ANEMII HEMOLITICE

Hemoliza fiziologica – eritrocitele imbatranite devin mai rigide si exprima un antigen de senescenta. Splina elimina aprox 90% din eritrocitele senescente prin hemoliza extravasculara (intratisulara) prin macrofage, 10% e hemoliza fiziologica intravasculara si hemoglobina e deversata in plasma si apoi prelucrata de ficat si rinichi.

Scurtarea duratei de viata a eritrocitelor e criteriul major care defineste hemoliza patologica. Riposte organismului e hiperreticulocitoza. MO: hiperplazia seriei eritroide in detrimental zonelor de maduva grasa care se restrang (de 7x mai mult ca cele normale). In anemiile hemolitice durata de viata a eritrocitelor circulante e mai mica de 17 zile.

I. Hemoliza extravasculara – in macrofag, la nivel infrastructural : alterare a membranei eritrocitare (cu liza parcelara a acesteia), urmata de precipitarea intracelulara a Hgb si de trecerea agregatelor de Hgb in citoplasma macrofagului. Componentele catabolizate sunt recuperate, cu exceptia inelului porfirinic care e descompus in CO si bilirubina, eliminata prin aerul expirat si prin bila.

Dgn curent are doua grupe de semnale indirecte :1. teste biochimice – semnaleaza hipercatabolismul protoporfirinei

(hiperdistructia eritrocitelor)i. hiper Bi I (BRI) – deoarece ficatul are o mare capacitate de

prelucrare a BR valorile BRI si intensitatea descarcarii urinare a Ubg nu se coreleaza perfect cu intensitatea hemolizei. Pentru un ficat indemn titrul BRI nu va fi mai mare de 3-4 mg/dl, oricat ar fi intensitatea hemolizei.

ii. descarcarea de Urobilinogen in urina2. semnale morfologice ale hiperproductiei compensatorii de eritrocite

i. reticulocitoza sanguinaii. hiperplazia seriei rosii in MO – daca MO e normala, gradul

hiperplaziei e paralel cu intensitatea hemolizei. Raportul G/E e micsorat, chiar inversat, iar ochiurile de grasime se sterg pana la disparitie. Eritroblastii au talie mare (macronormoblasti). Nu trebuie confundati cu megaloblastii care apar in anemii hemolitice cronice complicate cu carenta de ac folic !

II. Hemoliza intravasculara

Eliberare in plasma de Hgb care se disociaza imediat in dimeri αβ care sunt eliminate rapid din circulatie in 2 feluri:

1. dimeri captati de proteine, sunt transportati la ficat si iau calea mentionata mai sus. Trei proteine fixeza dimeri αβ:

i. haptoglobina– cantitatea disponibila e de 50-200 mg/dl

1

– ea poate fi aproape complet epuizata daca in sange sunt lizate rapid 1-2 ml eritrocite

– reducerea titrului de haptoglobina libera e cel mai fidel indicator al aparitiei Hg in plasma (si in hemoliza extravasculara mai scapa Hgb din macrofage si scade haptoglobina dar nu ca in hemoliza intravasculara)

– dupa consumarea completa a haptoglobinei raman dimeri αβ liberi care coloreaza plasma in roz

ii. hemopexina– dimerii nelegati de haptoglobina sunt dezasamblati in

methem + globina. – Methem e captat de hemopexina si la ficat sunt

transportate si transformate in BRI.iii. Serumalbumina capteaza ce nu mai poate hemopexina. Formeza

met/hem/albumina de culoare bruna.

2. Dimeri liberi strabat filtrul glomerular si vor fi reabsorbiti de celulele epiteliale ale tubilor proximali in care vor fi degradati, Fe ramane in citoplasma acestora ca hemosiderina (R. Perls – test de hemosiderina urinara – Fe in celula epiteliala descuamata)

HiperBi I si urobilinogenuria sunt markeri ai ambelor tipuri de hemoliza, hemosiderinuria doar a celei intravasculare !!!

Dupa un puseu de hemoliza intravasculara sunt decelate : Hgb in plasma si urina – timp de numai cateva ore Depletia haptoglobinei dureaza mai multe zile Hemosiderina e detectabila in urina mai multe saptamani.

Hemosiderinuria ramane indicatorul cel mai valoros intr-o hemoliza intravasculara cronica.

Daca iruptia Hg in nefroni e brusca si masiva, mecanismul retroresorbtiei e depasit, Hgb ajunge in urina care capata culoare rubinie (hemoglobinurie).

CLASIFICAREA ANEMIILOR HEMOLITICE

1. producerea a noi eritrocite cu defecte structurale. Nu supravietuiesc mult in circulatie, desi conditiile de mediu sunt normale : (AH intracorpusculare, endoeritrocitare). Aproape toate sunt boli ereditare (cu exceptia hemoglobinuriei paroxistice nocturne cand defectul de membrana e dobandit)!

a. Defecte de membranab. Defecte de enzima (enzimopatii)c. Defecte de globina

2. aparitia unor alterari ale mediului de viata (plasma sau vase) – AH extracorpusculare, exoeritrocitare. Toate sunt boli dobandite.

