Autoantitestek kimutatásának laboratóriumi problémái

Dr. Németh Julianna, Dr. Miklós KataOrszágos Gyógyintézeti Központ

Immundiagnosztikai OsztályBudapest

• 1901 P. Ehrlich– „Horror autotoxicus

des Organismus”– szövetkárosító

autotoxinok

• 1948 Hagraves– LE sejt

• 1957 autoantitest név• sejt-, szerv-,

szervrendszer-, szövetellenes antitestek

alma=antigén, autoantigén, tesztben használt antigén

kéz=antitest, autoantitestvizsgálandó minta

Különböző eljárásokkal kimutathatólegkisebb ellenanyag koncentrációk

• Nefelometria• Immunelektroforézis• Radiális immundiffúzió• Rakéta-immunelektroforézis• Komplement fixáció• Haemagglutináció• Immunfluoreszcencia• Enzim immunoassay (ELISA)• Lumineszcencia• Radio-immunoassay (RIA, Farr)• Immunoblot

• 20 – 50 mg• 20 – 40 mg• 5 – 10 mg• 2 – 10 mg• 0.2 – 1.0 mg• 0.2 – 1.0 mg• 1 – 100 ng• 0.2 – 100 pg• 0.1 – 100 pg• 0.1 – 100 pg• 0.2 – 100 pg

Indirekt immunfluoreszcencia elve

Indirekt immunfluoreszcencia

• Előnyei:– a vizsgálathoz használt antigén természetes

környezetében látható– a mintahígítás változtatásával (csökkentésével) a

metodika érzékenysége fokozható– inkubációs idő növelésével a vizsgálat érzékenysége

növelhető– a beteg különféle autoantitestjei sokszor nem

tankönyvi vagy jól ismert formában jelennek meg, ilyenkor lehetőség van sejt /szövet / szerv metszetek kombinált használatára (biochip)

– konjugátum változtatásával izotípus specifikus– szűrésre alkalmas– kis mintaszám esetén is olcsó– részben automatizálható

Indirekt immunfluoreszcencia

• Hátrányai:

– kiértékelés gyakorlatot igényel– kiértékelésben sok a szubjektív elem– fluoreszcens mikroszkóp szükséges– heterofil antitestek zavaró hatása– háttér fluoreszcencia zavaró hatása– aspecifikus lelet nem ritka– konfirmáló metodikára szükség lehet (GBM, ANCA)– nagy minta szériára megszorításokkal alkalmas

Indirekt immunfluoreszcenciaautomatizálása

Immunassay (ELISA, EIA)

Előnyei:

magas szenzitivitáskis és nagy aviditásúantitestek kimutatásakvantitatív meghatározásizotípus meghatározás lehetséges automatizálhatónagy számú minta, gyors (olcsó) vizsgálata

Hátrányai:

sokszor bizonytalan antigén (forrás)

bizonytalan antigén tisztaság

egyedi standardok és kontrollok

nemzetközi standardizálás hiánya

aspecifikus reakciók okoztaálpozitivitás (CIC, RF, Ig)

ELISA automatizálása

Immunoblot (dot blot, line-blot, WB)

• Előnyei:

• magas specificitás• nagy tisztaságú antigén• egyidőben több antitest

válasz (betegség specifikus panelek)

• könnyen kiértékelhető• sürgős vizsgálatra

alkalmas• egy beteg vizsgálatára

alkalmas

• Hátrányai:

• szemikvantitatív• kiértékelése szemmel

szubjektív • drága• nagy számú vizsgálatra

nem alkalmas• szűrővizsgálatra nem

alkalmas

Blot technika

Autoantitest meghatározások laboratóriumi sajátosságai

• Hígítások megválasztása– gyerek / felnőtt ( ANA)– diagnózis / monitorozás (ANCA)– végtiter (> 1:160)– prozóna jelenség

• Mosási lépések fontossága• Kvalitatív eredmény (pozitív, negatív,

bizonytalan)• Kvantitatív lelet ( határérték pozitivitás!)

– RNP MCTD-ben mindig magas– AMA PBC-ben mindig magas titerű– SMA alacsony titerben nem diagnosztikus értékű

Prozóna / postzóna jelenség

• Mérési tartomány megválasztása• Extrém alacsony, extrém magas minták mérése• Hiba észrevétele• Mérési trükkök (450/405 nm)

Autoantitest meghatározások zavarótényezői

• heterofil antitestek• természetes / protektív

antitestek• magas keringő

immunkomplexkoncentráció

• magas RF• gyógyszerek• plazmapótszerek

Minőségbiztosítás

• preanalitikai hiba ( szobahő/+4oC):– minta vétel ( lipémia, hemolizis)– minta tárolás:

• mélyhűtött minta többszöri feloldása és vissza-fagyasztása ( neg. minta háttér fluoreszcenciája nő, aspecifikus kötődések zavaró hatása)

• kontrollok (kit-k használata, saját kontrollok, konjugátum kontroll)

• WHO standardok• külső minőség-ellenőrzés (NEQAS, PSIT)

Autoantitestek izotípusának meghatározása

• szűrővizsgálathoz használt konjugátumkiválasztás szempontjai

• coeliakia (IgA/IgG)• APS ( IgG/IgA/IgM)• neurológiai autoantitestek ( IgG/IgM)

• pozitív minták azonosítása• zavaró tényezők ( szélsőséges immunglobulin

értékek)• gazdaságossági tényezők (szűrés / konfirmálás)

