ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio 氨基酸分析...v ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio 氨基酸分析系统的设计用途 Waters 设计的 ACQUITY UPLC® H-Class 和 H-Class

ACQUITY UPLCH-Class 和 H-Class Bio

氨基酸分析系统指南

修订版 B

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商标

ACQUITY UPLC、Millennium、UPLC 和 Waters 是 Waters Corporation 的注册商标，

AccQ•Fluor， AccQ•Tag、 eCord、 Empower、 MassLynx 和“THE SCIENCE OFWHAT’S POSSIBLE.”是 Waters Corporation 的商标。

MP35N 是 Hamilton Precision Metals 的注册商标。

PEEK 是 Victrex Corporation 的商标。

Teflon 是 E. I. DuPont de Nemours and Company 的注册商标。

TRITON 是 Union Carbide Corporation 的商标。

TWEEN 是 ICI Americas, Inc. 的商标。

其它商标或注册商标均为其各自所有者的专有资产。

ii

客户意见或建议

Waters 的技术交流部门恳请您告诉我们您在使用该文档时所遇到的任何错误或向我们提出

改进建议。请协助我们了解您最希望从文档中获得什么内容，让我们可以不断改进其准确性及可用性。

我们会认真对待收到的每条客户意见。您可以通过发送邮件到 [email protected] 与我们联系。

联系 Waters

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Waters。可以通过 Internet、电话或传统邮件联系我们。

安全注意事项

用于 Waters 仪器及设备的某些试剂和样品可能会产生化学、生物或放射性危险（或几种危

险兼而有之）。必须了解您使用的所有物质的潜在危险。请始终遵守“优良实验室规范”，并咨询所在组织的安全代表。

Waters 联系信息：

联系方式信息

Internet Waters 的网站包含有全球范围内 Waters 所在地的联

系信息。请访问 www.waters.com。

电话和传真电话：(021) 6879 5888 传真：(021) 6879 4588。

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传统邮件上海市浦东新区张东路 1387 号 41 栋 01 室

邮政编码 201203

iii

ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio 氨基酸分析系统的具体注意事项

高压危险

安全忠告

请参阅附录 A 查看警告和注意事项综合列表。

适用符号

警告：为防止电击，请不要取下 ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio 系统的保护面板。其中的组件不需要用户维护。

符号定义

制造商

欧盟授权代表

确认生产的产品符合所有对其适用的欧盟指令

通过澳大利亚 C-Tick EMC 认证

确认生产的产品符合所有对其适用的美国和加拿大的安全要求

请参阅使用说明

iv

ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio 氨基酸分析系统的设计用途

Waters 设计的 ACQUITY UPLC® H-Class 和 H-Class Bio 氨基酸分析 (AAA) 系统将结

合 Waters AccQ•Tag™ Ultra 化学品进行氨基酸分析，可有效分析蛋白质和缩氨酸水解产

物（鉴别和定性）、细胞培养基、烷化半胱氨酸以及食物和饲料的营养成分。 ACQUITYUPLC H-Class 和 H-Class Bio AAA 系统不能用于生理氨基酸的临床分析。现在已知有某

些峰对存在共流出物。

校正

要校正方法，请遵照可接受的使用至少五个标准样生成标准曲线的校正方法。标准样的浓度范围应涵盖质量控制样本、典型标本和非典型标本的整个范围。

质量控制

常规运行代表待分析氨基酸浓度范围的质量控制样本。确保质量控制样本的结果在可接受范围内，并在每天、每次测试时评估其精确度。质量控制样本的结果超出范围时，采集的数据可能无效。在确定仪器的运行状态满足要求前，请勿报告这些数据。

分析来自复杂基质（如培养基、饲料、食品等）的样品时，请注意基质组分可能对结果产生不良影响。为将此类基质效应降至最低，Waters 建议采用经过验证的适用样品制备步骤

进行操作。

ISM 分类

ISM 分类：ISM 第 1 组 B 类该分类是根据 IEC CISPR 11 工业、科学与医学（Industrial Scientific and Medical，ISM）

仪器要求确定的。第 1 组产品适用于有意生成的和/或使用的传导性耦合射频能量，它是设

备实现内部功能所必须的。B 类产品同时适用于商业区和居住区，而且可以直接连接到低压

供电网络。

v

EC 授权代表

Waters Corporation (Micromass UK Ltd.)

Floats Road

Wythenshawe

Manchester M23 9LZ

United Kingdom

电话： +44-161-946-2400

传真： +44-161-946-2480

联系人：质量经理

vi

目录

版权声明 .................................................................................................................................. ii

商标 .......................................................................................................................................... ii

客户意见或建议 ...................................................................................................................... iii

联系 Waters .......................................................................................................................... iii

安全注意事项 ......................................................................................................................... iii

ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio 氨基酸分析系统的具体注意事项 .................... iv 安全忠告 ......................................................................................................................... iv ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio 氨基酸分析系统的设计用途 ........................ v 校正 .................................................................................................................................. v 质量控制 .......................................................................................................................... v

ISM 分类 ................................................................................................................................. v ISM 分类：ISM 第 1 组 B 类 .......................................................................................... v

EC 授权代表 ........................................................................................................................... vi

1 系统概述 ................................................................................................................................ 1-1

ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio AAA 系统模块 ........................................... 1-2

ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio AAA 系统的特点 ........................................ 1-3

使用 AccQ•Tag Ultra 方法 ............................................................................................... 1-4 衍生化学品概述 ............................................................................................................. 1-4

2 系统设置 ................................................................................................................................ 2-1

安装检测器管路 .................................................................................................................... 2-2

管路连接 .............................................................................................................................. 2-2 接头安装建议 ................................................................................................................ 2-2 连接 TUV 检测器的管路 ............................................................................................... 2-6 连接 PDA 检测器的管路 ............................................................................................... 2-8 连接 FLR 检测器的管路 ................................................................................................ 2-8 连接溶剂管理器和样品管理器的管路 ............................................................................ 2-8 安装色谱柱，进行光学检测 ......................................................................................... 2-11 连接溶剂供应 .............................................................................................................. 2-13

目录 1

以太网连接 ......................................................................................................................... 2-14 以太网连接 .................................................................................................................. 2-14 柱温箱连接 .................................................................................................................. 2-14

信号连接 ............................................................................................................................ 2-15 建立信号连接 .............................................................................................................. 2-15

连接到电源 ......................................................................................................................... 2-19

3 检验系统运行 ........................................................................................................................ 3-1

准备系统 .............................................................................................................................. 3-2

制备洗脱液 ........................................................................................................................... 3-4 设置流动相 .................................................................................................................... 3-4 制备流动相 .................................................................................................................... 3-5

创建测试方法 ....................................................................................................................... 3-6 TUV 测试方法 .............................................................................................................. 3-7 PDA 测试方法 ............................................................................................................. 3-14 FLR 测试方法 ............................................................................................................. 3-20

创建样品组方法 .................................................................................................................. 3-26 TUV 样品组方法 ......................................................................................................... 3-26 PDA 样品组方法 ......................................................................................................... 3-26 FLR 样品组方法 ......................................................................................................... 3-26

制备系统检验样品 .............................................................................................................. 3-27

执行测试 ............................................................................................................................ 3-27 示例色谱 ..................................................................................................................... 3-28

4 制备标准样和样品 ................................................................................................................. 4-1

复溶 AccQ•Tag Ultra 粉末试剂 ....................................................................................... 4-2

制备校正标准样 .................................................................................................................... 4-3 制备校正标准样：外标法 .............................................................................................. 4-3 制备校正标准样：内标法 .............................................................................................. 4-4 衍生校正标准样 ............................................................................................................. 4-5

制备样品 .............................................................................................................................. 4-5 确定样品量 .................................................................................................................... 4-6 水解样品 ....................................................................................................................... 4-6 衍生样品 ....................................................................................................................... 4-7

2 目录

5 操作系统 ................................................................................................................................ 5-1

准备系统 .............................................................................................................................. 5-2 设置流动相 .................................................................................................................... 5-2 开启系统 ....................................................................................................................... 5-2 监视启动测试 ................................................................................................................ 5-2 监视系统模块 LED ....................................................................................................... 5-3 电源 LED ...................................................................................................................... 5-3 状态 LED ...................................................................................................................... 5-3 启用渗漏传感器 ............................................................................................................. 5-4 启动系统 ....................................................................................................................... 5-5 连接色谱柱 .................................................................................................................... 5-6

设置 Empower 软件 .......................................................................................................... 5-6 Empower QuickStart 界面 .......................................................................................... 5-7

打开 Empower 和还原项目 ................................................................................................ 5-8

加载、编辑和运行样品组方法 .............................................................................................. 5-9

处理数据 ............................................................................................................................ 5-11 批量处理数据 .............................................................................................................. 5-12 查看处理后的数据 ....................................................................................................... 5-13 生成报告 ..................................................................................................................... 5-13

6 处理特殊样品 ........................................................................................................................ 6-1

分析蛋白质样品中的半胱氨酸 .............................................................................................. 6-2 分析样品 ....................................................................................................................... 6-2 示例色谱 ....................................................................................................................... 6-3

分析食品与饲料的营养成分 .................................................................................................. 6-5 分析样品 ....................................................................................................................... 6-5 示例色谱 ....................................................................................................................... 6-6

分析细胞培养基 .................................................................................................................... 6-8 分析样品 ....................................................................................................................... 6-8 示例色谱 ....................................................................................................................... 6-8

7 故障排除 ................................................................................................................................ 7-1

一般原则 .............................................................................................................................. 7-2

色谱 ...................................................................................................................................... 7-3 定量问题 ....................................................................................................................... 7-4 衍生问题 ....................................................................................................................... 7-6

目录 3

衍生问题 .............................................................................................................................. 7-7 试剂不足 ....................................................................................................................... 7-7 样品复溶 ....................................................................................................................... 7-8

A 安全忠告 .............................................................................................................................. A-1

警告符号 ............................................................................................................................. A-2 特定任务的危险警告 ..................................................................................................... A-2 特定警告 ....................................................................................................................... A-3

注意事项 ............................................................................................................................. A-4

适用于所有 Waters 仪器的警告 ......................................................................................... A-5

电气和搬运符号 ................................................................................................................... A-6 电气符号 ....................................................................................................................... A-6 搬运符号 ....................................................................................................................... A-7

B 结构材料和兼容溶剂 ............................................................................................................ B-1

防止污染 ............................................................................................................................. B-2

接触溶剂的物品 ................................................................................................................... B-2

用于制备流动相的溶剂 ........................................................................................................ B-3

C 衍生化指导原则 ................................................................................................................... C-1

简介 ..................................................................................................................................... C-2

估算水解中的样品量 ........................................................................................................... C-3

估算用于衍生化的样品量 .................................................................................................... C-5

估计中和要求 ...................................................................................................................... C-8 注意事项 ....................................................................................................................... C-8

确认已有足够的试剂 ........................................................................................................... C-8

计算关系 ............................................................................................................................. C-9

示例 ................................................................................................................................... C-10 已知成分样品，浓度为 mg/mL ................................................................................... C-10 未知成分样品的示例，浓度为 mg/mL ........................................................................ C-13 未知成分样品的示例，浓度为 mg/ 管 ......................................................................... C-15 未知成分样品的示例，浓度为 pmol/ 管 ...................................................................... C-16 未知成分样品的示例，浓度为 pmol/µL ...................................................................... C-17 未知成分样品的示例，浓度为 µM .............................................................................. C-18 未知成分样品的示例，浓度为 % ................................................................................. C-20 未知成分样品的示例，浓度为 mg% ............................................................................ C-21

4 目录

1 系统概述

Waters ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio 氨基酸分析 (AAA) 系统将 UPLC分离技术与 AccQ•Tag™ Ultra 衍生化学品融为一体。与典型的 HPLC 分离技术相

比，这种组合显著降低了进行蛋白质表征、细胞培养基监测以及食品与饲料营养分析所需的时间。通过使用系统光盘上附带的项目模板和自定义计算方法，基于ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio 系统结构的 AAA 系统让您能轻松得到

准确的结果和优异的色谱分离效果。

使用本系统时，除本指南外，还可参阅以下信息资源：

• ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio 系统文档

• Empower™ 数据软件用户文档

内容：

主题页码

ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio AAA 系统模块 1-2

ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio AAA 系统的特点 1-3

使用 AccQ•Tag Ultra 方法 1-4

1-1

ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio AAA 系统模块

ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio AAA 系统可包含以下仪器和设备：

• 下列溶剂管理器之一：

– 四元溶剂管理器 (QSM)

– 生物四元溶剂管理器 (bioQSM)

• 下列样品管理器之一：

– 样品管理器 – Flow Through Needle (SM-FTN)

– 生物样品管理器 – Flow Through Needle (bioSM-FTN)

• 柱温箱模块 (CH-A)

• 下列检测器之一：

– 带流通池的可变波长紫外/可见光 (TUV) 检测器

– 带流通池的光电二极管阵列 (PDA) 检测器

– 带流通池的荧光 (FLR) 检测器

• AAA 套件：

– AccQ•Tag™ Ultra 化学品套件，附带 QC 测试用色谱柱和相应的化学品（洗脱

液、衍生试剂和标样）

– Empower 项目模板

– 色谱柱在线过滤器套件

– 管路套件（0.0025 内径 PEEK®） - 入口

– 相关手册

– Waters 完全回收样品瓶（带无切口隔片盖）

1-2 系统概述

ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio AAA 系统的特点

AAA 套件包括 AccQ•Tag Ultra 化学品套件，可用其执行最多 250 次分析。该化学品套件

包括以下材料：

• AccQ•Tag Ultra 试剂套件（部件号 186003836）

– Waters AccQ•Tag Ultra 硼酸盐缓冲溶液 (1)， 5 瓶

– Waters AccQ•Tag Ultra 试剂粉 (2A)， 5 瓶

– Waters AccQ•Tag Ultra 试剂稀释剂 (2B)， 5 瓶

• AccQ•Tag Ultra 氨基酸分析色谱柱（部件号 186003837）

该色谱柱可分离由 AccQ•Tag Ultra 衍生反应生成的氨基酸衍生物。 AccQ•TagUltra 色谱柱是内径为 1.7 µm 的高效 ACQUITY UPLC BEH C18 型色谱柱，此色

谱柱经专门证实，适用于 AAA 系统。《ACQUITY UPLC BEH 色谱柱保养与使用

说明》文档介绍了该色谱柱的正确使用和保养方法，此文档可在 www.waters.com上获得。

• AccQ•Tag Ultra 洗脱液 A 浓缩液（部件号 186003838）

预混合的水相和有机相浓缩缓冲液。

• AccQ•Tag Ultra 洗脱液 B （部件号 186003839）

• 水解氨基酸标准样， 10 个 1 mL 安瓿瓶（部件号 WAT088122）

每个安瓿瓶盛有 17 种水解氨基酸的混合溶液（胱氨酸的浓度为 1.25 mM，其它均

为 2.5 mM）。

• 6 × 50 mm 样品管（用于制备样品和标准样）

• Waters 完全回收样品瓶（带无切口隔片盖）（部件号 186000384C）

• Waters AAA 系统光盘（包括 ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio AAA 系统指南及 Empower 项目模板）

要求：系统使用 Empower 软件采集、处理、报告和管理色谱信息。支持 Empower 2（基本版）和 Empower 3（基本版）软件（使用 Windows XP SP3 32 位和 Windows7 专业版 64 位操作系统）。 ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio 系统支持的

仪器控制软件和固件应与 2011 年 6 月驱动程序包（部件号 667004296）配合使用。

• 管路套件（0.0025 内径 PEEK） - 入口（部件号 430001783）

• 色谱柱在线过滤器（部件号 205000343）

有关衍生和色谱附件的存储条件及使用寿命规格的信息，请参阅 AccQ•Tag Ultra Careand Use （《AccQ•Tag Ultra 维护和使用》）手册。

ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio AAA 系统的特点 1-3

使用 AccQ•Tag Ultra 方法

AccQ•Tag Ultra 方法是一种氨基酸柱前衍生技术。系统与 AccQ•Tag Ultra 方法相结合，

可用于衍生化氨基酸、使用反相 UPLC 分离衍生物以及根据 UV 吸光度或荧光强度定量衍

生物。

此系统的特点是可实现低于皮摩尔的灵敏度，并且具有很高的准确度且易于使用。

衍生化学品概述

AccQ•Tag Ultra 方法基于一种专门为氨基酸分析而研制的衍生化试剂。Waters AccQ•TagUltra 试剂（6-氨基喹啉基-N-羟基丁二酰亚胺基-氨基甲酸酯，亦称 AQC）是一种活性 N-羟基丁二酰亚胺的氨基甲酸酯，是一种氨衍生化化合物。