a. Prin anticorpi

2

– Alloanticorpi : reactii posttransfuzionale, boala hemolitice a nou-nascutului

– Autoanticorpi :1. AHAI idiopatice2. AHAI (autoimune) cu anticorpi la cald

si la rece3. AHAI secundare

b. Prin agenti infectiosic. Prin medicamentd. Prin agenti chimicie. Prin agenti fizicif. Prin factori traumaticig. Hipersplenism

I. Certificarea existentei hemolizei 4 markeri comuni ai existentei hemolizei :

1. hiper Bi I 2. descarcari urinare crescute de urobilinogen3. hiperreticulocitoza4. hiperplazia eriotroida a MO5. se poate adauga si cresterea in ser a LDH eliberat din eritrocitele hemolizate

Situatii:1. hiperBi izolata poate fi semnalul unui hematom profund (in seroase) sau a

unor ictere rare familiale (Gilbert, Criggler-Najar)2. asocierea anemiei+reticulocitoza in absenta hiper Bi sugereaza mai degraba

o hemoragie interna decat hemoliza, sugestie care e intarita daca se asociaza si o hiperplachetoza

3. daca asocierea de mai sus mai are si tablou leucoeritroblastic al formulei se suspecteaza o infectie severa sau o invadare a MO fie cu cellule neoplazice, fie printr-un process de mielofibroza

4. triada anemie + bilirubinemie + reticulociptopenie tradeaza eritropoieza ineficienta (tot o liza celulara dar la nivel central actioneza asupra eritroblastilor medulari)

5. inspectia plasmei poate orienta dgna. in general, in hemoliza plasma si urina sunt de culoare galben-inchisab. in hemoliza intravasculara: urini rosii-rubinii , suspiciunea e intarita

daca plasma e roz (in porfirinurie, mioglobinurie, urina rosie, plasma normala)

c. hemoliza recenta – se determina hemoglobinuria prin metoda spectroscopica; veche – hemosiderinuria (“sechela” trecerii Hgb prin glomerul): metoda curenta R Perls ptr hemosiderinurie. Mai exista o investigare rapida, orientativa pe lama cu ajutorul sulfurii de amoniu (sol apoasa 30%): o picatura sediment (din urina centrifugata) + o picatura reactiv, se formeaza granule de sulfura ferica , decelate in celulele epiteliale

3

II. Elucidarea cauzelor2.1. orientare anamnestica

1. cele mai frecvente, anemiile hemolitice (AH). Sunt dobandite.2. precizarea imprejurarilor in care s-a produs eliminarea urinilor suspecte

de hemoglobinuriea. mictiuni matinale – suspect hemoglobinurie paroxistica nocturnab. dupa un medicament – posibilitatea deficientei de G6PD sau

hemoglobina instabilac. la temperaturi joase – susp. Hemoglobinuria paroxistica a frigored. dupa alergare prelungita – hemoglobinurie de mars

2.2. inspectia frotiului de sange e cel mai important examen de triaj2.2.1. anemiile in marea majoritate a AH sunt normocrome. Asocierea

hipocromiei la un proces hemolitic evoca 2 situatii:

Hemoglobinopatie (talasemie sau hemoglobinoza E). Cea mai frecveta e β-talasemia cu :

o O mare dezordine a tabloului eritrocitar (anizocitoza, poikilocitoza, frecvente elemente in semn de tras la tinta, eritrocite cu punctatii bazofile, eritroblastemie)

o Modificari scheletale discrete Proemineta pometilor obrajilor Bolta palatina ogivala Craniu in turn

o Splenomegalie discretaDgn talasemiei se face prin electroforeza hemoglobinei.

Asocierea unei carente de Fier la un subiect cu tara talasemicao Dezordinea eritrocitara mai accentuatao Modelul repararii anemiei dupa terapia martiala

Creste Hgb pana la o valoare subnormala (pragul starii talasemice)

Mentinerea hipocromiei chiar dupa reumplerea depozitelor de Fe

In anemiile feriprive in care nu se pot demonstra sangerarile se cerceteaza existenta unei hemolize intravasculare :

1. hemoglobinuria paroxistica nocturna (HPN)a. prezenta (inconstanta) a leucotrombocitopenieib. prabusirea scorului FA leucocitarc. pozitivarea testelor specifice (test cu sucroza si test Ham)

2. anemia hemolitica microangiopatica: numeroase schizocite

2.2.2. prezenta eritrocitelor in semn de tras la tinta evoca β-talasemia uscarea LENTA a frotiului permite cristalizarea intracelulara a

hemoglobinei C, facilitand dgn acestei anomalii

4

2.2.3. sferocitoza in: Microsferocitoza ereditara AH immune AH cu corpi Heinz Unele hemolize induse medicamentos Hipersplenism Arsuri intinse Hipofosfatemie

Triajul incepe cu testul Coombs direct deoarece AHAI (anemiile hemolitice autoimune) sunt cele mai frecvente!!!

1. AHAI cu autoanticorpi active la cald care sutn Ig G, neactivatoare de complement, care raman pe antigenele Rh si la 37oC. pot fi evidentiate prin test Coombs dirct cu ser monospecific antiIg G.

