Bitki Doku Kltr

DERS ER*Bitki Doku Kltrnn Tanm ve Tarihesi*Bitki Doku kltrnn Uygulama Alanlar*Bitki doku kltnn avantaj ve dezavantajlar*Bitkinin Morfolojik Yaps*Temel Teknikler (laboratuvar Dzeni, Sterilizasyon Teknikleri, Besin Ortamlar, Kltr artlar)*Bitki rejenerasyonu (Organogenesis, Somatik embriyogenesis, Protoplast Kltr, Haploid Hcre kltr, Meristem Kltr)

Bitki Doku Kltr: aseptik koullarda, yapay bir besin ortamnda, btn bir bitki, hcre (meristematik hcreler, sspansiyon veya kallus hcreleri), doku (eitli bitki ksmlar=eksplant) veya organ (apikal meristem, kk vb.) gibi bitki ksmlarndan yeni doku, bitki veya bitkisel rnlerin (metabolitler gibi) retilmesidir.

Bitki doku kltrnn uygulama alanlar;** Bitkilerin klonal olarak hzl oaltlmas** Geleneksel yntemlerle kolay oaltlmayan bitkilerinoaltlmas** Patojenlerden ari bitki elde edilmesi** Islah amal almalar** Somaklonal varyasyonlarn oluturulmas** Haploid bitkilerin elde edilmesi** Bitki gen kaynaklarnn muhafazas** Biyokimyasal rnlerin (sekonder metabolitlerin) eldeedilmesi

Bitki Doku Kltrnn AvantajlarByk miktarlarda klon bitkiler retebilme

Bitkilerin spesifik ihtiyalarna gre alternatif oaltm metotlar

Hastalksz bitki retimi

Tohum retimi iin evebeynlerin klonal oaltm

Btn yl devam edebilen retim

6. Genotipi deitirebilme

7. Germplasm (Genetik kaynaklar) muhafazas

8. Embryolarn kurtarlmas /Somatic embryogenesis

Bitki Doku Kltrnn DezavantajlarMaliyeti yksek ve komplike altyap

Alannda uzman personel / Spesifik teknikler

Enfeksiyon kontrol

Bitki doku kltr ilemlerinde ve genetik iyiletirmelerde kullanlan temel sistem bitki rejenerasyonudur.

Bitki rejenerasyonu, kltr yaplan hcrelerin zellikleri bakmndan ksmda incelenir;

1. Organize olmu meristematik hcreleri ieren somatik dokulardan rejenerasyon; u ve yan mersitemlerden bitkiler oaltlr. Buna meristem kltr yoluyla klonal oaltm denir. Elde edilen hcreler, tamamen donr (verici) bitkiye benzerler.

2. Mersitematik olmayan somatik hcrelerden rejenerasyon; dorudan bir bitki eksplantnn kesilmi yzeylerindeki belirli somatik hcrelerin bir ksmnn, genellikle bitki byme dzenleyicilerinin (zellikle oksin ve sitokininler) etkisi sonucu blnerek ve organize olarak, organlar ve daha sonra da bitkiyi (direkt organogenesis) veya bir somatik hcrenin srekli blnerek embriyo ve daha sonra da tam bir bitkiyi oluturmas (direkt somatik embriyogenesis) eklinde olabilir. Ayrca her iki durum, belirli bir kallus, proto-kallus veya hcre sspansiyonu oluumu devresinden sonra da ortaya kabilir (indirekt rejenerasyon).

3. Mayoz blnme geirmi gametik hcrelerden rejenerasyon; normal kromozom saysnn yarsn ieren hcrelerden direkt veya dolayl yollarla bitki rejenerasyonunda, donr bitkinin kromozom saysnn yarsna sahip, genellikle steril olan haploid bitkiler elde edilebilir.

