Click here to load reader

การตรวจวินิจฉัยเชื้อ Cryptosporidium spp.เช อ Cryptosporidium spp. ระยะ oocyst จะม ค ณสมบ ต ของการต

  • View
    3

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of การตรวจวินิจฉัยเชื้อ Cryptosporidium spp.เช อ...

  • คู่มือปฏิบติังาน

    การตรวจวนิิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp.

    ดว้ยวธีิดูสด (Wet smear) และยอ้มสีพิเศษ

    (Rapid DMSO modified acid fast)

    กณัฐินิษฐ ์ทิมา

    ภาควชิาพยาธิโปรโตซวั คณะเวชศาสตร์เขตร้อน

    มหาวทิยาลยัมหิดล

  • คาํนํา

    เช้ือ Cryptosporidium spp. ระยะ oocyst จะมีคุณสมบติัของการติดสีทนกรด (acid fast) ดงันั้นการ

    ตรวจอุจจาระเพื่อการตรวจวินิจฉยั จึงยอ้มดว้ยสีพิเศษคือ Rapid DMSO modified acid fast ดว้ยวิธียอ้มน้ีจะทาํให้

    การอ่านผลง่ายข้ึน และใชเ้วลา ในการ ยอ้มนอ้ยกวา่การยอ้มดว้ยวิธีอ่ืน ภาควิชาพยาธิโปรโตซวั คณะ

    เวชศาสตร์เขตร้อน มหาวิทยาลยัมหิดล ไดใ้ชว้ิธียอ้มสีพิเศษน้ีกบัเช้ือ Cryptosporidium spp. มานานกวา่ 17 ปี

    คู่มือปฏิบติังานการตรวจ วินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. เล่มน้ีเป็นการรวบรวม ความรู้และ

    ประสบการณ์ ของผูเ้ขียนท่ี ไดใ้ห้ บริการตรวจวินิจฉยั เช้ือดงักล่า วดว้ยวิธีดูสดและยอ้มสีพิเศษ ดงักล่าว ใน

    หอ้งปฏิบติัการ ในคู่มือเล่มน้ีจะกล่าวถึงรายละเอียดทุกขั้นตอนของการเกบ็ตวัอยา่งส่งตรวจ การเตรียมสไลดเ์พื่อดู

    เช้ือแบบสด การเตรียมสไลดส์าํหรับยอ้มสีพิเศษ การ mount สไลด ์ ตลอดจนเทคนิคการตรวจเช้ื อดว้ยการดูสด

    และการยอ้มสีพิเศษ การรายงานผล ตวัอยา่งกรณีศึกษาจากหน่วยงานภาครัฐหรือโรงพยาบาลต่างๆ รวมถึง

    ปัญหาและอุปสรรคต่างๆของวิธีการตรวจ พร้อมทั้งขอ้เสนอแนะแนวทางในการแกไ้ขเพื่อพฒันาวิธีการตรวจใหดี้

    ข้ึน เทคนิคเฉพาะท่ีสาํคญัในการปฏิบติังานไดร้วบรวมและเนน้ไวใ้นกรอบส่ีเหล่ียมแลว้ ผูเ้ขียนหวงัวา่คู่มือเล่มน้ี

    จะเป็นขอ้มูลความรู้ท่ีก่อใหเ้กิดประโยชน์ต่อนกัวิจยัและผูป้ฏิบติังานในหอ้งปฏิบติัการต่างๆ ทัว่ประเทศท่ีมีการ

    ตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. เพื่อเอ้ือประโยชน์ต่อแพทยใ์นการวินิจฉยัผูป่้วยและการทาํนายโรค เพื่อเป็น

    แนวทางในการรักษาผูป่้วยต่อไป

    กณัฐินิษฐ ์ ทิมา

    9 กรกฎาคม 2558

  • กติตกิรรมประกาศ

    ผูเ้ขียนขอขอบคุณ รองศาสตราจารย์ ดร. พรทิพย ์เพช็รมิตร หวัหนา้ภาควิชาพยาธิโปรโตซวั สาํหรับ

    ตรวจสอบความถูกตอ้งของเน้ือหาและคาํแนะนาํต่างๆ ท่ีเป็นประโยชน์อยา่งยิง่เก่ียวกบัการตรวจวินิจฉยัเช้ือ

    Cryptosporidium spp. รวมทั้งขอขอบคุณรองศาสตราจารยพ์ิเศษวรรณา ไมพานิช สงักดัภาควิชา ปรสิต

    หนอนพยาธิ ซ่ึงเป็นผู ้ กลัน่กรอง ตรวจสอบความถูกตอ้งของเน้ือหา รวมทั้งแนะนาํใหค้าํปรึกษา ต่างๆท่ีเป็น

    ประโยชนใ์นการเขียนคู่มือเล่มน้ีไดอ้ยา่งดียิง่

    ขอขอบคุณ ผูช่้วยศาสตราจารยพ์ิเศษ เบญจนี พนัธ์ภูวงศ ์และคุณจารุฉตัต ์บุญนะโชติ สงักดัภาควิชา

    พยาธิวิทยา เขตร้อน ผูส้อนเทคนิคการเตรียมสี ขั้นตอนต่างๆเก่ียวกบัการยอ้มสีพิเศษ และดว้ยความระลึกถึงเป็น

    อยา่งยิง่แก่ ผูช่้วยศาสตราจารยจุ์ฑาทิพ ศิริพนัธ์ุ อาจารย์ ผูล่้วงลบั สังกดัภาควิชาพยาธิโปรโตซวั ซ่ึงเป็นผูส้อน

    เทคนิคการตรวจวินิจฉยัเช้ือดว้ยวิธีดูสดและวิธียอ้มสีพิเศษ และสุดทา้ยน้ีขอขอบคุณเจา้หนา้ท่ีทุกท่านในภาควิชาฯ

    ท่ีช่วยเหลือและใหก้าํลงัใจในการเขียนคู่มือเล่มน้ี

    กณัฐินิษฐ ์ ทิมา

    9 กรกฎาคม 2558

  • สารบัญ

    หน้า

    บทท่ี 1 บทนาํ

    ความเป็นมา 1

    วตัถุประสงค ์ 5

    ขอบเขต 5

    นิยามศพัทเ์ฉพาะ 6

    บทท่ี 2 บทบาทหนา้ท่ีความรับผดิชอบ 8

    บทบาทหนา้ท่ีความรับผดิชอบของตาํแหน่ง 8

    ลกัษณะงานท่ีปฏิบติั 10

    โครงสร้างการบริหารจดัการ 12

    บทท่ี 3 หลกัเกณฑว์ิธีการปฏิบติังาน 13

    หลกัเกณฑก์ารปฏิบติังาน 13

    วิธีการปฏิบติังาน 15

    ขอ้ควรระวงัในการปฏิบติังานในหอ้งปฏิบติัการ 18

    งานวิจยัท่ีเก่ียวขอ้ง 19

    บทท่ี 4 เทคนิคในการปฏิบติังาน 21

    แผนปฏิบติังาน 21

    ขั้นตอนการตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. 22

    วิธีติดตามและประเมินผลการปฏิบติังาน 35

    จรรยาบรรณในการการปฏิบติังาน 35

    ตวัอยา่งกรณีศึกษาจากหน่วยงานภาครัฐหรือจากโรงพยาบาลต่างๆ 36

    บทท่ี 5 ปัญหา อุปสรรค และแนวทางในการพฒันางาน 44

    บรรณานุกรม 51

    ภาคผนวก

  • สารบัญรูปภาพ

    รูปท่ี หนา้

    1. ลกัษณะผนงัซีสต ์2 ชั้นของเช้ือ C. parvum ดว้ยกลอ้งจุลทรรศน์แบบ TEM 2 2. ลกัษณะ oocyst ของเช้ือ C. parvum ท่ีมี sporozoite อยูภ่ายในจาํนวน 4 sporozoites 2 3. ลกัษณะภาชนะและปริมาณการเกบ็อุจจาระ 16 4. แบบฟอร์มการรับส่ิงส่งตรวจและรายงานผลการตรวจท่ีภาควิชาพยาธิโปรโตซวั 23 5. การตรวจวินิจฉยัเช้ือภายใตก้ลอ้งจุลทรรศน์ธรรมดา อยา่งเป็นระบบ 25 6. ลกัษณะ oocyst ของเช้ือ Cryptosporidium spp. ดว้ยวิธีการดูสดเปรียบเทียบกบั 25

    ลกัษณะของเช้ือราดว้ยกลอ้งจุลทรรศน์ธรรมดาดว้ยกาํลงัขยายสูง 40X

    7. ขั้นตอนการยอ้มสีพิเศษ Rapid DMSO modified acid fast เพื่อตรวจวินิจฉยัเช้ือ 28 Cryptosporidium spp.