2. AHAI cu autoanticorpi active la rece sunt Ig M sau specii Ig G care la temperature de 4oC se leaga de antigene eritrocitare specifice cu aviditate, impreuna cu complementul. La un anumit prag termic, anticorpii se desprind, ramane doar complementul care e depistat prin test Coombs direct cu ser anticomplement. Dgn bolii cu aglutinine la rece :

a. Demonstrarea aglutinarii (uneori aglutinarea eritrocitelor pe frotiul de sange)

b. Test Coomb direct pozitiv cu ser anticomplementc. Test Coombs indirect pozitiv cu ser anti Ig M

3. AHAI cu anticorpi bifazici4. Numai dupa eliminarea AHAI cu anticorpi la cald si la rece si a

AHAI secundare poate fi formulat dgn de AHAI idiopatice.

Un test Coombs direct anticomplement pozitiv, in absenta demonstrarii aglutinarii sau a hemolizei nu are semnificatie dgn pentru AHAI (traduce, cel mai probabil, o atasare pasiva de complexe imune circulante pe eritrocite) !

In AH induse medicamentos, testul Coombs e + numai in prezenta medicamentului cauzal.

Sferocitoza ereditara – vezi mai jos.

2.2.4. schizocitoza in AHM (mecanica), la purtatorii de valve cardiace si proteze vasculare. AHM apar in :

CID PTT sdr hemolitic uremic (SHU) hiperTA maligna cancere diseminate poliartrita nodoasa, LED, SIDA

5

Schizocitele se asociaza in AHM in mod caracteristic cu scaderea nr de trombocite la limita inferioara a normalului sau sub aceasta limita

Concluzii: Hemoliza trebuie suspectata ori de cate ori hiperBII se asociaza cu

hiperreticulocitoza Frotiul de sange, (cu exceptia eritrocitelor falciforme care sunt

cvasipatognomonice pentru siclemie) tablourile morfologiei eritrocitare sugereaza mecanisme diferite

Teste primare :o Test Coombso Test de aglutinare la receo Test de autohemolizao Rezistenta osmoticao Electroforeza Hgb

Teste specificeo Determinarea enzimelor eritrocitareo Determinarea structurii lanturilor de globinao Testul hemolizinelor bifaziceo Test Ham

6

ANEMIILE HEMOLITICEPRIN DEFECT DE MEMBRANA

Orice anemie hemolitica indifferent ca este vorba de o hemoglobinopatie (de exemplu siclemia), hemoglobinoza (talasemia) sau enzimatice (deficit de G6PD) cat se cele de cauza extraeritrocitara se insotesc de o alterare a membranei eritrocitare.

O schitare orientativa a patologiei membranare :A. patologia scheletului de membrana ( a retelei interne)

1. anemii de tip hemolitic cronic : sferocitoza, ovalocitoza si piropoikilocitoza ereditara

2. anemii hemolitice intravasculare (brutale) anicterice : hemoglobinuria de mars

B. patologia stratului mediu (lipidic)1. tulburari ale stratului lipidic bilaminat : acantocitoza ereditara2. tulburari ale componentelor lipoproteinelor integrate in stratul lipidic

bilaminat : stomatocitoza (stoma = gura) si xerocitoza (eritrocitele pierd, partial, continutul lor de apa, apar zbarcite cu aspect de prune uscate) ereditare

C. patologia stratului superficial1. anomalia ereditara numita boala grupului Rh nul2. anemii hemolitice autoimune (dobandite)

SFEROCITOZA EREDITARA (SE)(MICROSFEROCITOZA SAU BOALA MINKOWSKI-CHAUFFARD)

Se caracterizeazamprin anemie hemolitica de tip intraeritrocitar, icter, reticulocitoza crescuta si splenomegalie ; boala mai prezinta si o serie de stigmate eritrocitare carcateristice ca microsferocitoza, scaderea rezistentei eritrocitare la solutii saline hipotone, cresterea hemolizei spontane (care se corecteza dupa adaos de glucoza), precum si sechestrare splenica si raspuns favorbail la splenomegalie.

In urma descoperirii formelor clinice de talasemie minima (asimptomatice) depistate in familiile cu forme patente, frecventa sferocitozei a trecut pe locul doi.

Examene de laborator :1. Frotiu sanguin :

Numarul de eritrocite moderat redus : 3-4 milioane/mm3 ; anemie de tip normocrom, mai pronuntata la copii fara a fi severa (8/10 g Hgb/100 ml).

Patognomonic, prezenta microsferocitelor, eritrocite mai mici, mai intens colorate si cu disparitia zonei mai clare din centrul lor, comparabila unor sfere colorate omogen, intr-un procent de 20-25%, exceptional poate ajunge la 90% (exista si o boala genetica cu sferocite in proportie de 100%). Cand proportia lor e scazuta, pana la 5%, testul cu eritrocite puse in incubator evidentiaza mai bine anomalia. Frotiurile sanguine incorect intinse ar putea aparea pentru un ochi neexperimentat ca bogate in

sferocite, acestea fiind insa artefacte de intindere, prezente alaturi de eritrocite crenelate.

7

Reticulocitoza e constant prezenta cu exceptia starilor de criza aplastica. In mod obisnuit au valori de 8-25% ! Reticulocitoza peste 8% este un semn mai fidel si mai constant decat hiperbilirubinemia care poate lipsi in 30-40% din cazuri. Cresteri ale reticulocitelro de peste 50% si mai mult se intalnesc in crizele de deglobulinizare prin hemoliza.