Bitki Doku Kltrlerinin Tarihi Geliimi

Tarih almalar Aratrmaclar 1902 lk izole edilmi hcre kltr Haberlandt 1904 Olgun embriyolarn kltr Hanning 1917 Biyoteknoloji teriminin ilk defa kullanm Karl Ereky 1926 Oksinin tanmlanmas Went ve ark. 1922 Kk ve srgn ularnn laboratuvarda oaltm Kotte ve Robbins 1924 lk embriyo kurtarma teknii (msr) Dieterich 1934 lk srekli kk kltrleri (domates) White 1934 lk kallus kltrleri Gautheret 1942 lk kallus kltrlerinden sekonder metabolit eldesi Gautheret 1946 Srgn ularndan (apikal meristem) ilk bitki eldesi Ball 1953 DNA'nn yapsnn belirlenmesi Watson ve Crick 1990 Sentetik tohum gelitirme ve hzl dondurma yoluyla germplazm muhafazas almalarnn balamas - 1995 lk rekombinant insan gdas (Flavr Savr, domates)

Bitki Doku Kltrlerinin Tarihi Geliimi

1954Hcre sspansiyonlarndan ilk bitki eldesi Muir ve ark. 1957 lk sitokininin tanmlanmas ve organ oluumunda sitokinin/oksin orannn neminin ortaya konulmas Skoog ve Miller 1958 lk somatik embriyogenesis (havu) Steward ve ark. 1960 Enzimler kullanlarak ilk canl protoplast izolasyonu Cocking 1962 MS besin ortamnn gelitirilmesi Murashige ve Skoog 1965 Tek hcreden bitki rejenerasyonu Vasil ve Hilderbrandt 1967 lk haploid bitkinin retimi (anter polen kltr) Bourgin ve Nitsch 1968 B5 ortamnn gelitirilmesi Gamborg ve ark. 1970 HEPA (High-Efficiency Particulate Air) filtrelerin kullanlmaya balanmas)- 1971 Protoplastlardan ilk bitki rejenerasyonu Nagata ve Takabe 1978 Cinsler aras ilk somatik melezleme Melchers ve ark. 1983 Transgenik ilk bitkinin elde edilmesi (ttn) Murai ve ark. 1986 Transgenik ilk bitkinin tarla testleri (ttn)-

BTK DOKU KLTRLERNN UYGULAMA ALANLARIBTK DOKU KLTRLERNN BTK ISLAHINDAK UYGULAMA ALANLARI

Trler aras melezlemelerden sonra embriyo kltrHaploid bitki retiminde anter (polen) ve yumurtalk (ovl) kltrSomaklonal varyasyonn vitro seleksiyonn vitro dllenmen vitro germplazm muhafazasSomatik hcre melezlemesi (protoplast fzyonu)Gen transferi

2) BTK DOKU KLTRNN TCAR VE ISLAH DII UYGULAMALARI

Hastalksz bitki elde edilmesinde meristem kltr Mikrooaltm Sentetik tohum retimi (somatik embriyolar) Sekonder metabolit retimi (kallus-hcre sspansiyonlar) Kimeralar

3) BTK DOKU KLTRLERNN TEMEL ARATIRMALARDAK UYGULAMALARI

Trler aras melezlemelerden sonra embriyo kltr: Zigot oluumundan sonra ortaya kan uyumazlklar in vivo melezlemelerde embriyo oluumunu veya oluan embriyolarn yaamalarn engellemektedir. Bu embriyolar zel besin ortamlarnda doku kltr ile gelitirilmekte ve yeni melez bitkiler elde edilebilmektedir. Bu teknie embriyo kurtarma teknii denilmektedir.

BTK DOKU KLTRLERNN BTK ISLAHINDAK UYGULAMA ALANLARI

Haploid bitki retiminde anter (polen) ve yumurtalk (ovl) kltr: Mayoz blnme geirmi haploid sayda kromozoma sahip hcrelerde (polen/mikrospor veya megaspor) veya bu hcreleri ieren bitki ksmlarnn (anter veya yumurtalk) doku kltr yoluyla elde edilen hcrelerinde veya rejenerantlarnda yaplan kromozom katlanmas sonucu %100 homozigot bitkiler elde edilebilmektedir. Bu teknie in vitro haploidi teknii denir.

