Biohemija I Praktikum 2011 13

BIOHEMIJA ILABORATORIJSKE VJEŽBE

Student: _____________________________

BIOHEMIJA I–laboratorijske vježbe

1

Vježba broj 1

KVALITATIVNO I KVANTITATIVNO ODREĐIVANJEUGLJIKOHIDRATA

1. TEORETSKI DIO

Ugljikohidrati (šećeri, saharidi) su spojevi izgrađeni od lanca ugljikovodika na kojem jevezano više hidroksilnih grupa i po jedna aldehidna ili keto grupa. Nazivaju se i polihidroksilnialdehidi i polihidroksilni ketoni. Dijele se na proste i složene.

Prosti šećeri ili monosaharidi se dijele na aldoze i ketoze. Lanac od nC atoma ima n-1hidroksilnih grupa i ovisno o vrsti šećera, jednu aldehidnu ili jednu keto skupinu. Prema brojuC atoma dijele se na trioze, tetroze, pentoze, heksoze i heptoze. Složeni šećeri se dijele naholozide i heterozide. Holozidi su izgrađeni od više međusobno povezanih monosaharidnihjedinica koje se povezuju glikozidnom vezom. Prema složenosti dijele se na oligosaharide (2-10 jedinica) i polisaharide više od 10 monosaharidnih jedinica. Heterozidi (glikozidi) suspojevi monosaharida ili oligosaharida s nekom nešećernom frakcijom koja se naziva aglikon.

Šećeri su vrlo rasprostranjeni u prirodi i imaju višestruke biološke uloge: strukturni elementi: npr. celuloza u biljnom svijetu, a u životinjskom svijetu

polisaharidi izgrađuju zaštitne opne i oklope energetska rezerva: glikogen kod životinja i škrob u biljnom svijetu osnovni intermedijeri metabolizma: npr. šećer riboza koja ulazi u izgradnju RNA,

DNA i raznih koenzima uloga receptora raznih signala: na površini stanice glikoproteini i glikolipidi svojim

šećernim dijelom molekule imaju ulogu receptora raznih hemijskih i električnih signala.

Prisustvo karbonilne grupe u molekulama šećera uslovljava izvanrednu hemijskureaktivnost. Danas je prihvaćena poluacetalna struktura prostih šećera koja se predstavljaputem Haworth-ove projekcione strukture (slika 7).

Slika 7: Strukturna formula glukoze


2

Poluacetalna hidroksilna grupa se po svojim osobinama razlikuje od ostalih OH grupa umolekuli šećera. Ona interakcijom sa alkoholnom grupom istog ili različitog monosaharida, uzizdvajanje molekule vode omogućava formiranje kisikovih mostova, koji su bitni zapolimerizaciju monosaharida (nastanak glikozidnih veza).

Po osobinama, monosaharidi se razlikuju od drugih organskih supstanci: Oksidacija i redukcija -procesom oksidacije monosaharidi prelaze u onske, uronske i

dikarbonske oksikiseline. Onske nastaju oksidacijom aldehidne grupe u karboksilnu,uronske oksidacijom primarne OH-grupe u karboksilnu, a dikarbonske kiseline nastajuoksidacijom aldehidne i primarne alkoholne grupe. Na bazi oksidacije monosaharidauvedene su reakcije dokazivanja šećera u rastvoru, kao što su: Tromerova, Benediktova,Bottger-ova, Nylander-ova, Felingova i dr. Monosaharidi uz prisustvo nekogredukujućeg sredstva mogu preći u odgovarajuće alkohole, pri čemu se redukujealdehidna grupa od aldoze, a keto grupa od ketoze. Redukcija se vrši u baznoj sredini ipri povišenoj temperaturi. Šećeri sastavljeni iz dva ili više monosaharida (npr.oligosaharidi imaju 2-10 monosaharida) mogu zadržati reducirajuća svojstva ako imjedna reducirajuća grupa (aldehidna ili keto) nije stupila u glikozidnu vezu.

Optička aktivnost - Većina šećera ima svojstvo zakretanja ravni polarizirane svjetlostikao posljedicu posjedovanja asimetrično-og/ih C-atoma, što se koristi za kvalitativno(provjerom specifičnog ugla zakretanja) i kvantitativno (mjerenjem ugla zakretanja)određivanje. Mjerenjem optičke aktivnosti može se pratiti i kinetika brojnih reakcija.Kao primjer može se navesti i hidrolize saharoze, koja se još zove inverzija saharoze,jer je saharoza kao spoj desnogira (zakreće ravan polarizovane svijetlosti udesno), aprodukt koji nastaje hidrolizom je lijevogiri. Hidrolizom nastaje ekvimolarna smjesaglukoze i fruktoze. Obzirom da je fruktoza lijevogira, a glukoza desnogira, u otopinidva šećera dominira onaj smjer obrtanja polarizovane svijetlosti čiji je specifični ugaozakretanja veći. U ovom slučaju to je specifični ugao fruktoze i otopina je lijevogira.Zato se ekvimolarna smjesa glukoze i fruktoze naziva invertni šećer.

Konfiguracija monosaharida - označava se velikim slovima D i L, pa šećeri koji noseoznaku D imaju desnu, a šećeri koji imaju oznaku L imaju lijevu konfiguraciju. Svimonosaharidi koji imaju raspored H i OH-grupe na posljednjem asimetričnom, odnosnopretposljednjem C-atomu, kao i D-glukoza imaju desnu konfiguraciju bez obzira kakoobrću ravan polarizovane svjetlosti.

Pouzdano kvalitativno i kvantitativno određivanje ugljikohidrata vrši se brojnimhromatografskim metodama uz primjenu čistih šećera kao standarda.Reakcije koje se koriste za kvalitativno dokazivanje prisustva ugljikohidrata temelje senajčešće na reducirajućim svojstvima mono- i disaharida, oksidaciji mono- i disaharida uzvezivanje nastalih produkata pogodnim reagensima u specifično obojene komplekse. Vrlojednostavan eksperiment za kvalitativno dokazivanje šećera je karameliziranje koje se dešavana povišenoj temperaturi kada nastaju produkti (boja može varirati od žute preko smeđe docrne ovisno o visini temperature i vremenu zagrijavanja) uz izdvajanje karakterističnog iugodnog mirisa. Temperatura topljenja (preciznije temperatura raspadanja) kao fizičkakonstanta također služi pri identifikaciji šećera.

Fermentacija - pri djelovanju kvasca na otopine većine monosaharida, nekih disaharida ioligosaharida, dolazi do selektivne fermentacije. Ovisno o prisustvu odgovarajućih enzima u


3

pekarskom ili pivskom kvascu fermentacija može biti alkoholna i mliječno-kiselinska. Kodprve nastaje etanol, a kod druge kojoj podliježe mliječni šećer laktoza nastaje mliječna kiselina.

2. EKSPERIMENTALNI DIO

Reducirajuća svojstva monosaharida i disaharida

1. Trommerova reakcijaNa ispitivanu probu (1-2 ml otopine šećera) dodaje se isti volumen 2 M NaOH i uz miješanjetoliko 0,25 M otopine CuSO4 dok se ne stvori talog Cu(OH)2 koji se više ne otapa.Zagrijavanjem, reducirajući šećeri izdvajaju crveni talog Cu2O:

2. Fehlingova reakcijaU epruvetu sipati 1 ml reagensa Fehling I i Fehling II i zagrijavati na ključalom vodenomkupatilu nekoliko minuta. Zatim dodati ispitivanu otopinu šećera i ukoliko se odmah ne pojavicrveni talog Cu2O nastaviti grijati.

-Fehling I: vodena otopina bakar(II)-sulfata (6,25 g CuSO4x5H2O u 100 ml H2O)-Fehling II: alkalna otopina kalijum-natrijum tartarata (15 g NaOH i 5 g soli u 100 ml H2O)Pri spajanju Fehlinga I i Fehlinga II nastaje plavo obojeni kompleks bakarkalijnatrij tartarata.

3. Benedictova reakcijaU epruvetu se stavi 1,5 ml Benedictovog reagensa i nekoliko kapi ispitivane probe i zagrijava 2minute na ključalom vodenom kupatilu. Crveni talog Cu2O dokaz je prisustva reducirajućihšećera.


4

Benedictov reagens:1. Otopi se 173 g bezvodnog Na-citrata i 90 g bezvodnog Na-karbonata u 600 ml

destilovane vode uz grijanje. Po potrebi se filtrira. Nadopuniti sa destilovanom vodomdo 850 ml.

2. Otopi se 17,3 CuSO4x5H2O u 150 ml H2O. Nakon toga otopina 1, postepeno, uzmješanje, dodaje se u otopinu 2.

4. Nylanderova reakcijaNa 2 ml ispitivane otopine dodaje se 0,5 ml Nylanderova reagensa i zagrijava do pojavesmeđeg do crnog taloga od izdvojenog bizmuta:

Nylanderov reagens: otopi se 4 g K-Na tartarata u 100 ml 10 %-og NaOH. Tome se dodaje 2 gbizmutnitrata i zagrijava. Nakon toga, filtrirati i ohlađeni filtrat koristiti kao reagens.

5. Reakcija srebrnog ogledalaU epruvetu sipati 2 ml 10 %-og AgNO3 i dodavati NH4OH do alkalne reakcije. Zatim dodati 2ml 1 %-ne otopine glukoze i grijati na vodenom kupatilu. Nakon izvjesnog vremena nazidovima epruvete stvara se ogledalo od izdvojenog srebra.

Ostale bojene reakcije za dokazivanje ugljikohidrata

1. Molischeva reakcijaMolischeva reakcija je opća reakcija na prisustvo šećera. Negativna proba isključuje njihovoprisustvo u ispitivanom uzorku. Temelji se na dehidratacionom djelovanju koncentriranihkiselina pri čemu nastaje furfural ili njegovi derivati koji sa α-naftolom daju obojene spojeve.