Waters AccQ•Tag Ultra 试剂：

试剂化学品

AccQ•Tag Ultra 试剂将初级氨基酸和次级氨基酸转化为稳定的衍生物，如下图所

示。所有氨基酸都采用结构相同的衍生化基团，添加有 UV 吸收和荧光特征基团。

过量的试剂将水解生成 6-氨基喹啉 (AMQ)，这是一种无干扰的副产物。

注：衍生峰将在色谱图中标出，并始终显示。各批次中衍生峰的大小和数量不等，并且会随时间发生变化。由于这种差异的存在，峰的大小不能作为定量或特征性指标。

注意：为保持适当的纯度级别，请小心处理所有试剂。

1-4 系统概述

AccQ•Tag Ultra 反应：

与氨基酸反应

AccQ•Tag Ultra 试剂与初级和次级氨基酸快速反应生成稳定性极高的脲。如果能够

阻止样品溶剂的蒸发，所得衍生物可在室温下稳定保存最长一周的时间。

使用 AccQ•Tag Ultra 方法 1-5

试剂水解

在缓慢的反应中，过量的试剂将水解生成 6-氨基喹啉 (AMQ)、 N-羟基丁二酰亚胺

(NHS) 和二氧化碳（请参阅下图）。过量的试剂在一分钟之内完成分解。

主要水解产物 AMQ 在色谱上表现为一个易于分离的显峰。而 NHS 和二氧化碳不会

干扰分析。

AccQ•Tag Ultra 在水溶液中的反应：

1-6 系统概述

2 系统设置

本章将介绍如何进行系统的管路连接以及以太网和信号连接。

本章所述信息假定所有必需的系统组件已安装、配置并正确堆叠。

内容：

主题页码

安装检测器管路 2-2

管路连接 2-2

以太网连接 2-14

信号连接 2-15

连接到电源 2-19

2-1

安装检测器管路

系统要求使用低流量管路以便进行准确的氨基酸分析。安装部件号为 430001783 的部件，

步骤如第 2-6 页中所述。

提示：连接 PDA 和 FLR 检测器使用相同的管路。FLR 的标准配置中带有此管路套件。按

各检测器相应入门指南中的连接说明安装低流量管路。

管路连接

所有组件均架放完毕后，即可进行管路连接。管路配件已装配了压力接头和锥箍，但必须正确安装。

接头安装建议

系统使用镀金压力螺钉和两件式锥箍。有关组装方向的信息，请参阅下图。

压力螺钉锥箍组装：

建议：

• 为防止谱带扩展，紧固压力螺钉前，请确保管路完全位于接头孔底部。

• 为了便于连接，请使用较长的压力螺钉，用以将管路连接到进样器和排放阀。

• 如果维护期间更换或松开过接头，请执行溶剂管理器渗漏测试（请参阅 ACQUITYUPLC 在线帮助）。

• 如果在维护期间松开了接头，请检查有无破裂，螺纹损坏和变形。

• 请勿重复使用不锈钢接头超过六次。

必备材料

手套：干净、无粉、耐化学物质

注意：为防止污染，请在连接系统管路时戴上无颗粒物、无粉尘的非乳胶手套。

管路压力螺钉带锁定环的锥箍

2-2 系统设置

紧固系统接头时，请参考下表。

ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio 系统接头的安装建议：

接头紧固建议首

次使

用或

重新

安装

带无法兰锥箍和不锈钢锁定环的长型 1/4-28 接头，安装在 1/8 in 外径 (OD) 的管路上

手紧首

次使

用或

重新

安装

带无法兰锥箍和不锈钢锁定环的短型 1/4-28 接头，安装在 0.062 in 外径的管路上

手紧

首次

使用

或重

新安

装

带过滤器和不锈钢锁定环的 5/16-24 接头手紧

TP03377

锁定环锥箍

锁定环较小内径 (ID) 端

TP03379

锁定环锥箍


TP03376

过滤器锁定环


管路连接 2-3

首次

使用

不锈钢（镀金）接头，具有长平头和两件式不锈钢锥箍

手紧，加 3/4 圈（用扳手）重新

安装

不锈钢（镀金）接头，具有长平头和两件式不锈钢锥箍

手紧，加最多 1/6 圈（用扳手）

首次

使用

不锈钢（镀金）接头，具有短平头和两件式不锈钢锥箍

手紧，加 3/4 圈（用扳手）

重新

安装

不锈钢（镀金）接头，具有短平头和两件式不锈钢锥箍

手紧，加最多 1/6 圈（用扳手）

ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio 系统接头的安装建议：（续）

接头紧固建议

TP03378

长平头两件式锥箍

3/4 圈

TP02713

长平头两件式锥箍

1/6 圈

TP03375

短平头两件式锥箍

3/4 圈

TP03374

短平头两件式锥箍

1/6 圈

2-4 系统设置

首次

使用

或重

新安

装

10-32 LT135 PEEK，带锥箍手紧首

次使

用或

重新

安装

10-32 单件 PEEK 手紧

首次

使用

可重复使用的手紧接头手紧后再拧 1/6 圈

重新

安装

可重复使用的手紧接头手紧后最多再拧 1/6 圈；如有

渗漏，可再拧 1/8 圈

首次

使用

或重

新安

装

带不锈钢盖型螺母的双螺纹手紧接头 1. 从镀金接头处松开不锈钢盖型螺母。

2. 用手将镀金接头与锥箍拧入色谱柱入口。

3. 连接色谱柱，将色谱柱拧紧在镀金接头上。

4. 将不锈钢盖型螺母拧紧在镀金接头上。

ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio 系统接头的安装建议：（续）

接头紧固建议

TP02728

1/6 圈

夹头拆卸工具

1/6 圈

额外的 1/8 圈

TP03360A 不锈钢盖镀金接头

锥箍

管路连接 2-5

连接 TUV 检测器的管路

要求：系统要求使用低流量管路（部件号 430001783）以便进行准确的氨基酸分析。

提示：连接 PDA 和 FLR 检测器使用相同的管路。FLR 的标准配置中带有此管路套件。按

各检测器相应入门指南中的连接说明安装低流量管路。

检测器的管路连接包括连接流通池和安装反压调节器。

尽管在线脱气机从溶剂中去除了大多数气体（空气），但在不充满定量环进样期间仍会有气体进入系统。在压力作用下，这些气体会保留在溶液中。但是，因为柱后压力通常比柱前压力低得多，所以气体会从溶液中排出，并产生以意外大尖峰为特征的不稳定基线。反压调节器可将最小柱后压力保持在 1724 kPa（17 bar，250 psi），从而消除柱后放气现象并确保

基线平滑。

提示：安装反压调节器后，只要有正液流，不管出口管路配置和流速为何，系统均可保持至少 1724 kPa （17 bar， 250 psi）的反压。

要连接 TUV 检测器的管路：

1. 打开 TUV 检测器的前面板门，然后安装流通池，使 3 颗装配螺钉与隔板中相应的孔

对齐。

要求：安装流通池前，请确保已从隔板上移除防尘盖。

2. 用手指拧紧装配螺钉。

注意：为防止污染，请在连接检测器管路时戴上无颗粒物、无粉尘的非乳胶手套。

2-6 系统设置

TUV 检测器流通池：

3. 从 PEEK 池入口管取下保护盖，并将管路连接到流通池入口。

4. 将反压调节器较短的出口管连接到流通池的出口。

规则：如果要连接到第二个检测器或质谱仪，请勿安装反压调节器。

反压调节器：

TP03261

灯

渗漏传感器

出口管路入口管路

反压调节器

流通池 ID 连接器

流通池组件

手柄

连接旋钮

自检测器出口

至废液

管路连接 2-7

5. 将反压调节器较长出口管的另一端，穿过系统右前侧的线槽夹，引至适合的废液容器。

连接 PDA 检测器的管路

如果系统包括 PDA 检测器，请参阅《ACQUITY UPLC 光电二极管阵列检测器入门指南》

查看管路连接说明。

连接 FLR 检测器的管路

如果系统包括 FLR 检测器，请参阅《ACQUITY UPLC 荧光检测器入门指南》，查看管路

连接说明。

连接溶剂管理器和样品管理器的管路

要连接溶剂管理器和样品管理器的管路：

1. 找到标记有“样品管理器清洗”（或“样品管理器 2”）的溶剂管路，移除其溶剂过

滤器。

2. 将样品管理器清洗溶剂管路穿过样品管理器的管路管理通道，然后重新安装溶剂过滤器，并将管路插入标记有“90% 水/10% 乙腈”的储液瓶中。

或者：如果系统包括 FLR 检测器，则将管路插入标记有“100% 乙腈”的储液瓶中。

3. 将 A、 B、 C 和 D 溶剂管路穿过外部通道，然后分别插入相应的储液瓶：

• 溶剂 A 和溶剂 C 管路插入 100% 水储液瓶。

• 密封清洗管路插入 100% 水储液瓶。

• 溶剂 B 和溶剂 D 管路插入 100% 乙腈储液瓶。

4. 将标记有“样品管理器清除”（或“样品管理器 1”）的管路连接至样品管理器上的

任意一个（共两个） SM SYRINGE 端口。

5. 将样品管理器清除溶剂管路的另一端穿过通道导引装置，然后将其插入 90% 水/10%乙腈的储液瓶。

警告：为避免溢出，请定期清空废液容器。

注意：为防止污染，请在连接溶剂管理器和样品管理器管路时戴上无颗粒物、无粉尘的非乳胶手套。

2-8 系统设置

6. 将清除溶剂管路连接到溶剂管理器中可用的 SM SYRINGE 端口上。

7. 将注射器废液管引至溶剂管理器上不锈钢夹的后方。

8. 使用管路切割刀切割注射器废液管，以便连接溶剂管理器滴盘上的废液端口。

9. 将波纹废液管连接到样品管理器废液端口，然后将其穿过样品管理器滴盘上的孔洞。

10. 将样品管理器废液管引至溶剂管理器上不锈钢夹的后方，然后将其连接到溶剂管理器滴盘上的废液端口。

11. 用甲醇润湿溶剂管理器底部的倒钩排液接头。

12. 握住排液杯的背面，将废液管滑到倒钩排液接头上，然后引至适当的废液容器。

将排液接头连接到溶剂管理器：

TP03472

TP02479

排液接头

管路连接 2-9

排液管配置：

13. 将脱气机排放管引至适当的废液容器。

14. 将废液管路从溶剂托盘后部的倒钩接头引至适当的废液容器。

注意：为避免液体回流，请确保废液正常排放：

• 将废液容器置于系统机架下方。

• 确保排放管未皱缩或弯曲。皱缩或弯曲会妨碍液流流入废液容器。

• 确保排放管出口未被废液溶剂覆盖。必要时，请缩短废液管，以使其全部位于废液容器顶部之上（参见下图）。


警告：为避免溶剂蒸气释放到室内，请按下列方式之一布设在线脱气机排气管：

• 引至通风橱或其它适当的排气系统。

• 引至适当的废液容器，确保管路排放端始终位于液面以上。


TP02709正确不正确

2-10 系统设置

安装色谱柱，进行光学检测

要安装色谱柱（光学检测）：

必备材料

• 色谱柱支撑夹

• 手套：干净、无粉、耐化学物质

• 高温出口接头

• 高温出口接头扳手

• 可重复使用的接头

所需工具

5/16 in 开口扳手

要连接色谱柱在线过滤器设备和色谱柱入口：

1. 从色谱柱在线过滤器设备的出口端取下 O 形圈。

2. 从色谱柱入口取下塞子。

3. 将色谱柱在线过滤器设备的出口端推入色谱柱入口，直至无法推动为止。

4. 将可重复使用的手紧接头固定到位后，将色谱柱旋到接头上，直至其密合，然后最多再拧紧 1/6 圈。

警告：为防止灼伤，请将柱温设置为“关”，并让色谱柱室及其组件冷却 60 min 后再接触这些组件。监视色谱柱室的内部温度，确保所有组件都已冷却。

注意：为防止系统组件受到污染，安装色谱柱时请戴上干净、耐化学物质的无粉手套。

注意：为避免损坏主动预加热器装置，

• 在安装或拆卸色谱柱时请转动色谱柱（而非接头），以避免主动预加热器管路随接头转动。

• 请勿抓握并旋转装置。

• 请勿悬吊主动预加热器管路。

注意：为避免损坏管路，只能用手指拧紧此接头。

管路连接 2-11

要将 PEEK 管安装到色谱柱出口：

1. 将 PEEK 管插入高温出口接头，直至无法再插入为止。

2. 握住 PEEK 管，用手指将高温出口接头拧入色谱柱出口，直至拧紧。

3. 用 5/16 in 扳手夹稳色谱柱，然后用高温出口接头扳手将出口接头再拧紧 1/4 圈。

4. 将 PEEK 管路小心穿过色谱柱室。

要将 PEEK 管连接到检测器：

1. 从来自检测器流通池入口的 PEEK 管取下保护盖。

2. 确保流通池入口管路的标签与系统中检测器和流通池的类型相匹配。

3. 将流通池套件随附的 0.0025 in 内径的入口管连接到色谱柱出口。

注意：为避免谱带扩展，拧紧管路前，请确保管路已完全位于接头孔底部。

注意：为避免损坏出口接头，请勿用出口接头扳手将其拧得过紧。

TP02952来自色谱柱的检测器入口管路 (PEEK)

出口

入口

2-12 系统设置

4. 用色谱柱支撑夹夹住柱体（可重复使用的接头和色谱柱之间的部分），并旋转夹子使开口向前。

5. 将色谱柱放入色谱柱室中。

6. 将 eCord 芯片座连接到插孔上。

连接溶剂供应

位于系统顶部的溶剂盘最多能容纳 2 L 溢出溶剂。收集来自托盘后部废液管的溢出溶剂需

要配备适当的废液容器。

要连接溶剂供应：

1. 选择与启动套件提供的容器盖密合的溶剂容器。 Waters 建议使用 1 L 容器。

警告：为避免溢出，勿将溶剂容器置于样品组织器顶部。

注意：为保持足够的溶剂输送压力并确保正常的溶剂输送，请将溶剂容器置于系统机架顶部的溶剂盘中。

色谱柱支撑夹 eCord

加热器室插孔

eCord 芯片座

管路连接 2-13

2. 将溶剂管插入样品管理器或可选检测器顶部盘中的溶剂瓶中。

插好溶剂管的溶剂瓶：

以太网连接

以太网连接样品管理器配有内置的以太网交换机，可容纳 PC（工作站）和最多六个 ACQUITY UPLCH-Class 模块。将屏蔽以太网线缆从每个模块连接到样品管理器后面板的电路连接上。该样

品管理器从内部连接到以太网交换机。

柱温箱连接样品管理器为柱温箱提供电源，并与其通信。外部通信线缆必须连接至柱温箱和样品管理器的后面。

要连接柱温箱：

1. 确保样品管理器和柱温箱的电源都已关闭。

2. 将外部通信线缆连接到柱温箱后面的“高密度”(HD) 端口上。

3. 将外部通信线缆的另一端连接到样品管理器后面的 QSPI 端口上。

注意：为避免损坏电气部件，请勿在仪器接通电源时断开电气组件。要中断仪器的电源，请将电源开关设置为 Off（关），然后从交流电源插座拔下电源线。切断电源后，请等待 10 秒钟然后再断开组件。