Somaklonal varyasyon: Uzun sreli kltrlerde veya ksa sreli de olsa yksek bitki byme dzenleyicileri ieren ortamlarda bulunan hcrelerden oluan yeni bitkilerde gen veya kromozom bozukluklar sonucu kaltsal ve fenotipik varyasyonlar (somaklonak varyasyonlar) ortaya kmaktadr. Bu varyasyonlar, yeni eit gelitirme ve iyiletirmelerde slahlar tarafndan kullanlmaktadr.

In vitro seleksiyon: Tek hcre seviyesinde; tuz, herbisitler, patojenler vb. faktrlere kar dayanklla gre yaplan seleksiyonlar sonucu, bu hcrelerden elde edilen bitkilerde ilgili faktrlere dayankl veya toleransl bitkiler ortaya kabilir. Bu teknie in vitro seleksiyon denir.

In vitro dllenme: Baz durumlarda (zellikle d ortama altrlamayan bitkilerden tohum almak iin) doku kltr ile elde edilen bitkiler laboratuvar artlarnda tozlatrlmaktadr. Fakat bu uygulama ok snrl kalmtr.

In vitro germplazm muhafazas: Totipotent hcrelerin in vitro kltr, kallus veya sspansiyon hcreleri eklinde uzun sreli olarak veya belirli aralklarla yeniden oluturularak saklanabilir ve ihtiya duyulduunda bu hcrelerden yeni bitkiler oluturulabilir. Bu hcreler, meristemler veya minyatr bitkiler dk scaklkta (4 C), ok az besin maddesine ve alana ihtiya duyarak aseptik artlarda saklanabilir (1-4 yl). Benzer ekilde ok dk scaklklarda (-196 C), sv azot iinde doku ve hcreler hzl bir ekilde dondurularaak saklanabilirler.

Somatik hcre melezlemesi (protoplast fzyonu): Protoplast fzyonu ve somatik melezleme, pre-zigotik eeysel uyumazlklar nedeniyle, klasik melezleme ile elde edilemeyen hibritlerin elde edilmesinde kimyasal ve fiziksel metotlar kullanlarak uygulanan bir tekniktir. Elde edilen somatik melez hcreden (heterokaryon), kallus oluumu ve bitki rejenerasyonu yoluyla yeni bitkilerin elde edilmesi sistemin en nemli ve en gerekli parasdr.

Gen transferi: Doku kltrlerinin bitkileri iyiletirmede en nemli ve yaygn olarak kullanlan uygulamalarndan birisi de, gen veya genlerin bitkilere aktarlmasdr.

Hastalksz bitki elde edilmesinde meristem kltr: Tm apikal meristem veya buradan alnan kk embriyonik paralar kltre alnarak uygulanan teknie meristem kltr denir. ok az miktarlarda bitki byme dzenleyicileri ilave edildiinde u ve yan meristemlerden birok yeni bitkicikler elde edilebilmektedir. Bu metotla elde edilen bitkiler her bakmdan birbirinin benzeridirler.

BTK DOKU KLTRNN TCAR VE ISLAH DII UYGULAMALARI

Mikrooaltm: Organize meristemlerden, henz olgunlamam veya olgunlamasn tamamlam somatik hcrelerden direkt (organogenesis veya somatik embriyogenesis) veya indirekt (kallus, protoplast vb.) yollarla bitkilerin oaltlmas ve kklendirilmesi ilemine genel olarak mikrooaltm denir. Daha az srgn elde edilmesine ramen u ve yan meristemlerden kitle oaltm ticari olarak dierlerinden daha fazla kullanlan bir metottur.

Sentetik tohum retimi (somatik embriyolar):Somatik embriyolarn eitli metotlarla kaplanmas sonucu sentetik (yapay) tohumlar elde edilmektedir.Sentetik tohumlarn, hibritlerin somatik oaltmnda, erksr ve ebeveyn hatlarn muhafazasnda ve odunsu bitkilerin elit genotiplerinin elde tutulmasnda kullanm konusunda olduka fazla alma yaplmaktadr.