    8. ขั้นตอนการ mount สไลดด์ว้ยนํ้ายา permount 30 9. ลกัษณะ oocyst ของเช้ือ Cryptosporidium spp. ดว้ยการยอ้มสีพิเศษ 32

    Rapid DMSO modified acid fast ดูดว้ยกลอ้งจุลทรรศน์ธรรมดากาํลงัขยายสูงสุด 100X

    10. ใบส่งตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. ดว้ยการยอ้มสีพิเศษท่ีส่งมาจาก 34 หน่วยงานต่างๆและบนัทึกผลการตรวจหาเช้ือจากภาควิชาพยาธิโปรโตซวั

    11. สไลดส์เมียร์อุจจาระท่ีหนาเกินไปและสไลดท่ี์บางเกินไปตรวจดว้ยกลอ้งจุลทรรศน ์ 46 ธรรมดากาํลงัขยายสูง 40X

    12. Background ของสเมียร์อุจจาระท่ียอ้มไดดี้จะติดสีเขียวและยอ้มไม่ดีจะติดสีม่วงแดง 47 13. Oocyst ของเช้ือ Cryptosporidium spp. ท่ีไม่ชดัเจนในสไลดย์อ้มสีท่ีไม่ได ้mount 48

    ตรวจดว้ยกลอ้งจุลทรรศน์ธรรมดาดว้ยกาํลงัขยายสูงสุด 100X

    14. ความชดัเจนของ oocyst ในสไลดท่ี์ผา่นการ mount และไม่ผา่นการ mount 49 ตรวจดว้ยกลอ้งจุลทรรศน์ธรรมดาดว้ยกาํลงัขยายสูง 40X

    15. ลกัษณะ oocyst ของเช้ือ Cryptosporidium spp. และ artifact ท่ียอ้มติดสีคลา้ย oocyst 49 ของเช้ือตรวจดว้ยกลอ้งจุลทรรศน์ธรรมดาดว้ยกาํลงัขยายสูงสุด 100X

  • 1

    บทที ่1

    บทนํา

    1.1 ความเป็นมา

    เช้ือ Cryptosporidium spp. เป็นเช้ือโปรโตซวัท่ีอยูใ่นกลุ่มค็อกซิเดีย (coccidia) เป็นสาเหตุก่อโรค

    Cryptosporidiosis ซ่ึงเป็นโรคติดต่อระหวา่งสตัวแ์ละคน (zoonosis) และเป็นโรคติดเช้ือฉวยโอกาสในผูป่้วย

    เอดส์ ถือเป็นปัญหาสาธารณสุขของประเทศ ทาํใหผู้ป่้วยมีอาการทอ้งเสียและลาํไสอ้กัเสบ โดย Tyzzer เป็นผู ้

    คน้พบเช้ือ Cryptosporidium คร้ังแรกในปี ค.ศ. 1907 จาก gastric gland ของหนูทดลองในหอ้งปฏิบติัการ

    และตั้งช่ือวา่ Cryptosporidium หลงัจากนั้นมีรายงานมากมายท่ีพบวา่เช้ือ Cryptosporidium ทาํใหเ้กิดพยาธิ

    สภาพอยา่งเฉียบพลนัและเร้ือรัง ไดท้ั้งในสตัวป่์าและสตัวเ์ล้ียง โดยเฉพาะลูกสตัวเ์ค้ียวเอ้ืองท่ีเกิดใหม่ โดยมี

    Cryptosporidium parvum เป็นสาเหตุสาํคญัท่ีทาํใหเ้กิดอาการทอ้งเสียในโค ลูกแพะ และแ กะ ซ่ึงก่อใหเ้กิด

    ความสูญเสียทางเศรษฐกิจอยา่งมาก ทั้งทางตรงและทางออ้ม นอกจากน้ีในสตัวปี์ก พบวา่เช้ือน้ีทาํใหไ้ก่บา้น

    เกิดโรคทางระบบหายใจ และทาํใหเ้กิดโรคทางเดินอาหารในไก่งวงและไก่นกกระทา

    รายงานพบเช้ือในคนเป็นคร้ังแรกโดย Nime และคณะในปี ค.ศ. 1976 ในผูป่้วยเดก็อาย ุ3 ปี ต่อมา

    รายงานการติดเช้ื อโปรโตซวัชนิดน้ีไดเ้พิ่มมากข้ึน ในบริเวณต่างๆ ทัว่โลก จากการศึกษาของ Ryan และ

    Hijjawi ในปี ค.ศ. 2015 พบวา่มีเช้ือ Cryptosporidium จาํนวน 27 species ท่ีตรวจพบไดท้ั้งในสตัวแ์ละคน

    พบในสตัวปี์กมี 3 species ไดแ้ก่ C. meleagridis, C. baileyi และ C. galli พบในสตัวเ์ล้ียงลูกดว้ยนม

    จาํนวน 19 species ไดแ้ก่ C. muris, C. parvum, C. wrairi, C. felis, C. andersoni, C. canis, C. hominis, C.

    suis, C. bovis, C. fayeri, C. macropodum, C. ryanae, C. xiaoi, C. ubiquitum, C. cuniculus, C. tyzzeri, C.

    viatorum, C. scrofarum และ C. erinacei พบในสตัวค์ร่ึงบกคร่ึงนํ้า เพียง 1 species คือ C. fragile ส่วนท่ีพบ

    ในสตัวเ์ล้ือยคลานมี 2 species ไดแ้ก่ C. serpentis และ C. varanii พบในปลามี 2 species ไดแ้ก่ C. molnari

    และ C. huwi มีการายงานมากกวา่ 40 จีโนไทป์ท่ีมีการเปล่ียนแปลงทางชีววิทยาและอณูวิทยา ซ่ึง

    Cryptosporidium spp.ในคนมีมากเกือบ 20 species และมีการรายงานจีโนไทป์ดว้ย species ท่ีมีความสาํคญั

    และตรวจพบในคนมากท่ีสุด คือ C. hominis และ C. parvum ซ่ึงเช้ือ Cryptosporidium spp. ต่างๆนั้นแยกจาก

    กนัไดย้ากดว้ยการดูลกัษณะ รูปร่างของเช้ือภายใตก้ลอ้งจุลทรรศน์ ในปัจจุบนัการแยก species ของเช้ือน้ี

    จาํเป็นอยา่งยิง่ตอ้งใชเ้ทคนิคทางอณูชีววิทยา

    ปัจจุบนัพบวา่เช้ือท่ีก่อโรคในคน ชนิด C. parvum น่าจะเป็นสาเหตุหน่ึงของโรคอุจจาระร่วงในคน

    ท่ีเพิ่มมากข้ึน ทั้งในคนท่ีมีร่างกายสมบูรณ์แขง็แรง (Healthy individuals) และคนท่ีมีภาวะภูมิคุม้กนับกพร่อง

    เช่นคนไขเ้อดส์ หรือผูป่้วยท่ีไดรั้บยากดภูมิคุม้กนั

    รายงานส่วนใหญ่พบเช้ือในเดก็มากกวา่ผูใ้หญ่ โดยเฉพาะอยา่งยิ่งในสถานรับเล้ียงเดก็ โดยผูป่้วยท่ี

    มีภูมิคุม้กนัปกติอาการทอ้งเสียมกัจะหายเอง แต่ผูป่้วยท่ีมีภูมิคุม้กนัตํ่า ผูป่้วยท่ีมีภูมิคุม้กนับกพร่องหรือผูป่้วย

  • 2

    เอดส์มกัจะมีอาการทอ้งเสียถ่ายเป็นนํ้าเร้ือรังและอาจทาํใหเ้สียชีวิตได ้ ซ่ึงปัจจุบนัน้ีมีผูป่้วยเอดส์ท่ีมีการติ ด

    เช้ือน้ีเพิ่มมากข้ึน จากการศึกษาโครงสร้าง oocyst ของเช้ือภายใตก้ลอ้งจุลทรรศน์อิเลค็ตรอนแบบส่องผา่น

    (Transmission Electron Microscopy) ของ Nanduri ในปี ค.ศ. 1999 พบวา่เช้ือดงักล่าว มีผนงัซีสตห์นา 2 ชั้น

    เป็นสาร glycocalyx ท่ีอยูบ่ริเวณพื้นผวิของ oocyst (รูปท่ี 1) ซ่ึงทาํใหย้าดูดซึมไดย้าก ปัจจุบนัจึงยงัไม่มียา

    ชนิดใดท่ีใหผ้ลดีในการรักษาโรคจากเช้ือน้ีได ้

    รูปท่ี 1 ลกัษณะผนงัซีสตห์นา 2 ชั้น ของเช้ือ C. parvum ดว้ยกลอ้งจุลทรรศน์แบบ TEM (Nanduri J, 1999)

    รูปท่ี 2 ลกัษณะ oocyst ท่ีมี sporozoite อยูภ่ายในจาํนวน 4 sporozoites ของเช้ือ C. parvum (ศาสตราจารย ์

    ประยงค ์ระดมยศและคณะ 2556)