Postupak: na 2 ml ispitivane otopine dodati nekoliko kapi Molischeva reagensa, promješa ivrlo pažljivo, niz zidove epruvete dodati 3 ml konc. H2SO4. Na dodirnom sloju dvije tečnostijavlja se crveno-ljubičasto obojenje, koje ukazuje na prisustvo šećera.


5

2. Seliwanov test-razlikovanje aldoza i ketozaSpecifična reakcija na ketoze izvodi se Seliwanovim reagensom (otopina rezorcinola u HCl).Ketoze se dehidratiziraju sa rezorcinolom do furfurala (derivata furfurala) mnogo brže odaldoza, a furfural se kondenzira sa rezorcinolom i gradi kompleks crvene boje.Postupak: na 2 ml Seliwanov-og reagensa dodati nekoliko kapi ketoze (fruktoze) i zagrijavatido ključanja u toku 60 sekundi. Nastaje crvenkasto obojenje, a zatim crveni talog.

Razlikovanje pentoza i heksoza

1. Tauberova reakcijaOva reakcija je selektivno pozitivna na pentoze. Reagens sadrži benzidin u koncentrovanojacetatnoj kiselini. Postupak: na 0,5 ml pentoze (arabinoza, riboza, ksiloza) dodati 2 mlTauberovog reagensa, zagrijati do ključanja do smanjenja volumena na polovicu. Epruvetuzatim uroniti u hladnu vodu i dopuniti vodom na polazni volumen. U toku nekoliko sekundijavlja se vrlo stabilna svijetlo-crvena boja.

2. Bialova reakcijaOva reakcija je pozitivna na pentoze, a reagens sadrži orcinol i željezo(III)-hlorid u HCl.Postupak: Na 1,5 ml pentoze dodati 2,5 ml reagensa i grijati na ključalom vodenom kupatilu.Pentoze zagrijavanjem sa HCl daju furfural koji se u prisustvu feri jona kondenzira saorcinolom (1,3-dihidroksi-5-metilbenzen) pri čemu se javlja zeleno obojeni kompleks. Ponovitireakciju sa glukozom i ustanoviti negativan test.

FermentacijaNa suspenziju kvasca u vodi dodati otopinu koja se ispituje (2 %-nu fruktozu). Zatvoritiepruvetu (tzv. patkicu), okrenuti je i držati u termostatu pri 37 °C. Nakon 30 minuta zapažajuse mjehurići izdvojenog CO2, koji idu prema vrhu epruvete i potiskuju tečnost.


6

Hidroliza i inverzija saharoze1. Sa 1-2 ml otopine saharoze izvesti neku od reducirajućih proba (npr. Trommerovu iliBenedictovu) i zabilježiti ishod. Nakon toga, na 5 ml otopine saharoze dodati 0,5 ml konc. HCli zagrijavati 20-30 minuta na ključalom vodenom kupatilu. Ohladiti i hidrolizat neutraliziratizasićenom otopinom Na-karbonata.

2. Na neutraliziranoj otopini izvesti Benedictovu probu i konstatirati prisustvo reducirajućihgrupa, nastalih hidrolitičkim cijepanjem glikozidne veze.

Određivanje glukoze po Willstätter-uJod se u alkalnoj sredini prevodi u hipojodit koji oksidira aldoze do odgovarajućih aldonskihkiselina, a sam se redukuje u jodid. Višak joda koji nije reagovao sa aldozom odredi se saNa2S2O3. Iz količine joda koji je reagovao sa aldozom izračunava se preko utroškaodgovarajućeg rastvora Na2S2O3 sadržaj aldoze. Rastvor joda i baze moraju se brzo promješatisa rastvorom šećera da bi se izvršila reakcija oksidacije šećera. Ukoliko se sporo radi dolazi dooksidacije hipojodita u jodate, koji ne reaguju sa šećerom u alkalnoj sredini.

J2 + 4OH- → 2JO- + 2H2O

JO- + CH2CH(CHOH)4CHO + OH- → CH2OH(CHOH)4COONa + J- + H2O

Ketoze i disaharidi trehaloznog tipa ne reaguju sa alkalnim rastvorom joda.Treba se imati u vidu da sve aldoze i disaharidi maltoznog tipa (laktoza, maltoza) reaguju saalkalnim rastvorom joda na isti način kao i glukoza, te se u njihovom prisustvu ne možeodrediti glukoza na ovaj način. Međutim, praktično, u namirnicama u kojima se određujeglukoza kao što su proizvodi od šećera, voćne prerađevine, med i drugo, osim glukoze nema nijedne druge aldoze u količini koja bi bitno uticala na rezultat.

Potrebni reagensi:- 0,1 M rastvor joda- 0,2 M NaHCO3- 0,2 M Na2CO3- 25 % H2SO4- 0, 1 M Na2S2O3- 1 % škrob

PROCEDURA ZA RADU erlenmajer se uzme 25 ml “osnovnog filtrata” (nastalog rastvaranjem 2 g meda u 250 mlvode), pomješa se sa 25 ml 0,2 N Na2CO3, ostavi se da stoji 1-2 sata na tamnom mjestu. Nakonstajanja zakiseli se sa 12 ml 25 % H2SO4, a slobodni jod titrira sa 0,1 M Na2S2O3, uz škrob kaoindikator. Istovremeno se radi i slijepa proba. Na osnovu dobijenih vrijednosti odredi se sadržajglukoze u ispitivanom uzorku.


7

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Kakve osobine pokazuju monosaharidi:a) reducirajućeb) oksidirajućec) hidroksilirajuće

2. Napišite strukturne formule α-D-glukopiranoze i β-D-glukopiranoze?

3. Napišite strukturne formule: α-D-ribofuranoze i α-D-dezoksiribofuranoze?

4. Koji disaharidi u svom sastavu sadrže α-D-glukozu:a) maltozab) saharozac) laktozad) celobioza

5. Koji disaharidi u svom sastavu imaju β-D-glukozu?e) celobiozaf) laktozag) saharoza

6. Koji od navedenih ugljikohidrata će dati pozitivnu (+) ili negativnu (-) reakciju sanavedenim reagensima?

Benediktova reakcija Selivanov test Fermentacija Reakcija sa jodomGlukozaFruktozaGalaktozaSaharozaLaktozaMaltoza


8

7. Napisati konačnu reakciju alkoholne i mliječno-kiselinske fermentacije?

8. Napišite strukturne formule disaharidaa) trehalozeb) maltoze

4. REZULTATI

Uzorak Reakcija Opažanja i rezultat


9

Uzorak Reakcija Opažanja i rezultati


10

Određivanje koncentracije glukoze u uzorku

OVJERA VJEŽBE:


11

Vježba broj 2

POLISAHARIDI1. TEORETSKI DIO

Polisaharidi su sastavljeni od većeg broja monosaharida (više od 10) međusobnopovezanih glikozidnom vezom i nemaju reducirajuća svojstva. Najčešće imaju koloidnikarakter (škrob, glikogen itd.) ili su netopivi u vodi (celuloza). Koloidno stanje se možepotvrditi taloženjem. Razlikuju se homo- i heteropolisaharidi. Homopolisaharidi su izgrađeniod iste vrste monosaharidnih jedinica, a heteropolisaharidi od različitih vrsta.

Kod biljaka je velika raznolikost polisaharida koji uglavnom ispunjavaju dvije funkcije:izgrađuju stanične stijenke i stanične potporne elemente, ili su rezervne tvari u obliku škroba iinulina. Hidrolizom polisaharida nastaju postepeno slijedeći proizvodi razgradnje: dekstrini,disaharidi i najzad monosaharidi. Tokom hidrolize gube se karakteristične reakcijepolisaharida, a postepeno se javljaju redukujuće osobine nastalih di- i monosaharida.

Škrob – je biljna rezervna tvar, koja se osobito mnogo nakuplja u zrnima (žito) igomoljima u obliku škrobnih zrnaca. Ekstrakcijom i frakcioniranjem škrob se može razgraditina dva različita spoja amilozu i amilopektin. Čisti škrob je bijeli prah, nerastvorljiv u hladnojvodi, a u toploj daje koloidni rastvor. Škrob je izgrađen od 15-30% amiloze i 70- 85%amilopektina. Amiloza je linearni polimer koji nastaje povezivanjem D-glukoza (1-4)glikozidnim vezama. Broj glukoza u amilozi je 200-3000. Amiloza ima spiralnu konformacijuu kojoj je 6-7 glukoznih jedinica u jednoj spirali. Amilopektin je izgrađen od glukoznih lanacau kojima je zastupljena (1-4) glikozidna veza, koji su međusobno razgranati (1-6)glikozidnim vezama. U amilopektinu ima jedno grananje na prosječno 25 jedinica glukoze.Pod djelovanjem enzima (α i β amilaze) komponente škroba se postepeno razlažu na dekstrine(smjesa polisaharida niže molekularne težine), (+)-maltozu i konačno D(+)-glukozu. Smjesasvih tih spojeva se nalazi npr. u kukuruznom sirupu.

Slika 8: Struktura amiloze i amilopektina

Celuloza – je raširena u biljnom svijetu. Obično je povezana sa ostalim tvarima zaizgradnju (lignin). Gotovo čista celuloza nalazi se u staničnim stijenkama dlačica pamuka.Tehnička se dobiva najčešće od drveta, te različitim metodama čisti od lignina i drugihpopratnih tvari. Prirodna celuloza sadrži oko 8000-12000 jedinica glukoze povezaneglikozidnim vezama između C1 i C4. Celuloza se ne rastvara u vodi, ni u razblaženimkiselinama i bazama. Rastvara se u Schweitzerovom reagensu [Cu(NH3)4][OH]2. Hidrolizom sa


12

koncentrovanom hloridnom kiselinom se razlaže do glukoze. Tretiranjem celuloze sa dušičnomkiselinom dobiva se nitroceluloza, koja je eksplozivan spoj.

