Biologie Moléculaire des LAP

Maladie résiduelle

Bruno CASSINAT

Hôpital Saint-Louis

CSH

Platelets

Eosinophils

Erythrocytes

Granulocytes

Monocyte/

macrophages Lymphocytes

EMP

GMP

CM

P

CLP

GM-CSF

M-CSF

VD3

CSH Plaquettes

SCF

IL-3

IL-6

IL-11

IL-12

LIF Erythrocytes

Granulocytes

Monocyte/

macrophages

G-CSF

GM-CSF

AR

E/MK

progenitor

GM

progenitor

SCF

IL-3

G-CSF

GM-CSF

Contrôle par les cytokines et hormones

EPO

TPO

CLP

NB: Importance de la disponibilité des récepteurs: régulation transcriptionnelle

CSH

CM

P

CLP

AML-1

SCL

GATA-2

Lmo-2

C/EBPa

PU.1

PU-1

GATA-1

Contrôle par les Facteurs de Transcription

d ’après Ward et al., 2000 et Tenen 2007

Granulocytes C/EBPe

RARa

Gfi-1 (répresseur)

PU.1

IRF8

Plaquettes GATA-1

NF-E2

GATA-1

EKLF Erythrocytes

GATA-1

FOG MEP

PU.1

C/EBPa

RARa

GMP

PU-1

GATA-2

GATA-1

CM

P

Contrôle par les Facteurs de Transcription

Monocyte/

macrophages

Mode d’action des récepteurs nucléaires de l’acide rétinoïque

en absence de ligand

Répression de la transcription

Déacétylation des histones

Complexe corépresseur

NCoR / SMRT

HDAC

RAR RXR

Complexe coactivateur P300/CBP

p160

HMT

kinase

PCAF

Histones acétylation

en présence de ligand doses physiologiques (nM)

Répression de la transcription

RAR RXR

Acide rétinoïque

( d'après J. Bastien, C. Rochette-Egly, 2004)

Mode d’action des récepteurs nucléaires de l’acide rétinoïque

en présence de ligand doses physiologiques (nM)

en absence de ligand

Répression de la transcription

Déacétylation des histones

Complexe corépresseur

NCoR / SMRT

HDAC

RAR RXR

Complexe médiateur SMCC

facteurs de transcription RNA

pol II

( d'après J. Bastien, C. Rochette-Egly, 2004)

RARE TATA

Complexe coactivateur P300/CBP

p160

HMT

kinase

PCAF

RAR RXR

Acide rétinoïque Activation de la transcription

activation de la transcription Complexe médiateur

SMCC RNA

pol II facteurs de transcription

Contexte de la LAM3

RARE TATA

Doses physiologiques d’ATRA (nM)

Répression de la transcription

Déacétylation des histones

Complexe corépresseur

NCoR / SMRT

HDAC

RAR RXR

Acide rétinoïque

PML

PML : forte affinité pour le complexe corépresseur

Acétylation des histones

RARE TATA

Doses pharmacologiques d’ATRA (µM)

RAR RXR

Acide rétinoïque

PML

Complexe coactivateur P300/CBP

p160

HMT

kinase

PCAF

( d'après J. Bastien, C. Rochette-Egly, 2004)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

RARa (17q12-21) Point de cassure

bcr3

transcrit court ou bcr3 (20%)

Bcr3

bcr2

transcrit intermédiaire ou bcr2 (10%)

Bcr2

bcr1

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PML (15q22-23)

transcrit long ou bcr1 (70%)

Exons 3 4 5 6 7a 3 4

Bcr1

PML RARa

t(15;17): trois transcrits PML-RARa

p= 0.06

0

,1

,2

,3

,4

,5

,6

,7

,8

,9

1

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

months

bcr2, bcr3 bcr1

Event-free survival

p= 0.05

0

,1

,2

,3

,4

,5

,6

,7

,8

,9

1

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

months

bcr2, bcr3 bcr1

Time to relapse after remission

Pronostic selon le typage Bcr

p= 0.05

0

,1

,2

,3

,4

,5

,6

,7

,8

,9

1

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

months

bcr2, bcr3 bcr1

Overall survival

N= 110 Mais:

Non indépendant de la leucocytose

Reciprocal translocations with concurrent deletions

Translocations with large deletions

Welch et al JAMA 2011

Insertional Fusions

D’après T Ley

Translocations des APL

PML-RARa

PLZF-RARa

NuMA-RARa

NPM-RARa

STAT5b-RARa

PRKAR1A

FIP1L1-RARa

t(15;17)

insertions

t(11;17) (q23;q21)

t(11;17) (q13;q21)

t(5;17)

der(17)

der(17)

t(4;17)