    เปลือกชั้นนอก เปลือกชั้นใน

  • 3

    การตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. มีหลายวิธี ไดแ้ก่ วิธีการตรวจอยา่งง่ายหรือดูสด (wet

    smear) ซ่ึงเป็นการตรวจหา oocyst ของเช้ือจากอุจจาระดว้ยกลอ้งจุลทรรศน์ เน่ืองจาก oocyst ของเช้ือมีขนาด

    ใกลเ้คียงกบัระยะยสีตข์องเช้ือรา คือประมาณ 5 ไมโครเมตร (Jokipii, 1983) จึงตอ้งอาศยัทกัษะและความ

    ชาํนาญในการตรวจของผูป้ฏิบติังาน และ ทาํใหว้ิธีน้ีไม่ค่อยเหมาะสมสาํหรับการตรวจวินิจฉยัใน

    หอ้งปฏิบติัการของโรงพยาบาลทัว่ไป จากการศึกษาของ Casemore และคณะ ในปีค.ศ. 1985 เก่ียวกบัการ

    ตรวจอุจจาระดว้ยวิธีการยอ้มสีพิเศษต่างๆ พบวา่ oocyst ของเช้ือ Cryptosporidium มีคุณสมบติัในการติดสี

    ทนกรด (acid-fast) ดงันั้นการยอ้มดว้ยสีทนกรด จึงเป็นวิธีท่ีเหมาะสมในการตรวจวินิจฉยัมากท่ีสุด การยอ้ม

    ดว้ยวิธีน้ี oocyst จะติดสีแดงสด ทาํใหแ้ยกจากระยะยสีตข์องเช้ือราและส่ิงปนเป้ือนอ่ืนๆ ไดง่้าย และสามารถ

    ทาํการตรวจดูดว้ยกลอ้งจุลทรรศน์ธรรมดา ท่ีขนาดกาํลงัขยาย 400 เท่า (40X) การยอ้มสีทนกรดมีหลายวิธี

    ไดแ้ก่ modified Ziehl-Neelsen, modified dimethylsulfoxide (DMSO), safraninmethylene blue และ

    modified Koster จากการศึกษาเปรียบเทียบ การยอ้มดว้ย วิธีดงักล่าวน้ี พบวา่ทุกวิธีสามารถตรวจวินิจฉยั

    oocyst ของเช้ือ Cryptosporidium spp.ไดผ้ลดี รวดเร็ว แม่นยาํ และเหมาะสมในการใช้ งานในหอ้งปฏิบติัการ

    ทัว่ไปใหผ้ลดีใกลเ้คียงกนั นอกจากน้ียงัสามารถยอ้ม oocyst ของเช้ือดว้ยสีอ่ืนๆ เช่น สี Giemsa และสีฟลูออ

    เรสเซนต ์แต่ใหผ้ลการตรวจไม่ดีเท่าการยอ้มสี acid-fast ปัจจุบนัการตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp.

    ดว้ยการยอ้มวิธี modified Ziehl-Neelsen เป็นท่ีนิยมใชใ้นหอ้งปฏิบติัการทัว่ไปมากท่ีสุด โดยทัว่ไป oocyst

    ของเช้ือจะมีรูปร่างกลมและมีขนาดเสน้ผา่นศูนยก์ลางประมาณ 4-6 ไมโครเมตร (รูปท่ี 2) เม่ือยอ้มสีแลว้ จะมี

    สีแดง แต่การติดสีแดงน้ีมีลกัษณะไม่สมํ่าเสมอ จึงอาจพบทั้ง oocyst ท่ีมีสีซีดและสีเขม้ ผนงั oocyst หนา อาจ

    พบช่องวา่งระหวา่งผนงัของ oocyst ท่ีไม่ค่อยติดสี sporozoite ท่ีอยูภ่ายในสามารถพบไดต้ั้งแต่ 1-4 ตวั ทั้งน้ี

    ข้ึนอยูก่บัระยะและการเรียงตวัของ sporozoite และอาจพบ residuum body ได ้จากการศึกษาของ Bronsdon

    ในปีค.ศ. 1984 พบวา่การยอ้มสีดว้ยวิธี DMSO modified acid fast เป็นวิธีการท่ีทาํใหก้ารอ่านผลไดง่้ายข้ึน

    กวา่การยอ้มดว้ยสีวิธีอ่ืนๆ โดย oocyst จะติดสีสีชมพหูรือแดง ส่วนสีพื้นหรือ background จะติดสีเขียว

    นอกจากการยอ้มสีเช้ือจากอุจจาระโดยตรงเพื่อตรวจวินิจฉยัเช้ือดว้ยกลอ้งจุลทรรศน์แลว้ เรา

    สามารถทาํให้ oocyst ของเช้ือในอุจจาระแยกตวัออกมาจากเน้ืออุจจาระ โดยวิธีการลอยตวั (Flotation)

    วิธีการน้ีเป็นการตรวจแบบเขม้ขน้ ทาํใหเ้ราตรวจพบ oocyst ไดใ้นปริมาณท่ีเพิ่มข้ึนกว่าการยอ้มสี หรืออาจ

    ใชว้ิธีการตกตะกอน (Sedimentation) กไ็ด ้วิธีท่ีใหไ้ดผ้ลดีคือ Sheather’s sucrose floatation หรือ formalin

    ether sedimentation (Current and Garcia 1991) แต่มีขั้นตอนท่ียุง่ยาก การตรวจวินิจฉยัยงัสามารถใชว้ิธีทาง

    ภูมิคุม้กนัวิทยาหรือวิธีทางนํ้าเหลืองวิทยา เช่น อิมมิวโนฟลูออเรสเซนต ์และวิธีทางอณูชีววิทยา เช่น

    Polymerase Chain Reaction หรือ PCR ซ่ึงการตรวจดว้ยวิธี PCR น้ีมีความถูกตอ้ง ความไวและความจาํเพาะ

    เจาะจงในการ ตรวจวินิจฉยัสูง และยงัมีค่าใชจ่้ายสูง ขั้นตอนการตรวจท่ีซบัซอ้น อีกทั้งตอ้งอาศยัเคร่ืองมือ

    และผูเ้ช่ียวชาญเฉพาะทางในการวิเคราะห์ผล จึงไม่เหมาะสาํหรับงานตรวจวินิจฉยัประจาํในหอ้งปฏิบติัการ

    ของโรงพยาบาลทัว่ไป (Vejdani et al., 2014)

  • 4

    การตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp จะตอ้งอาศยัประสบการณ์และความชาํนาญของผูต้รวจ

    เป็นอยา่งมาก เน่ืองจากขนาด oocyst ของเช้ือน้ีมีขนาดเลก็ ทาํใหต้รวจวินิจฉยัไดย้ากมาก โดยเฉพาะอยา่งยิง่

    การตรวจเช้ือดว้ยการดูสด ในหอ้งปฏิบติัการ หลายแห่งยงัไม่สามารถท่ีจะตรวจวินิจฉยัเช้ือดงักล่าวไดอ้ยา่ง

    แม่นยาํ แมแ้ต่ผู ้ ท่ีผา่นการฝึกอบรมเก่ียวกบัการตรวจวินิจฉยัเช้ือดงักล่าวท่ีภาควิชาฯ จดัอบรม กย็งัไม่ค่อย

    มัน่ใจในการตรวจหาเช้ือน้ี

    ภาควิชาพยาธิโปร โตซวั เป็นหน่วยงานท่ีมีช่ือเสียง ในดา้นการตรวจเช้ือ Cryptosporidium spp.

    บุคลากรมีความเช่ียวชาญและชาํนาญในการตรวจวินิจฉยัเช้ือดว้ยวิธีการยอ้มสีพิเศษ ภาควิชาฯได้ใหบ้ริการ

    ตรวจวินิจฉยัเช้ือดงักล่าวแก่ผูป่้วยจากหน่วยงานต่างๆ มาเป็นเวลานาน อีกทั้งยงัได้ จดัใหมี้การอบรมเชิง

    ปฏิบติัการเพื่อใหค้วามรู้เก่ียวกบัการตรวจวินิจฉยัเช้ือ opportunistic protozoa ดว้ยการยอ้ม สีพิเศษใหแ้ก่

    บุคลากรทางการแพทย์เป็นประจาํทุกปี ภาควิชาพยาธิโปรโตซวัไดรั้บการยอมรับให้ เป็นแหล่งอา้งอิงในการ

    ตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. จากหน่วยงานอ่ืนๆตลอดมา

    ผูเ้ขียนดาํรงตาํแหน่งนกัวิทยาศาสตร์ รับผดิชอบงานการตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp.