Glikogen – je rezervni ugljikohidrat unutar životinjskih stanica. Sadržaj glikogena ujetri ovisi o prehrani, jer se već nakon kratkog gladovanja spušta na minimalnu vrijednost.Glikogen je veoma razgranat polisaharid, velike relativne molekulske mase (od 105 do 107).

Heteropolisaharidi se nalaze i u biljnom i u životinjskom svijetu gdje uglavnom imajuulogu izgradnje potpornih i zaštitnih tkiva. Dijele se na:

Glikozaminoglikani, koji su izgrađeni od ponavljajućih disaharidnih jedinica kojesadrže derivat jednog od amino šećera (glukozamina ili galaktozamina). Jedan odšećera u disaharidu sadrži negativno nabijenu karboksilnu ili sulfatnu skupinu.Glikokonjugati, koji su izgrađeni od oligosaharidne šećerne jedinice s jedne strane iproteina ili lipida s druge strane.Glikoproteini, koji nastaju spajanjem male oligosaharidne šećerne jedinice na velikuproteinsku molekulu. Postoje dva načina povezivanja proteinske molekule i šećernejedinice: O i N glikozidne veze.Glikolipidi su spojevi koji imaju jedan hidrofobni lipidni i jedan hidrofilni šećerni dio.Hidrofilna šećerna jedinica je glukoza ili galaktoza na koju se dalje nadovezujurazgranati oligosaharidi, dok hidrofobni dio molekule čine neki diacilglicerol iliaminoalkohol sfingozin i na njega vezana neka višemasna kiselina.

Razlikovanje polisaharida se zasniva na: rastvorljivosti u vodi (koloidne otopine) specifičnim reakcijama


Koloidne osobine

1. Taloženje alkoholomŠkrob se taloži 95 %-tnim etanolom tako što se na određeni volumen suspenzije škroba u vodidodaje isti volumen etanola. Otopina se promućka i ostavi da se izvrši taloženje, a zatim talogodvoji filtriranjem. Na filtrat i na talog izvesti reakciju sa jodom.

2. Taloženje amonijum-sulfatomNa određeni volumen škroba dodaje se isti volumen zasićenog rastvora (NH4)2SO4, dobropromućka i ostavi da stoji neko vrijeme. Škrob se taloži, a filtrat daje negativnu reakciju sajodom.

Reakcije sa jodom1. Reakcije na škrobNa 5 ml suspenzije škroba u vodi dodati Lugolov reagens (J2 u vodenom rastvoru KJ). Javlja seizrazito plava boja koja je pri jačoj koncentraciji tamno-modra.


13

Hidroliza škrobaHidroliza škroba provodi se u kiseloj sredini uz zagrijavanje. Na nekoliko mililitara vodeneotopine škroba doda se 2-3 ml HCl (3 mol/dm3) i stavi u ključalo vodeno kupatilo. Poslijesvaka dva minuta uzima se po nekoliko kapi hidrolizata i izvodi proba Lugolovim reagensom.Označi se vrijeme koje je potrebno za prvu promjenu boje sa škrobom i nastave probe sve dokreakcija sa jodom ne postane negativna. Dio finalnog hidrolizata neutralizirati sa Na2CO3 iizvesti jednu od reducirajućih reakcija, čiji će pozitivni test ukazati da je škrob razložen nadisaharid maltozu, odnosno monosaharid glukozu.

NapomenaTokom hidrolize škrob daje sljedeće međuproizvode: amilodekstrine, koji sa jodom daju crvenosmeđe obojenje; eritrodekstrine-sa jodom daje purpurnocrveno obojenje; ahrodekstrine-sa jodom ne daju boju; maltozu i glukozu-sa jodom ne daju boju, ali daju pozitivne redukujuće probe.

Proizvodi hidrolitičke razgradnje škroba mogu se utvrditi na primjer u hljebu.Na nekoliko komadića hljeba dodati vodu, homogenizirati, ostaviti da stoji izvjesno vrijeme,filtrirati kroz gazu, a zatim kroz filter-papir.Sa malom količinom filtrata izvesti jodnu probu, čija purpurnocrvena boja ukazuje na nastalieritrodekstrin tokom pečenja hljeba.Maltoza i glukoza nastaju hidrolitičkom transformacijom jednog dijela škroba iz brašna poduticajem enzima amilaze iz pšenice, koja se aktivira temperaturom u toku procesa kvasanjahljeba.U hljebu dakle, postoje istovremeno, škrob, dekstrini, maltoza i glukoza, jer proces kvasanja ipečenja uslovljava prelaz jednog dijela škroba u njegove razgradne proizvode.

Hidroliza celuloze

U posudu za hidrolizu staviti usitnjeni filter papir ili mikrokristaličnu celulozu i dodati oko 3ml hloridne kiseline (3 mol/dm3). Dobija se gusti sirup, koji se pažljivo sipa u vodu (oko 5 ml)i pusti da ključa 30 minuta. Ohladiti, neutralizirati 10%-tnim Na2CO3 (pažljivo uz lakmuspapir). Na neutralnom hidrolizatu izvesti neku od redukujućih proba.

Napomena: tokom hidrolize iz celuloze nastaju celobioza i glukoza, koje imaju redukujućasvojstva.

3. ZADACI I VJEŽBE

1. U sastav kojeg polisaharida ulaze ostaci fruktoze:a) glikogenab) škrobac) inulinad) celuloze


14

2. Koji se monosaharid dobija pri potpunoj hidrolizi glikogena:a) D-fruktozab) glukoza-1-fosfatc) glukozo-6-fosfatd) D-glukoza

3. Koji ugljikohidrati pripradaju heteropolisaharidima:a) heparinb) arabinozac) arabind) glikogene) hialuronska kiselina

4. Kojim specifičnostima strukture su uslovljene razlike u osobinama celuloze iglikogena?

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Od navedenih primjera izaberite pravilne:a) sastavna komponenta celuloze je α-glukozab) pri kiseloj hidrolizi skroba gradi se maltozac) djelovanjem maltaza na maltozu nastaje α-glukozad) proizvodi hidrolize mnogih polisaharida su heksoze i njihovi derivatie) pri redukciji aldoza i ketoza grade se alkoholi

6. Napišite strukturne formule slijedećih disaharida: laktoze, saharoze, celobioze! Kojimonosaharidi ulaze u njihov sastav?

7. Koji spojevi pripadaju heteropolisaharidima? Navedite njihov sastav?____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


15

4. REZULTATI


OVJERA VJEŽBE:


16

Vježba broj 3

KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE LAKTOZEPOLARIMETRIJSKOM METODOM

(ODREĐIVANJE SADRŽAJA LAKTOZE (IZRAŽEN U %) U UZORKU MLIJEKA)

1. TEORETSKI UVOD

Polarimetrija je optička metoda pomoću koje se prati zakretanje ravni polariziranesvjetlosti. To zakretanje ravni polarizirane svjetlosti naziva se optička rotacija, a spojevi kojizakreću ravan su optički aktivni. Veličina i pravac zakretanja ravni polarizovane svjetlosti kojeprolazi kroz rastvor neke asimetrične supstance je reprodukujuća i stalna veličina i može sekvantitativno odrediti. Zakretanje ravni polarizovane svjetlosti može da bude desno (u pravcukazaljke na satu) i lijevo (suprotno kretanju kazaljke na satu). Spoj koji zakreće udesno imadesnu rotaciju i obilježava se sa (+), a spoj koji zakreće ulijevo ima lijevu rotaciju i obilježavase sa (-). Uslov za optičku aktivnost jednog organskog spoja je prisustvo jednog asimetričnogcentra u molekuli, odnosno atoma ugljika kod kojeg su sve četiri valencije zasićene različitimgrupama ili radikalima.

Instrument pomoću kojeg se određuje vrijednost ugla zakretanja ravni polariziranesvjetlosti zove se polarimetar. Polarizirana svjetlost nastaje kada se svjetlost određene valnedužine iz vidljivog dijela elektromagnetnog spektra propusti kroz sistem Nikolovih prizmi.Znak polarizovane svjetlosti, žute svjetlosti iz svjetlosnog izvora prolazi kroz sabirno sočivo ipada na nepokretnu prizmu, izrađenu od kalcita koja ima osobinu dvostrukog prelamanjasvjetlosti. Ona je polarizator svjetlosti. Polarizovani zrak iz polarizatora dolazi na druguprizmu, koja se okreće oko svoje horizontalne ose (analizator). Iz analizatora zrak kroz sistemsočiva dolazi do oka posmatrača. Svjetlost kod koje su smjerovi oscilacija sređeni na nekinačin naziva se polarizovana svjetlost.

Slika 9: Princip rada polarimetra.

Vrijednost ugla rotacije ravni polarizirane svjetlosti za optički aktivnu tvar ovisi o: Strukturi molekule Broju molekula na svjetlosnom putu (koncentraciji) Temperaturi Talasnoj dužini svjetlosti iz izvora Otapalu


17

Specifični ugao rotacije nekog enantiomera je veličina ugla rotacije koja potiče od 1,00g tvari u 1,00 cm3 otapala u cijevi dužine 1,00 dm na određenoj temperaturi, valnoj dužinisvjetlosti i određenom otapalu. Najčešće se koristi svjetlost valne dužine 589,3 nm(natrijumova D linija). Specifični ugao rotacije ( TD ) za neku optički aktivnu tvar izračunavase iz izmjerenog ugla rotacije na polarimetru () pomoću slijedeće formule:

cl

TD

gdje je:

l – dužina kivete (dm)T – termodinamička temperaturaD – valna dužina volframove lampe koja odgovara žutoj natrijevoj liniji pri 589,3 nm.c – koncentracija tvari (g/cm3)

Mnogi optički aktivni spojevi daju otopine kod kojih se vrijednost ugla zakretanja ravnipolarizirane svjetlosti mijenja tokom vremena. Ova pojava, koja se naziva mutarotacija (lat.mutare = mijenjati) posljedica je aldehid-poluacetalne ravnoteže:

OHHO

OHOH

CH2OH

C

O

HO

OH

OH

OHHO

CH2OHO OH

OH

OHHO

CH2OH

-D-glukoza D-glukoza -D-glukoza(lančani oblik)

Slika 10: Strukturne formule α-D i β-D-glukoze

Svježe pripremljena otopina -D-glukoze ima specifični ugao zakretanja +112, a -D-glukoze +18,7. Tokom vremena, bilo koji od ova dva oblika glukoze mutarotacijom dostignekonačnu vrijednost specifičnog ugla zakretanja od +52,7. Prema tome, otopina glukoze kojapokazuje specifični ugao zakretanja od +52,7 predstavlja u stvari ravnotežnu smjesu i oblika.