Sekonder metabolit retimi (kallus-hcre sspansiyonlar): In vitro hcre kltrleri sekonder metabolit retiminde de nemli bir kaynak olarak grlmektedir.Bitki sekonder metabolitleri, bitki byme ve gelimesinde dorudan kullanlmayan maddelerdir. Ik mikroskobu ile grlebilen sekonder metabolitlerin (tanenler, antosiyaninler, karetenoitler) yannda UV ile grlebilenleri (alkaloitler) de vardr.

Kimeralar: Kimerik bitkiler; farkl trlerin protoplastlarnn kark kltr ve bitki rejenerasyonu, mutasyon uygulamalar sonucu bitki rejenerasyonu almalar, apikal meristemle ilgili yaplan mikro-cerrahi almalar ve gen transferi yaplmas srasnda, bir bitkiyi oluturan btn hcrelerin ilgili gen veya genleri tamamas durumlarnda (zellikle partikl bombardman metodu ve apikal meristemler kullanldnda) elde edilebilmektedir.

Doku kltr, protoplast izolasyonu ve fzyonu, hcre, doku ve bitki beslenmesi, sitogenetik almalar, morfogenesis almalar ve biyolojik azot fiksasyonu gibi temel aratrmalarda da kullanlmaktadr.

Bu tr aratrmalar genellikle sistem gelitirmede faydal olmaktadr.

BTK DOKU KLTRLERNN TEMEL ARATIRMALARDAK UYGULAMALARI

Doku kltr ilemleri bir ok aamadan olumaktadr. Bunlar;Uygun bir laboratuvar dzeninin kurulmas,Kullanlacak bitki paralarnn (eksplant) ve besin ortamlarnn seimi, hazrlanmas ve sterilizasyonu, Kallus ve hcre sspansiyonlarnn oluturulmas, Kallus veya hcre sspansiyonlarndan veya dorudan somatik veya gametik hcrelerden bitki rejenerasyonunun uyarlmas (organogenesis, somatik embriyogenesis veya meristem oaltm yoluyla), Oluan srgnlerin oaltlmas ve boylarnn uzatlmas, somatik embriyolarn olgunlatrlmas, Uzayan srgnlerin kklendirilmesi,Kklenen bitkilerin d ortama altrlmas (aklimatizasyon).

DOKU KLTRNDE TEMEL TEKNKLER

Doku Kltrnde en nemli konu, steril ilemleri yapabilecek baz temel alet ve ekipmanlara ve iyi bir laboratuvara sahip olmaktr.

Doku kltrnde en temel konular bitki paralar ve kullanlacak alet ekipmanlarn iyice temizlenmesi (sterilizasyon), besin ortamlarnn hazrlanmas ve kltre alnacak yerin belirlenmesidir.

Sterilizasyon

Bakteriler

AgrobacteriumBacillus Lactobacillus Pseudomonas Staphyllococcus Enterobacter Xanthomonas 2) Funguslar

3) Virsler ve mikoplazmalarBTK DOKU KLTRNDE KONTAMNASYON KAYNAKLARI

Sterilizasyon, sterilize edilecek yer ve materyale gre 3 ksmda deerlendirlir.

alma alannn sterilizasyonuKullanlacak alet, ekipman, kaplarn ve besin ortamlarnn sterilizasyonuBitki materyallerinin sterilizasyonu

Steril alma alannda kullanlacak yzeyler kullanmdan en az 10-15 dakika nce %10luk ticari sodyum hipoklorit solsyonu (%5 NaOCl ieren) veya %70lik alkolle silinir. Eer kabin iinde UV lambas varsa alr.

Kullanlacak aletler (bisturi, pens vb.) kullanmdan nce etil veya metil alkol iine batrldaktan sonra alev lambasna tutularak alevle yzey sterilizasyonuna tabi tutulur.

