint signaling through the p38MAPK/MK2 pathway

for survival after DNA damage. Cancer cell 11, 175–89 (2007).

206. McDermott, U. et al. Effect of p53 status and STAT1 on chemotherapy-induced, Fas-

mediated apoptosis in colorectal cancer. Cancer research 65, 8951–60 (2005).

207. Reinhardt, H. C. & Yaffe, M. B. Kinases that control the cell cycle in response to DNA

damage: Chk1, Chk2, and MK2. Current opinion in cell biology 21, 245–55 (2009).

208. Sheikh, M. S. & Fornace, a J. Role of p53 family members in apoptosis. Journal of

cellular physiology 182, 171–81 (2000).

209. Kaeser, M. D., Pebernard, S. & Iggo, R. D. Regulation of p53 stability and function in

HCT116 colon cancer cells. The Journal of biological chemistry 279, 7598–605

(2004).

210. Longley, D. B. et al. The roles of thymidylate synthase and p53 in regulating Fas-

mediated apoptosis in response to antimetabolites. Clinical cancer research : an

official journal of the American Association for Cancer Research 10, 3562–71 (2004).

211. Muñoz-Pinedo, C., Oliver, F. J. & López-Rivas, A. Apoptosis of haematopoietic cells

upon thymidylate synthase inhibition is independent of p53 accumulation and CD95-

CD95 ligand interaction. The Biochemical journal 353, 101–108 (2001).

212. Geller, J. et al. Interferon-gamma-induced sensitization of colon carcinomas to ZD9331

targets caspases, downstream of Fas, independent of mitochondrial signaling and the

inhibitor of apoptosis survivin. Clinical cancer research : an official journal of the

American Association for Cancer Research 9, 6504–15 (2003).

213. Zhuang, S., Demirs, J. T. & Kochevar, I. E. P38 Mitogen-Activated Protein Kinase

Mediates Bid Cleavage, Mitochondrial Dysfunction, and Caspase-3 Activation During

121

Apoptosis Induced By Singlet Oxygen But Not By Hydrogen Peroxide. The Journal of


214. Tonzetich, J. Orcein staining and the identification of polytene chromosomes. Methods

in molecular biology (Clifton, N.J.) 247, 249–56 (2004).

215. Békési, A. et al. Developmental regulation of dUTPase in Drosophila melanogaster.

The Journal of biological chemistry 279, 22362–70 (2004).

216. Wickramasinghe, S. N. & Fida, S. Bone marrow cells from vitamin B12- and folate-

deficient patients misincorporate uracil into DNA. Blood 83, 1656–61 (1994).

217. Blount, B. C. et al. Folate deficiency causes uracil misincorporation into human DNA

and chromosome breakage: implications for cancer and neuronal damage. Proceedings

of the National Academy of Sciences of the United States of America 94, 3290–5

(1997).

218. Ren, J., Ulvik, A., Refsum, H. & Ueland, P. M. Uracil in human DNA from subjects

with normal and impaired folate status as determined by high-performance liquid

chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical chemistry 74, 295–9 (2002).

219. Duthie, S. J. & McMillan, P. Uracil misincorporation in human DNA detected using

single cell gel electrophoresis. Carcinogenesis 18, 1709–14 (1997).

220. Lee, H.-W. et al. Monitoring repair of DNA damage in cell lines and human peripheral

blood mononuclear cells. Analytical biochemistry 365, 246–59 (2007).

221. Sikorsky, J. A., Primerano, D. A., Fenger, T. W. & Denvir, J. DNA damage reduces

Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency. Biochemical and

biophysical research communications 355, 431–7 (2007).

222. Laws, G. M., Skopek, T. R., Reddy, M. V, Storer, R. D. & Glaab, W. E. Detection of

DNA adducts using a quantitative long PCR technique and the fluorogenic 5’ nuclease

assay (TaqMan). Mutation research 484, 3–18 (2001).

223. Sikorsky, J. a, Primerano, D. a, Fenger, T. W. & Denvir, J. Effect of DNA damage on

PCR amplification efficiency with the relative threshold cycle method. Biochemical

and biophysical research communications 323, 823–30 (2004).

224. Rothfuss, O., Gasser, T. & Patenge, N. Analysis of differential DNA damage in the

mitochondrial genome employing a semi-long run real-time PCR approach. Nucleic

acids research 38, e24 (2010).

225. Meyer, J. N. QPCR: a tool for analysis of mitochondrial and nuclear DNA damage in

ecotoxicology. Ecotoxicology (London, England) 19, 804–11 (2010).

226. Hunter, S. E., Jung, D., Di Giulio, R. T. & Meyer, J. N. The QPCR assay for analysis

of mitochondrial DNA damage, repair, and relative copy number. Methods (San Diego,

Calif.) 51, 444–51 (2010).

227. Thomassin, H., Kress, C. & Grange, T. MethylQuant: a sensitive method for

quantifying methylation of specific cytosines within the genome. Nucleic acids

research 32, e168 (2004).

228. Nilsen, H. et al. Uracil-DNA glycosylase (UNG)-deficient mice reveal a primary role

of the enzyme during DNA replication. Molecular cell 5, 1059–65 (2000).

122

229. Kavli, B. et al. B cells from hyper-IgM patients carrying UNG mutations lack ability to

remove uracil from ssDNA and have elevated genomic uracil. The Journal of

experimental medicine 201, 2011–21 (2005).

230. Yamaguchi, M., Hayashi, Y., Nishimoto, Y., Hirose, F. & Matsukage, A. A nucleotide

sequence essential for the function of DRE, a common promoter element for

Drosophila DNa replication-related genes. The Journal of biological chemistry 270,

15808–14 (1995).