Potrebni reagensi:- mlijeko- laktoza


18

- reagens za bistrenje ( 40g kalij-jodida rastvoriti u 200ml vode, dodati 55g živinogjodida i sve dopuniti vodom do 500ml. Izvjesno vrijeme se mućka, a zatim se pusti dase talog slegne. Bistri talog se odlije)

- 20 % sumporna kiselina (H2SO4)

Optička metoda koja će se koristiti je polarimetrija. Detekcija se ostvaruje očitavanjemugla zakretanja na odgovarajućoj mjernoj skali koja je povezana sa analizatorom.

PROCEDURA ZA RADPripremiti po 50 ml 1 %, 2 %, 5%, 10 % i 15 %-tne otopine laktoze i držati 30 minuta natemperaturi 40 - 50 C, da bi se mutarotacija svela na minimum (U svrhu dobijanja boljihrezultata otopine se pripreme 24h prije mjerenja i ostave na temperaturu od 2 – 8 C). Prije radasa otopinama potrebno je naći korekciju (odstupanje od nule na mjernoj skali) polarimetrapomoću destilirane vode.Nakon toga za svaku otopinu izmjeriti ugao zakretanja na polarimetru i nacrtati grafik namilimetarskom papiru gdje je = f(c), gdje je mjereni ugao, a c koncentracija laktoze ug/100 ml, odnosno u %.

Zatim se mjeri ugao zakretanja otopine mlijeka. Uzme se 75 ml mlijeka u odmjerni sud od 100ml, doda se 7,5 ml 20% H2SO4 i 7,5 ml reagensa za bistrenje, a zatim dopuni vodom do marke.Filtrira se. Bistrom filtratu se mjeri ugao zakretanja.

Na osnovu kalibracione krive očitava se koncentracija u uzorku mlijeka.

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Objasnite, zašto u rastvoru α-galaktoze optička rotacija se vremenom smanjuje?Objasnite, zašto rastvori α- i β-oblika u istim koncentracijama po isteku određenogvremena pokazuju jednu te istu optičku aktivnost?

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2. Šta je inverzija, a šta je invertni šećer? Napišite formulu invertnog šećera?


19

3. Koristeći se podacima navedenim za specifične uglove zakretanja anomernih oblikaglukoze (u teorijskom dijelu) izračunati procentualnu zastupljenost tih oblika glukoze ustanju ravnoteže.

4. REZULTATI

- Vrijednosti mjerenja ugla zakretanja

α (H2O) α 1%laktoza

α 2%laktoza

α 5%laktoza

α 10%laktoza

α 15%laktoza

Uzorakmlijeka


20

- Koncentracija nepoznatog uzorka

- Uz izvještaj priložiti i grafik kalibracione krive.

OVJERA VJEŽBE


21

Vježba broj 4

KVALITATIVNO ODREĐIVANJE LIPIDA

1. TEORETSKI DIO

Prekursori lipida-masne kiseline

Masne kiseline su uglavnom monokarboksilne organske kiseline s ukupnim brojem Catoma većim od četiri. Mogu biti zasićene i nezasićene masne kiseline, ali gotovo uvijek snerazgranatim lancem. Masne kiseline se obilježavaju prema broju C atoma i prema broju ipoložaju dvostrukih veza:

C n:xn - broj C atomax - broj dvostrukih veza

Na primjer:C 14:0 miristinska kiselina ima 14 C atoma i nema dvostrukih vezaC18:2 (cis,cis-9, 12) linoleinska kiselina ima 18 C atoma i dvije cis dvostruke veze

iza devetog i dvanaestog C atoma.

Slika 2: Formule zasićene i nezasićene masne kiseline

Tabela 2: Pregled zasićenih masnih kiselinaBroj C atoma Naziv kiseline Formula

12 Laurinska CH3 (CH2)10COOH14 Miristrinska CH3 (CH2)12COOH16 Palmitinska CH3 (CH2)14COOH18 Stearinska CH3 (CH2)16COOH20 Arahidinska CH3 (CH2)18COOH22 Beheninska CH3 (CH2)20COOH24 Lignocerinska CH3 (CH2)22COOH

Tabela 3: Pregled nezasićenih masnih kiselinaBroj C atoma Naziv kiseline Formula

16 Palmitoleinska CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH

18 Oleinska CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH

18 Linolna CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH

18 Linoleinska CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH

20 Arahidonska CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)3COOH


22

Prisustvo dvostrukih veza u nezasićenim masnim kiselinama snižava tačku topljenja uodnosu na odgovarajuću zasićenu masnu kiselinu. S druge strane, tačka ključanja je utolikoviša što je lanac C atoma duži, dok prisustvovanje dvostrukih veza praktično nema utjecaja natačku ključanja. Masne kiseline pokazuju karakteristične reakcije na karboksilnu grupu, pa takograde u reakciji sa bazama soli (sapune), u reakciji sa alkoholima daju estere, dok nezasićenemasne kiseline učestvuju u reakciji adicije (npr. sa bromom ili jodom) i reakcijama oksidacije.

Lipidi

Lipidi su spojevi esterskog tipa sa kiselinskom komponentom iz reda viših masnihkiselina, dok je alkoholna komponenta glicerol ili neki visokomolekularni alkohol. Dijele sena: proste i složene lipide. Prosti (jednostavni) lipidi sadrže alkohol i masnu kiselinu, a složeni(kompleksni) sadrže pored alkohola i masne kiseline i neke druge spojeve, pa veza može biti iestarska i amidna.Prosti lipidi se dijele prema vrsti alkohola koji esterifikuju masne kiseline na: gliceride (masti i ulja) -alkohol je glicerin, esterifikuju se tri masne kiseline ceride - alkohol je visokomolekularan alifatičan i esterifikuje jednu masnu kiselinu steride - alkohol je derivat sterola, a esterifikuje jednu masnu kiselinu. Predstavnik je

lanolin, ester holesterola i masnih kiselina

Slika 3: Heterogeni trigliceridSloženi lipidi se dijele na: fosfolipide-sadrži, pored osnovnih sastojaka, i fosfornu kiselinu, H3PO4, esterificiranu

na jednu OH grupu glicerola. U zavisnosti od vrste sadržanog alkohola, mogu se dijelitina glicerofosfolipide (alkohol je glicerol i veza je esterska) i na sfingolipide (alkohol jesfingozin i veza je amidna)

glikolipide-sadrže, pored osnovnih sastojaka, i ugljikohidratsku komponentu.

Slika 4: Strukturna formula lecitina


23

Masti i ulja pod običnim uslovima mogu postojati u čvrstom ili tečnom obliku, uzavisnosti od prirode masnih kiselina. Dužina i stepen nezasićenosti masnih kiselina umolekuli triglicerida određuju njegove fizičke i hemijske osobine. Većina biljnih ulja sadrživećinski dio nezasićenih masnih kiselina, kao što su oleinska, linolna i linoleinska kiselina,koje imaju nisku tačku topljenja i tečne su. Nasuprot tome, animalne trigliceride odlikujeprisustvo zasićenih masnih kiselina, kao što su palmitinska i stearinska, koje doprinose da nasobnoj temperaturi masti budu polučvrste ili čvrste. Katalitičkom hidrogenizacijom ulja semogu prevesti u masti (npr. industrijski postupak dobijanja margarina).

Prirodne masti ili ulja nisu hemijske jedinke, već sadrže veliki broj raznih glicerida.Prosti lipidi imaju izvanrednu ulogu u ishrani (kravlje maslo, salo, biljna ulja, svinjska mast).To su tipične rezerve energije, visoke kalorične vrijednosti.

Opšte karakteristike lipida su rastvorljivost, emulzifikacija i saponifikacija. Zbog svojenepolarne prirode nerastvaraju se u vodi, ali se rastvaraju u organskim rastvaračima.Energičnim mućkanjem vode i ulja dobija se emulzija, koja nije stabilna i strajanjem serazdvaja na dvije faze. Postoje jedinjenja koja mogu stabilizirati emulzije, a najznačajnija suona koja se nalaze u probavnim sokovima (npr. Na2CO3, žučne kiseline i njihove soli, itd...).

Saponifikacija je alkalna in vitro hidroliza masti i ulja i ima veliki industrijski značaj.Sapuni alkalni metala su topivi u vodi (meki sapuni), a sapuni zemnoalkalnih metala sunetopivi u vodi (tvrdi sapuni).

Slika 4: Struktura sapuna


RastvorljivostU pet epruveta staviti nekoliko kapi ulja ili malo masti, a zatim dodati 1-2ml: Hloroforma Acetona Hladnog etanola Zagrijanog etanola Vode

Sadržaj svake epruvete dobro promućkati i zabilježiti svoja zapažanja o rastvorljivosti lipida.