溶剂瓶

溶剂管

溶剂托盘

2-14 系统设置

信号连接

建立信号连接

请参阅各仪器后面板上丝网印制的标签所显示的信号连接位置。

必备材料

• 9/32 in 螺帽扳头

• 平头螺丝刀

• 连接器

• 信号线缆

要建立信号连接：

1. 将连接器插入仪器背面的连接器端口。

连接器

连接器端口

信号连接 2-15

2. 使用平头螺丝刀将信号线缆的正负导线连接到连接器。

3. 将接地电缆的叉状端子安装到后面板的接地螺栓上，并使用防松螺母固定该端子。

提示：使用 9/32 in 螺帽扳头紧固防松螺母，直至叉状端子不再移动。

信号线缆

连接器

螺钉

叉状端子

防松螺母

接地螺栓

2-16 系统设置

四元溶剂管理器 I/O 信号连接器

四元溶剂管理器的后面板上有一个用于固定 I/O 信号线缆螺钉端子的活动连接器。该连接

器只能以一种方式插入，因此只要能插入，即为正确的连接方式。

四元溶剂管理器 I/O 信号连接器：

有关电气规格的信息，请参阅《ACQUITY UPLC 四元溶剂管理器操作员概述和维护信息》。

四元溶剂管理器事件输入连接：

信号连接说明

梯度开始通过接线端子输入或 0 V 输入启动泵，开始梯度操作。

停止液流当四元溶剂管理器接收到接线端子输入或 0 V 输入（例

如其它仪器出现错误或硬件故障）时，将停止四元溶剂管理器的液流。

梯度开始

+梯度开始

-接地

接地

停止液流

+停止液流

-1 2 3 4 5 6

信号连接 2-17

样品管理器 I/O 信号连接器

样品管理器的后面板上有一个用于固定 I/O 信号线缆螺钉端子的活动连接器。该连接器只

能以一种方式插入，因此只要信号线缆能插入，即为正确的连接方式。

样品管理器 I/O 信号连接器：

有关电气规格的信息，请参阅《ACQUITY UPLC 样品管理器 - Flow Through Needle 操作员概述和维护信息》。

TUV 检测器信号连接器

如果所用系统包括 TUV 检测器，请参阅《ACQUITY UPLC 可变波长紫外检测器入门指

南》，了解信号连接器的信息。

PDA 检测器信号连接器

如果系统包括 PDA 检测器，请参阅《ACQUITY UPLC 光电二极管阵列检测器入门指

南》，了解信号连接器的信息。

FLR 检测器信号连接器

如果系统包括 FLR 检测器，请参阅《ACQUITY UPLC 荧光检测器入门指南》，了解有关

信号连接器的信息。

样品管理器事件输出/事件输入连接：

信号连接说明

进样开始指示（通过接线端子输出）进样已经开始。

保持进样当样品管理器接收到接线端子输入（例如从另一个系统仪器）时延迟下一个进样。

进样开始

（出）

+进样开始

（出）

-接地

接地

保持进样

（入）

+保持进样

（入）

-

1 2 3 4 5 6

2-18 系统设置

连接到电源

每个系统仪器都需要一个独立的接地电源。所有电源插座的接地连接必须相同，并在物理位置上靠近系统。

要连接到电源：

建议：为获得最佳的长期稳定输入电压，请使用线路调节器和不间断电源 (UPS)。

1. 将电源线的外接头连接到各仪器后面板上的插座。

2. 将电源线的外接头连接到适当的墙壁插座。

或者：如果系统包括可选的 FlexCart，请将 Flexcart 电缆（包含在启动套件中）的

外接头连接到各仪器后面板上的插座。将 Flexcart 电缆有罩盖的内接头连接到小车

后的电源板。最后，将各电源板的电缆连接到以独立电路运行的墙壁插座。

警告：避免电击：

• 在美国请使用 SVT 型电源线，在欧洲请使用 HAR 型或更好的电源线。有关其

他国家/地区的要求，请联系当地的 Waters 分销商。

• 对仪器执行任何维护操作前，请关闭每个系统仪器的电源并拔下电源线。

• 将每个系统仪器连接到同一根地线。

连接到电源 2-19

2-20 系统设置

3 检验系统运行

用户必须清洗并准备系统以运行检验性能的测试方法。此外，还提供有氨基酸分析数据的定量和解析示例。

用于检验系统运行情况的样品包括在 AAA 套件中。此样品同时作为可选的

ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio AAA 系统性能检定 (PQ) 的一部分而提

供。开始检定过程前，必须按《ACQUITY UPLC H-Class 系统操作员指南》中的

所述步骤安装并配置所用系统。

内容：

主题页码

准备系统 3-2

制备洗脱液 3-4

创建测试方法 3-6

创建样品组方法 3-26

制备系统检验样品 3-27

执行测试 3-27

3-1

准备系统

安装 AAA 系统前，必须先清洗 ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio 系统。请按照

下述步骤制备所需的混合溶剂，然后用其清洗系统。清洗步骤将持续几个小时。

要求：对选定的检测器使用水解产物方法，以此检验系统性能。

示例：将系统光盘上的“Hydrolysate_TUV_HClass1011”项目还原到 Empower工作站。

另请参阅：第 5-8 页，获取有关还原项目的详细信息。

要制备清洗溶剂：

1. 制备 50:50 甲醇/水：

a. 在量筒中量取 500 mL 的 HPLC 级水。

b. 用另一个量筒量取 500 mL 甲醇。

c. 将甲醇加入水中，混合 5 分钟。

2. 将 50:50 甲醇/水的混合液转移至标记为 1 L 的容器。

3. 制备 30:70 磷酸/水的混合液：

a. 用量筒量取 700 mL 水。

b. 用另一个量筒量取 300 mL 磷酸。

c. 将磷酸加入水中，混合 5 分钟。

4. 将 30:70 磷酸/水的混合液转移至 1 L 的流动相容器。

5. 在 1 L 流动相容器中注满 100% 水。

6. 在 1 L 流动相容器中注满 100% 异丙醇。

要准备用于清洗系统的样品瓶：

1. 将 1 mL 50:50 甲醇/水添加到样品瓶中。

2. 在第二个样品瓶中添加 1 mL 30:70 磷酸/水。

3. 在第三个样品瓶中添加 1 mL 100% 水。

4. 在第四个样品瓶中添加 1 mL 100% 异丙醇。

注意：为避免损坏不锈钢或钛溶剂容器过滤器，请勿使酸流经密封清洗管，酸会与过滤器发生反应。

3-2 检验系统运行

要清洗系统：

1. 将所有管路（A、B、C、D、清洗、清除、密封清洗）的一端放入甲醇/水混合液中。

2. 每个溶剂管各灌注 5 分钟。

3. 灌注密封清洗液一分钟。

4. 灌注清除液 50 次。

5. 将流路限流器连接到柱温箱中主动预加热器装置的出口，使系统内产生大约 13,800 kPa （140 bar， 2000 psi）的反压。

6. 将废液管从流路限流器的出口连接到适当的废液容器。

7. 将样品瓶中所装的 1 mL 50:50 甲醇/水转移至自动样品器的样品瓶，并将其置于位置

1:A,1。

8. 采用下列参数设置创建仪器方法：

• 流速：0.5 mL/min。

• 梯度组分：25%A、 25%B、 25%C、 25%D。

9. 将运行时间设定为 0.5 分钟，从该样品瓶执行 10 次进样。

提示：此步骤大约需要 10 分钟。

10. 以 100% 异丙醇为溶剂和样品，重复步骤 1 至步骤 9。

注：禁止该清洗步骤中的排出液流经可选检测器。将管路从流路限流器的出口引至废液。

11. 用 100% 水作为溶剂，重复步骤 1 至步骤 9。

12. 取下溶剂容器过滤器。

13. 用 30:70 磷酸/水作为溶剂，重复步骤 1 至步骤 9。

14. 用 100% 水作为溶剂，重复步骤 1 至步骤 9。

15. 将废液管重新插入原始废液容器。

16. 将溶剂管重新连接至检测器。



准备系统 3-3

17. 更换所有管路中的溶剂容器过滤器。

18. 将密封清洗管与其它管路一起浸入 100% 水中。

19. 用 50:50 甲醇/水作为溶剂，重复步骤 1 至步骤 9。

20. 从柱温箱上的主动预加热器装置拆下流路限流器。

另请参阅：以下文档，获取有关准备场地和启动测试的详细信息：

• 场地准备指南（部件号 715003249ZH）

• 安装清单（部件号 715003250ZH）

制备洗脱液

用户必须制备运行系统进行蛋白水解产物、细胞培养、烷化半胱氨酸、食品和饲料分析时所用的流动相和清洗溶液。

建议：

请勿将用于制备洗脱液的玻璃器皿与常用的玻璃器皿一起清洗。清洗玻璃器皿时请勿使用去污剂。请仅使用将用于配制流动相的高纯度溶剂冲洗玻璃器皿。

由于该方法的灵敏度非常高，因此必须仅使用最高纯度（HPLC 级溶剂或更高纯度级别）

的溶剂和添加剂。否则将导致高背景污染、低信噪比以及灵敏度降低。

设置流动相

溶剂体积可进行调节，使最终浓度保持不变。

下表介绍了用于蛋白水解产物、细胞培养、烷化半胱氨酸、食品和饲料分析的流动相。

警告：为避免接触（包括吸入）溶剂对人体造成危害，处理溶剂时请遵守“优良实验室规范”。参阅“材料安全数据表”了解所用溶剂的信息。

系统流动相类型：

溶剂管路说明

A 100% AccQ•Tag Ultra 洗脱液 A 浓缩液

B 90:10 水：AccQ•Tag Ultra 洗脱液 B

C 100% HPLC 级水

D 100% AccQ•Tag Ultra 洗脱液 B


制备流动相

要制备 100% AccQ•Tag Ultra 洗脱液 A 流动相：

1. 将 AccQ•Tag Ultra 洗脱液 A 浓缩液转移到带有相应标记的流动相容器中。

或者：使 AccQ•Tag Ultra 洗脱液 A 留在其原始容器中。

提示：AccQ•Tag Ultra 洗脱液 A 浓缩液容器开启后，在室温下该洗脱液可存放 3 天。保存在 4 °C 条件下，且盖紧其原容器时可存放 1 个月。

要制备 90:10 水/AccQ•Tag Ultra 洗脱液 B 流动相：

1. 用 1 L 量筒量取 900 mL 水，将水转移到带有相应标记的流动相容器中。

2. 用另一个量筒量取 100 mL AccQ•Tag Ultra 洗脱液 B。

3. 将 AccQ•Tag Ultra 洗脱液 B 加入盛有水的流动相容器中，充分混合至少 5 分钟。

提示：AccQ•Tag Ultra 洗脱液 B 和水溶液在室温下可存放 3 天。

要制备水流动相：

向带有相应标记的流动相容器中注入 100% HPLC 级水。

提示：在室温下保存时， 100% HPLC 级水时可存放 3 天。

要制备 100% AccQ•Tag Ultra 洗脱液 B：

将 AccQ•Tag Ultra 洗脱液 B 转移到带有相应标记的流动相容器中。

或者：将 AccQ•Tag Ultra 洗脱液 B 盛放在其原始容器中，用作流动相。

提示：AccQ•Tag Ultra 洗脱液 B 浓缩液容器开启后，在室温下该洗脱液可存放 3 天。保

存在 4 °C 条件下，且盖紧其原容器时可存放 1 个月。

要制备 50:50 水/乙腈、针、密封和清除清洗溶液：

1. 用量筒量取 500 mL 水，将水转移到带有相应标记的 1 L 玻璃容器中。

2. 用另一个量筒量取 500 mL 乙腈。

3. 将乙腈加入到盛有水的清洗溶液容器内，充分混合至少 15 分钟。

制备洗脱液 3-5

创建测试方法

系统光盘中包含一组囊括 TUV、PDA 和 FLR 检测器在内的项目和测试方法，每种检测器

均有四种样品类型：

• 蛋白水解产物

• 细胞培养

• 烷化半胱氨酸

• 食品与饲料

对于所有样品类型， TUV、 PDA 和 FLR 检测器的检测参数均相同。但是，溶剂管理器的

仪器条件与样品管理器的仪器条件不同。而且，对于食品和饲料，溶剂成分和柱温与蛋白水解产物、细胞培养和烷化半胱氨酸分析所需的溶剂成分和柱温不同。

建议：

• 将所用检测器的项目（以及相应的样品类型）还原至 PC。

另请参阅：第 5-8 页，获取有关还原项目的信息。

• 为防止因疏忽导致的更改，测试方法已进行锁定。用户可以保存方法，进行重命名，从而可根据实验室的特定需要更改方法名称。

• 对选定的检测器使用水解产物方法，以此检验系统性能。

• 处理方法将自动更新保留时间。为防止时间漂移超出指定的窗口，请从系统提供的标准方法创建一个新方法。

Empower 通过运行以下方法执行样品分析：

方法名称操作

StartUp （启动）在方法中指定的温度下采用 0.2 mL/min 的流速以等度条件平

衡色谱柱。

Run （运行）采用仪器参数设置运行氨基酸标准样。

ShortStop（短时关闭）

关闭检测器，熄灭灯并将 25:25:25:25 A:B:C:D 的流速降至

0.05 mL/min。

LongStop（长时关闭）

用于长期存放系统，将熄灭检测器灯并关闭柱温箱和泵。

General （常规）处理方法

IntStd （内标）处理方法

Report （报告）报告方法

SmplSet （样品组）样品组方法


TUV 测试方法

下表所示的 Empower 项目、测试方法和参数设置适用于含 TUV 检测器的系统。

针对应用打开项目和测试方法，检验 TUV 检测器、溶剂管理器和样品管理器的参数值。

下表列出了用于 TUV 检测器的测试方法。

TUV 测试方法：

项目名测试方法

Hydrolysates_TUV_HClass1011 仪器方法：

• StartUp_Hyd_TUV_HClass1011

• Run_Hyd_TUV_HClass1011

• ShortStop_Hyd_TUV_HClass1011

• LongStop_Hyd_TUV_HClass1011

处理方法：

• General_Hyd_TUV_HClass1011

• IntStd_Hyd_TUV_HClass1011

报告方法：

• Report_Hyd_TUV_HClass1011

方法组：

• StartUp_Hyd_TUV_HClass1011

• Run_Hyd_TUV_HClass1011

• ShortStop_Hyd_TUV_HClass1011

• LongStop_Hyd_TUV_HClass1011

样品组：

• SmplSet_Hyd_TUV_HClass1011


Alkylated_Cys_TUV_HClass1011 仪器方法：

• StartUp_Cys_TUV_HClass1011

• Run_Cys_TUV_HClass1011

• ShortStop_Cys_TUV_HClass1011

• LongStop_Cys_TUV_HClass1011

处理方法：

• General_Cys_TUV_HClass1011

• IntStd_Cys_TUV_HClass1011

报告方法：

• Report_Cys_TUV_HClass1011

方法组：

• StartUp_Cys_TUV_HClass1011

• Run_Cys_TUV_HClass1011

• ShortStop_Cys_TUV_HClass1011

• LongStop_Cys_TUV_HClass1011

样品组：

• SmplSet_Cys_TUV_HClass1011

TUV 测试方法：（续）



Cell_Culture_TUV_HClass1011 仪器方法：

• StartUp_Cult_TUV_HClass1011

• Run_Cult_TUV_HClass1011

• ShortStop_Cult_TUV_HClass1011

• LongStop_Cult_TUV_HClass1011

处理方法：

• General_Cult_TUV_HClass1011

• IntStd_Cult_TUV_HClass1011

报告方法：

• Report_Cult_TUV_HClass1011

方法组：

• StartUp_Cult_TUV_HClass1011

• Run_Cult_TUV_HClass1011

• ShortStop_Cult_TUV_HClass1011

• LongStop_Cult_TUV_HClass1011

样品组：

• SmplSet_Cult_TUV_HClass1011




Foods_Feeds_TUV_HClass1011 仪器方法：

• StartUp_Foods_TUV_HClass1011

• Run_Foods_TUV_HClass1011

• ShortStop_Foods_TUV_ HClass1011

• LongStop_Foods_TUV_ HClass1011

处理方法：

• General_Foods_TUV_HClass1011

• IntStd_Foods_TUV_HClass1011

报告方法：

• Report_Foods_TUV_HClass1011

方法组：

• StartUp_Foods_TUV_HClass1011

• Run_Foods_TUV_HClass1011

• ShortStop_Foods_TUV_ HClass1011

• LongStop_Foods_TUV_ HClass1011

样品组：

• SmplSet_Foods_TUV_HClass1011




要检验含 TUV 检测器的系统性能：

1. 请检验以下 TUV 检测器参数设置：

2. 检验以下溶剂管理器设置：

参数设置

检测波长 260 nm

采样速率 10 pts/s

数据模式吸光度

时间常数 0.200 s

波长变化时自动复零维持基线

进样开始时自动复零是

灵敏度 2.00 AUFS

绘制极性正 (+)

电压偏移 0 mV

启用图表标记是

运行事件是

阈值 1.0000 AU

阈值切换操作开

参数值

压力下限 0 psi

压力上限 15,000 psi

密封清洗时间 5.00 min

流量变化率 0.45 min

前进样器体积 100 µL

流速 700 µL/min


用于细胞培养、水解产物、烷化半胱氨酸的梯度表：

步骤时间 (min)

%A %B %C %D 曲线

1 0.00 10.0 0.0 90.0 0.0 N/A

2 0.29 9.9 0.0 90.1 0.0 11

3 5.49 9.0 80.0 11.0 0.0 7

4 7.10 8.0 15.6 57.9 18.5 6

5 7.3 8.0 15.6 57.9 18.5 6

6 7.69 7.8 0.0 70.9 21.3 6

7 7.99 4.0 0.0 36.3 59.7 6

8 8.59 4.0 0.0 36.3 59.7 6

9 8.68 10.0 0.0 90.0 0.0 6

10 10.20 10.0 0.0 90.0 0.0 6

用于食品与饲料的梯度表：

步骤时间 (min)

流速 (mL/min)

%A %B %C %D 曲线

1 0.00 0.7 2.0 0.0 98.0 0.0 N/A

2 0.29 0.7 2.0 0.0 98.0 0.0 11

3 5.49 0.7 9.0 80.0 11.0 0.0 7

4 7.10 0.7 8.0 15.6 57.9 18.5 6

5 7.3 0.7 8.0 15.6 57.9 18.5 6

6 7.69 0.7 7.8 0.0 70.9 21.3 6

7 7.99 0.7 4.0 0.0 36.3 59.7 6

8 8.59 0.7 4.0 0.0 36.3 59.7 6

9 8.68 0.7 2.0 0.0 98.0 0.0 6

10 10.20 0.7 2.0 0.0 98.0 0.0 6


3. 检验以下色谱条件：

• 色谱柱：AccQ•Tag Ultra 色谱柱 2.1 × 100 mm， 1.7 µm

• 流动相 A：AAA 洗脱液 A

• 流动相 B：10:90 水/AAA 洗脱液 B

• 流动相 C：水

• 流动相 D：AAA 洗脱液 B

4. 检验以下样品管理器设置：

参数值

用于细胞培养、水解产物、烷化半胱氨酸的柱温

43 °C

用于食品与饲料的柱温 49 °C

样品温度 20 °C

进样前清洗时间 0.0 s

进样后清洗时间 6.0 s

稀释针位置 4 mm

注射器吸取速率自动

针位置自动


PDA 测试方法

下表所示的 Empower 项目、测试方法和参数设置适用于含 PDA 检测器的系统。

针对应用打开项目和测试方法，检验 PDA 检测器、溶剂管理器和样品管理器的参数设置。

下表列出了适用于 PDA 检测器的方法。

PDA 测试方法：


Hydrolysates_PDA_HClass1011 仪器方法：

• StartUp_Hyd_PDA_HClass1011

• Run_Hyd_PDA_HClass1011

• ShortStop_Hyd_PDA_HClass1011

• LongStop_Hyd_PDA_HClass1011

处理方法：

• General_Hyd_PDA_HClass1011

• IntStd_Hyd_PDA_HClass1011

报告方法：

• Report_Hyd_PDA_HClass1011

方法组：

• StartUp_Hyd_PDA_HClass1011

• Run_Hyd_PDA_HClass1011

• ShortStop_Hyd_PDA_HClass1011

• LongStop_Hyd_PDA_HClass1011

样品组：

• SmplSet_Hyd_PDA_HClass1011


Alkylated_Cys_PDA_HClass1011 仪器方法：

• StartUp_Cys_PDA_HClass1011

• Run_Cys_PDA_HClass1011

• ShortStop_Cys_PDA_HClass1011

• LongStop_Cys_PDA_HClass1011

处理方法：

• General_Cys_PDA_HClass1011

• IntStd_Cys_PDA_HClass1011

报告方法：

• Report_Cys_PDA_HClass1011

方法组：

• StartUp_Cys_PDA_HClass1011

• Run_Cys_PDA_HClass1011

• ShortStop_Cys_PDA_HClass1011

• LongStop_Cys_PDA_HClass1011

样品组：

• SmplSet_Cys_PDA_HClass1011

PDA 测试方法：（续）



Cell_Culture_PDA_HClass1011 仪器方法：

• StartUp_Cult_PDA_HClass1011

• Run_Cult_PDA_HClass1011

• ShortStop_Cult_PDA_HClass1011

• LongStop_Cult_PDA_HClass1011

处理方法：

• General_Cult_PDA_HClass1011

• IntStd_Cult_PDA_HClass1011

报告方法：

• Report_Cult_PDA_HClass1011

方法组：

• StartUp_Cult_PDA_HClass1011

• Run_Cult_PDA_HClass1011

• ShortStop_Cult_PDA_HClass1011

• LongStop_Cult_PDA_HClass1011

样品组：

• SmplSet_Cult_PDA_HClass1011




要检验含 PDA 检测器的系统性能：

1. 检验以下 PDA 检测器设置：

Foods_Feeds_PDA_HClass1011 仪器方法：

• StartUp_Foods_PDA_HClass1011

• Run_Foods_PDA_HClass1011

• ShortStop_Foods_PDA_HClass1011

• LongStop_Foods_PDA_HClass1011

处理方法：

• General_Foods_PDA_HClass1011

• IntStd_Foods_PDA_HClass1011

报告方法：

• Report_Foods_PDA_HClass1011

方法组：

• StartUp_Foods_PDA_HClass1011

• Run_Foods_PDA_HClass1011

• ShortStop_Foods_PDA_HClass1011

• LongStop_Foods_PDA_HClass1011

样品组：

• SmplSet_Foods_PDA_HClass1011

参数值

2D 通道 - 数据模式吸光度

2D 通道 - 波长 260 nm

2D 通道 - 分离度 4.8 nm

3D 数据未启用

采样速率 10 pts/s

分离度 4.8 nm

时间常数正常 0.2000 s

曝光时间自动 (ms)




2. 检验溶剂管理器的以下设置：

参数值

压力下限 0 psi

压力上限 15,000 psi

密封清洗时间 5.00 min

流量变化率 0.45 min

前进样器体积 100 µL

流速 700 µL/min

用于细胞培养、水解产物、烷化半胱氨酸的梯度表：

步骤时间 (min)

%A %B %C %D 曲线

1 0.00 10.0 0.0 90.0 0.0 N/A

2 0.29 9.9 0.0 90.1 0.0 11

3 5.49 9.0 80.0 11.0 0.0 7

4 7.10 8.0 15.6 57.9 18.5 6

5 7.3 8.0 15.6 57.9 18.5 6

6 7.69 7.8 0.0 70.9 21.3 6

7 7.99 4.0 0.0 36.3 59.7 6

8 8.59 4.0 0.0 36.3 59.7 6

9 8.68 10.0 0.0 90.0 0.0 6

10 10.20 10.0 0.0 90.0 0.0 6


3. 检验以下色谱条件：






4. 检验样品管理器的以下样品类型设置：

用于食品与饲料的梯度表：

步骤时间 (min)

流速 (mL/min)