    ดว้ยการยอ้มสีพิเศษ Rapid DMSO modified acid fast มาเป็นเวลานาน 17 ปี โดยเร่ิมเรียนรู้เทคนิคการตรวจ

    วินิจฉยัเช้ือน้ีจากผูช่้วยศาสตราจารยจุ์ฑาทิพ ศิริพนัธ์ุ ภาควิชาพยาธิโปรโตซวั และฝึกฝนวิธียอ้มสีพิเศษจาก

    ผูช่้วยศาสตราจารยพ์ิเศษ เบญจนี พนัธ์ภูวงศแ์ละคุณจารุฉตัต ์บุญนะโชติ สงักดัภาควิชาพยาธิวิทยา เขตร้อน

    จากนั้นผูเ้ขียนไดศึ้กษาเพิ่มเติมและฝึกทกัษะในการตรวจวินิจฉยัเช้ือดงักล่าวดว้ยตนเอง จากประสบการณ์ใน

    การตรวจวินิจฉยั จึงไดรั้บมอบหมายใหเ้ป็นผูรั้บผดิชอบในการตรวจวินิจฉยัเช้ือฉวยโอกาส (opportunistic

    protozoa) ชนิดต่างๆดว้ย เช่น เช้ือ Cyclospora cayetanensis, Cystoisospora belli ในผูป่้วยเอดส์ โดยการยอ้ม

    สีพิเศษ Rapid DMSO modified acid fast และการตรวจวินิจฉยัเช้ือ Microsporidium spp. ดว้ยการยอ้มสี

    พิเศษ Gram chromotrope

    ดงันั้นผูเ้ขียนหวงัวา่ คู่มือเล่มน้ีน่าจะมีประโยชน์อยา่งยิง่แก่ผูป้ฏิบติังาน เก่ียวกบัการตรวจวินิจฉยั

    เช้ือ Cryptosporidium spp. ในหอ้งปฏิบติัการของโรงพยาบาลต่างๆทัว่ประเทศ

  • 5

    1.2 วตัถุประสงค์

    1. เพื่อเป็นคู่มือในตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. จากส่ิงส่งตรวจท่ีเป็นอุจจาระของผูป่้วยเอดส์ท่ีมีอาการทอ้งเสีย

    2. เพื่อถ่ายทอดความรู้และประสบการณ์ในการ ตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. ใหแ้ก่บุคลากรทางการแพทย/์นกัเทคนิคการแพทยท่ี์ปฏิบติังานในหน่วยชนัสูตรโรค

    3. เพื่อใชเ้ป็นเอกสารอา้งอิงสาํหรับวิธีการตรวจวิเคราะห์เช้ือ opportunistic protozoa ให้มีประสิทธิภาพในหอ้งปฏิบติัการ

    1.3 ขอบเขต คู่มือการปฏิบติังานฉบบัน้ี เป็นคู่มือเก่ียวกบัการการตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. ดว้ย

    วิธีดูสดและการยอ้มสีพิเศษ Rapid DMSO modified acid fast ซ่ึงเน้ือหาครอบคลุมรายละเอียดต่างๆ ดงัน้ี

    - ลกัษณะของอุจจาระท่ีมีเช้ือ Cryptosporidium spp. - การเตรียมสเมียร์สไลดท่ี์ดี - การตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. ดว้ยการดูสดซ่ึงเปรียบเทียบกบัลกัษณะของเช้ือรา - ขั้นตอนการเตรียมสีและการยอ้มสีพิเศษ - เทคนิคต่างๆในการตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. ดว้ยการเปรียบเทียบสไลด์ท่ีผา่น

    การ mount และสไลดท่ี์ไม่ผา่นการ mount การตรวจวินิจฉยัเช้ือดว้ยกาํลงัขยายสูง 40X และการ

    ตรวจวินิจฉยัเช้ือดว้ยกาํลงัขยายสูงสุด 100X

    - ตวัอยา่งกรณีศึกษาเก่ียวกบัปัญหา และประสบการณ์เก่ียวกบั การตรวจวินิจฉยัเช้ื อ Cryptosporidium spp. จากโรงพยาบาลและหน่วยงานอ่ืนๆ รวมถึงการเสนอแนวทางใน การ

    แกไ้ขปัญหาดว้ย

  • 6

    1.4 นิยามศัพท์เฉพาะ

    Cryptosporidium spp. เช้ือโปรโตซวัซ่ึงจดัเป็นเช้ือฉวยโอกาสท่ีมกัก่อโรคในผูป่้วยเอดส์

    Zoonosis โรคติดต่อระหวา่งคนและสตัวท่ี์มีกระดูกสนัหลงัอ่ืนๆ ทั้งสตัว์

    เล้ียงและสตัวป่์า การติดต่ออาจติดต่อจากสตัวม์ายงัคน หรือจาก

    คนไปยงัสตัวก์ไ็ด ้

    Coccidia เช้ือโปรโตซวักลุ่มคอ็กซิเดียท่ีมีสาเหตุก่อใหเ้กิดโรคอุจจาระร่วง

    Oocyst ระยะหน่ึงของเช้ือโปรโตซวัในกลุ่มค็ อกซิเดีย มกัมี รูปร่างกลม

    หรือรี มีขนาดประมาณ 4-6 ไมครอน ผนงัเรียบ บางคร้ังอาจเห็น

    รูปร่างคลา้ยพระจนัทร์เส้ียวจาํนวน 1-4 ตวับรรจุอยูภ่ายใน

    Gastric กระเพาะอาหาร

    Formalin ether sedimentation การตกตะกอนอุจจาระดว้ยการใชฟ้อร์มาลีนและอีเทอร์

    Polymerase chain reaction เป็นเทคนิคท่ีใชใ้นการตรวจวินิจฉยัเช้ือทางอณูวิทยาเรียกวา่

    ปฏิกิริยาลูกโซ่เพอลิเมอเรส

    Opportunistic เช้ือฉวยโอกาสท่ีมกัเกิดกบัผูป่้วยท่ีมีภูมิคุม้กนับกพร่องหรือผูป่้วย

    เอดส์

    Species สปีชีส์

    Fix เป็นการทาํใหเ้ช้ือติดสไลด์ การติดสี oocyst ของเช้ือไดดี้ข้ึน และ

    ทาํใหรู้ปร่างของเช้ือยงัคงสภาพเดิม

    Mount การหยดนํ้ายา permount ลงบนสไลด ์แลว้ปิดทบัดว้ย กระจกปิด

    สไลด ์

    Coverslip แผน่กระจกปิดวตัถุบนสไลดโ์ดยมีหลายรูปร่าง และมีหลายขนาด

    เช่นขนาด 22x22 มิลลิลิตร

    Hospital number เป็นหมายเลขของผู ้ ป่วยนอก ซ่ึงจะออกหมายเลขให้ ในการ

    ลงทะเบียนเป็นผูป่้วยท่ีจะตรวจในโรงพยาบาล ซ่ึงออกโดยหน่วย

    เวชระเบียนของโรงพยาบาล

    Laboratory center หอ้งปฏิบติัการกลาง ซ่ึงจะมีผูก้รอกรายละเอียดต่างๆในการส่งส่ิง

    ส่งตรวจ

    Residuum ส่ิงท่ีเห็นใน oocyst ของเช้ือ Cryptosporidium spp. ซ่ึงจะเป็น

    ลกัษณะท่ีเป็นรูปร่างคลา้ยพระจนัทเ์ส้ียว

    Decolourize การลา้งสีส่วนเกินออกจากสีสเมียร์

  • 7

    Counterstain การยอ้มทบัดว้ยสีอีก 1 ชนิดลงบนสเมียร์เพื่อช่วยใหเ้ห็น รูปร่าง

    ของเช้ือชดัเจนข้ึน

    Background สีพื้นสเมียร์ของสไลด ์ซ่ึงจะเห็นเป็นสีเขียว

    Artifact ลกัษณะอ่ืนๆท่ีมีรูปร่างกลมคลา้ย oocyst ของเช้ือ

    Cryptosporidium spp.

    Positive control การควบคุมผลการยอ้มสี ดว้ยการมีสไลดท่ี์มีเช้ือ

    Cryptosporidium spp. ยอ้มควบคู่กบัสไลดข์องผูป่้วยดว้ยทุกคร้ัง

    Forcep คีมหรือปากคีบ สาํหรับใชจ้บัสไลดใ์นการยอ้มสี

    Nested PCR-RFLP เป็นเทคนิคการทาํปฏิกิริยาลูกโซ่ เพอลิเมอเรส 2 คร้ังโดยใช ้ไพร

    เมอร์ 2 คู่ เพื่อทาํใหป้ฏิกิริยามีความไวและความจาํเพาะมากข้ึน

    จากนั้นจึงนาํผลผลิตท่ีไดจ้ากปฏิกิริยาไปตดัดว้ยเอนไซม ์ตดั

    จาํเพาะ เพื่อดูขนาดของผลผลิตท่ีถูกตดัออกไป

    False positive ไม่มีการติดเช้ือ แต่ผลการตรวจเป็นบวก

  • 8

    บทที ่2

    บทบาทหน้าทีค่วามรับผดิชอบ

    2.1 บทบาทหน้าทีค่วามรับผดิชอบของตําแหน่ง

    นกัวิทยาศาสตร์ เป็นสายสนบัสนุนวิชาการท่ีมีความสาํคญัท่ีจะช่วยตอบสนองภารกิจหลกัดา้นงาน

    บริการวิชาการ งานวิจยัและงานดา้นการเรียนการสอน ช่วยอาํนวยความสะดวกให้กบัสายวิชาการใหมี้ความ