Pe frotiu se mai constata semne de regenerare eritrocitare ca : o policromatofilia, o prezenta de resturi nucleare intraeritrocitare (corpi Howel-Jolly) o aparitia de eritroblasti

curba Price-Jones prezinta in general doua varfuri: unul la stanga diametrului eritrocitar mediu (polulatia microsferocitara), iar al doilea la dresapta (prezenta reticulocitelor)

2. Medulograma: o maduva cu celularitate bogata (hiperplazie normoblastica). Nu exista eritropoieza ineficienta! Apare tablou de eritroblastopenie doar la inceputul crizei de aplazie aplastice. Hemoliza e de tip periferic, formarea microsferocitelor are loc abia in sangele periferic.3. Rezistenta osmotica: fragilitate crescuta a eritrocitelor (scaderea rezistentei osmotice in solutii hipotone) care este test de rutina si de triere in SE.

La evaluare cu ochiul liber hemoliza incepe, la normali, la o concentratie de NaCl de 0,45% si e totala la 0,35% ; la determinari fotometrice, hemoliza incepe la 0,52% si se incheie la 0,3%

In sferocitoza, rezistenta osmotica e pronuntat scazuta ; hemoliza incepe la valori apropiate de ale serului fiziologic (0,8%) si se termina la aprox 0,4%.

Intrucat testul clasic e adesea insuficient de sensibil pentru diagnostic, s-a generalizat determinarea acesteia dupa incubarea simpla (24 ore la 37oC) sau cu adaos de glucoza, imitandu-se astfel conditiile din sinusurile splenice. Limitele hemolizei sunt acum intre 0,75 – 0,15% NaCl.

4. Alte determinari : Rezistenta mecanica fara a fi un test de rutina este si ea scazuta, dar nu la nivelul valorilor intalnite in talasemiile homozigote (eritrocitele tarate pierd continuu fragmente de membrana). Testul de autohemoliza : eritrocitele recoltate steril si mentinute in plasma proprie la termostat, la 37oC timp de 48 de ore, se hemolizeaza mai intens decat cele normale. Aceasta hemoliza se corecteaza la adaogare de glucoza. Semne de hemoliza (determinari rar necesare pentru diagnostic) :

bilirubinemia sa fie crescuta, predominand fractiunea libera neconjugata (3-4mg/100ml). La o crestere persistenta de peste 5mg/100ml, trebuie suspectata o leziune hepatica concomitenta.

Hemoglobinemia absenta sau foarte putin crescuta Haptoglobina serica absenta sau numai slab evidentiabila Creste activitatea LDH

Crizele in sferocitoza ereditara (inrautatiri in evolutia bolii ; nu lipsesc, practic, la nici un pacient):

1. crize hemolitice sau de deglobulinizare, frecvente si benigne

8

2. crize aplastice,mult mai rare, dar mai drastice3. crize megaloblastice

OVALOCITOZA SAU ELIPTOCITOZA EREDITARA

PIROPOIKILOCITOZA EREDITARA

E o varianta rara de sferocitoza, respectiv ovalocitoza ereditara, ce se manifesta prin anemie hemolitica severa cu o pronuntata poikilocitoza pe frotiul sanguin si care se accentueaza si mai mult la incalzirea sangelui in vitro. In afara « cotei «  periodice de sange pe care o reclama organismul, bolnavii sunt nevoiti sa fie spitalizati prin fenomene intempestive de « deglobulinizari » . Spitalele neavertizate sunt contrariate de simptomatologia acestora care constata, in afara sindromului de anemie hemolitica severa, bizarerii eritrocitare pe frotiul sanguin, alaturi de normalitatea unor teste specifice pentru anemiile hemolitice (electroforeza Hgb, testele Coombs, cercetarea enzimelor eritrocitare).

ANEMII HEMOLITICE INTRAVASCULARE (BRUTALE) ANICTERICEHEMOGLOBINURIA DE MARS

E o tulburare hemolitica intravasculara acute ce se manifesta prin hemoglobinurie si hemoglobinemie pasagera la persoanece efectueaza activitati fizice cu contact repetat al extremitatilor la suprafete dure.

Teste osmotice si mecanice normale. Bilirubina discreta, sub 2 mg/100 ml. Haptoglobina serica scade pana la disparitie. Urina contine hemoglobina, iar dupa incetarea atacului contine hemosiderina.

ACANTOCITOZA

Eritrocite sunt sferice, acoperite cu spini regulati si fini, iar pe frotiu apar ca frunzele de acant. Apar in abetalipoproteinemia familiala dar sunt acantocitoze ereditare fara abetaproteinemii.

HEMOGLOBINOPATIILE

Sunt boli ereditare in care leziunea fundamentala afecteaza rata de sinteza sau structura globinei din hemoglobina normala. Exista hemoglobinopatii

calitative si cantitative, care cuprinde sindroamele talasemice.

Examenul clinic si hematologic, se completeaza cu examene speciale, capabile sa evidentieze anomalia hemoglobinica. Unele sunt tehnici simple ce pot fi executate in laboratorul clinic cu dotare tehnica obisnuita si anume :

Testul de siclizare Determinarea Hg alcalinorezistente Coloratia pentru corpi Heinz Testul de stabilitate termica

9

Electroforeza de Hb este testul de baza in diagnosticul hemoglobinopatiilor cu toate limitele ei (Hb anormale cu migrare asemanatoare Hb A, cazuri de β si α talasemie cu electroforeza normala). Tehnica de « fingerprint » si analiza de aminoacizi, care permit precizarea anomaliei structurale, se executa in laboratoare specializate.