%A %B %C %D 曲线

1 0.00 0.7 2.0 0.0 98.0 0.0 N/A

2 0.29 0.7 2.0 0.0 98.0 0.0 11

3 5.49 0.7 9.0 80.0 11.0 0.0 7

4 7.10 0.7 8.0 15.6 57.9 18.5 6

5 7.3 0.7 8.0 15.6 57.9 18.5 6

6 7.69 0.7 7.8 0.0 70.9 21.3 6

7 7.99 0.7 4.0 0.0 36.3 59.7 6

8 8.59 0.7 4.0 0.0 36.3 59.7 6

9 8.68 0.7 2.0 0.0 98.0 0.0 6

10 10.20 0.7 2.0 0.0 98.0 0.0 6

参数值

柱温细胞培养、水解产物、烷化半胱氨酸

43 °C

食品与饲料 49 °C

样品温度 20 °C





针位置自动


FLR 测试方法

下表列出了适用于配有 FLR 检测器的系统以及适用于四种样品类型的 Empower 项目、测

试方法和参数。

注：针对应用打开项目和测试方法，检验 FLR 检测器、溶剂管理器和样品管理器的参数值。

下表列出用于 FLR 检测器的方法。

FLR 测试方法：


Hydrolysates_FLR_HClass1011 仪器方法：

• StartUp_Hyd_FLR_HClass1011

• Run_Hyd_FLR_HClass1011

• ShortStop_Hyd_FLR_HClass1011

• LongStop_Hyd_FLR_HClass1011

处理方法：

• General_Hyd_FLR_HClass1011

• IntStd_Hyd_FLR_HClass1011

报告方法：

• Report_Hyd_FLR_HClass1011

方法组：

• StartUp_Hyd_FLR_HClass1011

• Run_Hyd_FLR_HClass1011

• ShortStop_Hyd_FLR_HClass1011

• LongStop_Hyd_FLR_HClass1011

样品组：

• SmplSet_Hyd_FLR_HClass1011


Alkylated_Cys_FLR_HClass1011 仪器方法：

• StartUp_Cys_FLR_HClass1011

• Run_Cys_FLR_HClass1011

• ShortStop_Cys_FLR_HClass1011

• LongStop_Cys_FLR_HClass1011

处理方法：

• General_Cys_FLR_HClass1011

• IntStd_Cys_FLR_HClass1011

报告方法：

• Report_Cys_FLR_HClass1011

方法组：

• StartUp_Cys_FLR_HClass1011

• Run_Cys_FLR_HClass1011

• ShortStop_Cys_FLR_HClass1011

• LongStop_Cys_FLR_HClass1011

样品组：

• SmplSet_Cys_FLR_HClass1011

FLR 测试方法：（续）



Cell_Culture_FLR_HClass1011 仪器方法：

• StartUp_Cult_FLR_HClass1011

• Run_Cult_FLR_HClass1011

• ShortStop_Cult_FLR_HClass1011

• LongStop_Cult_FLR_HClass1011

处理方法：

• General_Cult_FLR_HClass1011

• IntStd_Cult_FLR_HClass1011

报告方法：

• Report_Cult_FLR_HClass1011

方法组：

• StartUp_Cult_FLR_HClass1011

• Run_Cult_FLR_HClass1011

• ShortStop_Cult_FLR_HClass1011

• LongStop_Cult_FLR_HClass1011

样品组：

• SmplSet_Cult_FLR_HClass1011




要检验 FLR 检测器的系统性能：

1. 检验 FLR 检测器是否已设置以下参数值：

Foods_Feeds_FLR_HClass1011 仪器方法：

• StartUp_Foods_FLR_HClass1011

• Run_Foods_FLR_HClass1011

• ShortStop_Foods_FLR_HClass1011

• LongStop_Foods_FLR_HClass1011

处理方法：

• General_Foods_FLR_HClass1011

• IntStd_Foods_FLR_HClass1011

报告方法：

• Report_Foods_FLR_HClass1011

方法组：

• StartUp_Foods_FLR_HClass1011

• Run_Foods_FLR_HClass1011

• ShortStop_Foods_FLR_HClass1011

• LongStop_Foods_FLR_HClass1011

样品组：

• SmplSet_Foods_FLR_HClass1011

参数值

波长模式（紫外检测） 2D 通道

激发波长 ( ex) 266 (nm)

发射波长 ( em) 473 (nm)

采样速率（数据率） 10 (pts/s)

时间常数 0.200 (s)

PMT 增益 1.00

数据单位发射




2. 检验溶剂管理器是否已设置以下参数值：

参数值

压力下限 0 (psi)

压力上限 15,000 (psi)

密封清洗时间 5.00 (min)

流量变化率 0.45 (min)

前进样器体积 100 (µL)

流速 700 (µL/min)

用于细胞培养、水解产物、烷化半胱氨酸分析的梯度表：

步骤时间 (min)

%A %B %C %D 曲线

1 0.00 10.0 0.0 90.0 0.0 N/A

2 0.29 9.9 0.0 90.1 0.0 11

3 5.49 9.0 80.0 11.0 0.0 7

4 7.10 8.0 15.6 57.9 18.5 6

5 7.3 8.0 15.6 57.9 18.5 6

6 7.69 7.8 0.0 70.9 21.3 6

7 7.99 4.0 0.0 36.3 59.7 6

8 8.59 4.0 0.0 36.3 59.7 6

9 8.68 10.0 0.0 90.0 0.0 6

10 10.20 10.0 0.0 90.0 0.0 6


3. 检验是否满足以下色谱条件：






4. 检验样品管理器是否已设置以下参数值：

用于食品与饲料分析的梯度表：

步骤时间 (min)

流速 (mL/min)

%A %B %C %D 曲线

1 0.00 0.7 2.0 0.0 98.0 0.0 N/A

2 0.29 0.7 2.0 0.0 98.0 0.0 11

3 5.49 0.7 9.0 80.0 11.0 0.0 7

4 7.10 0.7 8.0 15.6 57.9 18.5 6

5 7.3 0.7 8.0 15.6 57.9 18.5 6

6 7.69 0.7 7.8 0.0 70.9 21.3 6

7 7.99 0.7 4.0 0.0 36.3 59.7 6

8 8.59 0.7 4.0 0.0 36.3 59.7 6

9 8.68 0.7 2.0 0.0 98.0 0.0 6

10 10.20 0.7 2.0 0.0 98.0 0.0 6

参数值

柱温细胞培养、水解产物、烷化半胱氨酸

43 °C

食品与饲料 49 °C

样品温度 20 °C





针位置自动


创建样品组方法

系统光盘包含有适用于 TUV、 PDA 和 FLR 检测器的样品组方法集合，请针对使用的检测器选择样

品组方法。

TUV 样品组方法

要打开 TUV 样品组方法：

1. 打开样品组方法“Reproduc_Hyd_TUV_HClass1011”并确认以下条件：

• 进样体积设置为 1.0 µL。

• 运行时间设置为 10.2 分钟。

• 方法设置为“Reproduc_Hyd_TUV_HClass1011”。

PDA 样品组方法

要打开 PDA 样品组方法：

1. 打开样品组方法“Reproduc_Hyd_PDA_HClass1011”并确认以下条件：



• 方法设置为“Reproduc_Hyd_PDA_HClass1011”。

FLR 样品组方法

要打开 FLR 样品组方法：

1. 打开样品组方法“Reproduc_FLR_TUV_HClass1011”并确认以下条件：



• 方法设置为“Reproduc_FLR_TUV_HClass1011”。


制备系统检验样品

移液准确无误是确保样品质量的必要条件。请遵守贵公司正确移液方法的相关操作规程。

要制备系统检验样品 (50 pmol/µL)：

1. 使用微量移液器将以下组分转移到完全回收样品瓶：

a. 移取 70 µL AccQ•Tag Ultra 硼酸盐缓冲剂（试剂 1）。

b. 加入 10 µL 500 pmol/µL 标准样（有关制备标准样的说明，请参阅第 4 章）。

要求：充分混合几秒钟。

c. 加入 20 µL 复溶的 AccQ•Tag Ultra 试剂。

2. 盖上样品瓶的瓶盖，涡旋混合几秒钟。

3. 在室温下放置 1 分钟。

4. 在恒温加热仪中以 55 °C 加热 10 分钟。

5. 用钳子从加热恒温仪中取出样品瓶。

执行测试

当系统准备就绪、测试方法得到确认并且样品衍生完成后，即可执行测试。

有关制备标准样的说明，请参阅第 4 章；有关准备系统的信息，请参阅第 5 章。

要执行测试：

1. 在“运行样品”中打开项目开始运行。

2. 选择“UPLC AAA 重现性”样品组，然后选择“运行并报告”。

3. 当样品组完成后，在下表中输入相应的结果。

4. 查看梯度性能报告。将报告中的色谱与下面的其中一个样品色谱进行比较（根据使用的检测器类型选择对比图谱）。

样品组结果：

组分峰保留时间平均值标准偏差可接受的标准偏差

组氨酸 (His) < 0.116

丙氨酸 (Ala) < 0.116

苯丙氨酸 (Phe) < 0.116

制备系统检验样品 3-27

示例色谱

使用推荐的 TUV 检测器设置所得 25 pmol 水解产物标准样结果：

使用推荐的 PDA 检测器设置所得 25 pmol 水解产物标准样结果：

0.10

0.05

0.00

0.00 2.50 5.00 7.50

min

AU

0.10

0.05

0.00

0.00 2.50 5.00 7.50

min

AU


使用推荐的 FLR 检测器设置所得 25 pmol 水解产物标准样结果：

3000.00

1500.0

0.00

2.50 5.00 7.50

min

EU

0.00

执行测试 3-29


4 制备标准样和样品

AccQ•Tag Ultra 化学品套件包含的物品最多可执行 250 次衍生化反应。请按照本章

中所述过程制备执行分析所需的标准样和样品。

内容：

主题页码

复溶 AccQ•Tag Ultra 粉末试剂 4-2

制备校正标准样 4-3

制备样品 4-5

4-1

复溶 AccQ•Tag Ultra 粉末试剂

AccQ•Tag Ultra 试剂套件包括经测试可以确保最低程度的氨基酸污染的预配置试剂。复溶

的 AccQ•Tag Ultra 试剂是约 10 mM 溶于乙腈的 AccQ•Tag Ultra 试剂。

要复溶 AccQ•Tag Ultra 试剂：

1. 将恒温加热仪预热至 55 °C。

2. 在打开前轻叩样品瓶 2A，确保所有 AccQ•Tag Ultra 粉末试剂位于样品瓶的底部。

3. 吸取然后废弃 1 mL 样品瓶 2B 中的 AccQ•Tag Ultra 试剂稀释剂，润洗洁净的微量

移液器。重复 2 次。

要求：重复进行两次清洁过程。

4. 从样品瓶 2B 中吸取 1.0 mL 试剂稀释剂，将其转移至装有 AccQ•Tag Ultra 粉末试

剂的样品瓶 2A 中。盖紧瓶盖。

5. 涡旋混合 10 秒钟。

重要说明：加热试剂不得超过 10 分钟。

提示：可将复溶的 AccQ•Tag Ultra 试剂于室温下储存在干燥器内，可储存 1 周。每次打

开样品瓶都会使水分污染的危险增加。因此，从任何样品瓶中提取的试剂量不可多于执行

3 次衍生化实验所需的用量。

警告：乙腈易燃，有毒。请参阅“材料安全数据表”。

注意：AccQ•Tag Ultra 试剂会与空气中的水分反应。不使用时应密封保存。请勿冷藏。请勿使用已褪色的试剂，特别是已经变黄或变绿的试剂。

4-2 制备标准样和样品

制备校正标准样

本节将介绍外标和内标校正标准样的制备方法，以及校正标准样的衍生步骤。

使用校正标准样计算水解样品中的蛋白质和缩氨酸成分、水解样品中单体氨基酸的摩尔百分比值以及绝对进样量。

所需设备

• 可调式微量移液器（1、 10、 20、 200 和 1000 L）和吸头

• 涡旋混合器

• Waters 完全回收样品瓶（带无切口隔片盖）

• 恒温加热仪

• Mill-Q® 或其它 18 MΩ 超纯水

制备校正标准样：外标法

Waters AccQ•Tag 化学品套件包括 Waters 水解氨基酸标准样。标准样混合物溶解在 0.1 N HCl 中，各种水解氨基酸的浓度均为 2.5 mM （胱氨酸为 1.25 mM）。

确保所有的玻璃器皿都是干净的。进行高灵敏度分析时，将所有的玻璃器皿置于 500 °C 下热解至少 4 小时。

要制备校正标准样：

将 100 L Waters 氨基酸水解标准样和 900 L Milli-Q （或其它 18 MΩ 超纯水）

转移到完全回收样品瓶中并混合均。

在稀释的校正标准样中，胱氨酸的浓度为 125 pmol/L （相当于 250 pmol/L 半胱

氨酸），其它氨基酸的浓度均为 250 pmol/L。

请按照以下指导原则储存标准样：

• 稀释的校正标准样在 -20 °C 下可储存最多 1 个月。

• 将剩余的氨基酸水解标准样从安瓿瓶转移到密封样品瓶。剩余的标准样在 -20 °C 下可储存最多 3 个月。存储期间，标准样应防燥和防冻。

• 未开封的水解标准样安瓿瓶在 4 °C 下最多可储存 1 年。

避免所有的标准样被污染和蒸发。

制备校正标准样 4-3

制备校正标准样：内标法

使用添加有校正标准样的内标物可以修正制备样品时引入的容量误差。应使用结构稳定并且在已知的特定保留时间处洗脱的氨基酸。推荐以正缬氨酸为内标。另一种可接受的标准样是 -氨基丁酸。

制备内标储备溶液

使用内标储备溶液制备以下样品：

• 添加有内标物的校正标准样

• 加入样品的内标溶液

要制备 2.5 mM 正缬氨酸内标储备溶液：

将 2.94 mg 正缬氨酸添加到 10 mL 的 0.1 N HCl 中。

要制备 2.5 mM -氨基丁酸内标储备溶液：

将 2.58 mg -氨基丁酸添加到 10 mL 的 0.1 N HCl 中。

内标储备溶液在 -20 °C 下最多可储存 6 个月。

制备含内标的校正标准样

要制备添加有内标物的校正标准样：

在干净的自动样品器样品瓶中混合以下试剂：

• 100 L 内标储备溶液

• 100 L Waters 水解氨基酸标准样混合溶液

• 800 L Milli-Q （或其它 18 MΩ 超纯水）

在添加有内标物的校正标准样中，胱氨酸的浓度为 125 pmol/L （相当于 250 pmol/L 半胱氨酸），其它氨基酸的浓度均为 250 pmol/L。

校正标准样在 -20 °C 下可储存最多 1 个月，存储时应盖紧瓶盖，注意防燥。


衍生校正标准样

衍生作用会将标准样中的氨基酸转化为更加稳定的衍生物。

要衍生校正标准样：


2. 再用微量移液器将 70 L AccQ•Tag Ultra 硼酸盐缓冲剂（试剂 1）添加到干净的完

全回收样品瓶中。

3. 用微量移液器将 10 L 校正标准样转移到该样品瓶中，然后进行短时间的涡旋混合。

4. 用带干净吸头的微量移液器将 20 L 复溶的 AccQ•Tag Ultra 试剂转移到样品瓶内，

并立即涡旋混合几秒钟。

5. 在室温下将混合物放置 1 分钟。

6. 将样品瓶置于恒温加热仪或柱温箱内，在 55 °C 下加热 10 分钟。

提示：通过加热可将酪氨酸 (Tyr) 的次要副产物转化为主要的单一衍生化合物。室温

下转化较为缓慢，半衰期大约为 1 个小时。

在 1 L 衍生后标准样的进样溶液中，各种氨基酸的含量为 25 pmol（胱氨酸为 12.5 pmol）。

衍生物在室温下最多可保存 1 周。使用未穿孔的隔片紧紧密封样品瓶，以免存储期间液体

蒸发。

制备样品

要使用 AccQ•Tag Ultra 方法制备用于进行氨基酸分析的样品：

1. 确定所需样品量。

2. 将样品水解为氨基酸（如果需要）。

3. 使用 AccQ•Tag Ultra 试剂衍生氨基酸。

有关样品量的详细信息，请参阅附录 A。

样品制备是最容易造成氨基酸污染的过程。有关最大程度降低背景污染的更多信息，请参阅：“背景污染”。

制备样品 4-5

确定样品量

下表列出了使用 AccQ•Tag Ultra 方法进行水解和分析的样品量范围。

水解样品

系统与纯化后的蛋白质、食物样品和饲料样品的所有常规水解过程相兼容。必须遵循附录 A中的指导原则，确保样品量没有超出化验的线性范围，且具有用于反应的最佳 pH 值。