> 95%

1%

1 cas

< 1%

1 cas

1 cas

1 cas

B C A D E F

B C D E F

B C D E F

B C D E F

B C D E F

B C D E F

RARa

PML-RARa

PLZF-RARa

NuMA-RARa

NPM-RARa

STAT5b-RARa

DNA

binding

Ligand binding

transactivation

dépendante de l’ATRA 530

Coiled-coil Pro Ring B1 B2

POZ/BTB Pro Zn

fingers

455

Coiled-coil Phosphorylation

1883

Oligomérisation

Coiled-coil DNA

binding

SH3 SH2

117

636

Protéines de Fusion X-RARa

Maladie résiduelle

Diagnostic Maladie Résiduelle Rechute

PCR

Standard +++ +

_ _ + +++

Temps

Marqueur Diagnostic

Pronostic Réponse

traitement

Suivi

Rechutes

PCR

Quantitative

Accumulation des produits de PCR

Seuil

Cycle Seuil = Ct

Pour quantifier nécessité de détecter le cycle seuil (proportionnel à quantité de cible dans échantillon initial)

Nécessité de suivre en temps réel l’apparition de l’ADN

Méthodes fluorescentes

PCR Quantitative en temps réel

3’ 5’

5’ 3’

5’

3’

Amorce sens

Amorce antisens

R Q

3’

3’

3’ 5’

5’ 3’

5’

Q

3’

3’

3’ 5’ 5’ 3’

5’

Q

3’

3’

3’ 5’

5’ 3’

5’

Q

3’

Polymérisation

Déplacement du brin

Clivage

Fin de la polymérisation

R

R

R = Reporter Q = Quencher

Sonde Taqman

Gamme de plasmides: dilutions de 10 en 10

Ct des différentes dilutions

Gamme de plasmides: dilutions de 10 en 10

Sonde

Protocole de RT-PCR Quantitative en temps réel

1 2 3 4 5 6

RARa PML

Sonde

1 2 3 4 5 6

Bcr1

Bcr2

Sonde

1 2 3

RARa PML

Bcr3

Normalisation par rapport à un gène de ménage: Housekeeping gene (ABL1 etc…)

Hokland P , and Ommen H B Blood 2011;117:2577-2584

Traitement Entretien et hors traitement

Indétectable

10

102

103

104

105

106

107

Diagnostic 1 mois

RQ-PCR: nombre de copies au diagnostic et après 1 mois

N= 25

No

mb

re d

e c

op

ies a

u d

iagn

ostic

Valeur pronostique?

% o

f p

ati

en

ts p

er

arm

MRD fin d’induction (n= 370 patients)

MRD après 1ère

Consolidation

pati

en

ts p

er

arm

Exemples APL 2006

Echantillon positif ne prédit pas la rechute

- après l’induction

- après la consolidation

Seul point reconnu: négativité après les consolidations

RQ-PCR: réduction du transcrit sous traitement

Fin de Consolidation :

ELN recommendations: Sanz et al, Blood 2009

10

102

103

104

105

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

HR

mR

(Months)

6

4

PM

L-R

AR

/PB

GD

x1

04

10

102

103

104

105

2 4 6 8 10 12 14 16

HR

BM PB

mR

(Months)

2

3

PM

L-R

AR

/PB

GD

X1

04

10

102

103

104

105

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

(Months)

HR

3 PM

L-R

AR

/PB

GD

X1

04

Tous les 3 mois: permet de détecter la rechute

Mais pas toujours

Exemples APL 2006

Induction + consolidation

Maintenance

Rythme des prélèvements de MRD

Rythme des prélèvements de MRD

Grimwade et al., JCO 2009

Cinétique de rechute variable, parfois très rapide

RQ-PCR: recommandation de suivi

Type de prélèvement: Moelle ou Sang ?

Fréquence de prélèvement:

- Diagnostic, Induction, 1ère et 2ème conso

- Entretien: tous les 3 - 6 mois

- Après traitement: ??

Rechute = évènement très rare !!

Lo-Coco et al., NEJM 2013

Critères à prendre en compte:

Efficacité du suivi: probabilité de détecter la rechute

Coût

Acceptation par le patient

Réserver à sous-population ?

-Patients à risque ? Mais lesquels ?

-Traitement incomplet

-Enfants

-Protocoles de désescalade ?

Anomalies additionnelles détectées par SNP arrays

Akagi et al., Blood 2009

Additions

Délétions

LOH

47 patients analysés

19 patients avec 1 anomalie ou plus

Anomalies additionnelles détectées par SNP arrays

Valeur pronostique ?

Nowak et al, 2012

Mutations détectées par exome sequencing

Cas des sujets sains

Les mutations non leucémogènes s’accumulent en fonction de l’âge

Welch et al., cell 2012

3 clones analysés par échantillon.

Sang de cordon et HSC de moelle isolées de

sujets sains d'âge croissant,

D’après T Ley

Mutations détectées par exome sequencing

Reanalysis with deep coverage of

RMGs

D’après T Ley

Mutations détectées par exome sequencing

Ding et al, Nature 2012

Evolution clonale des LAM

Welch et al., cell 2012

Modèle intégrant les différents types de mutations dans les LAM

Evolution clonale et sous-clonale

Welch et al., cell 2012

Nombreux sous-clones dans les LAM3

Evolution clonale et sous-clonale

Evolution clonale et sous-clonale: rechute ?

Rechute = évènement très rare !!

Mutations dans ATRA Ligand Binding Domain de PML-RAR

chez patients résistants à l’AR

Lo-Coco et al., NEJM 2013

Gallagher et al., Blood 2012

Mutations dans PML proche site liaison

As2O3 chez patients résistants à l’Arsenic

Goto et al., Blood 2011