SICLEMIA SAU HEMOGLOBINOPATIA SSinonime : drepanocitoza, anemia falciforma,anemia cu hematii in secera, hemoglobinoza S

E o hemoglobinopatie calitativa, tulburarea de baza e prezenta in eritrocite a HbS.La subiectii cu forma de tara (heterozigoti) rezultatele sunt in cadrul limitelor

normale, cu exceptia testului de siclizare si a electroforezei. La homozigoti exista intotdeauna un grad de anemie cu cifre de 5-10mg% Hb si

20-30% Ht, cu scadere corespunzatoare a numarului de hematii. Reticulocitele sunt constant crescute intre 5-25% oglindind reactia interna regenerativa medulara. Pe frotiu modificari de :

Forma : Hematii colturoase, hematii alungite sau cu prelungiri ascutite, schizocite. Prezenta de hematii in tinta si hematii cu corpi Jolly traduce in parte gradul de hiposplenism realizat de numeroasele infarcte splenice.

Marime: majoritatea usor macrocitare, cu hipocromie moderata, aparand ca hematii “in tinta”

Culoare : Policromatofilie – prezenta de eritroblasti si hematii cu punctatii bazofile.

Cu toata concentrarea mare de Hb S din hematii (80-90%) numai la putine cazuri se pot vedea pe frotiu hematii in secera care sugereaza dgn.

Leucocitele si trombocitele depasesc in mod constant valorile normale si numai la cazurile cu splenomegalie si hipersplenism pot fi gasite valori scazute fata de normal. In crizele acute, leucocitele pot ajunge la cifre pana la 20.000-30.000, cu deviere la stanga pana la mielocit.

VSH este obisnuit scazuta, mai ales daca sangele este recoltat cu staza, datorita capacitatii scazute a hematiilor « in secera » de a forma rulouri !

Rezistenta osmotica a hematiilor e crescuta, cea mecanica scazuta.Sideremia e constant crescuta sau foarte crescuta, valori intre 150-200 μg5 fiind

normla intalnite. Coloratia pentru hemosiderina medulara pune in evidenta gradul mare de incarcare cu fier, mai ales la cei ce au primit transfuzii repetate.

Bilirubinemia variaza cu intensitatea hemolizei, valorile bilirubinemiei indirecte depasind de regula normalul. (La bolnavii hepatici BiI si D sunt crescute)

Examen de urina oglindeste suferinta renala (hematuria, hipostenuria cu D=1010 sunt aproape constante) si hemoliza cronica (urobilinogen crescut sau foarte crescut).

Ex MO nu e necesar dgn. Cand se face arata o maduva hipercelulara cu predominanta seriei eritrocitare si inversarea raportului G/E.

Testul de siclizare – procentul de hematii in secera si rapiditatea pozitivizarii tetului fiind direct legate de cantitatea de Hb S continuta in eritrocite. La heterozigoti testul e pozitiv in 1-2 ore, iar proportia hematiilor in secera e de 40-50%, la

10

homozigoti, in cateva minute si aproape toate hematiile sunt transformate drepanocitar.

Electroforeza Hb confirma dgn. La heterozigoti, 25-45% este obisnuit Hb S, la homozigoti aproape toata Hb e Hb S.

ALTE HEMOGLOBINE ANORMALECARE PRODUC HEMOLIZA

1. Sunt hemoglobinopatia C, D, E, O.2. hemoglobine instabile – “anemii hemolitice cu corpi Heinz”. Modificarile

morfologice ale eritrocitelor pe frotiu : anizocitoza, poikilocitoza cu frecvente ovalocite, hematii in picatura, hematii cu contur deformat, hipocromie de diverse grade, prezenta de hematii in tinta, frecvente hematii cu punctatii bazofile (aspect de anemie hemolitica nesferocitara). Reticulocitele intre 2-5%. Bi I si urobilinogen urinar cresteri variabile in raport cu gradul de hemoliza. Testul pentru corpii Heinz este foarte util, prezenta corpilor Heinz de talie mare si in procent crescut fiind caracteristica pentru aceste Hb anormale. Inainte de splenectomie pot fi rari sau absenti, dupa indepartarea splinei prezenta acestora in numar amre e constanta. (degradarea Hb : methemoglobinizare cu pierderea gruparilor hem, disocierea in subunitati, precipitarea si formarea corpilor Heinz). Testul de stabilitate termica si testul cu isopropanolol sunt pozitive si patognomonice. Precipitatul care apare in eprubeta cu ehmolizat, tinut 2-3 ore la 50oC pun ein evidenta instabilitatea structurala a acestor Hb. Electroforeza Hb efectuata in conditii standard: cele mai multe dintre Hb instabile au o migrare asemanatoare cu cea a Hb A sin u pot fi isolate electroforetic, se ecplica prin faptul ca anomalia structurala consta din inlocuirea unui aminoacid prin altul cu aceeasi sarcina electrica, fara a modifica astfel migrarea electroforetica a Hb.