    คล่องตวัและเกิดประสิทธิภาพในการปฏิบติังาน

    นกัวิทยาศาสตร์ มีบทบาทสาํคญัในการปฏิบติังานดา้นวิทยาศาสตร์ จะตอ้งมีความชาํนาญการใน

    ดา้นวทิยาศาสตร์และเทคโนโลย ีมีความรู้ความสามารถและประสบการณ์สูง มีความคิดริเร่ิมสร้างสรรค์ และ

    สามารถพฒันาแนวทางการปฏิบติังานท่ีเหมาะสม เพื่อหา วิธีการใหม่ๆและนาํมาประยกุตใ์ชก้บังานท่ีปฏิบติั

    ได ้ตลอดจนแกไ้ขปัญหาต่างๆ และ ตดัสินใจในงานท่ีรับผดิชอบใหส้าํเร็จ ลุล่วง ตามวตัถุประสงค ์และ

    ปฏิบติังานอ่ืนๆ ตามท่ีไดรั้บมอบหมายไดอ้ยา่งมีประสิทธิภาพ โดยผูเ้ขียนคู่มือเล่มน้ีเป็นนั กวิทยาศาสตร์ท่ีมี

    หนา้ท่ีความรับผดิชอบในดา้นต่างๆ ดงัน้ี

    2.1.1 งานบริการวชิาการ

    - ใหบ้ริการวิชาการในการตรวจวินิจฉยัเช้ือพยาธิโปรโตซวัฉวยโอกาส (opportunistic protozoa) ดว้ยวิธียอ้มสีพิเศษ Rapid DMSO modified acid fast เพื่อตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp., C. cayetanensis,

    C. belli และการตรวจวินิจฉยัเช้ือ Microsporidia spp. ดว้ยวิธียอ้มสีพิเศษ Gram chromotrope

    - ใหค้วามอนุเคราะห์ตวัอยา่งเช้ือสดของเช้ือ Giardia duodenalis ดว้ยการเพาะเล้ียงเช้ือ เพื่อใช้ในการประกอบการเรียนการสอนของนกัศึกษาหลกัสูตรต่างๆและผูส้นใจมาศึกษาดูงานจากหน่วยงานต่างๆ

    ทั้งภายในและภายนอกคณะฯ

    - ใหค้วามอนุเคราะห์ตวัอยา่งเช้ือสดของเช้ือ Trichomonas vaginalis ดว้ยการเพาะเล้ียงเช้ือ เพื่อใชใ้นการประกอบการเรียนการสอนของนกัศึกษา หลกัสูตรต่างๆ และผูส้นใจมาศึกษาดูงานจาก หน่วยงาน

    ต่างๆ ทั้งภายในและภายนอกคณะฯ

    - ทาํการตรวจทางหอ้งปฏิบติัการในการตรวจประเมิ นคุณภาพของตวัอยา่งเช้ือพยาธิโปรโตซวัดว้ยวิธี direct smear การตรวจหาเช้ือ Cryptosporidium spp. และเช้ือ Microsporidia spp. ดว้ยการยอ้มสี

    พิเศษ ซ่ึงตวัอยา่งอุจจาระท่ีส่งมา จากหอ้งปฏิบติัการปรสิตวิทยาของหน่วยงานจาํนวน 5 หน่วยงาน ตอ้งทาํ

    การสเมียร์และยอ้มสีพิเศษเองทั้งหมด

    - ทาํการตรวจทางหอ้งปฏิบติัการในการตรวจประเมิ นคุณภาพของตวัอยา่งเช้ือพยาธิโปรโตซวัจากกรมวิทยาศาสตร์การแพทยด์ว้ยวิธี direct smear การตรวจหาเช้ือมาลาเรียชนิดต่างๆ และการตรวจหาเช้ือ

    โปรโตซวักลุ่ม opportunistic ในผูป่้วยเอดส์ (ซ่ึงตวัอยา่งส่งตรวจจะเป็นตะกอนขอ งอุจจาระและสไลดท่ี์ยอ้ม

    สีเป็นท่ีเรียบร้อยแลว้

  • 9

    2.1.2 งานวจัิย

    ขณะน้ีผูเ้ขียนคู่มือเป็นผูร่้วมทาํวิจยัอยู ่จาํนวน 2 โครงการในหวัขอ้เร่ือง ดงัน้ี

    - การศึกษาเช้ือโปรโตซวัและปรสิตก่อโรคสตัวติ์ดคนในลาํไสข้องสตัวต์ระกลูลิง สตัวส์ะเทินนํ้าสะเทินบกและสตัวเ์ล้ือยคลานท่ีเป็นสตัวเ์ล้ียงและในกรงเล้ียง ซ่ึงเป็นโครงการวิจยัท่ีทาํวิจยัร่วมกบัอาจารยจ์าก

    คณะสตัวแพทย ์ม.มหิดล

    - เป็นผูร่้วมวิจยัในการศึกษาฤทธ์ิของนํ้ามนัหอมระเหย จากสมุนไพรไทยต่อการตา้นเช้ือ G. duodenalis ซ่ึงเป็นโครงการวิจยัท่ีทาํวิจยัร่วมกบัอาจารยใ์นภาควิชาฯ

    โดยทาํหนา้ท่ีดาํเนินการวิจยับางส่วน มีส่วนร่วมในการแสดงความคิดเห็นต่างๆและ การแก้ไข

    ปัญหาต่างๆท่ีเกิดข้ึนในขณะดาํเนินการวิจยัดว้ย

    2.1.3 งานการเรียนการสอน

    - ใหค้วามอนุเคราะห์สไลดแ์บบถาวรของเช้ือ Cryptosporidium spp. C. cayetanensis, C. belli และเช้ือ Microsporidia spp. ดว้ยการยอ้มสีพิเศษ สาํหรับใชเ้ป็นส่ือประกอบการเรียนการสอน นกัศึกษา

    หลกัสูตรต่างๆจาก สถาบนั อ่ืนๆทั้งภายในและภายนอกคณะฯ รวมถึง ผูส้นใจมาศึกษาดูงานจากหน่วยงาน

    ต่างๆ

    - ช่วยสอนภาคปฏิบติัการเก่ียวกบัการเพาะเล้ี ยงเช้ือ G. duodenalis และเช้ือ Plasmodium falciparum แก่นกัศึกษาหลกัสูตร D.T.M. & H. ของคณะฯ และผูส้นใจมาศึกษาดูงานจากหน่วยงานต่างๆทั้ง

    ภายในและภายนอกคณะฯ

    - ช่วยสอนภาคปฏิบติัการเก่ียวกบัการตรวจวินิจฉยัเช้ือกลุ่ม คอ็กซิเดีย ดว้ยการยอ้มสีพิเศษ และการ สาธิตการดูเช้ือพยาธิโปรโตซวั ต่างๆแก่นกัศึกษาจากสถาบนัต่างๆ และผูส้นใจมาศึกษาดูงานจาก

    หน่วยงานต่างๆทั้งภายในและภายนอกคณะฯ

    2.1.4 งานอืน่ๆ ตามทีไ่ด้รับมอบหมาย

    เป็นกรรมการ วิทยากรพิเศษในการสอนภาคปฏิบติัการ เก่ียวกบัการดูเช้ือโปรโตซวัต่างๆให้ กบั

    นกัศึกษาของสถาบนัต่างๆ ภายนอกคณะฯ รวมทั้งการจดักิจกรรมต่างๆของภาควิชาฯ และคณะฯ

  • 10

    2.2 ลกัษณะงานทีป่ฏิบัติ

    2.2.1 ลกัษณะงานทีป่ฏิบัติทีส่อดคล้องกบัตําแหน่ง

    นกัวิทยาศาสตร์เป็นผูท่ี้ตอ้งปฏิบติังานดา้นต่างๆในหอ้งปฏิบติัการ ดงันั้นจะตอ้งมีความรับผดิชอบ

    ต่องานสูงมาก มีขั้นตอนในการวางแผนงานท่ีดีและมีความชาํนาญในการปฏิบติังาน จึงจะสามารถทาํงานได้

    เสร็จทนัเวลาและมีผลงานท่ีมีประสิทธิภาพสูงสุด ซ่ึงลกัษณะงานท่ีผูเ้ขียนคู่มือปฏิบติั มีดงัน้ี

    - การบริหารจดัการดว้ยการวางแผนในการเพาะเล้ียงเช้ือต่างๆ เช่น เตรียมสารเคมี อาหารเล้ียงเช้ือ รวมทั้งลา้ง ทาํความสะอาด อุปกรณ์ เคร่ืองแกว้ต่างๆใหส้ะอาดและ ทาํให้ปราศจากเช้ือ เพื่อใชใ้นงาน

    เพาะเล้ียงเช้ือ G. duodenalis, T. vaginalis และ เช้ือ P. falciparum รวมทั้งมีการปรับเปล่ียนวิธีการเล้ียงเช้ือ