231. Katoh, K., Asimenos, G. & Toh, H. Multiple alignment of DNA sequences with

MAFFT. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 537, 39–64 (2009).

232. Ohno, K., Hirose, F., Sakaguchi, K., Nishida, Y. & Matsukage, A. Transcriptional

regulation of the Drosophila CycA gene by the DNA replication-related element (DRE)

and DRE binding factor (DREF). Nucleic acids research 24, 3942–6 (1996).

233. Matsukage, A., Hirose, F., Yoo, M.-A. & Yamaguchi, M. The DRE/DREF

transcriptional regulatory system: a master key for cell proliferation. Biochimica et

biophysica acta 1779, 81–9 (2008).

234. Yan, N., O’Day, E., Wheeler, L. A., Engelman, A. & Lieberman, J. HIV DNA is

heavily uracilated, which protects it from autointegration. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America 108, 9244–9 (2011).

235. Weichsel, a, Montfort, W. R., Cieśla, J. & Maley, F. Promotion of purine nucleotide

binding to thymidylate synthase by a potent folate analogue inhibitor, 1843U89.


3493–7 (1995).

123

9. Közlemények listája

9.1. Referált szakmai folyóiratban megjelent közlemények (megosztott első szerzők*)

1. Muha Villő*, Horváth András*, Békési Angéla, Pukáncsik Mária, Hodoscsek Barbara,

Merényi Gábor, Róna Gergely, Batki Júlia, Kiss István, Jankovics Ferenc, Vilmos Péter,

Erdélyi Miklós, Vértessy G. Beáta; Uracil-containing DNA in Drosophila: Stability, Stage-

specific Accumulation, and Developmental Involvement, PLoS Genetics 2012, 8(6):e1002738

2. Horváth András, Vértessy G. Beáta; A one-step method for quantitative determination of

uracil in DNA by real-time PCR, Nucleic Acids Research 2010, 38(21):e196

9.2. Referált szakmai folyóiratban közlés alatt álló publikációk

1. Horváth András, Békési Angéla, Muha Villő, Erdélyi Miklós, Vértessy G. Beáta;

Expending the Alphabet in the fruit fly: uracil enrichment in genomic DNA, Fly, elfogadva:

2012. december 10.

9.3. Konferencián tartott szóbeli előadások (Az előadó neve aláhúzva)

2012: Horváth András, Muha Villő, Békési Angéla, Batki Júlia, Vilmos Péter, Kiss István,

Erdélyi Miklós, Vértessy G. Beáta

Uracil szubsztituált DNS által kiváltott sejtválaszok muslicában

Magyar Biokémiai Egyesület Jelátviteli szakosztályának III. konferenciája, Esztergom

2012: Horváth András, Muha Villő, Békési Angéla, Batki Júlia, Hodoscsek Barbara,

Vilmos Péter, Jankovics Ferenc, Kiss István, Erdélyi Miklós, Vértessy G. Beáta

dUTPase is essential for genome stability and imaginal tissue development in Drosophila

FEBS 3+ Meeting, Opatija, Horvátország

2011: Vértessy G. Beáta, Muha Villő, Békési Angéla, Horváth András, Merényi Gábor,

Zagyva Imre, Tóth Judit, Leveles Ibolya

Uracil-DNS: javítás és jelátvitel

IX. Magyar Genetikai Kongresszus és XVI. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Siófok

2011: Muha Villő, Békési Angéla, Gudor Róbert, Horváth András, Zagyva Imre, Vértessy

G. Beáta

dUTPáz hatása a Drosophila melanogaster fejlődésére

IX. Magyar Genetikai Kongresszus és XVI. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Siófok

2011: Horváth András, Muha Villő, Vértessy G. Beáta

124

Deoxyuridine accumulation in organisms performing perturbed thymidylate metabolism

4th

European Conference on Chemistry for Life Sciences (ECCLS), Budapest

2010: Horváth András, Muha Villő, Békési Angéla, Tóth Judit, Szabó Judit Eszter, Leveles

Ibolya, Lopata Anna, Erdélyi Miklós, Jankovics Ferenc, Szabad János, Vértessy G. Beáta

The world of uracil-DNA

Straub Napok, Szegedi Biológiai Központ, Szeged

2008: Tombácz István, Schauer Tamás, Komornyi Orbán, Horváth András, Boros Imre

Az RNS polimeráz CTD foszfatáz FCP1 szerepe

Magyar Biokémiai Egyesület Vándorgyűlés, Szeged

9.4. Konferencián tartott poszter előadások (Az előadó neve aláhúzva)

2011: Horváth András, Muha Villő, Békési Angéla, Hodocsek Barbara, Kiss István,

Jankovics Ferenc, Erdélyi Miklós, Vértessy G. Beáta

Relation of factors influencing genomic uracil appearance and Drosophila development

3rd

EMBO Meeting, Bécs, Ausztria

2010: Horváth András, Muha Villő, Vértessy G. Beáta

Uracil accumulation in DNA of organisms performing perturbed thymidilate metabolism

Straub Napok, Szegedi Biológiai Központ, Szeged

2009: Horváth András, Vértessy G. Beáta

DNS-beli uracil kvantifikálása kvantitatív PCR segítségével

Magyar Biokémiai Egyesület Vándorgyűlés, Budapest

Documents

A dUTPáz kifejeződés hatása a DNS bázisösszetételére és a ...teo.elte.hu/minosites/ertekezes2012/horvath_andras.pdf · A dUTPáz kifejeződés hatása a DNS bázisösszetételére