3. hemoglobinele anormale variante de Hb F sau Hb A2 – de regula, dat fiind valoarea procentuala foarte mica (1% din totalul Hb) a acestor Hb A2, majoritatea sunt descoperite intamplator, in cursul investigatiilor curente efectuate in laboratoare specializate.

SINDROAME TALASEMICE

Sunt afectiuni ereditare cauzate de blocarea partiala sau totala a sintezei unuiaq din lanturile polipeptidice ale globinei. Nu se sintetizeaza o Hb anormala ci exista un impas in formarea de eritrocite cu continut normal de Hb, de aceea se numesc hemoglobinopatii cantitative. Se manifesta ca anemii hipocrome microcitare hipersideremice, cu eritropoieza ineficienta, hemoliza si splenomegalie.

In raport cu lantul polipeptidic afectat de mutatia talasemica exista α si β talasemii.

BETA-TALASEMIISinonime : thalassaemia major si minor, anemia si tara Cooley,

anemia mediteraneaza, leptocitoza ereditara, anemia cu celule de tras la tinta,

11

microcitemia familiala.

β talasemiile se impart in β+ talasemii (cu blocarea partiala a sintezei) si βo talasemii (cu blocarea totala a sintezei lanturilor). Ambele se caracterizeaza prin cresterea valorilor Hb A2, in forma de heterozigot. Se manifesta clinic sub diferite forme :

1. anemie hemolitica severa cu hemoliza cronica, icter, splenomegalie, ce necesita transfuzii in perioada de decompensare

2. forma clasica de talasemie minora, se manifesta ca anemie hipocroma hipersideremica

3. forma asimptomatica clinic si hematologic, adevarata forma de tara – talasemia minima sau microcitemie

4. silent thalassaemiaExamene de laborator :In talasemia majora, anemia este intotdeauna severa si intens hipocroma, cu

valori de Hb obisnuite intre 5 si 7 g/dl si cu scaderea corespunzatoare a numarului de eritrocite si a hematocritului. Constantele eritrocitare HEM si CHEM sunt sub limita normalului, concordante cu incarcarea deficitara cu Hb a eritrocitelor. VEM e insa variabil, in raport cu carenta de acid folic si macrocitoza secundara acesteia.

Frotiul este foarte caracteristic si sugestiv. Hipocromia – foarte accentuata si insotita de un inalt grad de anizopoikilocitoza. Numeroase hematii in tinta, frecvente hematii in picatura si ovalocite, alaturi de un numar mare de hematii cu contur deformat si schizocite. Hematiile in tinta cu marginile indoite dau aspectul de ‘palarie mexicana’ si uneori sunt macromegalocite (12-15μ). La cazurile cu Hb foarte scazuta, unele hematii par lipsite de continut si sugereaza aspectul de ‘umbre eritrocitare’. Hematiile cu inele Cabot, corpi Jolly si punctatii bazofile sunt frecvent intalnite. Prezenta de eritroblasti e constanta (5-20% leucocite), numarul de eritroblati putand depasi de cateva ori numarul de leucocite la cazurile splenectomizate (300-500% leucocite). Policromatofilia accentuata de pe frotiu oglindeste reticulocitoza crescuta (5-15%).

In talasemia minora, aspectul frotiului periferic e de anemie hipocroma microcitara. Totusi, poikilocitoza, prezenta de hematii in tinta si de hematii cu punctatii bazofile permite diferentierea de tabloul uniform microcitar hipocrom din anemia feripriva. Policromatofilia usoara corespunde unui numar de reticulocite usor crescut (2-5%). Eritroblasti mai rari (1-2% leucocite).

In talasemia majora leucocitoza moderata e constanta (10.000 – 20.000/mm3 sau mai mare) si se insoteste de deviere la stanga a formulei leucocitare. Uneori s-au vazut reatii leucemoide cu celule tinere pana la mieloblasti. Cei mai multi bolnavi au un numar moderat crescut de trombocite. (In talasemia minora si minima L si Tr normale).

Semne de distrugere eritrocitara : Bi I, urobilinogen urinar si excretia de stercobilinogen fecal.

Rezistenta osmotica a eritrocitelor in solutie salina hipotona e aproape constant crescuta, hemoliza totala situandu-se frecvent in jurul concentratiei de 0,2 g NaCl/100 ml sau sub aceasta cifra la cei cu platicitoza accentuata. Fara a fi patognomonic, e util dgn talasemiei.

12

Determinari enzimatice : crestere a glucozo-6-fosfatdehidrogenaza si a fosfatazei acide si o scadere a acetilcolinesterazei.

Gradul de incarcare cu Fe a organismului in talasemia majora: Sideremie constant crescuta, capacitatea totala de legare a siderofilinei, sub limita normalului de

300-330 μg capacitatea latenta, coeficientul de saturare cu Fe a siderofilinei obisnuit intre 60-100%

ca in hemocromatoza in maduva : hemosiderina crescuta si un procent important de

sideroblasti, maduva hipercelulara cu predominanta seriei eritroblastice (G/E=1/4-1/8)

Electroforeza Hb e tehnica de baza in precizarea dgn de β-talasemie. Valori foarte crescute pentru Hb F (N<2%, dupa varsta de 1 an) obisnuit intre 20-90% din Hb.