EmulzifikacijaU tri epruvete staviti nekoliko kapi ulja i malo vode. U prvu eppruvetu dodati 5 kapi 0,5 %-tnog Na2CO3, u drugu 0,5 %-tnog NaHCO3, a u treću nekoliko kapi destilovane vode. Epruvetedobro promućkati i ostaviti da stoje neko vrijeme i posmatrati gdje dolazi do stabilizacijeemulzije.


24

SaponifikacijaU epruvetu uzeti 0,5 ml ulja, dodati 10 ml 10%-tne otopine NaOH u etanolu i držati uključalom kupatilu 5 -10 minuta. Nastaje mliječna emulzija sapuna, na koju se dodaje topla,destilovana voda do otapanja. Podijeliti dobijenu otopinu sapuna na tri epruvete i izvestislijedeće probe.1. Isoljavanje sapunaU prvu epruvetu dodati malo čvrstog NaCl. Promućkati, a zatim dodavati i dalje, sve dok se sorastvara. Stvara se tzv. isoljeni sapun (jer je dodan višak elektrolita).2. Nastajanje sapuna netopivih u vodiU drugu epruvetu dodati 2 ml otopine CaCl2 (0,5 mol/dm3). Nastaje netopljivi Ca-sapun (tzv.tvrdi sapun)3. Precipitacija sapunaU treću epruvetu dodavati kap po kap konc. HCl ili konc. CH3COOH i dobro promućkati.Stvara se bijeli talog, jer se zakiseljavanjem, topivi sapun prevodi u netopive masne kiseline.

Dokazivanje sastojaka jednostavnih lipida

1.Dokazivanje alkoholne komponente

a) Dokazivanje glicerolaU suhu epruvetu staviti nekoliko kapi ulja, dodati malo anhidrovanog CaCl2 i grijati naplamenu. Vježbu obavezno raditi u digestoru. Nastali akrolein napada disajne organe.

b) Dokazivanje holesterola

1. Salkovskijev (Salkowsky) test na holesterolU epruvetu staviti 2ml hloroformne otopine holesterola. Pažljivo dodati 2ml koncentrovaneH2SO4 i blago promućkati. Ostaviti kratko vrijeme i utvrditi da gornji hloroformni dio postajecrven, a donji žut sa zelenom fluorescencijom.

2. Libermanova (Liebermann) reakcijaU epruvetu nasuti oko 2ml hloroformne otopine holesterola, dodati 10 kapi anhidrida acetatnekiseline i 2 kapi konc. H2SO4. Kao pozitivan test javlja se prvo ružičasto, zatim plavo obojenje,koje prelazi u zelenkasto.Holesterol se djelovanjem H2SO4 dehidratizira i oksidira. Iz dvije molekule holesterolakondenzacijom nastaju ugljikovodici sa dvostrukim vezama koji daju različite proizvodeH2SO4 i acetanhidridom, što je uzrok prelaza boje jedne u drugu boju.


25

2. Dokazivanje kiselinske komponente

a) Dokazivanje nezasićenih masnih kiselina

Na 2 ml hroloformne otopine uzoraka lipida (izvestu probu na puter i jestivo ulje) dodavati ukapima otopinu joda u hloroformu uz mućkanje i blago zagrijavanje na vodenom kupatilu.Ukoliko je u uzorku prisutna neka od nezasićenih masnih kiselina, otopina joda će seobezbojiti.

Dokazivanje prisustva složenih lipida i njihovih sastojaka

1. Dokazivanje prisustva lecitinaNa otopinu žumanca jajeta dodati zasićenu alkoholnu otopinu kadmij-klorida. Ukoliko uuzorku ima lecitina izdvaja se bijeli talog kompleksnog spoja glicerolfosfolipida sa kadmijem.Također, izvesti reakciju na alkoholnu otopinu uzorka lecitina poznate čistoće.

2. Hidroliza lecitinaStaviti u epruvetu 6 ml otopine lecitina, dodati 2-3 ml otopine NaOH i pažljivo kuhati 5minuta. Hidrolizat je potrebno razdijeliti u četiri epruvete.

a) Dokazivanje holina (trimetiletanolamin)Pri ključanju, tokom hidrolize, može se osjetiti karakterističan miris rasola, svojstventrimetilaminu, koji nastaje iz holina. Postavljeni crveni lakmus papir (na otvor epruvete u kojojse vrši hidroliza) poplavi zbog isparavanja baznog trimetilamina.

b) Dokazivanje fosfataNa 2 ml hidrolizata lecitina dodavati 10 %-tnu HNO3 do neutralizacije. Na neutraliziranuotopinu dodati 2 ml amonijum-molibdata, pri čemu nastaje karakteristična žuta boja amonijum-fosfomolibdata.

c) Dokazivanje kisele komponente

a) Dokazivanje masnih kiselinaOvaj eksperiment zasniva se na istom principu kao i dokazivanje prisustva masnih kiselina(saponifikacija i precipitacija). U ovom slučaju izvešćemo samo precipitaciju.Na 2-3 ml hidrolizata lecitina dodavati u kapima 10 %-tnu HCl do kisele reakcije. U kiselojsredini se iz natrijevih soli masnih kiselina (nastalih baznom hidrolizom) stvaraju slobodnemasne kiseline koje isplivavaju na površinu otopine i grade masni, odnosno uljasti sloj. Jakakiselina HCl istiskuje slabu organsku kiselinu.

b) Dokazivanje prisustva nezasićenih masnih kiselinaNa 2 ml otopine nehidroliziranog lecitina ili njegovog ekstrakta dodavati jod u hloroformu(raditi u digestoru), uz mućkanje i zagrijavanje.


26

3. ZADACI I VJEŽBE

- Odgovorite na slijedeća pitanja:

1. Koje funkcije imaju lipidi:a) javljaju se kao strukturni sastojci biomembraneb) služe kao oblik u kome se akumulira metabolička toplotac) nose genetičku informacijud) imaju zaštitnu funkciju

2. Koji spojevi se odnose na lipide:a) fosfolipidib) kefalinic) vitaminid) neutralne masti

3. Navedite karakteristične osobine dvostrukih veza nezasićenih masnih kiselina kojeulaze u sastav lipida:

a) dvostruka veza u većini slučajeva se nalazi između C-9 i C-10b) dopunske dvostruke veze se obično nalaze između C-10 i metilne grupe na kraju

lancac) dvostruke veze imaju trans konfiguracijud) dvostruke veze imaju cis konfiguracijue) u masnim kiselinama se nalaze dvije ili više dvostrukih veza, ali se one nikada

ne nalaze povezane

4. Koji spojevi pripadaju fosfolipidima:a) kefalinb) lecitinc) fosfatidilserind) lanolin

5. Koji spojevi spadaju u steroide:a) žučne kiselineb) hormoni nadbubregac) polni hormonid) sfingomijelini

6. Šta je funkcionalna grupa kod triglicerida?


27

7. Prikazati jednačinu kiselinske hidrolize gliceriletanoata?

4. REZULTATI



28


OVJERA VJEŽBE:


29

Vježba broj 5

ODREĐIVANJE VAŽNIJIH HEMIJSKIHKONSTANTI UZORAKA LIPIDA

1. TEORETSKI DIO

Kvalitet prostih lipida utvrđuje se na bazi određivanja nekih hemijskih pokazatelja.Veličina izvjesnih fizičko-hemijskih pokazatelja mijenja se u zavisnosti od porijekla ulja ilimasti, animalnog tkiva ili biljnog organa (sjeme, plod), koji služe kao njihov izbor, zatim odnačina dobijanja ulja kao i od načina i uslova njihovog čuvanja. Tako je poznato da pri čuvanjumasla dolazi do razlaganja triglicerida, pri čemu dolazi do povećanja kiselosti uslijednagomilavanja slobodnih masnih kiselina. Povećana kiselost doprinosi sniženju kvaliteta ulja.Promjena kvaliteta ulja javlja se i kao posljedica oksidacije masnih kiselina na mjestudvostruke veze u lancu, i kao posljedica toga dolazi do povećanja sadržaja aldehida,peroksidnih oblika i drugih raspada triglicerida. Kao posljedica tih promjena javlja se užeglostulja.

Kao kriteriji fizičko-hemijskih osobina prostih lipida služe: saponifikacijski broj,kiselinski broj, esterski broj, jodni broj, određivanje, indeks loma itd. Tako npr., smanjenjejodnog broja i povećanje saponifikacijskog broja u toku čuvanja ulja ili masti javljaju se kaopokazatelji njegove užeglosti.

Saponifikacijski broj predstavlja broj miligrama KOH ili NaOH potreban za potpunusaponifikaciju 1g masti. Značaj određivanja ovog broja leži u odnosu između saponifikacijskogbroja i dužine lanca ostatka masne kiseline. Iz vrijednosti saponifikacijskog broja dobija seuvid o zastupljenosti masnih kiselina u uzorcima lipida. Ovaj broj je manji ukoliko jemolekulska masa masnih kiselina veća. U toku saponifikacije hidroliza triglicerida se vršipostepeno.

Slika 5: Opšta reakcija saponifikacije

Kiselinski broj je broj miligrama KOH ili NaOH potreban za neutralizaciju slobodnihmasnih kiselina u 1 g masti. U praksi ima važnost pri određivanju ispravnosti namirnica,ukazuje na proces raspadanja tokom stajanja masti ili ulja.

Esterski broj predstavlja razliku saponifikacijskog i kiselinskog broja, a ukazuje nabroj vezanih –COOH grupa.

Jodni broj je broj grama J2 koji se adira na 100g masti ili ulja. Ovaj broj je većiukoliko su masti ili ulja tečniji tj. ukoliko je sadržaj nezasićenih masnih kiselina, na čijedvostruke veze se i vrši adicija joda, veći.


