Barbara Steiner

BOKU-University of Natural Resources and Applied Life Sciences Vienna, Department IFA-Tulln, Institute for Biotechnology in Plant Production, Konrad Lorenz Str. 20, A-.3430 Tulln, Austria

University of Natural Resources and Applied Life Sciences, ViennaDepartment IFA - Tulln

Zuchtmethodik und quantitative Genetik in der Pflanzenzüchtung - Übungen 951321

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Übung: Auswertung und Erfassung von Mikrosatelliten- und AFLP-Gelen, Überprüfung der Aufspaltung, Prüfung auf Kopplung mit Chi2 –Test, Berechnung der Rekombinationsrate

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SSR: GWM 720 Lane 1: Chinese Spring, Lane 2: Elter A, Lane 3: Elter B, Lane 4 bis 63 DH-Linien Nachkommen Elter A *Elter B

SSR: GWM 1121Lane 1: Chinese Spring, Lane 2: Elter A, Lane 3: Elter B, Lane 4 bis 63 DH-Linien Nachkommen Elter A *Elter B

AFLPSelektive Primer: Mse GC Sse AC

AFLP Mse GC Sse ACLane 1: Chinese Spring, Lane 2: Elter A, Lane 3: Elter B, Lane 4 bis 63 DH-Linien Nachkommen Elter A *Elter B

AFLP Mse GC Sse ACLane 1: Chinese Spring, Lane 2: Elter A, Lane 3: Elter B, Lane 4 bis 63 DH-Linien Nachkommen Elter A *Elter B

aflp1

aflp2

aflp3

Mikrosatelliten oder: SSR Simple Sequence Repeat, STR Short Tandem Repeat, STMS Sequence-Tagged Microsatellite site, SSLP Simple Sequence Length PolymorphismusVariable Wiederholung von einfachen Sequenzen (2-5 Nukleotide, Minisatelliten 10-15). Flankierende Regionen sind innerhalb einer Art konserviert. Polymorphismen durch unterschiedliche Anzahl der repeats – INDEL Polymorphismen; Mikrosatellitenmotive sind gleichmäßig über das Genom verteilt und kommen auch in Genen vor – EST-abgeleitete SSRs;

A B A/B

A --------------GAGAGAGAGAGAGAGAGA-------------------------

B ----------------GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA------------

Die bekannteste Anwendung von Mini- und Mikrosatelliten ist das DNA-Fingerprinting (Jeffreys et al. 1985).

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Detektion von Mikrosatelliten Polymorphismen beruhen auf INDELs, Detektion = Fragmentgrößenbestimmung

Gel-basierende Systeme • Agarose Gele• Hochauflösende Agarosegele• Native Acrylamidgele• Sequenziergele (denaturierende Acrylamidgel)

Agarosegel (2.5%)

Acrylamidgel (6%)

SSR Marker Tom316 auf 10 Tomatenlinien. Acrylamidegel hat bessere Auflösung!

Pavan et al. (2008): Euphytica 162: 91-98,

Sequenziergel: denaturierendes Polyacrylamid, 6%ig (LI-COR®), sehr gute Auflösung bis 2 bp Unterschied

8201

199

197

195

193

191

189

187

185

Bsp: Kapillare Elektrophorese von SSR MarkerFragmentlänge von 185 bis 201 bpDetektion mittels FluoreszenzGrößenbestimmung relativ zu Standard

Semi-automatische Analyse möglich

Source: http://www.traitgenetics.com

Kapillare Elektrophorese• Kapillare Sequenzierer• Chip Elektrophorese

Detektion von Mikrosatelliten

Vor- und Nachteile von Mikrosatelliten

+ sehr gut reproduzierbar, wenig DNA nötig+ ko-dominant + Locus spezifisch und viele SSR Marker sind genetisch kartiert+ einfache Handhabung und sehr gut automatisierbar+ hohe Zahl an Allelen in einem Mikrosatellitenlocus + direkt verwendbar in der marker-gestützten Selektion

- Entwicklungskosten aufgrund des Sequenzierungsbedarfs- nicht für alle landwirtschaftlichen Nutzpflanzen entwickelt

AnwendungWichtiger Markertyp für die praktische Pflanzenzüchtung: Marker-gestützten Selektion, Sortenidentifizierung, genetische Diversitätsstudien, „Ankermarker“ zum Erstellen von genetischen Karten, kartieren von wichtigen Merkmalen;

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AFLP-MarkerAmplified Fragment Length Polymorphism

Die AFLP®-Technik (Keygene 1993 Zabeau & Vos) ist eine beliebte Technik für DNA-fingerprinting.

Kombination aus Restriktionsverdau mit einem/zwei Enzymen und 2-Schritt-PCR-AmplifikationPolymorphismen durch Mutation in der Restriktionsschnittstelle und INDELs.

Owner:

http://www.keygene.com

Vos et al. (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acids Res. 11: 4407–4414.

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+1 +2 +3 +4 selective nukleotides

AFLP-flow-chart

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Beispiel für ein AFLP-Gel

Verdau mit den Enzymen Sse8387I und MseI

Selektive primer KombinationMseAA/SseTT

BC1F5 lines von Triticum durum x Triticum dicoccum

Cy5 markierte Fragmente,visualisiert auf einem Fluoreszenzscanner (Typhoon TRIO)

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AFLP-Elektropherogramm

Pare

nt 1

Pare

nt 2

*

*

Ausschnitt mit 25 Gelspuren und 14 Polymorphismen,

AFLP sind überwiegend (ca. 90% der AFLP) dominante Marker auswertbar:Bande vorhanden oder Bande fehlend

*

** ca. 10% der AFLP Marker sind ko-dominant auswertbar

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ABAACACACAACCAAAACCACAACAABDBDDDBDBDDBDDBDDDDDDDDD

ABAAAAAAAABBAACAAAAAABAAA

ABCAACAAAAAAAACAAAACAAAAA

Elte

r 1El

ter 2

ABDDDDDDBDBBBBDDBDDDDDDDD

ABDDDDDDDBBDDDDDDDBDBDDBD

Und so weiter….

Beispiel 2: Auswertung für dominanten AFLP-Marker

Diese beiden AFLP Banden gehören wahrscheinlich zu einem ko-dominanten AFLP Marker, daher gemeinsame Auswertung mit A, B, H möglich

nach unserer Erfahrung ca. 10% der AFLPs ko-dominant e Marker (Polymorphismus : INDEL zwischen Primerbindungsstellen)

WS 2014/15 Zuchtmethodik und quant. Genetik - Übungen 951321

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Vor- und Nachteile von AFLP-Markern

+ universell einsetzbar + keine Sequenzinformationen nötig + sehr gute Reproduzierbarkeit+ große Fragmentanzahl pro PCR (50-150 Banden) daher effiziente Methode zur Polymorphismusdetektion + wenig DNA notwendig + mit wenigen Primern große Anzahl an Kombinationsmöglichkeiten

- AFLPs sind meist dominante Marker und ‚anonyme‘ Marker- sehr gute DNA-Qualität ist nötig- technisch herausfordernd- AFLP-Gele sind oft schwierig auszuwerten - keine direkte Anwendung in der marker-gestützten Selektion möglich