背景污染

背景污染会轻易使样品增加 10 pmol 或更多的氨基酸。氨基乙酸、丝氨酸、天冬氨酸盐和

谷氨酸盐往往是含量最大的污染物。

另请参阅：有关如何最大程度降低污染的详细信息，请参阅《控制 LC/MS 系统中的污染》。

潜在的污染源如下：

• 不干净的玻璃器皿

• 实验室动物

• 烟草烟雾

• 空气浮尘

• 指纹

• Kimwipes®

为获得最佳结果，请遵循以下指导原则：

• 在清洁、安静的工作区域内处理样品。

• 戴上干净、不含滑石粉的手套，使用干净的钳子。

• 如果可能，请使用一次性玻璃器皿。

• 将所有的样品管和反应样品瓶置于 500 °C 下热解 4 小时。

• 对于纯净蛋白质，请考虑使用气相酸法水解。使用装有高纯度 HCl (6N) 的 1 mL 安瓿瓶。

• 通过空白样的衍生反应和适当的对照样检查背景污染。

样品量范围：

样品样品量a

a. 蛋白质的平均分子量为 25,000，而缩氨酸的平均分子量为 1000。

范围

蛋白质 0.1 至 5.0 g 4 至 200 pmol

缩氨酸 0.02 至 1.0 g 20 至 1000 pmol


• 用空的样品管作为对照水解空白样。

• 注意移液管、一次性吸头、注射器和钳子存在潜在污染。避免样品和校正标准样交叉污染。

衍生样品

衍生作用会将样品溶液中的氨基酸转化为稳定的氨基酸衍生物。

复溶水解样品

要复溶干燥样品：

1. 在干净的自动样品器样品瓶中，加入 2.5 mL Milli-Q（或其它 18 MΩ 超纯水），再

加入 50 L 恒沸 HCl (6N)，制得 100 mM 的盐酸溶液。

2. 将样品溶解在根据附录 C 中的指导原则估算的溶液体积中。

3. 盖紧瓶盖，并进行彻底的涡旋混合。

要复溶样品，使其包含内标：

1. 在干净的自动样品器样品瓶中，加入 2.5 mL Milli-Q（或其它 18 MΩ 超纯水），再

加入 50 m L 恒沸 HCl (6N)，制得 100 mM 的盐酸溶液。

2. 将 20 µL 的 2.5 mM 内标储备液加入到 980 mL 的 20 M 盐酸中，从而制得内标溶液。

另请参阅：有关如何制备内标溶液的详细信息，请参阅第 4 -4 页。

3. 根据附录 A 中的指导原则估算的体积溶解样品。

4. 盖紧瓶盖，并进行彻底的涡旋混合。

衍生样品

要衍生样品：


2. 将样品、 AccQ•Tag Ultra 硼酸盐缓冲剂和中和试剂添加到完全回收样品瓶中。

要求：在整个衍生过程中，样品瓶都必须密封紧闭。

提示：

• 如果方便，可以在水解管中进行衍生。

• 根据附录 C 中的介绍，可以更改硼酸盐溶液体积对样品中和进行调节。

制备样品 4-7

3. 加入 20 L 的 AccQ•Tag Ultra 试剂，并立即涡旋混合几秒钟，然后等待 1 分钟。

结果：衍生反应完成后多余的试剂将水解为 AMQ，衍生反应终止。

4. 将管中物质转移到完全回收样品瓶中（如有必要）。

5. 将样品瓶置于恒温加热仪内，在 55 °C 下加热 10 分钟。

提示：通过加热可将酪氨酸的次要副产物转化为主要的单一衍生化合物。室温下转化反应发生得更为缓慢。

衍生空白样

确保所有的玻璃器皿都是干净的。将样品管置于 500 °C 下热解至少 4 个小时。

要衍生空白样：

1. 将 80 L AccQ•Tag Ultra 硼酸盐缓冲液转移到样品瓶中。

2. 加入 20 L 的 AccQ•Tag Ultra 试剂，然后进行涡旋混合。

3. 放置 1 分钟，让多余的试剂水解为 AMQ。

4. 在 55 °C 下加热样品瓶 10 分钟。


5 操作系统

要执行校正并开始采集数据，必须先准备系统并设置 Empower 软件。

内容：

主题页码

准备系统 5-2

设置 Empower 软件 5-6

打开 Empower 和还原项目 5-8

加载、编辑和运行样品组方法 5-9

处理数据 5-11

5-1

准备系统

设置流动相

请按第 4-1 页中所述制备洗脱液。

开启系统

要启动系统，必须打开工作站并接通系统模块的电源，每次启动都会连续发出三次蜂鸣声，然后运行一系列启动测试。

提示：如果系统中包括柱温箱，它会在启动样品管理器时自动启动。

另请参阅：第 5-3 页，获取有关如何根据指示器 LED 模式了解模块流量状态以及模块的电

源是否已经开启的信息。

要启动系统：

1. 打开系统的工作站。

2. 要启动溶剂管理器和样品管理器，请按下位于每个模块门左上角的电源开关。

3. 溶剂管理器和样品管理器的电源 LED 显示平稳的绿色后，按下位于检测器左上角的

电源开关。

要求：仅在流通池湿润后启动检测器。

4. 启动色谱数据系统软件。

提示：可以监视 ACQUITY UPLC 控制台中是否有信息和 LED 指示。

监视启动测试

启动系统的工作站时，会运行以下启动测试：

• CPU 板

• 内存（RAM 和 ROM）

• 外部通信系统（以太网）

• 时钟

如果启动测试指示有故障，请参阅 ACQUITY UPLC 控制台的在线帮助。

5-2 操作系统

监视系统模块 LED每个系统模块上的 LED 指示模块的运行状态。 LED 特定于相应的模块，因此其不同颜色

和模式的重要性在不同模块中可能会有所不同。

电源 LED位于模块前面板左侧的电源 LED 指示模块的电源打开或关闭状态。模块接通电源时，此

LED 为绿色，断电时 LED 熄灭。

提示：为保证充分通风，即使电源开关处于“off” （关）位置，样品管理器的冷却风扇也

会持续运行。只有从模块背面断开电源电缆后，这些风扇才会停止。

状态 LED

流量 LED （溶剂管理器）

流量 LED 位于四元溶剂管理器电源 LED 的右侧，指示流量状态。呈稳定绿色的流量 LED指示有液流通过四元溶剂管理器。

运行 LED （样品管理器）

运行 LED 位于样品管理器电源 LED 的右侧，指示运行状态。稳定绿色的运行 LED 指示

正在运行进样。

灯 LED （检测器）

灯 LED 位于检测器电源 LED 的右侧，指示灯的状态。呈稳定绿色的灯 LED 指示灯已点亮。

状态 LED 指示：

LED 模式和颜色说明

熄灭 • 溶剂管理器和样品管理器：指示模块当前处于空闲状态。

• 检测器：指示灯熄灭。

稳定绿色 • 溶剂管理器：指示溶剂正在流动。

• 样品管理器：指示模块在正常运行，正在完成任何未完成的样品或诊断功能请求。样品和诊断功能请求完成后， LED 恢复为熄灭模式。

• 检测器：指示灯已点亮。

准备系统 5-3

启用渗漏传感器

规则：如果事先未启用渗漏传感器，开启系统时，渗漏传感器的缺省状态将为禁用。

要启用渗漏传感器：

1. 在 ACQUITY UPLC 控制台中，选择“控制”>“渗漏传感器”。

“渗漏传感器”对话框：

2. 要启用各模块的渗漏传感器，请单击模块说明左侧的状态。

提示：要启用所有渗漏传感器，请单击“启用全部”。

闪烁绿色 • 溶剂管理器和样品管理器：指示模块正在初始化。

• 检测器：指示模块正在初始化或校正。

闪烁红色任何模块：指示因错误导致模块停止。有关错误的信息，请参阅 ACQUITY UPLC 控制台。

稳定红色任何模块：指示出现阻止进一步操作的故障。先关闭模块的电源，再重新接通电源。如果 LED 仍为稳定的红色，

请联系 Waters 服务代表。

状态 LED 指示：（续）

LED 模式和颜色说明

单击以启用或禁用各仪器的渗漏传感器

单击以启用或禁用所有仪器的渗漏传感器

5-4 操作系统

启动系统

更换流动相之后、更换样品针或者系统空闲一段较长时间（例如整夜）后，请使用“启动系统”功能灌注溶剂管理器。

在开始此步骤之前，请确保系统配置正确。另外，如果要改用其它溶剂（所含成分与系统中已有溶剂的成分不同），请灌注四元溶剂管理器至少 5 分钟。

要启动系统：

1. 在 ACQUITY 控制台中，单击“控制”>“启动系统”。

2. 在“系统启动”对话框的“灌注溶剂”选项卡中，查看以下溶剂的设置：A、 B、 C和 D。

提示：在“A/B/C/D 溶剂”区域中，可以选择或清除任意一种或所有溶剂。也可以更

改“灌注持续时间”字段中的设置。所有所选溶剂的灌注持续时间均相同。

3. 选择或清除密封清洗、清洗溶剂和清除溶剂的灌注。

4. 如有必要，可更改灌注密封清洗和清洗溶剂的指定持续时间以及灌注清除溶剂的指定循环次数。

缺省值：密封灌注 2.0 分钟，清洗溶剂灌注 15 秒，清除溶剂循环灌注 5 次。

5. 选择“平衡到方法”选项卡，查看最终流速、流动相、成分、温度和灯状态的设置。

6. 在“平衡到方法”选项卡中，根据需要更改这些值，使其满足平衡要求。

灌注参数值：

范围 0.1 到 60.0 分钟

缺省值所有溶剂分别灌注 2.0 分钟

建议灌注 3 分钟。更换溶剂后灌注 7 分钟。

“平衡到方法”选项卡的值：

系统启动参数缺省值允许的设置

方法初始流速 0.500 mL/min 0.1 至 2.0 mL/min

A、 B、 C 和 D 的组分

（总和必须为 100%）

A， 100%

B、 C、 D， 0%

A；0 到 100%

B；0 到 100%

C；0 到 100%

D；0 到 100%

柱温关取决于色谱柱室类型

准备系统 5-5

7. 如果更换了样品针，请单击“更改”。

8. 在“体积配置”对话框中，选择新的针尺寸，然后单击“确定”。

9. 单击“开始”。

结果：光学检测器中的灯点亮，系统软件将设置柱温和样品温度，并启动所有灌注操作。灌注后，样品管理器将定性针和密封（如果指定有此功能）。然后系统会将定性结果记录到数据库中。最后，系统软件将建立方法流速、溶剂选择和组分。

连接色谱柱

有关如何连接色谱柱的详细说明，请参阅第 2-11 页。

设置 Empower 软件

系统要求在尝试运行任何分析前必须要安装完整的 Empower 软件。如果还没有安装

Empower 软件，请使用 Empower 光盘进行安装，然后对其进行配置。

下列信息提供了使用系统直接开始的方法。有关对 Empower 功能和选项的完整讨论，请参

阅该系统附带的 Empower 软件文档。

样品温度开关，或 4.0 到 40.0 C（39.2 到 104 F）

灯开开或关

（对于光导流通池，当没有液流经过流通池或流通池处于干燥状态时，请勿打开、操作或点亮检测器的灯。）

“平衡到方法”选项卡的值：（续）

系统启动参数缺省值允许的设置

5-6 操作系统

Empower QuickStart 界面

QuickStart 是精简后的 Empower 界面，使用该界面可以轻松简便地运行样品。

QuickStart“项目”窗口包含三个主要视图区域。

QuickStart“项目”窗口

QuickStart“项目”窗口的视图区域：

窗口区域说明

导航条使用导航条（主窗口左侧的垂直面板）可选择与采集、处理、查看和报告色谱数据相关的任务和功能。

• 运行样品

• 浏览项目（样品队列、控制面板）

• 查看数据

• 查看方法（“方法组”、“仪器”和“处理”）

• 查看采集

• 演示（提供交互式帮助）

工作工作区位于导航条的右侧，显示用户在导航条中所选的内容。用户可在工作区中设置数据采集、查看数据、处理数据和预览报告。

查看采集在“查看采集”区域中，可以查看系统状态、当前采集以及相关的参数。该区域的左侧将提供多种工具，用于访问采集的相关功能；右侧显示色谱窗格，其中包括用于显示选项和访问“查看”窗口的工具。

Work AreaNavigation

Bar

ViewAcquisition

Work AreaNavigation

Bar

ViewAcquisition

查看采集窗口

导航条

设置 Empower 软件 5-7

打开 Empower 和还原项目

系统附带有系统光盘，其中包含有预定义的 Empower 项目和测试方法。有关文件说明，请

参阅光盘中的“自述”文件。

在实验室中启动 Empower 软件应用程序前：

1. 启动色谱模块，等待内部诊断测试完成。

2. 开启任意打印机或外围设备，然后开启计算机。

要启动 Empower：

1. 双击“Empower 登录”图标。

2. 在“登录”对话框中，输入用户名和密码。

要求：必须使用 QuickStart 界面。如果系统的缺省设置是 Pro 界面，请在“登录”

屏幕上单击“高级”并将 QuickStart 选择为操作界面。

系统管理员可以设置系统缺省值，以便用户不再选择界面。

3. 选择一个项目和系统，然后单击“确定”。

规则：“选择项目和系统”对话框中将仅显示您能够访问的项目和色谱系统。“UPLC氨基酸分析”色谱系统必须在安装时进行配置。如果没有配置任何系统，请咨询系统管理员。

4. 将 UPLC 氨基酸分析解决方案光盘放入驱动器。

5. 在 QuickStart 项目窗口中，选择“管理”>“还原项目”。

6. 在“还原项目向导”页面上，单击“浏览”。

5-8 操作系统

7. 指定系统中所用检测器的项目文件夹路径和实验室中使用的应用程序，然后单击“下一步”。

要求：如果要还原已经存在的项目，则必须创建一个新项目名。此外，如果要还原到

Empower 2154，系统会显示以下消息。显示消息后单击“确定”继续。

8. 当“还原显示”对话框中显示消息“导入已成功完成”时，单击“完成”。

9. 单击“管理”>“改变项目/系统”。

10. 选择“在该窗口切换项目 /系统”，从可用选项中选择适当的项目和系统名，然后单

击“确定”将新近还原的项目载入 QuickStart。

加载、编辑和运行样品组方法

样品组是通过运行样品组方法生成的数据文件的绑定组合。样品组方法是一组可重复使用的指令，为软件提供数据采集方式的信息。该信息包括样品瓶位置、进样体积、样品名称、方法组和样品类型等自定义字段。样品组方法还可包括有关打印摘要报告、清除报告、借助摘要功能执行自定义计算等等指令。

每个项目都提供了一个样品组方法示例。用户可以编辑样品表，使其与预期批次的标准样和样品相匹配。

要加载、编辑和运行样品组方法：

1. 单击 QuickStart 窗口工作区中的按钮，打开样品组方法示例。

或者：要进行进一步分析，单击“文件”>“新建样品组”>“使用样品组方法”。

提示：要打开之前修改的“样品组方法”，请选择适当的方法后，单击“打开”加载该方法。

注：“样品组方法”示例将采用以下参数设置：

• 一个 15 分钟的“平衡色谱柱”行设置，将在 25:25:25:25 A/B/C/D，流速 0.2 mL/min 的等度条件下平衡色谱柱，温度为方法规定温度，然后切换到分离

方法的初始条件。

加载、编辑和运行样品组方法 5-9

• 三个“平衡色谱柱”行设置，将运行用于样品分析的梯度方法，以便进一步准备用于分析的色谱柱。

要求：四个“平衡色谱柱”行设置对于保证样品进样的再现性十分必要。因而，必须将其保留在样品组方法中。

• 一个梯度空白的样品进样，用于测试流动相和样品制备溶剂的质量。

• 一个试剂空白的样品进样，用于测试衍生试剂的质量。

• 用于样品定量的 25 pmol 标准进样。

• 样品进样。

• 一个 15 分钟的“平衡色谱柱”行设置，用于准备系统以便短期关机。该方法将

熄灭检测器灯并关闭柱温箱。该方法将在 25:25:25:25 A/B/C/D 条件下将流速降

至 0.05 mL/min。（如果在分析结束时需要做长期储存，请将方法组更改为长期

停止方法。冲洗系统 15 分钟后，该方法将熄灭检测器灯并关闭柱温箱和泵。）

2. 在对样品组方法做任何修改前，请先重命名该方法并进行保存，确保所需信息不会被覆盖。

5-10 操作系统

3. 输入任何其它样品或标准样，分别指定参数，步骤如下：

• 要添加行，请右键单击某行，然后选择“插入行”或“添加行”。

提示：“插入行”功能将在光标位置处插入一行（前一行的副本）。

要求：“添加行”功能将在表格的底部添加一行。新行中的所有规格与原始行中的规格相同，仅样品瓶标识号除外。软件将递增新行中样品瓶的标识号。但请注意，软件不会更改新行下方所有样品的样品瓶标识号。用户必须对这些样品重新编号。

• 要删除行，请右键单击此行然后选择“删除行”。

4. 完成编辑后，请将更改保存到样品组方法。

要求：从光盘还原项目时，方法将被锁定以防止覆盖。因此必须采用其它名称保存样品组方法。

5. 从 QuickStart 窗口中工作区的顶部列表中选择“运行并报告”。

6. 通过单击“查看采集”区域中的图标或从 QuickStart 窗口顶部工具栏上选择

“进样”>“运行”，开始运行样品组。

7. 命名样品组，选择运行模式，然后单击“运行”。

处理数据

分析完成后，即可处理所得数据。 Empower 软件按照数据文件被选中的顺序处理数据文

件。因此从“通道”视图表选择文件时，必须先选择标准样，再选择未知样。

要手动处理数据：

1. 单击导航条中的“浏览项目”选项卡。

2. 在工作区的项目表中，单击“样品组”选项卡。

3. 单击待处理样品组的行号，然后单击“查看”>“通道”。

4. 在“通道”表中，双击样品查看要处理的数据。

结果：该数据文件将在工作区中按处理方法指定的格式打开：色谱、结果表或其它视图。

5. 在“查看数据”窗口的“窗口”菜单中，选择所需视图。

6. 在 QuickStart 窗口中，单击“文件”>“打开”>“处理方法”，然后单击所需的处

理方法，再单击“打开”。

处理数据 5-11

7. 单击“积分” 和“定量” 处理样品，或单击（或“校正” 处理标准样。

8. 单击“文件”>“保存”>“结果”保存处理后的数据。

要求：如果更改了处理方法，则必须将其另存为新的处理方法，才能保存结果。

批量处理数据

用于批量处理的两种方法为通道和样品组。

处理样品组会生成结果组，Empower 将采用相同于样品组的名称对其进行命名。Oracle 关系数据库将为这些组、单个进样、通道和结果指定标识（使每个都具有关联的日期和时间戳），确保其唯一性。