30

Tabela 4: Vrijednosti saponifikacijskog broja za neke masti i ulja

Uzorak Saponifikacijski broj Uzorak Saponifikacijski brojOrahovo ulje 189-193 Pamučno ulje 188-196

Kokosovo ulje 225-262 Laneno ulje 184-194Kukuruzno ulje 187-193 Svinjska mast 195-205Maslinovo ulje 185-196 Loj 195-200


Određivanje saponifikacijskog broja

Odvagati 0,5-1,0 g masti u suhoj erlenmajerovoj tikvici, dodati 50 ml NaOH u etanolu (c= 0,1mol/l) i kuhati jedan sat na vodenom kupatilu uz povratno hladilo. Nakon toga smjesa seretitrira sa 0,1 mol/l HCl uz indikator fenolftalein. Dobijeni volumen predstavlja volumen HClkoji je utrošen na titraciju viška NaOH (koji se nije saponificirao). Pored glavne izvodi se ikontrolna proba koja sadrži istu količinu alkohola i baze koji su dodani pri saponifikaciji, atitrira se sa HCl. Utrošena količina HCl odgovara količini NaOH koja je bila prisutna prijepočetka procesa saponifikacije. Iz razlike ove količine i količine NaOH koji se nijesaponificirao dobije se količina NaOH koja se saponificirala sa masnim kiselinama u uzorkumasti.

Ako je rađeno sa tačno 1 g masti dobijena masa NaOH izražena u miligramima, predstavljasaponifikacijski broj, a ako to nije slučaj preračunati na 1g.

3. ZADACI I VJEŽBE

-Odgovorite na slijedeća pitanja:

1. Koji od navedenih pokazatelja karakteriše stepen nezasićenosti masnih kiselina:a) esterski brojb) jodni brojc) saponifikacijski brojd) kiselinski broj

2. Koji od navedenih pokazatelja daje mogućnost da se odredi sadržaj slobodnih masnihkiselina u nuetralnim mastima:

a) saponifikacioni brojb) jodni brojc) kiselinski brojd) esterski broj


31

3. Odredite jodni broj ulja ako njegova masa iznosi 0,375g i ako se za titraciju ove maseutroši 5,8 ml rastvora hiposulfita (0,05 mol/l) u kontroli i 3,8 ml u eksperimentu?

4. Odredite kiselinski broj ulja čija je masa 0,2521g i ako se za titraciju ove mase utroši1,2 ml (0,01 mol/l) rastvora kalijhidroksida?

5. Zašto je proces saponifikacije pomoću alkoholnih rastvora baza brža u odnosu navodene rastvore baza?

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


32

1. REZULTATI

Određivanje saponifikacijskog broja

OVJERA VJEŽBE:


33

Vježba broj 6

IZOLACIJA OLEINSKE KISELINE IZ MASLINOVOG ULJA

1. TEORETSKI DIO

Plodovi maslina imaju mesnate plodove pune ulja, a iznutra sjemenke, u kojima takođerima ulja, ali slabijeg kvaliteta. Maslinovo ulje dobiva se postupkom mljevenja (gnječenja) ipresanja zrelih plodova masline. Proces proizvodnje maslinovog ulja odvija se u dvije faze. Uprvoj fazi se zdravi plod masline drobi gnječenjem, a potom se u drugoj fazi presanjem smjesezdrobljenih plodova cijedi čisto maslinovo ulje. Hladno presanje je najčistija tehnologijaobrade maslina. Maslinovo ulje se prema kvaliteti dijeli na nekoliko vrsta:o Ekstra djevičansko maslinovo ulje (olio di oliva extravergine) dobija se nakon prvog

presanja zdravog ploda masline, a kiselost mu ne prelazi 0,8 % (izraženo u oleinskojkiselini) Uz zadovoljenje hemijskih parametara, ulje mora još proći organoleptičkuprovjeru i ne smije imati niti jedan miris koji nije svojstven ulju.

o Djevičansko ulje (vergine) se dobiva nakon prvog presanja slabijeg ploda masline, pamu je kiselost u odnosu na ekstra djevičansko ulje nešto veća, ali sadržaj masnihkiselina ne prelazi 2 %.

o Maslinovo ulje se dobiva miješanjem rafiniranog ulja i određene količine ekstradjevičanskog ulja koje poboljšava boju i okus, a kiselost ovako proizvedenog ulja jeoko 5 %.

o Sansa ulje (olio di sansa) se dobija hemijskim izdvajanjem iz krutih ostataka plodamasline nakon presanja. Ovako proizvedeno ulje je slabije kvalitete, ali se možekoristiti za prženje.

Maslinovo ulje karakterizira ugodna i jedinstvena aroma koja potječe od različitihsastojaka (vitamina E, fenola, hidrokarbona, sterola, aromatičnih tvari) koji su prisutni u vrlomalim količinama. Najveći dio ulja (više od 95%) čine masne kiseline, od kojih jenajzastupljenija mononezasićena oleinska kiselina (65–85%), zbog koje je maslinovo uljenajzdravije i ujedno najstabilnije. Nezasićene masne kiseline smanjuju tzv. loši holesterol iliLDL holesterol, a oleinska još povisuje koncentraciju HDL - lipoproteina. Pored toga, oleinskakiselina djeluje još i antitrombotično. Dobro je poznato blagotvorno djelovanje maslinovogulja na sluznicu želuca. Također je svakodnevna upotreba maslinovog ulja preporučljiva uprevenciji različitih vrsta raka (debelog crijeva, dojke, prostate), te u prevencijikardiovaskularnih bolesti. Pored toga, zbog velikog sadržaja polifenola, te alfa - tokoferola ibeta - karotena, maslinovo ulje se ubraja u namirnice sa snažnim antioksidativnim djelovanjem.Također, povećava imunitet i omogućuje odbranu organizma od upalnih procesa. Djelovanjemaslinovog ulja na kožu je također blagotvorno. Omogućava koži dugo zadržavanje vode itako spriječava suhoću kože, ali i brže cijeljenje rana.

Uobičajeni postupak pripreme viših masnih kiselina jest alkalna hidroliza triacilglicerola. Nataj način kuhanjem maslinova ulja s etanolskom otopinom kalij-hidroksida najprije se dobijekalij-oleat (sapun), koji se zatim dodavanjem mineralne kiseline prevodi u slobodnu kiselinu.Alkalna hidroliza triacilglicerola jest nukleofilna supstitucija, u kojoj hidroksilni ion djelujekao nukleofil. Sustavno ime oleinske kiseline je cis-odnosno (Z)-9-oktadecenkiselina. U


34

prisustvu katalizatora tipa slobodnih radikala ta kiselina izomerizira u trans-odnosno (E)-oblikkoji se naziva elaidinska kiselina

Slika 6: Hemijska formula oleinske i elaidinske kiseline


Potrebni reagensi:- Maslinovo ulje- KOH- Etanol- HCl:voda- Eter- Na2SO4, bezvodni

Na tikvici s okruglim dnom se pripremi otopina 3g KOH u 35ml etanola. U slučaju da se KOHne rastvara, potrebno je smjesu zagrijati u ključalom vodenom kupatilu. U malo ohlađenusmjesu se doda 10,5 ml (10g) maslinovog ulja. Zaostalo ulje sa stijenki menzure ispere se utikvicu s pomoću 5ml etanola. Na tikvicu se stavi povratno hladilo i zagrijava 1 sat navodenom kupatilu. Zatim se sadržaj tikvice razrijedi s 30ml vode i prebaci u lijevak zaodvajanje. Nakon što se ohladila na sobnu temperaturu, otopini kalij-oleata se dodaje vodenaotopina hloridne kiseline (1:1) do pH 1-2 (približno 25ml). Pritom se sirove masne kiselineizdvoje kao gornji uljasti sloj. Sadržaj lijevka se izmućka s 30ml etera. Nakon odvajanjagornjega eterskog sloja, iz vodenog se sloja ostatak masnih kiselina izdvaja s još 20ml etera.Vodeni sloj se odbaci, a sjedinjeni se eterski ekstrakti u lijevku ispiru vodom do neutralnereakcije. Isprani sloj se suši 15min u erlenmajerovoj tikvici s bezvodnim natrij-sulfatom.Dobijena sirova oleinska kiselina se dekantira u vaganu tikvicu.

Literaturni prinos: 8,5g T.t.= 13,4oC


35

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Odredite molarni odnos između lipida i proteina u membrani koja sadrži 40% lipida i60% proteina, ako srednja molekulska masa lipida iznosi 800, a proteina 50000?

2. Odredite molekulsku masu nepoznate monokarbonske kiseline ako se pri titraciji 10mgove kiseline utroši 3,5 ml alkoholnog rastvora 0,01 mol/l natrijhidroksida?

3. U kojim se ćelijskim djelovima vrši oksidacija masnih kiselina:a) jedrub) mitohondrijamac) ribozomimad) citoplazmi

4. Na koji način se vrši razgradnja viših masnih kiselina:a) redukcijomb) ω-oksidacijomc) α-oksidacijomd) β-oksidacijom


36

5. U sastav kojih neutralnih masti (triglicerida) ulazi linoleinska i linolna kiselina:a) palminog uljab) lanenog uljac) suncokretovog uljad) ulja konopljee) svinjskog sala

4. REZULTATI

- Masa dobijene sirove oleinske kiseline je _______________.

OVJERA VJEŽBE


37

Vježba broj 7

KVALITATIVNO ODREĐIVANJE AMINOKISELINA I PROTEINA

1. TEORETSKI DIO

Aminokiseline su organske kiseline koje u svojoj molekuli sadrže najmanje jednu amino ijednu karboksilnu grupu. Prema broju karboksilnih, odnosno amino-grupa aminokiselinedijelimo na: Monoamino-monokarboksilne koje se dalje dijele na alifatske nerazgranate (glicin,

alanin, β-alanin, α-aminobuterna kiselina, γ-aminobuterna kiselina, norvalin,norleucin); alifatske razgranate (valin, leucin, izoleucin); oksiaminokiseline (serin,treonin); tioaminokiseline (cistein, cistin, metionin); ciklične aminokiseline (fenil-alanin, tirozin, triptofan, histidin, prolin, oksiprolin).