Eksplantlarn kesiminde kullanlan fayanslar, alminyum folyo iine sarlarak otoklavda sterilize edilir. Kltr kaplar (cam kavanozlar) aldktan sonra boazlar ve az ksmlar aleve tutularak sterilize edilir.

alma alannn sterilizasyonu

Besin ortamlar, alet ve ekipmanlar 3 ekilde sterilize edilirler:

Otoklav ve scak hava sterilizasyonuFiltre sterilizasyonuMikrodalga sterilizasyonuBesin ortamlarnn, alet ve Ekipmanlarn sterilizasyonu

Besin ortamlarnn sterilizasyonu, otoklavda 1.05 atm (105 kPa) basnta, 121 Cde 15 dakika tutularak yaplr.

Aletler ve bo kaplar otoklav poeti iine konulduktan ve azlar kapatlp, otoklav band ile yaptrldktan sonra sterilize edilirler. Otoklav bantlar, sterilizasyon sonras renk deitirerek ortamn veya kaplarn sterilize edilip edilmediini gsterir. Erlenler, pipetler (cam) ve dier kuru materyaller, azlar alminyum folyo ile kapatlarak scak hava frnnda (etv) 1-4 saat sreyle 200 Cde sterilize edilirler.

Plastik malzemeler kesinlikle otoklavda veya etvde sterilize edilmezler.

Otoklav ve scak hava sterilizasyonu

Ortam hacmi (ml)121 oC scakla ulama zaman (dakika)Minimum sterilizasyon sresi (dakika)20-2592450112610013.528.525016.531.55002035100025402000334840004863

Sv ortamlar ve s ile bozulabilen maddelerin stok solsyonlar iin uygulanr. Filtre sterilizasyonu iin, iki litre kapasiteli elikten yaplm silindirler, 250 mllik plastik Sartorius filtreler ve tek kullanmlk selloz nitrattan yaplm membran filtreler (filtre, enjektr ucuna taklr ve ortam steril plastik veya cam ieler iine szlr) kullanlr. Filtre ile sterilize edilen besin ortamlarn kontaminasyon riskinden korumak iin bu ortamlar en az 4-5 gn dolapta tutulduktan sonra kullanlmaldr.

Filtre sterilizasyonu

Filtre ile sterilizasyonun pahal ve az miktarda ortam iin uygun olmakta, otoklav ile sterilizasyon ise uzun zaman almaktadr.

Bunlara alternatif olarak mikrodalga ile sterilizasyon hem ucuz hem de daha ksa srese sterilizasyonu salamaktadr.

D artlardan (tarla, sera vb.) alnan eksplantlar ncelikle musluk suyu altnda en az yarm saat tutulurlar.

Tohum ve yumru gibi daha kaba paralar 1-20 saniye alkol iinde tutulduktan sonra gerek yzey sterilizasyonu ortamna konulur.

Yzey sterilizasyonu iin en fazla kullanlan maddeler etil alkol, sodyum veya kalsiyum hipoklorit, civa klorr, gm nitrat ve hidrojen peroksittir.

Ayrca sterilizasyon iin biyositler de kullanlabilir. Bitki materyallerinin yzey sterilizasyonu

Kullanlan bitki paralarna gre farkl yzey sterilizasyonu ekilleri

Eksplant n sterilizasyonSterilizasyon Tohum10 sn saf alkolde muamele ve steril su ile durulama20-30 dk %10-20lik ticari sodyum hipoklorit solsyonu iinde kartrlarak tutulduktan sonra en az 3 defa steril su ile durulama, steril filtre kad zerinde kurutma.Meyve, baklaKsa sreli saf alkol ile muamele10-15 dk %10luk ticari sodyum hipoklorit solsyonu iinde kartrlarak tutulduktan sonra en az 3 defa steril su ile durulama.Gvde, hipokotil, petiyolYarm saat musluk suyu altnda tutma10-20 dk %15lik ticari sodyum hipoklorit solsyonu iinde kartrlarak tutulduktan sonra en az 3 defa steril su ile durulama.YaprakYarm saat musluk suyu altnda tutma15 dk %10luk ticari sodyum hipoklorit solsyonu iinde kartrlarak veya %0.1-0.25 HgCl2 solsyonunda 2-5 dk alkalandktan sonra en az 3 defa steril su ile durulama.Depo organlarMusluk suyu altnda ykama20-30 dk %15-20lik ticari sodyum hipoklorit solsyonu iinde kartrlarak tutulduktan sonra en az 3 defa steril su ile durulama, steril filtre kad zerinde kurutma.