生成结果组的唯一方法是处理样品组。如果选择样品组内的所有单独通道并进行批量处理，则不会生成结果组。

要批量处理数据：

提示：Empower 软件按照数据文件被选中的顺序处理数据文件。从“通道”视图表选中文

件时，请务必在选择未知样前先选择标准样。

1. 单击导航条中的“浏览项目”选项卡，并在工作区的项目表中单击“样品组”选项卡。

2. 单击待处理样品组的行号，然后单击“工具”>“处理”。

结果：“后台处理和报告”对话框将提供以下方法组选项。

批量处理方法：

方法说明

通道处理通道表中的单个数据文件时，即使选择了样品组中的所有文件， Empower 软件仍会根据方法组或处理方法中的说明处

理文件。

样品组 Empower 软件将根据样品组方法中的说明处理样品组的数据

文件。

方法组选项：

选项说明

使用采集方法组采用收集数据所用的方法组处理样品组。

使用指定的方法组需要从组中选择方法组。

使用指定的处理方法需要从列表中选择处理方法。

5-12 操作系统

注：配有 PDA 或 FLR 检测器的系统可以采集 2D 或 3D 数据。系统光盘上提供的

方法仅指定了 2D 通道。“使用指定的处理方法”选项处理使用这些方法采集的数据。

如果创建了其它 3D 方法，则还必须创建一个定义提取波长和提取处理方法的方法组。

要求：如果要更改处理方法，则必须将新的处理方法添加到方法组中。这样可以确保

Empower 软件使用新方法进行批量处理。

3. 在 QuickStart 的“后台处理和报告”窗口中，确保始终选中“处理”复选框。

4. 从菜单中选择“使用指定的方法组”和方法组。

要求：如果该处理方法已有校正曲线，而您希望生成一条新的曲线，请选择“清除校正”。否则，标准样数据点将添加至现有的校正曲线。

5. 单击“确定”。

查看处理后的数据

要查看结果组：

1. 单击导航条中的“浏览项目”选项卡。

2. 在工作区的项目表中，单击“结果组”选项卡。

3. 单击待查看结果组的行号，然后单击“工具”>“查看”。

结果：“工作区”中将打开“查看”窗口，同时“结果组”树会显示在其左侧。

4. 使用“查看数据”窗口底部的“2D 通道”选项卡，选择和查看处理后的数据通道。

5. 查看峰表。

提示：

• 峰表包含选定通道中单个峰的信息，如保留时间、区域、含量和浓度等。

• 使用附带的 AAA 方法将不会出现 3D 通道。

生成报告

要生成报告：

1. 在导航条中，单击“浏览项目”选项卡。

2. 在工作区的结果表中，单击要为其生成报告的结果的行号。

3. 单击“工具”>“预览”。

4. 选择“使用以下报告方法”。

5. 选择附带的“常规”报告或已创建的其它报告，并单击“确定”。

6. 如果对报告的显示方式感到满意，单击“文件”>“打印”。

处理数据 5-13

5-14 操作系统

6 处理特殊样品

本章介绍如何分析特殊样品和制备标准储备溶液。请按照本章中所述过程制备执行分析所需的标准样，并将结果与提供的典型色谱图进行比较。

内容：

主题页码

分析蛋白质样品中的半胱氨酸 6-2

分析食品与饲料的营养成分 6-5

分析细胞培养基 6-8

6-1

分析蛋白质样品中的半胱氨酸

分析的半胱氨酸是蛋白质水解前进行还原反应和烃化反应所得的衍生物。公开的文献中提供有很多方案。AAA 系统为以下两种常见的衍生物提供了示例方法。羧甲基半胱氨酸是用

碘乙酸或碘乙酰胺经烃化反应得到的。酸法水解会将碘乙酰胺形成的氨基化合物转换为碘乙酸形成的相同游离酸。与乙烯基吡啶反应则生成吡啶乙基半胱氨酸。

分析样品

要分析这些样品，请针对所用的检测器类型选择包含“_AlkylatedCys...”的方法名称。

要分析样品：

1. 打开样品组方法并检查是否已指定以下条件：

• 进样体积 = 1.0 µL

• 运行时间 = 10.2 min

2. 打开“运行样品”中的样品组，选择样品组，然后选择“运行并报告”。

3. 样品组完成后，查看梯度性能报告。

4. 将报告中的色谱图与下面的样品色谱图进行比较。

典型色谱图将显示半胱氨酸、CM 半胱氨酸和 PE 半胱氨酸的洗脱位置。每个样品仅会出现

其中一种化合物。

6-2 处理特殊样品

示例色谱

使用推荐的 TUV 检测器设置所得 25 pmol 烷化半胱氨酸标准样结果：

使用推荐的 PDA 检测器设置所得 25 pmol 烷化半胱氨酸标准样结果：

0.10

0.05

0.00

0.00 2.50 5.00 7.50

min

AU

0.10

0.05

0.00

0.00 2.50 5.00 7.50

min

AU

分析蛋白质样品中的半胱氨酸 6-3

使用推荐的 FLR 检测器设置所得 25 pmol 烷化半胱氨酸标准样结果：

注：色谱图显示了 Waters 水解标准样中未包括的几种氨基酸的洗脱位置。

请根据下列表格制备所需的标准溶液。

烷化半胱氨酸储备标准样的制备：

氨基酸名称储备液浓度 (mM)0.1N HCl 的体积 (mL)

用量(mg)

羧甲基半胱氨酸

(CM Cys)

5 10 8.9595

吡啶乙基半胱氨酸或 S-[2-(4-吡啶基)乙基]-L-半胱氨酸 (PE Cys)

5 10 11.315

正缬氨酸 (Nva) 5 10 5.8575

烷化半胱氨酸，工作标准样的制备，所需体积：

所需浓度 (pmol/L) 所需体积 (μL)

250 1000

1600.00

800.00

0.00

2.50 5.00 7.50

min

EU

0.00


分析食品与饲料的营养成分

分析食品和饲料样品通常采用两种不同的样品制备方法。大多数氨基酸直接酸法水解后即可得到正确的结果。但含硫氨基酸最好采用过甲酸氧化反应转化为稳定的半胱氨酸和蛋氨酸砜。

分析样品

要分析两种样品类型，请针对所用的检测器类型选择包含“_Food_”的方法名称。食品分

析分离方法基于其它 AAA 方法中所用四种洗脱液的相同组合。有关如何分析特殊样品的说

明，请参阅第 6-2 页。

典型色谱图将显示半胱氨酸和蛋氨酸砜的洗脱位置。这些化合物绝不会在同一样品（如蛋氨酸和胱氨酸）中出现。色谱图还将显示牛磺酸、另一种内标 DL-2-氨基丁酸以及正缬氨酸

的洗脱位置。

烷化半胱氨酸，工作标准样的制备：

标准样名称要添加的体积 (μL) 实际添加的体积 (μL)

H 标准样 100 100

CM Cys 50 50

PE Cys 50 50

Nva 50 50

烷化半胱氨酸，工作标准样的制备，最终体积：

最终体积用量 (L)

储备液 250

要添加的稀释液体积 750


示例色谱

使用推荐的 TUV 检测器设置所得 25 pmol 食物与饲料标准样结果：

使用推荐的 PDA 检测器设置所得 25 pmol 食物和饲料标准样结果：

0.10

0.05

0.000.00 2.50 5.00 7.50

min

AU

0.10

0.05

0.00

0.00 2.50 5.00 7.50

min

AU


使用推荐的 FLR 检测器设置所得 25 pmol 食物和饲料标准样结果：



食品与饲料储备标准样的制备：


用量(mg)

半胱氨酸 (Cya) 5 10 8.458

牛磺酸 (Tau) 5 10 6.257

蛋氨酸砜 (MetSO2) 5 10 9.0605

-氨基丁酸或 2-1 氨基丁酸 (AABA) 5 10 5.156

正缬氨酸 (Nva) 5 10 5.8575

食品与饲料，工作标准样的制备，所需体积：


250 1000

1800.00

900.00

0.00

2.50 5.00 7.50

min

EU

0.00


分析细胞培养基

细胞培养基主要用于分析游离氨基酸。无需水解，但含有许多其它氨基酸。

分析样品

要分析细胞培养基样品类型，请针对所用检测器类型选择包含“_CellCult_”的方法名称。

细胞培养基分析分离方法基于其它 AAA 方法中所用四种洗脱液的相同组合。有关如何分析

样品的具体说明，请参阅第 6-2 页上的“要分析样品：”。

示例色谱

注：以下色谱图中标记的 y- 氨基丁酸 (GABA) 洗脱位置仅作参考用。此类特定细胞培养基

标准样的制备省略了 GABA。

食品与饲料，工作标准样的制备：


H 标准样 100 100

Cya 50 50

Tau 50 50

MetSO2 50 50

AABA 50 50

Nva 50 50

食品与饲料，工作标准样的制备，最终体积：


储备液 350



使用推荐的 TUV 检测器设置所得 25 pmol 细胞培养标准样结果：

使用推荐的 PDA 检测器设置所得 25 pmol 细胞培养标准样结果：

0.10

0.05

0.00

0.00 2.50 5.00 7.50

min

AU

0.10

0.05

0.000.00 2.50 5.00 7.50

min


使用推荐的 FLR 检测器设置所得 25 pmol 细胞培养标准样结果：



细胞培养基储备标准样的制备：


用量(mg)

羟脯氨酸或反式 -4- 羟基 -L- 脯氨酸(HyPro)

5 10 6.5565

天冬酰胺 (Asn) 5 10 6.606

牛磺酸 (Tau) 5 10 6.257

谷氨酰胺 (Gln) 5 10 7.307

y-氨基丁酸 (GABA) 5 10 5.156

5-羟基赖氨酸盐酸盐 (HyLys) 5 10 9.9325

-氨基丁酸或 2-氨基丁酸 (AABA) 5 10 5.156

鸟氨酸 HCl (Orn) 5 10 8.431

1600.00

800.00

0.000.00

2.50 5.00 7.50

min

EU

AU


正缬氨酸 (Nva) 5 10 5.8575

色氨酸 (Trp) 5 10 10.2115

细胞培养基工作标准样的制备，所需体积：


250 1000

细胞培养基，工作标准样的制备：


H 标准样 100 100

HyPro 50 50

Asn 50 50

Tau 50 50

Gln 50 50

GABA 50 50

HyLys 50 50

AABA 50 50

Orn 50 50

Nva 50 50

Trp 50 50

食品与饲料，工作标准样的制备，最终体积：


储备液 600


细胞培养基储备标准样的制备：（续）


用量(mg)



7 故障排除

系统出现故障时，必须系统地进行故障排除以便找出问题。

要排除与 ACQUITY UPLC H-Class 系统、 ACQUITY UPLC H-Class Bio 系统或

Empower 软件相关的具体故障，请参阅这些产品的相关文档。

内容：

主题页码

一般原则 7-2

色谱 7-3

衍生问题 7-7

7-1

一般原则

对 ACQUITY UPLC H-Class 和 H-Class Bio AAA 系统进行故障排除时，请遵守以下一般

原则：

• 详细定义故障：

– 完全无法分析

– 无法正确识别峰

– 定量问题（精确度或准确度差）

• 按照与安装时完全相同的方式运行标准样：

– 使用经过测试的新色谱柱

– 使用经过测试的瓶装洗脱液

• 评估标准样运行结果时，请遵循以下指导原则：

– 重复进样的保留时间必须相同

– 保留时间必须与方法中指定的时间相符

– 峰面积必须相同

– 峰面积必须与安装时的采集结果相符

– 将面积比率与安装结果相对比

警告：为避免接触（包括吸入）溶剂对人体造成危害，处理溶剂时请遵守“优良实验室规范”。参阅“材料安全数据表”了解所用溶剂的信息。

警告：为避免人员沾染生物危害性物质或有毒物质，执行维护步骤时务必戴上干净、耐化学物质的无粉手套。为避免污染扩散，请勿使用被污染的手套接触未被污染的表面，完成步骤后请立即扔掉手套。

7-2 故障排除

色谱

在参阅下文的故障排除表格前，请遵循以下指导原则：

1. 记录关键组分峰的保留时间：组氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和赖氨酸。

2. 考虑问题的可能原因。例如，模块无响应可能是电源或信号线缆未连接，或连接不正确。液体或真空渗漏可能说明管路或阀的连接有问题。

3. 查找未注意到的问题原因：

• 确认柱温箱是否运行正常。

• 确认系统反压是否适当。

• 用量筒确定流速。

• 确定梯度准确度。

• 如有必要，请执行色谱柱效率测试。

下表总结了最常见的色谱和保留问题。

色谱问题：

问题现象可能原因解决办法

所有峰的保留时间增加梯度错误请参阅梯度表。

强洗脱液的输送速率低确定流速和溶剂成分。

色谱柱温度低确认柱温箱的操作是否正确。

洗脱液输送速率低确定流速。

渗漏检查所有接头。

容器 B 中的洗脱液 B 稀释不正确

确定洗脱液 B 是否正确

稀释。

洗脱半胱氨酸前的峰保留时间增加

柱温过低确认柱温箱的操作是否正确。

所有峰的保留时间减少强洗脱液的输送速率过高确认泵的操作是否正确。

柱温过高确认柱温箱的操作是否正确。

峰保留时间的重现性差泵运行不稳定确定反压并灌注泵。

所有峰在空体积处或其附近洗脱

洗脱液已切换选择正确的洗脱液。

色谱 7-3

定量问题

有关样品量的详细说明及其它衍生化指导原则，请参阅附录 C。

所有峰变宽色谱柱效率低确定色谱柱是否合适，并根据需要进行更换。

系统谱带扩展过大诊断并降低由进样器、管路连接或检测器流通池引起的谱带扩展。

色谱峰的前半部分变宽，后半部分正常

色谱柱效率低确定色谱柱是否合适，并根据需要进行更换。

系统谱带扩展过大诊断并降低由进样器、管路连接或检测器流通池引起的谱带扩展。

进样体积过大将进样体积限制为 1.0 L。

色谱柱平衡不够使用指定方法的运行时间，以便充分平衡色谱柱。

样品溶液中有机组分的含量过量

严格遵循方案要求。

峰分裂偏早（特别是组氨酸）

进样体积过大将进样体积限制为 1.0 L。

定量问题：

问题可能的解决方案或怀疑的问题原因

衍生化的 pH 值太低；

仅未质子化的胺进行反应

• 天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和丙氨酸的产量所受影响最大

• 通常观察组氨酸和丝氨酸之间的单衍生物赖氨酸的峰

试剂不足，样品量过多 • 观测到的 AMQ 峰比 25 pmole/µL 的标准样所得峰小



试剂降解 • AMQ 峰与 25 pmol/µL 的标准样所得峰相同



色谱问题：（续）

问题现象可能原因（续）解决办法

7-4 故障排除

与试剂不足相关的问题 • 移液错误

• 混合不

与酸法水解相关的问题 • 色氨酸和半胱氨酸/胱氨酸分解

• 由于部分分解，酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸的回收率降低

• 由于释放缓慢，异亮氨酸和缬氨酸的回收率降低

• 由于氧化，蛋氨酸的回收率很低

• 天冬酰胺和谷氨酰胺水解为天冬氨酸和谷氨酸

注：本文档中介绍的大多数氨基酸水解步骤主要用于提高敏感性氨基酸或难释放氨基酸的回收率。任何一种水解步骤都不可能适用于所有氨基酸。

样品问题 • 氨基酸未完全溶于溶液

• 样品浓度估算不准确

样品洗脱液的定量效应，通常表现为先出的洗脱峰的比例或量增加，后出的洗脱峰的比例或量降低。

确定是否出现以下情况：

• 如果衍生样品中的有机物浓度太低，溶液中将生成更多的疏水性衍生物，进行分析时峰的大小将降低。如果加入的试剂太少就会发生这种情况。

• 如果样品洗脱液蒸发，溶液体积和乙腈浓度都将降低。由于溶液蒸发导致液体浓缩，先出的洗脱峰将更大。乙腈浓度降低时，溶解的物质会发生沉淀，导致后出的洗脱峰将更小。稀释液蒸发与样品瓶密封不完全、隔片预开口或者几小时后再从穿孔的样品瓶中执行进样有关。

污染下列任何因素都会导致污染：

• 实验室环境（实验室中可能具有较多的氨基酸和蛋白质源）。

• 各种来源的氨基乙酸。

• 皮肤中最丰富的丝氨酸。

• 来源于纸张的天冬氨酸盐和谷氨酸盐。

• 来源于皮肤的脯氨酸和羟基脯氨酸。

定量问题：（续）

问题可能的解决方案或怀疑的问题原因

色谱 7-5

衍生问题

衍生问题及解决方案：


无试剂峰，无氨基酸峰未加入试剂加入试剂，重新进样。

无进样操作排除自动样品器和进样器的故障，并根据需要进行维修。

检测器故障排除检测器的故障；根据需要进行维修。

无试剂峰，有氨基酸峰样品过多减少样品用量。

试剂不足减少样品用量。

试剂严重降解重配新试剂。

样品中天冬氨酸和/或谷氨

酸的含量较低，试剂峰面积 < 衍生空白中试剂峰面

积的 80%。

样品过多减少样品用量。


试剂降解重配新试剂。

峰分裂偏早（特别是组氨酸）

试剂用量过大重新制备衍生样品，使试剂含量低于最终样品组分的 20%。

色谱峰的前半部分变宽；后半部分正常。

出现较大的 AMQ 峰。

试剂过多重新制备衍生样品，使试剂含量保持在最终样品组分的 20%。

出现赖氨酸的单衍生峰，赖氨酸含量较低，试剂峰面积 < 衍生空白中试剂峰

的 80%

样品过多减少样品用量。


出现赖氨酸的单衍生峰，赖氨酸含量较低，试剂峰面积 > 衍生空白中试剂峰

的 80%

试剂降解使用新试剂

混合不确保试剂与样品充分混合，在加入试剂后立即进行涡旋混合。

样品中精氨酸、组氨酸和/或赖氨酸的含量较低；试剂峰正常

样品复溶不正确向样品中加入 100 mM HCl；充分涡旋混合。

7-6 故障排除

衍生问题

试剂不足

有关衍生化的指导原则，请参阅附录 C。样品中适当过量的试剂应产生一个 AMQ 峰，其面

积大于衍生空白中 AMQ 峰的 80%。

试剂不足对天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸的影响最大。赖氨酸的衍生化位置通常有两个（-氨基和侧链上的 -氨基）。如果试剂太少或样品太多，赖氨酸可生成一种或两种单衍生异构体。

这些单衍生物表现为组氨酸和丝氨酸之间的峰。

与试剂不足相关的问题包括：

• 样品过多。

• 移液错误。

• 试剂降解。

• 混合不。

样品过多

有关衍生化的指导原则，请参阅附录 C。

样品中天冬氨酸和/或赖氨

酸的含量较低；试剂峰正常

样品缓冲不正确（因为有盐存在）

• 样品除盐

• 限制样品量

• 按附录 C 所述进行

中和。

水解步骤使用的盐酸过多衍生前中和盐酸。

大多数或所有氨基酸的衍生效果差，加入试剂后样品变黄

样品缓冲不正确（因为有盐存在）， pH 值呈酸性

• 样品除盐或限制样品量


中和。

水解步骤使用的盐酸过多 • 衍生前进行中和


中和。

衍生试剂已过期按说明重新制备 AccQ•Tag Ultra。

衍生问题及解决方案：（续）


衍生问题 7-7

移液错误

如果转移的试剂量过少，则会产生与样品量过多时相同的问题现象。缓冲液太多会降低有机物的浓度，导致大部分疏水性衍生物沉淀。

试剂降解

尽管试剂降解可产生正常大小的 AMQ 试剂峰，但氨基酸收率则可能较低，而且有可能观察

到一个或两个赖氨酸单峰。降解的原因可能是保存不当造成试剂的水解。严重水解的试剂完全不产生 AMQ 峰。

混合不匀

向每个样品中添加试剂后，应立即混合。请勿在整个样品组试剂添加完毕后才进行混合。添加试剂后混合不充分可能导致试剂在与样品溶液完全接触前水解。

样品复溶

水解后，碱性氨基酸对样品管玻璃具有较强的亲和性。为确保有较好的回收率，请使用100 mM HCl 复溶样品。

缓冲液

“ACQUITY UPLC H-Class AAA 系统”与很多常用的缓冲液盐类和去污剂相兼容。但是，

在某些盐存在的情况下， HCl 水解会生成非挥发性酸，这些酸无法用衍生缓冲液进行有效

缓冲。

为确保充分衍生，样品的 pH 值必须在 8.2 到 10 之间。如果 pH 值低于 6，加入试剂则可

使溶液变黄，而且衍生效果极差。为克服非挥发性酸的缓冲容量，应进行样品除盐操作或增加缓冲液的用量。

• 如果增加缓冲液的体积，则应同时增加试剂的用量以使试剂的浓度维持在 20 % （体

积比）。pH 值始终偏高（如碱性水解后）会清除或破坏试剂。请遵循附录 C 中的中

和指导原则进行操作。

7-8 故障排除

A 安全忠告

Waters 仪器会显示危险符号，这些符号用于警示用户操作和维护仪器过程中的潜在

危险。这些仪器的相应用户指南中也包含这些危险符号，并带有介绍这些危险以及告诉您如何避免这些危险的文字说明。本附录介绍的所有安全符号和说明适用于整个Waters 产品线。