Monoamino-dikarboksilne kiseline (asparaginska, glutaminska, oksiglutaminska) Diamino-monokarboksilne kiseline (ornitin, citrulin, arginin, lizin, oksilizin).

Prema sposobnosti ljudskog organizma da ih sintetizira dijelimo ih u dvije grupe: Esencijalne koje moramo stalno unositi putem hrane (valin, leucin, izoleucin,

metionin, treonin, fenilalanin, triptofan, lizin, arginin i histidin) Neesencijalne koje organizam sam sintetizira

Opšte osobine aminokiselina Rastvorljivost - Prirodne aminokiseline su kristalne i bezbojne supstance. Sve su osim

prolina i oksiprolina rastvorljive u vodi, a ne u alkoholu i drugim organskimrastvaračima.

Amfoterne osobine aminokiselina - Zbog toga što imaju amino i karboksilnu grupu tj.baznu i kiselu komponentu pri dodatku baze reagira amino kraj dipola (NH3

+), a pridodatku kiseline reagira karboksilni kraj dipola (COO-). Prema tome aminokiseline suamfoterna jedinjenja. Vrijednost izoelektrične tačke se dobije ako se vrijednostinegativnog logaritma konstante disocijacije kisele (pK1) i bazne komponente (pK2)saberu i podijele sa dva.

Optička aktivnost - Sve prirodne aminokiseline osim glicina, β-alanina, γ-aminobuterne kiseline imaju jedan ili više asimetričnih C-atoma u molekuli pa suoptički aktivne supstance.

Konfiguracija aminokiselina - Sve prirodne aminokiseline imaju lijevu konfiguraciju(L).


38

Reaktivnost aminokiselina - Aminokiseline stupaju u reakcije s čitavim nizomjedinjenja, pri čemu nastaju derivati, pomoću kojih se neke aminokiseline moguidentificirati, druge se kvantitativno određuju, a neke od njih se mogu izolirati. Kaoamfoterna jedinjenja reaguju sa jakim kiselinama i bazama pri čemu nastaju soli. Opštahemijska svojstva su povezana prisutnošću karboksilne i amino grupe, a s druge straneprisutnost reaktivnog R ostatka objašnjava specifična svojstva pojedinih aminokiselina.

Reakcije karakteristične na karboksilnoj grupi su:

Esterifikacija alkoholima u prisustvu jakih kiselina Reakcija dekarboksilacije i nastajanje amina (moguća je hemijskim i enzimskim

putem) Stvaranje amida (reakcija aminokiselina sa aminima)

Reakcije karakteristične na amino grupi su:

Dezaminacija (sa nitratnom kiselinom, uz nastajanje kiseline (alkohola) ioslobađanje nitrogena)

Stvaranje imina (kondenzacijom sa aromatskim aldehidima) Reakcije sa fenilizotiocijanatom u baznoj sredini

Denziliranje aminokiselina sa denzilhloridom pri čemu nastaje fluorescentniderivat.


39

Alanin(Ala / A)

Arginin(Arg / R)

Asparagin(Asn / N)

Asparaginska kiselina(Asp / D)

Cistein(Cys / C)

Glutaminska kiselina(Glu / E)

Glutamin(Gln / Q)

Glicin(Gly / G)

Histidin(His / H)

Izoleucin(Ile / I)

Leucin(Leu / L)

Lizin(Lys / K)

Metionin(Met / M)

Fenilalanin(Phe / F)

Prolin(Pro / P)

Serin(Ser / S)

Treonin(Thr / T)

Triptofan(Trp / W)

Tirozin(Tyr / Y)

Valin(Val / V)

Tabela 1: Strukturne formule i oznake aminokiselina


40

Dvije ili više aminokiselina se mogu međusobno povezati tako da čine amid između α-karboksilne skupine jedne aminokiseline i α-amino skupine druge aminokiseline. Tu posebnuvrstu veze E. Fischer nazvao je peptidna veza.

Molekule koje sadrže dvije amonokiseline povezane peptidnom vezom su dipeptidi, a kojesadrže više aminokiselina međusobno povezanih u lanac peptidnim vezama zovu se tripeptidi,tetrapeptidi, pentapeptidi itd. Peptidi izgrađeni od 10 aminokiselina su oligopeptidi, a sa višeod 10 polipeptidi. Peptidi imaju vrlo bitnu biološku ulogu. Najpoznatiji peptidi su sa jednestrane hormoni (oksitocin, vazopresin, adrenokortikotropni hormon, inzulin), a sa drugeantibiotici (penicilin). Imaju ulogu i kao moždani neuroprijenosnici, kao što su neuropeptid Y,i somatostatini.Molekule biološkog porijekla izgrađene uglavnom od aminokiselina međusobno povezanihpeptidnom vezom u dugačke lance zovemo proteini. Za razliku od peptida, proteini imajukarakterističnu višestepenu strukturu. Njenu osnovu predstavlja polipeptidni lanac, u kome suaminokiseline poredane određenim redom i povezane peptidnim vezama. Ovaj lanac seoznačava kao primarna struktura proteina, a redoslijed aminokiselina u njemu je genetskiuslovljen, s obzirom da poziciju jedne aminokiseline u lancu determinira položajodgovarajućeg tripleta purinskih i pirimidinskih baza u strukturi odgovarajuće DNK odgovorneza sintezu dotičnog peptidnog lanca. Usljed karakteristika bočnih grupa, primarna strukturauslovljava i sve ostale stupnjeve strukture, a to su: sekundarna, tercijarna, kvarterna.

Proteini se mogu podijeliti na: Proste (koji predstavljaju polipeptide koji su izgrađeni iz velikog broja aminokiselina

međusobno povezanih peptidnim vezama). Tu spadaju protamini i histoni, prolamini iglutelini, skleroproteini, albumini i globulini

Složene (pored polipeptidnih lanaca sadrže i neku neproteinsku komponentu vezanu zate lance). Tu spadaju hromoproteidi, nukleoproteidi, glikoproteidi i fosfoproteidi.

Proteini se dokazuju velikim brojem bojenih reakcija, karakterističnih za funkcionalne grupe iradikale pojedinih aminokiselina. Taložne reakcije također mogu poslužiti za kvalitativnodokazivanje proteina, a neki zahvaljujući tom svojstvu mogu se razdvojiti.

Taložne reakcije mogu se podijeliti na reverzibilne (sa solima lahkih metala i amonijevimsolima) i ireverzibilne (sa solima teških metala, kiselinama i alkaloidnim reagensima).Ireverzibilno taloženje je ustvari denaturisanje proteina.


41

2.EKSPERIMENTALNI DIO

Bojene reakcije za dokazivanje proteina

1. Ninhidrinska reakcijaNapravi se svježa 0,2 %-tna vodena otopina ninhidrina. Zagrijavanjem otopine proteina saotopinom ninhidrina nastaje plava boja. Ovu reakciju daju proteini koji imaju slobodnu aminogrupu i sve amonokiseline.

2. Ksantoproteinska reakcijaU jednu epruvetu nasuti malo razrijeđene otopine proteina (npr. malo mlijeka) i dodati malokonc. HNO3. Zagrijati oprezno do ključanja i pri tome će nastati žuti talog. Na ohlađeni talogdodati konc. NH4OH, žuta boja prelazi u narandžastu. Reakcija je pozitivna kod proteina koji usebi sadrže aromatske amonokiseline. Reakciju izvesti i sa otopinom triptofana ili tirozina(aromatske aminokiseline) i nekim od alifatskih aminokiselina (alanin, glicin), kao i saotopinom želatine, te uočiti razlike.

3. Biuret reakcija (Reakcija na peptidnu vezu)Na 2 ml otopine proteina dodati 2-3 ml 10 %-tne otopine NaOH i 1-2 kapi 1 %-tne otopineCuSO4 nemiješajući. Na površini nastaje plavi talog Cu(OH)2, a između tih plavo obojenihdijelova ljubičasti prsten kao znak pozitivne Biuret reakcije. Reakciju izvesti i sa nekom odaminokiselina, te uočiti razliku.

4. Cisteinska probaNa 2 ml otopine proteina dodati 2-3 ml 5 %-tne otopine NaOH i nekoliko kapi 5%-tnogolovnog acetata. Zagrijavanjem nastaje crni talog PbS. Reakcija je pozitivna kod proteina kojisadrže aminokiseline sa sumporom. Uraditi reakciju i sa cisteinom (aminokiselina sasumporom) i nekom od aminokiselina koje ne sadrže sumpor, npr. alanin, te uočiti razliku.

5. Adamkijevičeva reakcijaNa 2 ml razrijeđene otopine bjelanca jajeta dodaju se 4 ml konc. glacijalne acetatne kiseline iepruveta protrese. Zatim se pažljivo dodaje niz zid epruvete, 2 ml konc. H2SO4. Nastajeljubičasti prsten na nivou kontakta dvije tečnosti. Ako se lagano promućka (uz hlađenje),ljubičasta boja difunduje u cijelu otopinu.Reakcija je karakteristična za triptofan (slobodan ili u sastavu proteina). Zasniva se na reakcijiizmeđu glioksalne kiseline (sadržane u glacijalnoj acetatnoj kiselini) i triptofana, a nastali spojima ljubičasto obojenje kada dođe u kontakt sa H2SO4.