    ต่างๆ เพื่อใหมี้การใชท้รัพยากรของรัฐและภาควิชาฯอยา่งคุม้ค่า เช่น การเพาะเล้ียงเช้ือ P. falciparum ในจาน

    เพาะเล้ียงขนาดเลก็จะตอ้งมีการเปล่ียนอาหารเล้ียงเช้ือทุกวนั แต่เพื่อประหยดัเวลา และอาหารเล้ียงเช้ือ จึงได้

    ทาํการเล้ียงเช้ือในจานเพาะเล้ียงขนาดใหญ่ ซ่ึงใชเ้วลาในการเปล่ียนอาหารเล้ียงเช้ือทุก 3 วนั

    - ทาํการ เตรียมสเมียร์ตวัอยา่งสไลดแ์บบถาวรของเช้ือโปรโตซวั จากส่ิงส่งตรวจต่างๆ เช่น ตวัอยา่งอุจจาระ ตวัอยา่งเลือด เตรียมสีต่างๆท่ีใชใ้นการยอ้มสไลดข์องเช้ือแต่ละชนิด ตลอดจนยอ้มสีของ

    เช้ือแต่ละชนิดเพื่อเกบ็ไวเ้ป็นสไลดอ์า้งอิงของภาควิชาฯ โดยมีการบริหารจดัการเก่ียวกบัการเตรียมสีในแต่

    ละคร้ัง จะมีการเตรียมสีในปริมาณ 500 - 1,000 มิลลิลิตร และเกบ็ในขวดสีชา เพื่อสามารถใชใ้นการยอ้มสีได้

    เป็นเวลาหลายเดือน และช่วยประหยดัเวลาในเตรียมสีดว้ย

    - ทาํการสัง่ซ้ือวสัดุวิทยาศาสตร์และสารเคมีต่างๆท่ีใชใ้นหอ้งปฏิบติัการของภาควิชาฯ โดยมีการบริหารจดัการกบัวสัดุวิทยาศาสตร์ต่างๆ ดว้ยการจดัใหมี้ stock กลาง เพื่อเจา้หนา้ท่ีสามารถเบิก ใชว้สัดุต่างๆ

    ไดอ้ยา่งทนัท่วงที ซ่ึงจะมีสมุดสาํหรับใหล้งบนัทึกรายละเอียดต่างๆในการเบิกวสัดุของภาควิชาฯดว้ย

    - ดูแลเคร่ืองมือบางอยา่งในหอ้งปฏิบติัการใหพ้ร้อมใชง้าน เช่น ตู ้ บ่มสาํหรับเพาะเล้ียงเช้ือ ชนิดท่ีควบคุมอุณหภูมิท่ี 37 องศาเซลเซียส และมี 5% คาร์บอนไดออกไซดด์ว้ย หาก พบวา่ตูมี้ปัญหาเก่ียวการ

    ปนเป้ือนเช้ือแบคทีเรียหรือเ ช้ือราเกิดข้ึน จะทาํการอบตูบ่้มสาํหรับเพาะเล้ียงเช้ือ เพื่อฆ่าเช้ือและทดสอบการ

    เจริญเติบโตของเช้ือดงักล่าว ดว้ย blood agar หลงัจากนั้นติดต่อประสานงานกบับริษทัเพื่อตรวจสอบความ

    ผดิปกติของตูบ่้มสาํหรับเพาะเล้ียงเช้ือดว้ย และตรวจรับเม่ือซ่อมเสร็จเรียบร้อยแลว้

    - ติดต่อประสานงานกบับริษทัเก่ียวกบัการ สัง่ซ้ือไนโตรเจนเหลว เพื่อใชใ้นการเกบ็รักษาเช้ือพยาธิโปรโตซวัต่างๆใหค้งสภาพอยูไ่ดน้าน โดยมีการบริหารจดัการดว้ยการตั้งงบประมาณรายปีในการสัง่

    ซ้ีอสารเคมีดงักล่าว และติดตามใหบ้ริษทัทาํการเติมสารเคมีใหทุ้กๆเดือน

    - ติดต่อประสานงานกบับริษทัเก่ียวกบัการ สัง่ซ้ือแกส็คาร์บอนไดออกไซด์ สาํหรับ ใชใ้นการเพาะเล้ียงเช้ือต่างๆ ของภาควิชาฯ โดยการตรวจเช็คและดาํเนินการสัง่ซ้ือแกส็ทุกๆ 4 เดือน

    -

  • 11

    2.2.2 ลกัษณะงานทีป่ฏิบัติทีส่อดคล้องกบัคู่มือปฏิบัติงาน - เป็นผูต้รวจหลกัในการตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. โดยวิธีดูสดและตรวจยนืยนัดว้ย

    การยอ้มสีพิเศษ เพื่อใหบ้ริการแก่ผูป่้วยในของ โรงพยาบาลเวชศาสตร์เขตร้อน ม. มหิดล และจากหน่วยงาน

    ต่างๆ ทัว่ประเทศท่ีส่งตรวจ โดยจะทาํการสเมียร์สไลดจ์ากตวัอยา่งอุจจาระ ตรวจหาเช้ือดว้ยการดูสด การยอ้มสี

    พิเศษ และมีการรายงานผลการตรวจเช้ือดงักล่าวในวนัจนัทร์ วนัพธุ และวนัศุกร์ของทุกสปัดาห์

    - เป็นผูร้ายงานผลการตรวจวินิจฉยั เช้ือ Cryptosporidium spp. โดยมีอาจารยผ์ูรั้บผดิชอบในภาควิชาฯ เป็นผูเ้ซ็นตรั์บรองผลการตรวจ และลงวนั เดือน ปีท่ีรายงานผลการตรวจกาํกบัทุกคร้ัง หลงัจากนั้นจะ

    มีการถ่ายเอกสารผลการตรวจไวเ้ป็นหลกัฐานจาํนวน 1 ฉบบั และผูต้รวจจะประสานงานกบัเจา้หนา้ท่ีของ

    Laboratory Center ของโรงพยาบาลเวชศาสตร์เขตร้อนใหม้ารับผล และจดัส่งผลการตรวจไปยงัหน่วยงานท่ี

    เก่ียวขอ้งตามลาํดบั

    - เตรียมตวัอยา่งอุจจาระตรวจดว้ยการทาํ สเมียร์สไลดแ์ละยอ้มสีพิเศษ เพื่อ ตรวจยนืยนัเช้ือ Cryptosporidium spp. สาํหรับงานประเมินคุณภาพของหอ้งปฏิบติัการปรสิตวิทยาจาํนวน 5 หน่วยงาน ไดแ้ก่ 1.

    ภาควิชาปรสิตวิทยา คณะแพทยศาสตร์ศิริราชพยาบาล ม. มหิดล 2. ภาควิชาปรสิตวิทยา คณะเทคนิคการแพทย ์ม.

    มหิดล 3. งานหอ้งปฏิบติัการเวชศาสตร์ชนัสูตร คณะเวชศาสตร์เขตร้อน ม. มหิดล 4. สาขาวิชาโรคติดเช้ือและ

    อายรุศาสตร์เขตร้อน ภาควิชาอายรุศาสตร์ คณะแพทยศาสตร์ศิริราชพยาบาล ม. มหิดล 5. หอ้งปฏิบติัการจุลทรรศน

    ศาสตร์คลินิกภาควิชาพยาธิวิทยา คณะแพทยศาสตร์โรงพยาบาลรามาธิบดี ม. มหิดล

    - ตรวจยนืยนัเช้ือ Cryptosporidium spp. เพื่องานประเมินคุณภาพของหอ้งปฏิบติัการ จากตวัอยา่งส่ิงส่งตรวจท่ีเป็นสไลดท่ี์ยอ้มสีเป็นท่ีเรียบร้อยแลว้ จากกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์

    - งานช่วยสอนภาคปฏิบติัการเก่ียวกบัการตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. ดว้ยการยอ้มสีพิเศษใหแ้ก่นกัศึกษาหลกัสูต รต่างๆ ทั้งภายในและภายนอกคณะฯ ตลอดจน ผูส้นใจศึกษาดูงานจากสถาบนั

    ต่างๆ

    - เป็นผูเ้ตรียมสีพิเศษ Rapid DMSO modified acid fast และเตรียมสเมียร์สไลดจ์ากตวัอยา่งอุจจาระท่ีใชใ้นการยอ้มเช้ือ Cryptosporidium spp. เพื่อใชใ้นการจดัอบรมเชิงปฏิบติัการของภาควิชาฯ ซ่ึงมีการจดั

    อบรมเป็นประจาํทุกปี

  • 12

    2.3 โครงสร้างการบริหารจัดการ

    ภาควิชาพยาธิโปรโตซวัเป็นหน่ึงใน 11 ภาควิชาของคณะเวชศาสตร์เขตร้อน ม . มหิดล และยงัเป็น

    1 ใน 5 ภาควิชา ฯ ท่ีเร่ิมมีการก่อตั้งคณะ ฯ ในปี พ .ศ.2503 โดยมีหนา้ท่ีหลกั ไดแ้ก่ การเรียนการสอน การ