ENZIMOPATII ERITROCITARE

Constituie un grup de afectiuni hemolitice nesferocitarem ereditare. Enzimele afectate sunt cele implicate in metabolizarea glucozei:

Aldolaza eritrocitara e rar afectata Glucoza-6-fosfat dehidrogenaza (G-6-PD) si piruvat-kinaza (PK)

sunt cel mai frecvent afectateO eficienta redusa a oricareia dintre enzimele care asigura metabolizarea glucozei

in eritrocite reprezinta un risc considrabil de hemoliza deoarece, dincolo de stadiul de reticulocit, singura modalitate de a asigura cantitatea de enrgie necesara desfasurarii unei activitati normale a eritrocitului, ca si potentialul reducator, essential mentinereii integritatii structurale a celulei, o constituie degradarea glucozei pe calea metabolica a ciclului Embden-Meyerhoff.

Exprimarile clinice sunt variate. Astfel, tulburarile neurologice induse de deficitul de fosfo-fructokinaza (PFK) sunt mult mai grave decat anemia hemolitica (modesta) care poate insoti aceasta eritroenzimopatie. Tulburarile psihice si cele vizuale determinate de deficitele de galactozo-fosfat-uridil-transferaza si de galactokinaza pot sa fie insotite si de modificari ale eritrocitelor fara ca acestea sa fie importante.

DEFICITUL ERITROCITARDE GLUCOZO-6-FOSFAT DEHIDROGENAZA

Fenomenele hemolitice sunt declansate de contactul eritrocitelor cu unele medicamente sau substante chimice cu potential oxidative, sau ca urmare a unor infectii virale sau bacteriene.

Hemoliza e declansata de primul contact cu medicamentul, dupa care noile eritrocite introduce in circulatie se dovedeau a fi rezistente la efectele preparatului. Un nou contact cu acelasi medicament determina o noua criza de hemoliza. Eritrocitele varstnice sunt sensibile la contactul cu substanta, in timp ce eritrocitele tinere pot rezista la hemoliza.

13

Fiecare izoenzima (peste 300 izoenzime ale G-6-PD) este definite prin aplicarea unui set de criterii care include:

1. activitatea eritrocitara (exprimata in unitati de activitate enzimatica)2. constanta Michaelis (cea mai mica concentratie de substrat la care

enzima poate functiona cu o eficienta normala)3. mobilitatea electroforetica (in medii diverse: bloc de amidon, acetate de

celuloza)4. pH-ul optim la care enzima are maximum de activitate5. stabilitatea termica6. capacitatea de a utilize substraturi altele decat cele specifice7. gradul de afinitate pentru substratul specific

Examene de laborator:Anemia este de obicei normocroma. In hemolizele acute si intense se noteaza

scaderea hemoglobinei si aparitia de corpi Heinz intraeritrocitari. Pe frotiu se constata frecvent o macrocitoza cu deviere la dreapta a curbei Prince-Jones, care poate aveam doua varfuri. Uneori se vede anizo- si poikilocitoza, policromatofilie si mai rar eliptocite si corpi Jolly. Reticulocitoza este cvasiconstanta si apare la 4-5 zile de la episodul hemolitic.

Semnalam leucotrombopenii (pancitopenie), mai ales in procesele infectioase. Maduva are hiperplazie a seriei rosii cu rpedominanta de normoblasti. Reticulocitele contin mai mult G-6-PD decat eritrocitele adulte.

Testul de autohemoliza (deficitul de piruvat kinaza) permite unele diferentieri in cadrul enzimopatiilor, precum si deosebirea lor de anemiile hemolitice sferocitare.

Determinari specifice:1. masurarea productiei de NADH, care pentru a da un rezultat correct

necesita prezenta a 20-30% eritrocite cu deficit enzimatic. 2. testul cu cianura-ascorbat (cu sensibilitate mai mare) masoara

capacitatea eritrocitelor de a preveni oxidarea indusa de ascorbat a hemoglobinei.

3. pentru screening teste mai putin sensibile (necesitata prezenta a 30-40% eritrocite cu deficit enzimatic):

a. decolorarea mediate prin colorant a NAD+ b. reducerea methemoglobinei in prezenta albastrului de metilen

Rezistenta osmotica si mecanica ale eritrocitelro sunt normale.Bi I crescuta. LDH crescuta corespunzator hemolizei. Test Coombs negative.In afara episoadelor acute purtatorii acestui deficit nu au nici un fel de anomalie

morfologica sau functionala a eritrocitelor.

DEFICITUL ERITROCITAR DE PIRUVAT KINAZA

PK catalizeaza una dintre reactiile majore responsabile de producerea ATP in glicoliza.

14

ANEMII HEMOLITICEPRIN MECANISME IMUNE

Eritrocitele exprima antigene denumite in vorbirea curenta antigene de grup sanguin. Un individ normal isi tolereaza propriile antigene, dar va riposta prin elaborarea de allo-Atc daca in circulatia sa patrund eritrocite ‘incompatibile’ (echipate cu alte Atg eritrocitare). Primul contact cu un allo-Atg nu are consecinte clinice. Dar la contacte ulterioare se produc reactii imune prompte si energice : eritrocitele necompatibile vor fi hemolizate selectiv cu contributia allo-Atc produsi in titru mare. In practica, hemolizele mediate de allo-Atc apar dupa transfuzii si sarcini incompatibile. Sunt hemolizate atat eritrocitele proprii cat si cele incompatibile administrate terapeutic.