内容：

主题页码

警告符号 A-2

注意事项 A-4

适用于所有 Waters 仪器的警告 A-5

电气和搬运符号 A-6

A-1

警告符号

警告符号提醒用户注意与仪器的使用或不当使用相关的死亡、伤害或严重不良生理反应的危险。安装、维修和操作 Waters 仪器时，请注意所有警告。对于安装、维修或操作仪器的

人员不执行安全预防措施而导致的后果， Waters 不承担任何责任。

特定任务的危险警告以下警告符号提醒用户注意可能在仪器或仪器组件的操作和维护过程中出现的危险。此类危险包括烧伤、电击、紫外线辐射暴露以及其它危险。

当以下符号出现在手册的叙述或步骤中时，其附带的文字指明了具体的危险并说明了避免的方法。

警告：（常规风险。当此符号显示在仪器上时，请在使用仪器前参考仪器的用户文档以查看重要的安全信息。）

警告：（接触过热表面的灼伤危险。）

警告：（电击危险。）

警告：（火灾危险。）

警告：（尖头刺伤的危险。）

警告：（手部挤压受伤的危险。）

警告：（暴露于紫外线辐射的危险。）

警告：（接触腐蚀性物质的危险。）

警告：（暴露于有毒物质的危险。）

警告：（人员暴露于激光辐射下的危险。）

警告：（暴露于可造成严重健康威胁的生物制剂的危险。）

警告：（倾倒危险。）

警告：（爆炸危险。）

A-2 安全忠告

特定警告

以下警告可能出现在特定仪器的用户手册中，以及粘贴在这些仪器或其组件上的标签中。

爆裂警告

该警告适用于安装有非金属管的 Waters 仪器。

质谱仪易燃溶剂警告

该警告适用于使用易燃溶剂进行操作的仪器。

质谱仪电击危险

该警告适用于所有 Waters 质谱仪。

该警告应用于处于运行模式下的特定仪器。

警告：压力密封的非金属或聚合物管材可能爆裂。在此类管材周围工作时，请遵守以下预防措施：

• 佩戴护目镜。

• 熄灭附近所有明火。

• 请勿使用（曾经）受压或弯曲的管材。

• 请勿使非金属管材接触不相容的化合物，比如四氢呋喃 (THF) 和硝酸及硫酸。

• 请注意，某些化合物（例如二氯甲烷和二甲基亚砜）会导致非金属管材的膨胀，膨胀管材的抗压能力显著降低，更容易破裂。

警告：如需使用大量的可燃溶剂，必须不断向离子源中通入氮气流，以避免封闭空间起火。

在应用易燃溶剂进行分析时，应确保氮气供应压力不低于 690 kPa （6.9 bar，100 psi）。同时应确保将一个供气失败接头连接到 LC 系统，使 LC 溶剂流在氮气供

应失败时停止。

警告：为防止电击，请不要取下质谱仪的保护面板。保护面板内的组件不需要用户维护。

警告：在运行模式下，质谱仪外表面某些区域可能存在高压。为防止非致命电击，在接触标有此高压警告符号的区域前，请确保仪器处于待机模式。

警告符号 A-3

生物危害警告

该警告适用的 Waters 仪器用于处理可能造成生物危害的材料：含有能对人体造成危害的生

物制剂的物质。

化学危险警告

该警告应用于可处理腐蚀性、有毒、易燃或其它类型的危险材料的 Waters 仪器。

注意事项

在使用或不当使用仪器或设备可能会对其造成损坏或影响样品完整性的位置，将标有注意事项。惊叹号及其相关说明文字将提醒用户此类风险。

警告：Waters 仪器和软件可用于分析和处理潜在传染性人体来源产品、失去活性的微生物和其它生物材料。为避免这些制剂造成传染，应将所有生物液体都视为具有传染性，遵守“优良实验室规范”并就有关正确使用和处理的方法咨询所在组织的生物危害安全代表。最新版本的美国国家卫生研究院 (NIH) 出版物 Biosafety inMicrobiological and Biomedical Laboratories (BMBL)（《微生物及生物医学实验室生物安全规范》）介绍了具体的防范措施。

警告：Waters 仪器可用于分析或处理具有潜在危险性的物质。为避免任何此类物质造成的伤害，应熟悉这些物质及其危险性，遵守“优良实验室规范 (GLP)”，并就有关正确使用和处理的方法咨询所在组织的安全代表。最新的“国家研究委员会”出版物 Prudent Practices in theLaboratory: Handling and Disposal of Chemicals （《实验室谨慎操作：化学物质处理与处置》）为此提供了指导原则。

注意：为避免损坏仪器外壳，请勿使用磨蚀性材料或溶剂进行清洗。

A-4 安全忠告

适用于所有 Waters 仪器的警告

操作本设备时，请遵守标准质量控制程序以及本部分提供的设备指导原则。

注意：未经有关法规认证部门明确允许对本设备进行的改变或改装，可能会使使用者丧失操作该设备的合法性。

警告：当有压力的情况下使用管线时，小心注意以下几点：

• 当接近有压力的聚合物管线时一定要戴防护眼镜。

• 熄灭附近所有的火焰。

• 不要使用已经被压瘪或严重弯曲的管线。

• 不要在非金属管线中使用四氢呋喃或浓硝酸或浓硫酸。

• 要了解使用二氯甲烷及二甲基亚砜会导致非金属管线膨胀，大大降低管线的耐压能力。

警告：使用者必须非常清楚如果设备不是按照制造厂商指定的方式使用，那么该设备所提供的保护将被削弱。

适用于所有 Waters 仪器的警告 A-5

电气和搬运符号

电气符号

这些符号可能显示在仪器的用户手册中，以及仪器的前后面板上。

电源打开

电源关闭

待机

直流电

交流电

保护性导线端子

框架或底盘，接线端

保险丝

回收符号：请勿丢弃于城市垃圾中。

A-6 安全忠告

搬运符号

这些搬运符号及其相关文字说明可显示在 Waters 仪器和组件的发货外包装标签上。

向上！

防潮！

易碎！

请勿用钩！

电气和搬运符号 A-7

A-8 安全忠告

B 结构材料和兼容溶剂

警告：为避免质谱仪中源排放系统未完全密封导致的相关危险，请立即解决所有溶剂相关的问题。

内容：

主题页码

防止污染 B-2

接触溶剂的物品 B-2

用于制备流动相的溶剂 B-3

B-1

防止污染

有关防止污染的信息，请参阅《控制 LC/MS 系统中的污染》，部件号 715001307ZH。可

在 http://www.waters.com 找到此文档；单击 Services and Support（服务和支持），然后

单击 Support Center （支持中心）。

接触溶剂的物品

下表所示的物品可接触溶剂。如果您的应用中使用的溶剂不同于这些物品通常所使用的溶剂，则必须评估安全问题。有关用于制备流动相的最常见成分的详细信息，请参阅第 B-3 页。

接触溶剂的物品：

物品材料

APPI 灯驱动装置：

安装轴不锈钢

推斥电极不锈钢

绝缘体 PEEK

灯窗口氟化镁

自动调谐样品瓶 HDPE

电晕放电针安装接头 PEEK

排气口铝

气体管 FEP

离子源不锈钢

固定离子源的法兰盘 PEEK

隔离阀镀金铝/青铜

O 形圈 Viton® 或 PTFE 密封 Viton

探头调节器的喷气管 PTFE/Viton

探头调节器装置阳极氧化铝、玻璃填充的乙缩醛和不锈钢

探头轴 PEEK

插入式气体接头镍/黄铜

溶剂废液/渗漏管理 Tygon 管

源封闭镀铬铝

源封闭查看端口硬质玻璃板

B-2 结构材料和兼容溶剂

用于制备流动相的溶剂

以下列表包括用于制备反相 LC/MS (API) 流动相的最常见成分：

• 水

• 甲醇

• 乙腈

• 甲酸 (< 0.1%)

• 乙酸 (< 0.1%)

• 三氟乙酸 (< 0.1%)

• 乙酸铵 (< 10 mM)

• 甲酸铵 (< 10 mM)

这些溶剂不会导致第 B-2 页中所示的材料出现任何问题。

废液瓶聚丙烯

废液瓶插入式接头 NBR、 SST、 PBT 和 POM

接触溶剂的物品：（续）

物品材料

用于制备流动相的溶剂 B-3

B-4 结构材料和兼容溶剂

C 衍生化指导原则

AccQ•Tag™ 衍生试剂将与初级和次级氨基进行快速反应（在数毫秒内）。除污染因

素外，用户可对反应相关的所有其它因素进行系统控制。

内容：

主题页码

简介 C-2

估算水解中的样品量 C-3

估算用于衍生化的样品量 C-5

估计中和要求 C-8

确认已有足够的试剂 C-8

计算关系 C-9

示例 C-10

C-1

简介

系统计划氨基酸分析的主要关注点在于将样品溶解到可以进行分析的氨基酸溶液内。为此，必须确定执行的应用是针对游离氨基酸（即，游离在溶液中的氨基酸）还是结合氨基酸（即，结合在蛋白质中的氨基酸）。

游离氨基酸样品通常只需要执行稀释步骤。但在一些实例中，可能需要进行脱蛋白。结合氨基酸样品需要破坏肽键，以便游离出氨基酸进行分析。要水解蛋白质样品，估算时就必须考虑中和缓冲液以及固体。

酸法水解是制备氨基酸样品最常用的方法。用户必须估算待添加样品和酸的含量，并遵循以下指导原则：

• 水解过程中必须添加有至少 2 μg 的蛋白质，以便将污染的影响降到最低。

• 不可添加过多的固体物质，因为蛋白质或非蛋白质物质会干扰肽键的暴露，导致水解不完全。AOAC 有关饲料中氨基酸的公告方法 (994.12) 建议每毫升酸添加总共约 8 mg固体。

• 水解中酸的净浓度必须为大约 6N。

• 液体水解时酸的重量必须比样品过量 10 - 100 倍。

• 如果样品中有缓冲液，请确保酸量比可滴定缓冲液过量约 25 倍摩尔数。

• 如果除了蛋白质外样品中还有其它固体，则必须将这些重量加入以固体 / 每体积酸计

的蛋白质浓度中。

• 建议在水解之前加入内标物 (NVa)。如果合适，可在样品制备期间加入内标物，或将

其加入到即将添加至水解管的酸中。通常情况下，用户会计算内标物用量，使其与用于校正的标准样用量相匹配。

• 必须将苯酚加入水解所用的酸中，充当去氧剂。

AccQ•Tag™ 衍生试剂将与初级和次级氨基进行快速反应（在数毫秒内）。过量试剂与水的

反应较慢，水解时间为几十秒钟。衍生化过程中，只有少数几种情况会导致氨基酸分析结果不准确：

a. 试剂仅与未质子化的胺反应，因此 pH 值必须在 pH 8 和 10 之间。

b. 必须有足够过量的试剂，才能完成衍生反应。

c. 衍生混合物中的有机物浓度必须足够高以维持溶液中的试剂和衍生物，但不能高到使色谱发生歪曲。

d. pH 值不得过高或过低，以免破坏试剂。

e. 氨基酸浓度必须高于所需的灵敏度限值。

f. 样品不得被氨基酸、蛋白质或外界的其它胺污染。

设计氨基酸分析有三个步骤。

C-2 衍生化指导原则

要设计氨基酸分析：

1. 估算可正常定量且不超出方法限值的给定样品最低量。

2. 估计中和要求。

3. 确认已有足够的试剂。

估算水解中的样品量

除非样品量受限，否则需水解 20 μg 蛋白质。此用量能够合理地确保不对环境产生明显的污

染，且 6 × 50 mm 管内没有过多的固体物质。

必须使样品发生气相水解或液相水解。对少量纯蛋白质进行分析时，气相水解方法更适用。但该方法不适用于水解复杂样品，因为此类样品中通常存在有其它固体物质。

要估算水解中的样品量：

1. 请根据需要，按照以下指导原则在水解之前稀释样品：

• 向水解管中添加至少 10 μL 的样品。

• 水解所用蛋白质不超过 25 μg。

• 确保液体水解中酸的重量比固体过量约 100 倍。

• 确保样品中酸比缓冲液过量 25 倍摩尔数。将磷酸盐缓冲液的摩尔数乘以 3 计算

三个可滴定的基团。

• 水解的总体积不应超过水解管或容器总容量的 50%。对于 6 × 50 mm 管，推荐

的最大体积为 100 μL。

2. 包含如下例所推荐的酸和内标物体积。向水解管中添加至少 10 μL 的样品。对于以

5 mg/mL 浓度溶于 150 mM NaCl 中的蛋白质，水解管中添加的 10 μL 样品将需要

50 μg 蛋白质。

示例：

– 样品的基质中存在有其它固体。

样品

总固体

μLμg1 3.8

μm olN aC lμg5 8.4 4

μLN a C lμmo l0 .1 5

μL1μg5

样品样品

蛋白质

稀释5:1μg5μL

μL20μg20

蛋白质

样品

所需体积

所需蛋白质

估算水解中的样品量 C-3

3. 将样品分配至水解管：

a. 分配在水解管中水解和衍生约 2 μg 蛋白质所需的体积，或者分配大量样品（最

多 25 μg 蛋白质）并使用足够体积的 0.1N HCl 进行复溶，以便转换约 0.2 μg的蛋白质（理想情况为 10 μL）进行衍生化。

b. 对于气相水解，请干燥样品，使其在管底部形成薄膜。

注：可采用多种方式制备和分配内标物：

– 可在样品中进行制备（使其随样品一起分配）。

– 可在酸中制备（使其随酸一起分配）。

– 可以不与样品一起添加。

示例：对于以 5 mg/mL 浓度溶于 150 mM NaCl 中的蛋白质，水解管中添加的 10 μL样品需要 50 μg 蛋白质。样品的基质中存在有其它固体。

4. 将酸添加到水解环境中：

• 气相：将含有 0.1 – 0.5% 苯酚的 200 μL 6N HCl 添加到水解容器的底部。

• 液相：

– 确保最终酸浓度为 6N （加入苯酚）。

– 确保有足够过量（约 25 倍）摩尔数的酸来中和缓冲液。

– 确保酸的重量大大超过固体总重量（约 100 倍）。在此估算中包含样品基

质和其它固体，以及蛋白质。

示例：对于以 2.1 mg/mL 的浓度溶于 2mM Na/K2PO4 中的蛋白质。

;

分配分配

复溶水解

复溶水解

衍生溶液

衍生溶液

所需

μLISpmol1250

μL 20μL100

μL 10μL 100

μLISpmol25

分配分配 mLNVamg0.146

mLμL10

pmol10mmol

NVammolNVamg117.15

μLNVapmol1250 3

9

管

缓冲酸

管

分配

分配可滴定基团

分配

缓冲酸 nmol30μL 10μL

nmol63

μLnmol2

管管

缓冲酸 HClμmol0.7525

nmol30

（中和缓冲酸所需量）管

分配

管

HCl6MμL0.125HClμmol6

μLHClμmol0.75


;

5. 执行水解后的步骤：

a. 如果出现大量颗粒或漂浮的油脂，请将水解液进行离心处理。

提示：此操作便于提取等分的纯水解产物。

b. 为更好地定量，请在对样品执行衍生化之前进行干燥和复溶。

提示：这样可以避免水解过程中因蒸发或冷凝引起的体积变化。

估算用于衍生化的样品量

以下是样品浓度的典型表示方式：

• mg

• pmol-nmol-µmol

• mg/mL

• pmol-nmol-µmol/µL-mL

• µM （微摩尔，即 μmol/L）

• %

• mg%

对于色谱柱，氨基酸分析仪的灵敏度和线性范围的典型表示方式为 pmol。

固体分配分配分配分配

蛋白质μg24.9μL10)

μLPOKμg0.17317

μLNaμg0.02299

2()μLμg2.1

( 42

管管

固体 HClμg2490100

μg24.9

（所需超过固体的量）管管

HCl6MμL11.4HClμmol6

μLHClμg36.46

HClμmolHClμg2490


要估算用于衍生化的样品量：

1. 按以下原则，从 Waters AccQ•Tag Ultra 试剂的已知特征开始：

– 确保色谱柱上已有 50 fmol （定量限）的任意氨基酸。色谱柱上的量等于

或大于 1 pmol 时，可以获得最佳的定量效果。

– 定量上限由检测器属性（而非试剂过量）决定。

– 衍生化的推荐总体积为 100 µL。

– 最大进样体积为 1 µL。

– 色谱柱上的理想进样体积为 20 ng 蛋白质。

2. 使用氨基酸（标准样或样品）的初始浓度确定衍生的氨基酸总量。用于描述氨基酸分析色谱的量指的是各个单峰的量。可用下表作为参考：

3. 根据以下比例关系，将样品浓度以氨基酸的皮摩尔数表示：

– 样品浓度通常为蛋白质浓度。

– 蛋白质的总量为所有氨基酸的总量之和。

– 蛋白质水解可产生 16 种氨基酸。

– 将蛋白质的总量除以 16，得到每种单个氨基酸的量。各种氨基酸的含量不

可能完全相等，因此含量最低的氨基酸会低于样品中总蛋白含量的 1/16。含量最低的氨基酸用于确定浓度的下限。

– 如果已知特定样品的氨基酸组成，可用含量最低的氨基酸残基数除以总的氨基酸残基数。（进行计算时，应排除不稳定的氨基酸：色氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸。）将蛋白质的量乘以这一因子，即可估算出含量最低的氨基酸含量。

– 在没有提供任何其它信息的情况下，含量最低的氨基酸可估计为总氨基酸含量的 2-4%。将蛋白质的量乘以 0.03，即可估算出含量最低的氨基酸含量。

氨基酸浓度：

色谱柱上的皮摩尔数[pmol/µL （在最终衍生样品中） ]

衍生物的皮摩尔数氨基酸溶液的初始浓度[衍生 10µL]