    ฝึกอบรม การวิจยั และการใหบ้ริการตรวจ รวมทั้งใหค้าํแนะนาํเก่ียวกบัเช้ือพยาธิโปรโตซวั ส่วนงานวิจยัของ

    ภาควิชาฯ มีความหลากหลายตั้งแต่ระดบัชีวโมเลกลุของเช้ือไปจนถึงการศึกษาในระดบัชุมชน และมี

    โครงสร้างการบริหารจดัการตามแผนผงั ดงัต่อไปน้ี

  • 13

    บทที ่3

    หลกัเกณฑ์วธีิการปฏิบัตงิานและเงือ่นไข

    3.1 หลกัเกณฑ์การปฏิบัติงาน

    3.1.1 หลกัเกณฑ์การเกบ็ตัวอย่างส่งตรวจ

    การท่ีผลการตรวจทางหอ้งปฏิบติัการจะถูกตอ้งแม่นยาํได ้การเกบ็ตวัอยา่งส่ิงส่งตรวจท่ีถูกตอ้งกมี็

    จาํเป็นและมีความสาํคญัอยา่งยิง่ การเกบ็ตวัอยา่งท่ีถูกตอ้ง ควรใชห้ลกัเกณฑ ์ 9 ความถูกตอ้ง (“9” The right)

    ซ่ึงมีดงัน้ี

    1. The right patient คือ ถูกผูป่้วย หมายความวา่ การเกบ็ตวัอยา่งส่งตรวจควรเกบ็ใหถู้กคน เช่นแพทยส์ัง่ใหเ้กบ็อุจจาระนาย ก. ส่งตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. พยาบาลกต็อ้งเกบ็อุจจาระของ

    นาย ก. ส่งตรวจหาเช้ือดงักล่าว

    2. The right specimen คือ ตวัอยา่งถูกตอ้ง หมายความวา่ การเกบ็ตวัอยา่งส่งตรวจควรเกบ็ให้ถูกตอ้งตามแผนการรักษาของแพทย ์เช่น ถา้ตอ้งการตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. ควรเกบ็อุจจาระ

    ของผูป่้วยส่งตรวจ

    3. The right requisition คือ คาํสัง่ถูกตอ้ง หมายความวา่ การลงมือปฏิบติัการตรงตามหลกัเกณฑ์ของหอ้งปฏิบติัการ เช่น การเขียนใบนาํส่งส่ิงส่งตรวจ ควรตอ้งเขียนใหถู้กตอ้งและตรงกบัชนิดของส่ิงท่ีจะ

    ตรวจ ควรระบุช่ือ - นามสกลุผูป่้วย เลขประจาํตวัผูป่้วย หอผูป่้วย การวินิจฉยัโรค วนัเวลาท่ีทาํการเก็ บ ชนิด

    ของส่ิงส่งตรวจ การเกบ็ แพทยผ์ูรั้กษา เป็นตน้

    4. The right method คือ วิธีการถูกตอ้ง หมายความวา่ การเกบ็ส่ิงส่งตรวจควรใหถู้กวิธีตามหลกัเกณฑข์องปฏิบติัการ เช่น การเกบ็อุจจาระเพื่อส่งตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. ควรแนะนาํให้

    ผูป่้วยเกบ็อุจจาระตอนเชา้หลงัต่ืนนอน ถ่ายปัสสาวะท้ิงก่อนเพื่อลดการปนเป้ือนของอุจจาระท่ีส่งตรวจ และ

    ไม่ควรเป็นอุจจาระท่ีถ่ายลงบนดิน การถ่ายอุจจาระควรถ่ายลงภาชนะรองรับขนาดใหญ่ท่ีแหง้และสะอาด

    แลว้จึงตกัอุจจาระใส่ภาชนะท่ีมีฝาปิดมิดชิด

    5. The right amount คือ จาํนวนถูกตอ้ง หมายความวา่ การเกบ็ส่ิงส่งตรวจ ตามจาํนวนท่ีหอ้งปฏิบติัการกาํหนด เช่น การเกบ็อุจจาระเพื่อส่งตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. ควรเกบ็อุจจาระ

    ปริมาณ 5 กรัมหรือใหเ้กินคร่ึงของกระบอกพลาสติกเบอร์ 1 หรือเบอร์ 2

    6. The right container คือ ใส่ภาชนะถูกตอ้ง หมายความวา่ การเกบ็ส่ิงส่งตรวจใส่ภาชนะตามท่ีหอ้งปฏิบติัการกาํหนด เช่น การเกบ็อุจจาระ ควรเกบ็ในภาชนะท่ีมีฝาปิดมิดชิด ไม่ควรใชภ้าชนะท่ีมีรอยร่ัว

    หรือแตกร้าว

  • 14

    7. The right label คือ ฉลากถูกตอ้ง หมายความวา่ ควรติดฉลากส่ิงส่งตรวจใหถู้กตอ้ง และตรงกบัใบนาํส่งตรวจ เช่น ตอ้งระบุช่ือ-นามสกลุผูป่้วยใหช้ดัเจน หมายเลขประจาํตวัผูป่้วย หอผูป่้วย วนัเวลาท่ีเกบ็

    ตวัอยา่งส่ิงส่งตรวจ

    8. The right time คือ เวลาถูกตอ้ง หมายความวา่ การเกบ็ส่ิงส่งตรวจใหถู้กเวลา เช่น การเกบ็อุจจาระเพื่อส่งตรวจวินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp. ควรแนะนาํใหผู้ป่้วยเกบ็อุจจาระตอนเชา้หลงัต่ืนนอน

    และควรเกบ็อุจจาระส่งตรวจติดต่อกนัเป็นเวลา 3 วนั เน่ืองจากเช้ือน้ีจะออกมาในอุจจาระไม่สมํ่าเสมอคลา้ย

    กบัอุจจาระของผูป่้วยโรคบิดมีตวัจากเช้ือะมีบา

    9. The right attitude คือ เขา้ใจถูกตอ้ง หมายความวา่ เป็นการเตรียมผูป่้วยใหพ้ร้อมทั้งดา้นร่างกาย จิตใจและจิตวิญญาณ เป็นหวัใจสาํคญัของพยาบาลในการท่ีจะประเมิ นความรู้ ความเขา้ใจ เจตคติและ

    ความสามารถของผูป่้วยต่อสถานการณ์ท่ีผูป่้วยกาํลงัเผชิญอยู ่เช่นการเกบ็อุจจาระตรวจ วินิจฉยั เช้ือ

    Cryptosporidium spp. พยาบาลควรแนะนาํใหผู้ป่้วยเขา้ใจถึงเหตุผลท่ีตอ้งเกบ็อุจจาระส่งตรวจติดต่อกนัเป็น

    เวลา 3 วนั

    ท่ีมา : http://www.gotoknow.org

    3.1.2 การปฏิบัติงานเกีย่วกบัตัวอย่างส่ิงส่งตรวจของผู้ป่วยโดยอาศัยหลกั Universal precaution

    Universal precaution เป็นการระมดัระวงัป้องกนัตนเองของบุคคลากรทางการแพทยใ์หป้ลอดภยั

    จากการติดเช้ือในการปฏิบติังาน โดยถือวา่ผูป่้วยทุกรายมีเช้ือเอชไอวี เช้ือไวรัสตบัอกัเสบบีหรือเช้ืออ่ืนๆท่ีอยู่

    ในเลือด และอยู่ในร่างกาย และเช้ือสามารถแพร่กระจายสู่บุคคลากรไดห้ากบุคคลากรขาดความระมดัระวงั

    ดงันั้นบุคลากรทางการแพทยต์อ้งใชค้วามระมดัระวงัเพื่อใหป้ลอดภยัจากการติดเช้ือ ซ่ึงมีหลกัในการป้องกนั

    การติดเช้ือดงัน้ี

    - การปฏิบติังานกบัตวัอยา่ง ส่ิงส่งตรวจต่างๆ พึงตระหนกัเสมอวา่ ตวัอยา่งส่ิงส่งตรวจทุกช้ินอาจมีเช้ือโรค โดยเฉพาะอยา่งยิง่ เลือด สารคดัหลัง่ต่างๆ และเช้ือโรคต่างๆในอุจจาร ะของผูป่้วย ควรลา้งมือให้

    สะอาดดว้ยนํ้ายาลา้งมือหรือนํ้าสบู่หลงัปฏิบติังาน

    - ตวัอยา่งส่ิงส่งตรวจท่ีทาํการตรวจเป็นท่ีเรียบร้อยแลว้ ควรมีการฆ่าเช้ือก่อนนาํไปท้ิงในภาชนะท่ีเตรียมไว ้

    - ขณะปฏิบติังานควรสวมเส้ือกาวน์ ถุงมือและผา้ปิดจมูกหรืออาจมีการสวมแวน่ตาดว้ย - ควรปูกระดาษซบัรองบริเวณผวิหนา้โตะ๊ปฏิบติังาน เม่ือเลิกใชง้านควรฆ่าเช้ือ ก่อนนาํไปท้ิงใน