Sürgős autoantitest meghatározás

• Glomerulonephritisek DD• Sürgősség oka (terápia

választás)• ANCA asszociált

vasculitisek– M. Wegener :cANCA– RPGN: pANCA

• Goodpasture sy: GBM• SLE: ANA, ds-DNA• Metodikaválasztás:

– gyors– megbizható– kombinált

Diagnosztikai és interpretálási problémák

• 1.az antigén ismerete a tesztben: SS-A

• 2.szenzitivitás és specificitás diagnosztikai jelentősége: RA diagnosztika

• 3.nemzetközi diagnosztikai ajánlás befolyása a teszt kiválasztására: cardiolipin tesztek

• 4.két eltérő teszt egy betegség igazolásához: ANCAdiagnosztika

• 5.kétféle teszt az AMA diagnosztikában

Tesztben használt antigén ismerete

• SS-A 60 és 52kDa• Diagnosztikai

jelentőség:– SLE– RA– M. Sjögren– neonatális lupus– gyógyszer indukálta

lupus– egyéb szisztémás

autoimmun betegség– egészségesek 5%-a

pozitív

Rheumatoid arthritis szerológiai markereiszenzitivitás / specificitás

91-99 %55-70 %Anti-CCP1 (1998)

91-99 %68-85 %Anti-CCP2

88-98 %35-55 %AKA (1979)Filaggrin (filament

aggregatingprotein)

73-90 %49-60 %APF (1964)~ 87 %~ 50 %WR (1948)< 65 %~ 75 %RF (IgM) (1937)

Specificitás (%)Szenzitivitás (%)Metodika

Rheuma faktor előfordulási gyakorisága

10-50gyulladásos tüdőbetegség

15-70CAH, PBC

5-20vasculitis

20-30szisztémás sclerosis

50-60MCTD

75-95Sjögren-szindróma

15-35SLE

70-90RA

Gyakoriság (%)

Kórkép

25-65endocarditis subacuta

5-60bakteriális fertőzések

100cryoglobulinaemia II

10-25egészségesek 70 év felett

< 5egészségesek 50 év alatt

5-25daganatos betegségek

15-65vírusos fertőzések

20-90parazitás fetőzések

Gyakoriság (%)

Kórkép

Rheumatoid arthritis szerológiai markereiszenzitivitás / specificitás

91-99 %55-70 %Anti-CCP1 (1998)

91-99 %68-85 %Anti-CCP2

88-98 %35-55 %AKA (1979)Filaggrin (filament

aggregatingprotein)

73-90 %49-60 %APF (1964)

~ 87 %~ 50 %WR (1948)

< 65 %~ 75 %RF (IgM) (1937)

Specificitás (%)Szenzitivitás (%)Metodika

Antifoszfolipid szindróma (APS) diagnosztikai kritériumai

Wilson és mts. 1999

Laboratóriumi kritériumok6 héten belül legalább 2 alkalommal mért pozitív

cardiolipin IgG és / vagy IgM koncentrációközepes vagy magas titerben, olyan standard ELISA teszttel, amely β2-GPI- függő cardiolipintmér

6 héten belül legalább 2 alkalommal pozitívnak talált plazma lupus antikoagulans ( az LA mérést az International Society on Thrombosis andHemostasis előírásai szerint kell végezni)

Cardiolipin teszt sajátosságai

• Bovin / human β2GPI• Diluens / puffer / plate• Közepes vagy magas koncentráció• Szűrés ( GAM) érzékeny teszt• Konfirmálás ( IgG, IgA, IgM) specifikus

teszt• Ismétlés

International Consensus Statement on Testing andReporting of Antineutrophyl Cytoplasmic Antibodies 1999

• Ajánlás

– „új beteg” laboratóriumi vizsgálatánál csak mindkét metodika kombinált eredménye alapján szabad a leletet kiadni (IIF, ELISA)

– a kétféle vizsgálat (IIF és ELISA) sorrendje is fontos: az IIF történjen előbb

– IIF mintázat nem elég specifikus a diagnózis felállításához, ezért terápiás döntéshez az ANCA ELISA leletre is szükség van

– minden nem c mintázat esetén ANA vizsgálata is ajánlott

– mindkét teszt forma quantitatív végzése ajánlott

ANCA diagnosztikaInternational Consensus Statement on Testing and

Reporting of Antineutrophyl Cytoplasmic Antibodies 1999

• Minimális diagnosztika:– minden, IIF-val pozitív ANCA mintából MPO

és PR-3 ELISA végzése ajánlott

• Optimális diagnosztika:– minden, a laboratóriumban történő ANCA

vizsgálat a 2 módszer kombinálásával adjon eredményt

AMA diagnosztika

• Arany standard: rágcsáló máj /vese / gyomor IIF

• Diagnosztikai ajánlás: 1.teszt: AMA2 ELISA– rekombináns:

• szenzitivitása.98%• specificitása: 85%

– biokémiai tisztítású:• szenzitivitása: 93%• specificitása: 96%

• AMA IIF- / ELISA v.BLOT+• AMA IIF+/ ELISA v.BLOT-

Autoantitest diagnosztika jelentősége

• Betegség diagnózisa: EMA cöliákiában• Betegségek közötti laboratóriumi

differenciáldiagnózis: RF pozitivitás• Betegség prognosztikai jellemzése:

centromer antitest• Therápia monitorizálása: ds-DNA elleni

antitest titere)• Szervi manifesztációk előrejelzése:

myositis SRP+ (szív), Mi-2+ (bőr)