6. Sakaguchieva reakcijaU epruvetu nasuti oko 2-3 mL 0,5% proteinskog rastvora, dodati 1ml rastvora NaOH i 5-6 kapirastvora α-naftola i ohladiti nastalu smjesu. Dodati zatim u epruvetu 0,5 ml hipohlorita ipromješati. U prisustvu arginina smjesa postaje crveno obojena. Boja nakon kratkog vremenapostaje blijeda, što se može spriječiti dodavanjem 1ml 40% rastvora uree.Reakcija je karakteristična za arginin. Pod uticajem nekog oksidacionog sredstva (NaOCl iliNaOBr) u alkalnoj sredini arginin podliježe oksidaciji, pri čemu oksidirani arginin daje sa α-naftolom jedinjenje svijetlo crvene boje.


42

Taložne reakcije1. Reverzibilno taloženjeOtopini proteina dodati čvrsti amonijum-sulfat. Nastaje talog koji dodatkom vode nestaje.

2. Ireverzibilno taloženjeUzeti u epruvetu 2-3 ml otopine proteina, dodati nekoliko kapi konc. acetatne kiseline i kap pokap kalijum ferocijanata [K4Fe(CN)6]. Nastaje bijeli talog koji se dodatkom viška reagensa neotapa. Uticaj pH kod taloženja toplotom

U tri epruvete nasuti po 2 ml otopine bjelanceta jajeta. U prvu dodati nekoliko kapi acetatnogpufera (pH = 4,7), u drugu 2 kapi konc. HCl, a u treću 2 kapi 10 % NaOH. Lagano zagrijavati iuočiti gdje dolazi do taloženja. Nakon toga u epruvetama gdje nije došlo do taloženja dodati0,5 ml acetatnog pufera, te ponovo zagrijavati.Komentirati učinak pH.

pHi kazeina mlijeka

U pet epruveta stavljaju se različiti omjeri acetatne kiseline (c = 0,2 mol/dm3) i vode i na tododaje po 0,2 ml otopine kazeina (0,4 % u 0,2 mol/dm3 Na-acetatu). Dodavanjem kazeina uNa-acetatu u epruvete koje sadrže različite omjere acetatne kiseline postiže se skala pH od 3,8do 5,3:

Br. epruvete ml acetatne kiseline ml vode ml kazeina pH1 1,6 0,4 0,2 3,82 0,8 1,2 0,2 4,13 0,4 1,6 0,2 4,44 0,2 1,8 0,2 4,75 0,06 1,94 0,2 5,3

U svim epruvetama se javlja zamućenje različitog intenziteta, uz taloženje nakon izvjesnogvremena. U epruveti u kojoj je najveća količina taloga postignut je pHi, pa treba zabilježiti tuvrijednost.


43

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Koje aminokiseline u rastvoru imaju kiselu reakciju:a) alanin;b) valin;c) glutaminska kiselina;d) leucin;e) asparaginska kiselina?

2. Koje aminokiseline pokazuju bazne osobine:a) leucin;b) treonin;c) histidin;d) lizin;e) metionin;g) arginin?

3. Napišite reakciju glicina:a) sa HCl,b) sa NaOH?

4. U litar rastvora glicina 1,0 mol/l pri izoelektričnoj tački dodato je 0,3 mla NaOH.Odredite pH dobiveno rastvora.


44

5. Kakvo naelektrisanje ima protein u izoelektričnoj tački:a) pozitivno;b) negativno,c) elektro neutralno?

6. Koja jedinjenja daju biuretsku reakciju:a) sve aminokiseline;b) glutation;c) dipeptidi;d) tripeptidi i proteini?

4. REZULTATI

Bojene reakcije za dokazivanje aminokiselina i proteina


Taložne reakcije



45

Uticaj pH kod taloženja


pHi kazeina mlijeka

Broj epruvete pHi kazeina mlijeka

OVJERA VJEŽBE


46

Vježba broj 8

HIDROLIZA I HROMATOGRAFIJA PROTEINA

1. TEORETSKI DIO

Denaturacija i proteolizaVišestepena struktura proteina učvršćuje se vezama različite jačine. U stvaranju primarnestrukture angažirane su isključivo kovalentne peptidne veze. Međutim u formiranju iobezbjeđenju drugih (natprimarnih) α-struktura mnogo veći značaj pripada slabim vezama,prije svega vodikovoj vezi. Zbog toga će za razaranje ovih veza, a time i za narušavanjepojedinih stupnjeva strukture proteina biti potrebno primijeniti sile različite jačine. Svi oviprocesi mogu se podijeliti u dvije skupine: To su procesi u kojima se narušavaju natprimarni stupnjevi strukture, bez afekcije

osnovnog polipeptidnog lanca tj. primarne strukture. Ti procesi se ostvaruju primjenomslabijih sila, a nazivaju se procesima denaturacije proteina. Kao denaturirajući agensimogu se primijeniti fizički i hemijski postupci kao što su: zagrijavanje, djelovanjerentgenskih ili ultravioletnih zraka, djelovanje ultrazvuka, promjene pH dodavanjemkiselina ili baza, efekti nekih specifičnih hemijskih agenasa (urea), te enzimi.

Procesi kojima se narušava primarna struktura proteina tj. kojima se cijepa polipeptidnilanac, predstavljaju procese proteolize ili hidrolize proteina, čime nastaju krupniji ilisitniji fragmenti (peptidi) označeni kao albuminoze i peptoni. Proteoliza se možepostići djelovanjem proteolitičkih enzima (pepsin, tripsin i dr.), kao i kuhanjem rastvoraproteina uz dodatak mineralnih kiselina.

Od kiselina se najčešće radi sa rastvorom HCl koncentracije 6 mol/dm3 (kuhanjem 10 sati natemperaturi 80-90 °C) ili sa 35 % H2SO4, sa kojom se hidroliza vrši 12 – 14 sati na temperaturi105 – 110 °C.

HromatografijaAminokiseline iz hidrolizata proteina se mogu odvojiti i identificirati primjenjujući metoduhromatografije (npr. papirne, jonoizmjenjivačke, hromatografije na tankom sloju, tečnehromatografije pri visokom pritisku – eng. High performance liquid chromatography HPLCitd.).Hromatografija na tankom sloju spada u podionu hromatografiju kod koje se razdvajanjezasniva na kontinuiranoj raspodjeli molekula hromatografirane supstance između dviju faza:stacionarne (silika gel, koji se u tankom sloju nanosi na staklene ploče odgovarajućihdimenzija) i mobilne (smjesa otapala obično različite polarnosti). Različite molekule putovat ćerazličitom brzinom (raspodjela zavisi od strukture), a ta brzina je definirana Rf vrijednošću kaobezdimenzionalnim parametrom:

Rf = d1/d2

d1 – put hromatografirane molekule (cm) d2 – put mobilne faze – eluenta (cm)


47


Uzeti 1 g proteina i 15 ml 6 mol/dm3 HCl. Hidroliza se može vršiti u tikvici sa povratnimhladilom ili u staklenoj ampuli koja je uronjena u vodeno kupatilo na navedenoj tmeperaturi ilise može držati u sušnici na toj temperaturi.

Prije aplikacije potrebno je hidrolizat proteina upariti na mali volumen. Kao mobilna faza zatankoslojnu hromatografiju aminokiselina služi jedna od slijedećih smjesa: hloroform : metanol : 17 % otopina NH3 u volumnom omjeru 4: 4: 2 n-butanol : glacijalna sirćetna kiselina : voda u volumnom omjeru 4: 1: 1

Od čistih aminokiselina uzeti npr. 0,5 % otopine alanina, triptofana, lizina i leucina (kaostandarda).

Na lijevu poziciju startne linije aplicirati po pet kapljica (ne aplicirati narednu kapljicu dok seprethodna ne osuši) hidrolizata bjelanceta, zatim standarde aminokiselina, a na desnu pozicijuhidrolizat 1%-tnog kazeina. Nakon što se kapljice osuše, ploča se stavi u posudu za razvijanje(u kojoj se već nalazi mobilna faza) pazeći da mobilna faza bude barem 1 cm ispod startnelinije. Ploča se vadi kada mobilna faza dospije 2 cm prije kraja ploče i ostavi da se osuši nasobnoj temperaturi u digestoru. Zatim se ploča prska sa 0,2 % ninhidrinom u acetonu i nakon2-3 minute ostavi u sušnicu na 90 °C 10 minuta. Pojaviće se različito obojene mrlje (najčešćeljubičaste, ali boja može da bude na prijelazu od narandžaste, preko crvene do ljubičaste). Akose Rf vrijednost obojene mrlje iz uzorka proteinskog hidrolizata poklapa sa Rf vrijednošćuobojene mrlje standardne aminokiseline može se reći da je data aminokiselina identificirana uispitivanom uzorku.


48

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Koje su osobine karakteristične za proteine:a) amfoternost;b) odsustvo sposobnosti kristalizacije;c) odsustvo sposobnosti zakretanja ravni polarizovanog zraka;d) termostabilnosti?

2. Sa kojim od navedenih jedinjenja ninhidrinski reagens daje obojenu reakciju:a) polisaharidimna; b) monosaharidima;c) nukleinskim kiselinama;d) α-aminokiselinama;e) lipidima?

3. Koje veze učestvuju u gradnji konformacione strukture proteina:a) koordinacione; b) vodikove;c) ionske;d) kovalentne?

4. Koje su od navedenih osobina karakteristične za denaurisane proteine:a) prisustvo vodikovih veza;b) prisustvo peptidnih veza; c) sekundarna i tercijarna struktura;d) dobra rastvorljivost u vodi?

5. Povežite pojmove po ulogama proteina?

Inzulina Prostetična grupa proteina učestvuje u fotosintezi

Mioglobina Protein sa hormonskom aktivnošću učestvuje uregulaciji metabolizma ugljikohidrata

Rodopsina Protein mišića sisara veže kiseonikHlorofila Hromoproteid se nalazi u štapićima mrežnjače oka


49

4. REZULTATI

Aminokiseline d1 Rf Uzorak d1 Rf

d2= __________

Komentar rezultata__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

OVJERA VJEŽBE

Documents

Biohemija I Praktikum 2011 13