Cu cateva exceptii, medicamentele se comporta ca haptene. Conjugatele imune (combinatii haptene-caraus) induc formarea de Atc anti-haptena.

Partenerii reactiei imune :1. antigene eritrocitare : antigene de grup

A, B, AB, O si substanta H. Atg A, B si H se exprima si pe alte celule (trombocite, leucocite, celule endoteliale vasculare, celule epiteliale, spermatozoizi). 85% din indivizii de rasa alba poseda Atg D (antigen de sistem Rh)

2. anticorpii : Atc anti-A ai indivizilor de grup sanguin B (anti-B pentru cei de grup A, si anti-A si anti-B pentru cei de grup B)

Mecanismele hemolizei imune :1. atasarea Atc pe Atg2. distrugerea eritrocitele de elementelor :

a. fagocite (fagocite splenice, celule Kupffer, monocite circulante, granulocite neutrofile)

b. limfocitec. molecule (‘complexul de atac al membranei’)

Dupa locul distrugerii hemolizele sunt de 2 tipuri :1. hemoliza intravasculara – mediata de sistemul complement. Principala

cauza este transfuzarea de eritrocite incompatibile, care, desi putin frecventa, este si cea mai grava.

2. hemoliza extravasculara – mediata de sistemul macrofagic. Macrofagele ‘recunosc’ si retin eritrocitele in trecere pe care sunt fixate molecule de anticorpi (Ig G), de complement (fractiunea C3b) sau ambele.

a. Hemoliza extravasculara mediata de Ig G (subclasa G1 si G3). Nu toate eritrocitele care adera la macrofage sunt fagocitate. Macrofagul sufera in acest proces o depletie membranara a carei suprafata este egala cu aceea a eritrocitului incorporat, iar prin incorporarea mai multor eritrocite se ajunge la o ‘insuficienta de membrana’. Pentru refacerea membranei consumate si redobandirea capacitatii de fagocitoza, macrofagul are nevoie de mai multe ore. Apar in incomptibilitatea Rh si in anemiile hemolitice autoimune cu Atc la cald.

15

b. Hemoliza extravasculara mediata de C3b. Anticorpii capabili sa fixeze complementul pe eritrocite sunt Ig M (constant fixatori de complement) si unele subclase de Ig G. Ig M sunt macroglobuline cu cuplare cu Atg specifice la temperatura scazuta (sunt ‘aglutinine la rece’). Etapa cheie e formarea compusului C3b, care este factor de opsonozare.

Evidentierea Atc fixati pe eritrociteCa regula generala, Atc aglutinanti sunt Ig M, iar Atc neaglutinanti sunt Ig G!

Atc aglutinanti sunt Atc care aglutineaza Er in ser fiziologic. Atc neaglutinanti pot fi detectati prin tehnici de aglutinare artificiala:

TestulCoombs, tratare enzimatica a Er, adaugare de solutii macromoleculare.

Testul Coombs are la baza antigenitatea moleculelor de Ig care fixate pe eritrocite prin fragmentul Fab, expun situsurile antigenice ale fragmentului lor Fc. Adaugarea de reactiv antiglobulina umana la eritrocitele acoperite cu Atc neaglutinanti permite declansarea aglutinarii eritrocitelor. Testul Coombs are doua versiuni:

1. testul Coombs direct (TCD). Ca principiu, TCD evidentiaza prezenta Ig si/sau fractiuni ale complementului (Er ‘sensibilizate’) fixate in vivo la suprafata Er (debarasate prin spalare de proteinele plasmatice) cu ajutorul reactivului antiglobulina umana care serveste de legatura intre Atc fixati specific, provocand aglutinarea Er. In fata unui TCD pozitiv cu reactive specific, se folosesc seruri monospecifice: anti-IgG, anti-IgA, anti=IgM, anti-C3, anti-C4. Trei tipuri de pozitivitate sunt observate :

a. Ig G. Masurarea cantitativa a Ig G fixat la suprafata Er a aratat ca nu exista totdeauna o corelatie intre numarul moleculelor Ig G si severitatea hemolizei.

b. Ig G + C3

c. C3. Auto Atc Ig M sunt detectati mai greu la suprafat Er prin TCD pentru ca sunt detasati mai usor prin spalare de pe Er. Dar Ig M fixeaza intotdeauna C3 la suprafata Er de aceea depistarea prin TCD este mai usor realizabila prin intermediul potentialului anti-C3 al antiglobulinei.

Semnificatia diagnostica a TCD : Anemie hemolitica autoimuna cu anticorpi la cald (si

medicamentoasa) unde TCD este tip Ig G si/sau C3d, C4

Anemia hemolitica autoimuna cu anticorpi la rece, unde TCD este tip C3d si/sau C4

Transfuzia de sange incompatibil unde TCD este tip Ig G si/sau C3d, C4

Sensibilizarea Er prin medicamente : penicilina (Ig G), rifampicina (C3)

Boala hemolitica a nou-nascutului unde TCD este tip Ig G (rar, C3d, C4)

Diferite boli2. testul Coombs indirect

16