0.05 5 0.5 pmol/µL

0.50 50 5.0 pmol/µL

1.00 100 10.0 pmol/µL

10.00 1,000 100.0 pmol/µL

25.00 2,500 250.0 pmol/µL

50.00 5,000 500.0 pmol/µL


4. 按以下示例所示执行样品计算。

示例：对于蛋白质浓度为 1.0 mg/mL 的样品（含量最低的氨基酸为 0.03 mg/mL），

将氨基酸的单位转化为 mol。

注：蛋白质中氨基酸残基的平均分子量为 110。

• 计算色谱柱上含量最低的氨基酸（将产生 1 pmol）最终体积。因为标准目标进样

量为 1 µL （总体积为 100 µL），所以注入 100 pmol 估算为含量最低的氨基酸。

• 由于难以准确吸取 0.37 µL，可使用方便的方法稀释样品。例如，可以准确吸取

10 µL。因此，可以用 10 µL （可吸取的量）除以 0.37 µL （要求的量），求得

结果需稀释 27 倍。然后准确吸取 5 µL 样品，并用 0.1M HCl 稀释 27 倍，即可

准确吸取 10 µL 注入反应样品瓶中。

或者：在之前的计算方法中，将质量/体积单位转换为摩尔量/体积单位。要使用

其它单位确定含量最低的氨基酸，请遵循以下指导原则：

– 已知蛋白质的分子量时使用 pmol/µL、nmol/µL、mmol/µL、µM/L，由此

可计算出氨基酸的量。1 mol 蛋白质中即有该摩尔数的氨基酸。1 mol 蛋白

质通常由几百摩尔的氨基酸组成。如果是未知的蛋白质，可假定分子量为55,000，且含有 500 个氨基酸（总量）。估算分子量的误差因子不会超出

3（左右）。同样，对于未知蛋白质，假定含量最低的氨基酸占总量的 3%。

– 执行与前一例中所述相同的计算，确定含量最低的氨基酸。但请注意，必须尽可能精确地定义单位。百分比通常表示为 g/100g 或 g/100mL。毫克百

分比 (mg%) 是一种常用于表示蛋白质的不精确用法。因为分子量过高，通

常会将单位定义为 mg/100g。

pmol/ μm 270μL 10

ml 1mg 10

gm 1mol

pmol 10 AAgm101.1

mol AA 1mL

mg 10333

12

2

2

μL 0.37pmol 270μL 1

pmol 100


估计中和要求

AccQ•Tag™ 衍生化学品需要 pH 值为 8-10 的未质子化胺。中和酸性样品可确保 pH 维持

在可接受的范围内。

注意事项

以下原则为通用原则，适用于任何浓度和任何酸。但必须与相同体积的相同浓度相匹配。

估计中和需求时，请遵循以下指导原则：

• 如果氨基酸溶液是溶解在 0.1M HCl 中，则可在衍生混合物中使用 10-20 µL 样品，

而不会有 pH 值过低的危险。选择以下公式之一测量衍生试剂：

– 10 µL 样品： 70 µL 硼酸盐： 20 µL 试剂

– 20 µL 样品： 60 µL 硼酸盐： 20 µL 试剂

确保可用的试剂未超过下述范围。

• 如果氨基酸溶液未溶解于 0.1M HCl 中，且初始溶液的酸浓度较高，则使用相同体积

和浓度的氢氧化钠对溶液进行中和。

– 可在衍生过程中通过在反应样品瓶中混合这些试剂来对样品进行中和。为此，将

10 µL 的 6M HCl 样品溶液、 10 µL 的 6M NaOH、 60 µL 硼酸盐和 20 µL 试剂相混合。或者可以通过混合以下试剂，将中和样品与衍生反应分开进行：将500 µL 的 6M HCl 样品溶液与 500 µL 的 6M NaOH 混合。然后，必须按照中

和要求初始步骤中所述的方式测量衍生试剂。

确认已有足够的试剂

AccQ•Tag 衍生化学品与其它衍生反应相似。必须有过量的试剂与可衍生的基团进行反应。

通常， AccQ•Tag 试剂应比可衍生胺的总量过量 2-5 倍摩尔数。

注： AccQ•Tag 标准试剂样品瓶包含 3-4 mg 试剂，大约相当于 10-14 µmol 试剂。将试剂

溶解于 1 mL 乙腈中，每 100 µL 衍生反应使用 20 µL。因此，每个反应容器中含有 210-280 nmol 衍生试剂。

要确认有足够的试剂：

1. 确保每个反应样品瓶中的总胺不超过 40-140 nmol。

2. 通过首先确定“氨基酸浓度：”表中所述任意给定氨基酸在色谱柱上的皮摩尔数，估算可衍生胺的总量。标准样中有 17 种可衍生组分，且进样量为衍生量的 1/100。因

此，将其乘以 1700 即可估算可衍生胺的总量。


3. 确保试剂比可衍生的基团过量 2-5 倍摩尔数。 25 pmol 标准样的胺总量为 42.5 nmol，处于试剂过量的安全范围内。

4. 对于蛋白质样品，估算所需的过量试剂要求时应考虑样品重量和氨基酸平均重量。

示例：

在此例中，对灵敏度要求的最小量进行估算，结果相等于约 1/3 µL 样品，因此胺的

总量在要求的试剂过量范围之内。

计算关系

1 g = 103 mg = 106 µg

1 L = 103 mL = 106 µL

1 mol = 103 mmol = 106 µmol = 109 nmol = 1012 pmol

计算成分未知的蛋白质样品时，按以下原则进行样品估算：

• 蛋白质的平均分子量 =

• 蛋白质平均包含 500 个氨基酸。

• 氨基酸的平均分子量 =

• 确定蛋白质中含量最低的氨基酸的量时，估算蛋白质总量的 3%。

• “% 溶液”表示 g/100 g 或 g/100 mL

• “mg% 溶液”表示 mg/100 g 或 mg/100 mL（如果未提供密度，则假定密度 = 1）。

nmol/μm 9.1μL 10

ml 1mg10

gm 1molnmol 10

gmAA 101.1mol AA 1

mLmg 1

33

9

2

lnmol 3.3μL 10μL140μL 5

μLnmol 9.1

稀释液稀释液

储备液

储备液

Lg MW

mol1为单位）（以

pLpmol1

nLnmol1

μLμmol1

mLmmol1

Lmol1

M1 溶液

molg55,000

molg110

计算关系 C-9

示例

已知成分样品，浓度为 mg/mL• 缓冲液配方中 1.00 mg/mL 肌红蛋白

• 分子量为 16,700

a 由于水解时会被部分或完全破坏，因此不能作为估算灵敏度要求的最低含量。b 由于水解时会转化为谷氨酸和天冬氨酸，因此在确认含量最低的氨基酸时，应首先将酸和氨基化合物加在一起。

缓冲液配方：

配方分子量 (mg/mL) (M)

蔗糖 25

氯化钠 58.44 0.15

磷酸钠、一元碱、一水合物

137.99 0.025

磷酸钠、二元碱、无水 141.96 0.25

Tween 80 0.10

肌红蛋白的氨基酸残基：

丙氨酸 15 a半胱氨酸 0 天冬氨酸 8 谷氨酸 13

苯丙氨酸 7 甘氨酸 15 组氨酸 11 异亮氨酸 9

赖氨酸 19 亮氨酸 17 a甲硫氨酸 4 b

天冬酰胺 2

脯氨酸 4 b谷氨酰胺 6 精氨酸 2 丝氨酸 5

苏氨酸 7 缬氨酸 7 a色氨酸 0 酪氨酸 2


估算水解中蛋白质的量

要估算水解中蛋白质的量：

1. 计算样品中的总固体。

2. 计算水解管中的总固体。

3. 计算分散固体所需酸的最低量。

4. 将最低 HCl 要求转换为摩尔表达式。

5. 计算中和缓冲液所需酸的最低量。

样品样品 μLNaClμg8.77

NaClμmolNaClμg58.44

μLNaClμmol0.15

样品

配方固体

样品

蔗糖

样品

吐温

样品 μLμg33.87

μLμg25

μLμg0.10

μLNaClμg8.77

样品

总固体

样品

配方固体

样品

肌红蛋白

μLμg34

μLμg33.87

μL1μg1.00

总固体所需体积样品

总固体μg680μL20

μLμg34

HClμg680010μg680 倍过量酸总固体

HClμmol186.5HCl36.46μ

HClμmolHClμg6800

g

缓冲酸样品

μg103310PONaHμmol

PONaHμg137.99μL

PONaHμmol0.025

42

4242

缓冲酸样品

μg106310NaHPOμmol

NaHPOμg141.96μL

NaHPOμmol0.025

4

44

HClμg522525μg209 倍过量酸总缓冲酸

示例 C-11

6. 将最低 HCl 要求转换为摩尔表达式。

7. 计算添加至水解过程的最小酸体积。

估算衍生化的样品量

要估算衍生化的样品量：

1. 计算溶液中含量最低的氨基酸 (LAAA)

示例：精氨酸 (Arg)

提示：

• 目标 100 pmol 含量最低的氨基酸是近似值，可以相应地增加以使用整数值。

• 添加 100 µL 0.1M HCl 仍处于方法的线性工作范围之内。

HClμmol143.3HClμg 36.46

HClμmolHClμg5225

HClμL15.5

HClμLHClμmol12HClμmol186.5

HCl6N~μL35.5μL20HCl12NμL15.5 样品

1.34%100AA149Arg2

总残基

残基

样品样品 mLArgmg0.0134

0.0134mL

mg1.00

样品样品 μLArg85.9pmol

μL101ml

mg101gm

molpmol10

Arggm156.19Argmol1

mL1Argmg101.34

33

122

管管

Argpmol1718μL20μL

Argpmol85.9

管管

μL171.8pmol100μL10pmol 1718


pH 值

要求出最终 pH 值：

1. 计算稀释液的最终酸浓度。

提示：

• 因为最终的酸浓度大于 0.1 M HCl，所以需在衍生混合物中加入等体积的 2.5 MNaOH。

• 蒸发干燥水解产物，然后使用 100 µL 的 0.1 M HCl 进行复溶是合理的。

• 硼酸盐体积必须进行相应的调整。因此，在加入衍生试剂之前，应将 10 µL 样品和

10 µL 2.5M NaOH 与 60 µL 硼酸盐缓冲液相混合。

过量试剂的估算

要估算过量试剂：

1. 计算反应容器中的氨基酸总量。

结果： 18 nmol 远低于 140 nmol 的限制。

未知成分样品的示例，浓度为 mg/mL示例：对于以 11.2 mg mAb/mL 的浓度溶解在 50 mM NH4HCO3 中的样品

估算水解中的量

要估算水解中的量：

1. 计算样品中的总固体。

– 由于难以准确吸取 1.8 µL，请使用 0.1M HCl 将原始样品稀释到约 1 mg/mL。

HClM2.46μL

HClμmol2.46μL100

HCl)μmol6HClμmol(240μL100

)μLμmol0.1

μL(60)μLμmol6

μL(40或

总稀释液总稀释液

nmol18μL 10μL 100μL 20

μL10ml1

mg10gm1

molnmol10

AAgm101.1mol AA 1

mLmg 1.00

33

9

2

稀释液稀释液

储备液

样品

μL1.8

μL1mAbμg11.2

μg20

样品

目标物

示例 C-13

样品量的估算

要估算样品量：

1. 使用稀释的样品浓度计算含量最低的氨基酸。

提示：

• 目标 100 pmol LAAA 是近似值，可以相应地增加以使用整数值。

• 添加 500 µL 0.1M HCl 仍处于方法的线性工作范围之内。

pH 值



提示：

• 因为最终的酸浓度大于 0.1 M HCl，所以在进行衍生前需要进一步调整。加入等体积

的 0.57 M NaOH。

• 蒸发干燥水解产物，然后使用 500 µL 的 0.1 M HCl 进行复溶是合理的。

• 如果加入 NaOH，则硼酸盐体积必须进行相应的调整。因此，在加入衍生试剂之前，

应将 10 µL 样品和 10 µL 0.57 M NaOH 与 60 µL 硼酸盐缓冲液相混合。

mLmg0.03

0.03mL

mg1.0

LAAA/μApmol 273μL10

1mlmg10

1gmmol

pmol10gm110

mol1mL1

LAAAmg0.0333

12

溶液

管管

LAAApmol5460μL20μL

LAAApmol273

管管

μL546pmol100μL10pmol5460

HClM0.57μL

HClμmol0.57μL500


)μLμmol0.1

μL(460)μLμmol6

μL(40或






结果： 3.6 nmol 远低于 140 nmol 的限制。

剩下的示例仅针对衍生化计算。

未知成分样品的示例，浓度为 mg/管示例：对于 1.2 mg 蛋白质/管的样品

样品量的估算


1. 计算每管的蛋白质总量。

2. 计算溶液中的氨基酸总量。

3. 计算溶液中的 LAAA。

nmol3.6μL 10μL500μL20

μL10ml1

mg10gm1

molnmol10

AAgm101.11mol AA

mLmg1.0

33

9

2

稀释液稀释液

储备液

储备液

管

蛋白质

管

蛋白质 nmol21.8molnmol10

mg10g1

55000gmolmg1.2 9

3

管蛋白质管

蛋白质 AAnmol10,900AA500nmol21.8

管管

LAAAnmol3270.03

AAnmol10,900

（加入管中）管

HClM0.1μL 32,700pmol10μL

nmolpmol10nmol327 3

示例 C-15

4. 因为结果体积大于便于稀释的体积，请使用可在 1000 µL 体积内制备的初始储备浓度。





未知成分样品的示例，浓度为 pmol/管示例：对于 28 pmol 蛋白质/管的样品

样品量的估算



μLpmol21.8

nmolpmol10

μL1000nmol21.8 3 蛋白质蛋白质

μLAApmol10900AA500

μLpmol21.8

蛋白质

蛋白质

μLLAAA327pmol

0.03μL

AApmol10900

μL0.31pmol327μL1

pmol100 稀释液要求值

期望值 32

μL0.31μL 10

）（加入储备液进行稀释（至移液管） HCl0.1MμL 16032μL 5

nmol3.3μL 10μL 165μL 5

μL10ml1

mg10gm1

molnmol10

gmAA101.11molAA

mLmg1.

33

9

2

稀释液稀释液

储备液

储备液

2

管蛋白质管

蛋白质 AApmol14,000AA500pmol28







未知成分样品的示例，浓度为 pmol/µL示例：对于 1 mL 1.5 pmol 蛋白质/µL （溶于 0.1 M HCl 中）的样品

样品量的估算



管管

LAAApmol4200.03

AApmol14,000

（加入管中）期望值

HClM0.1μL42

μLpmol10

LAAApmol420

nmol3.3AA500

μL 10pmol10

nmol1μL42

pmol283

蛋白质

μLAApmol750AA500

μLpmol1.5

蛋白质

蛋白质

示例 C-17






未知成分样品的示例，浓度为 µM示例：对于 1 mL 4 µM 蛋白质溶液（溶于 6 M HCl 中）的样品

样品量的估算



μLLAAApmol22.5

0.03μL

AApmol750

μL4.44pmol22.5μL1


期望值 2.25

μL4.44μL 10

）（加入储备液进行稀释（至移液管） HCl0.1MμL 22.52.25μL 10

nmol2.3μL10AA500

μL32.5μL 10

pmol10nmol1

μLpmol1.5

3 稀释液蛋白质稀释液

储备液

储备液

蛋白质

μLpmol4

μmolpmol10

μL10L1

Lμmol4

μM46

6

蛋白质

μLAApmol2,000AA500

μLpmol4

蛋白质

蛋白质


2. 计算溶液中含量最低的氨基酸。

pH 值



提示：

• 因为最终的酸浓度大于 0.1 M HCl，所以需在衍生混合物中加入等体积的 1 M NaOH。


10 µL 1 M NaOH 与 60 µL 硼酸盐缓冲液相混合。





μLLAAApmol60

0.03μL

AApmol2,000

μL1.67pmol60μL1


期望值 6

μL1.67μL 10


HClM0.94μL

HClμmol0.94μL70


)μLμmol0.1

μL (60)μLμmol 6

μL (10或


nmol2.9μL10AA500

μL70μL 10

pmol10nmol1

μLpmol4

3 稀释液蛋白质稀释液

储备液

储备液

蛋白质

示例 C-19

未知成分样品的示例，浓度为 %示例：对于溶于 1.5 M HCl 中的 0.5% 蛋白质溶液的样品

样品量的估算


1. 计算溶液中的蛋白质总量。


pH 值



提示：因为最终的酸浓度大致相当于 0.1 M HCl，所以在进行衍生前无需用碱性溶液调节。

mLproteinmg

gmg

mLg 510

100

5.0%5.0

3

mL

mg5gmg10

mL100g0.5

0.5%3 蛋白质

mLmg0.15

0.03mLmg5

LAAA/μApmol 1364μL10

ml 1mg10

gm 1mol

pmol10gm110

mol1mL1

LAAAmg0.1533

12

溶液

μL 0.07pmol 1364μL 1

pmol 100 稀释液要求值

期望值 136

μL0.07μL 10


HClM0.11μL

HClμmol0.11μL685

HCl)μmol68HClμmol(7.5μL685

)μLμmol0.1

μL (680)μLμmol1.5

μL (5或







未知成分样品的示例，浓度为 mg%示例：对于溶于 4 M NaOH 中的 36 mg% 蛋白质溶液的样品。

样品量的估算


1. 计算溶液中的蛋白质总量。



μL10ml1

mg10gm1

molnmol10

gmAA101.1molAA 1

mLmg5

33

9

2

稀释液稀释液

储备液

储备液

mLmg0.36

mL100mg36

%mg36蛋白质

mLmg0.011

0.03mL

mg0.36

LAAA/ μApmol 100μL10

ml 1mg 10

gm 1mol

pmol 10gm110

mol1mL1

LAAAmg0.01133

12

溶液

μL 1pmol 100μL 1

pmol 100 稀释液要求值

期望值 10

μL1μL 10


示例 C-21

pH 值


样品的稀释需要 5 µL 的 4 M NaOH （如之前的计算方法中所示）。

1. 用 50 µL 的 0.1 M HCl 稀释样品。

注： 50 µL 0.1 M HCl = 5 µL 1 M HCl = 1.25 µL 4 M HCl

2. 计算酸和碱量的差值。

5 µL NaOH – 1.25 µL HCl

3. 现在，样品中相当于包含 3.75 µL 过量的 4 M NaOH。

提示：

• 因为最终的碱浓度大于 0.1 M NaOH，所以应在衍生混合物中加入等体积的 0.25 MHCl。


10 µL 0.25 M HCl 与 60 µL 硼酸盐缓冲液相混合。





NaOHM 0.27μL55

NaOHM4μL3.75

总稀释液


μL10ml1

mg 10gm 1

molnmol 10

AAgm 101.1mol AA 1

mLmg5

33

9

2

稀释液稀释液

储备液

储备液


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