    ภาชนะท่ีเตรียมไว ้

    - ขณะปฏิบติังานหากมีสารเคมีหกหรือหยดบนโตะ๊ปฏิบติังาน ควรหยดนํ้ายาฆ่าเช้ือลงไปทนัที - ไม่รับประทานอาหารหรือเคร่ืองด่ืมในหอ้งปฏิบติัการ - ไม่ควรหยอกลอ้กนัขณะปฏิบติังาน

    http://www.gotoknow.org/

  • 15

    - ขณะปฏิบติังานไม่นาํส่ิงของ เช่น ดินสอ ปากกาหรือน้ิวเขา้ปาก - ท้ิงของต่างๆในหอ้งปฏิบติัการใหถู้กท่ี เช่น แกว้แตกหรือของมีคม ควรใส่ภาชนะรองรับหรือ

    หุม้ดว้ยถุงพลาสติกท่ีหนาก่อนท้ิงในถงัหรือภาชนะท่ีหน่วยงานจดัเตรียมไวใ้ห ้

    - สารเคมีท่ีมีการติดไฟ สารกดักร่อน ต่างๆ ควรมีการแยกไวเ้ป็นสดัส่วนและ ควรมีการติดฉลากใหช้ดัเจน แลว้แจง้ใหก้รรมการหรือผูท่ี้รับผดิชอบทราบเพื่อดาํเนินการในการกาํจดัต่อไป

    - ควรมีการรายงานอุบติัเหตุท่ีเกิดข้ึนทุกคร้ัง ใหผู้บ้งัคบับญัชาไดรั้บทราบ การฆ่าเช้ือโรค

    ฆ่าเช้ือด้วยความร้อน

    - อบแหง้ 171 องศาเซลเซียส นาน 1 ชัว่โมงหรือ 160 องศาเซลเซียส นาน 2 ชัว่โมงหรือ 121 องศาเซลเซียส นาน 16 ชัว่โมง

    - น่ึง อดัความร้อนท่ี 121 องศาเซลเซียส นาน 15 นาที หรือ 132 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที - ตม้เดือด 100 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที ฆ่าเช้ือแบคทีเรียไดแ้ต่ไม่สามารถฆ่าสปอร์ของเช้ือ

    ราไดห้มด

    - นํ้าร้อน 80 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที ฆ่าเช้ือ Staphylococcus aureus ได ้- นํ้าร้อน 60 องศาเซลเซียส นาน 20 นาที ส่วนมากฆ่าเช้ือไวรัสได ้ - รังสี Ultra violet (190-300 นาโนมิเตอร์) สามารถฆ่าเช้ือในอากาศและพื้นผวิ (ในตูห้รือหอ้ง)

    ยาฆ่าเช้ือในห้องปฏิบัติการ

    - Chlorox หรือนํ้ายาซกัผา้ขาว สามารถใชฆ่้าเช้ือบนวสัดุ - Virgon สามารถใชฆ่้าเช้ืออุปกรณ์ เคร่ืองใชต่้างๆได ้- Ethyl alcohol สามารถใชฆ่้าเช้ือต่างๆได ้- Formalin สามารถใชฆ่้าเช้ือบนวสัดุและอบหอ้งได ้

    ท่ีมา: ภาควิชาพยาธิโปรซวั หนงัสือการตรวจทางหอ้งปฏิบติัการเพื่อ ตรวจหาเช้ือโปรโตซวัในโรคเอดส์ ,

    2542

    3.2 วธีิการปฏิบัติงาน การตรวจ วินิจฉยัเช้ือ Cryptosporidium spp.โดยวิธีดูสดและ ตรวจ ดว้ยการยอ้มสีพิเศษ

    ประกอบดว้ยวิธีการปฏิบติังาน ดงัน้ี

    3.2.1 การเกบ็ตัวอย่างส่ิงส่งตรวจ ส่วนใหญ่จะเป็นอุจจาระของผูป่้วยเอดส์ท่ีมีอาการทอ้งเสีย

    ในการเกบ็ตวัอยา่งอุจจาระ ควรเกบ็จากอุจจาระตอนเชา้หลงัต่ืนนอน แนะนาํใหผู้ป่้วยถ่ายปัสสาวะ

    ท้ิงก่อนเพื่อลดการปนเป้ือนของอุจจาระท่ีส่งตรวจ และไม่ควรเป็นอุจจาระท่ีถ่ายลงบนดิน (เพราะส่ิงต่างๆ

  • 16

    และเช้ือโรคในดินอาจปนเป้ือนในอุจจาระ ทาํใหผ้ลการตรวจวินิจฉยัผดิพลาดได)้ การถ่ายอุจจาระจึงควรถ่าย

    ลงภาชนะรองรับขนาดใหญ่ท่ีแหง้และสะอาด แลว้จึงตกัอุจจาระใส่ภาชนะท่ีมีฝาปิดมิดชิด อุจจาระท่ีส่ง

    ตรวจควรมีปริมาณ 5 กรัมหรือใหเ้กินคร่ึงของกระบอกพลาสติกขนาดเบอร์ 1 หรือเบอร์ 2 (รูปท่ี 3) และควร

    นาํส่งอุจจาระภายใน 4 - 6 ชัว่โมงหลงัการเกบ็ หากส่งไม่ไดต้ามเวลาใหเ้กบ็อุจจาระไวท่ี้อุณหภูมิ 4 องศา

    เซลเซียส ไดน้าน 24 ชัว่โมง และตอ้งระบุช่ือ - นามสกลุผูป่้วย และรายละเอียดอ่ืนๆ บนภาชนะนาํส่งพร้อม

    ใบส่งตรวจ (Request form) จากแพทย ์

    รูปท่ี 3 ลกัษณะกระบอกพลาสติกท่ีใชเ้กบ็อุจจาระและระดบัปริมาณของอุจจาระท่ี 2, 4, 6 และ 8 กรัม

    3.2.2 การทาํความสะอาดสไลด์

    สไลดท่ี์ซ้ือมาจากบริษทั ต่างๆนั้นจะสกปรกและมีคราบไขมนัติดอยู ่ ดงันั้นก่อนท่ีจะนาํมาใชใ้น

    การสเมียร์ตวัอยา่งอุจจาระ ควรมีการทาํความสะอาดสไลดก่์อน ดว้ย การแช่ส ไลดใ์น 70% แอลกอฮอล์

    ประมาณ 10 นาที ไม่ควรแช่สไลดไ์วข้า้มคืน เพราะจะทาํใหส้ไลดก์รอบได ้หลงัจากนั้น ใชผ้า้ท่ีสะอาดเช็ด

    ทาํความสะอาด ทัว่สไลดใ์หแ้หง้ พยายามหลีกเล่ียงการสมัผสับริเวณท่ีตรงกลางสไลด ์ใหจ้บัตรงขอบของ

    สไลด ์แลว้เกบ็เรียงใส่กล่อง ปิดฝาใหมิ้ดชิด จึงจะสามารถนาํมาใชง้านได ้

    ตัวอย่างส่ิงส่งตรวจวนิิจฉัยเช้ือ Cryptosporidium spp. ส่วนใหญ่จะเป็นอุจจาระ หากไม่

    สามารถนําส่งเป็นอุจจาระสดได้ ควรจะรักษาสภาพของ oocyst ในอุจจาระด้วย 10% formalin โดย

    การผสมอุจจาระ 1 ส่วน ลงใน 10% formalin 3 ส่วน ผสมให้เป็นเนือ้เดียวกนั

    ตัวอย่างส่ิงส่งตรวจอืน่ๆ เช่น เสมหะกส็ามารถส่งตรวจเพือ่หาเช้ือดังกล่าวได้ ซ่ึงผู้เขียนได้เคย

    ตรวจพบเช้ือดังกล่าวจากเสมหะผู้ป่วยด้วย จํานวน 2 ราย ซ่ึงสามารถตรวจด้วยการย้อมสีพเิศษชนิด

    เดียวกบัวธีิทีย้่อมในอุจจาระ

  • 17

    หมายเหตุ กรณีตวัอยา่งส่งตรวจเป็นอุจจาระ อาจจะไม่มีปัญหาในการ ทาํสเมียร์มากนกั หากเป็น

    กรณีตวัอยา่งส่งตรวจเป็นเลือดสาํหรับการตรวจหาเช้ือมาลาเรีย ถา้สไลด์ มีไขมนั จะทาํใหก้ารทาํสเมียร์เลือด

    แบบบางไม่ดี จะมีเลือดบนสเมียร์บางส่วนท่ีขาดหายไป

    3.2.3 การเตรียมสารเคมี เพือ่ใช้ในการดูเช้ือด้วยวธีิดูสด ซ่ึงประกอบดว้ยสารเคมีต่างๆดงัน้ี

    3.2.3.1 0.85% Normal saline solution (NSS)

    NaCL 0.85 กรัม

    นํ้ากลัน่ 100 มิลลิลิตร

    ละลายสารเคมีในนํ้ากลัน่ใหเ้ขา