MS ortam (Murashige ve Skoog, 1962): ttn iin gelitirilmi yksek tuz ierikli bir ortamdr. zellikle dk younluklarda (1/4, 1/2) younluklarda birok bitki trndeki kklendirme almalarnda baaryla kullanlmaktadr.

B5 ortam (Gamborg ve ark, 1968): soya kallus kltrleri iin gelitirilmi nitrat azotu yksek bir ortamdr.

LS ortam (Linsmaier ve Skoog, 1965): MS ortamnn organik bileikler bakmndan farkl bir versiyonudur.

WH ortam (White, 1963): dk tuz formlasyonlu ve domates kklerinin kltr iin gelitirilmi bir ortamdr.

SH ortam (Schenk ve Hilderbrandt, 1972): hem monokotiledon hem de dikotiledonlar iin uygun bir besin ortamdr.

NN ortam (Nitsch ve Nitsch, 1969): anter kltr iin gelitirilmitir.

BESN ORTAMLARI

Bitki besin ortmalarnda yer alan komponentler kullanm sklna gre srasyla; su, makro elementler, mikro elementler, vitaminler, ekerler (karbon kayna), yar katlatrclar (jel yapclar; agar, agaroz vb.), bitki byme dzenleyicileri, tamponlar, amino asitler ve kimyasal olarak tanmlanamayanlardr.

Makro elementler; azot, fosfor, sodyum, magnezyum, kkrt, kalsiyum

Mikro elementler; demir, manganez, inko, bor, bakr, molibden, kobalt, iyot

Vitaminler; thiamin (B1), nikotinik asit (B3), pridoksin (B6), Myo-inositol ve d-biotin (H)dir. Dier vitaminler arasnda d-pantotenik asit (B5), askorbik asit (C), -tokoferol (E), folik asit (M), retinol (A), riboflavin (B2) ve kolekalsiferol (D3)

ekerler; sakkaroz, glikoz, maltoz, rafinoz, fruktoz

Jel yapc maddeler; agar, agaroz, Sea-Kem agaroz, aljinat, Phytagel, silikajel, jelatin ve niasta

Bitki hormonlar, bir dokuda retilip, byme ve gelimenin olaca dier dokulara tanan ve ok dk konsantrasyonlarda etkili olan endojen organik bileiklerdir.

En ok kullanlanlar; oksinler, sitokininler, gibberellinler, absisik asit ve etilendir.

Bitki byme dzenleyicileri

1926 ylnda Went adl aratrc tarafndan keefedilmitir.Bitkilerde ilk kefedilen hormon grubudur. lk bulunan oksin hormonu ise indolasetik asitdir (IAA). Bitkide IAAnn balca sentez yeri gvde ve dal ulardr. Fotoperyodizm, kklendirme, apikal dominans, tohum imlenmesi ve hcre geliiminde etkilidir.

Oksinler, doku kltrlerinde tek balarna kullanldklarnda kallus uyarmn, hcre sspansiyonlarnn elde edilmesini ve somatik embriyo oluumunun uyarmn, sitokinlerle birlikte yine kallus oluumunu, srgn rejenerasyonunu ve somatik embriyo oluumunun uyarmn salayabilirler.

Oksinler

Oksinlerin bymeyi arttrc etkileri iki mekanizma ile aklanmaktadr.

a) Oksinler hcre eperine H+ iyonu tanmn arttrp hcre eperinin esnekliini arttrarak daha ok su alnmasn salarlar. Bylece hcre ier ve byr. b) Bymenin ayn hzda olabilmesi iin gerekli mRNAlarn sentezini uyarrlar.

Hcre blnmesini ve zellememi gen hcrelerde farkllamay ilerletir.

Sitokininler olarak isimlendirilmelerinin nedeni de sitokinezi (sitoplazma blnmesi) uyarmasdr.

Sitokininler klorofilin ve hcre proteininin bozulmasn yavalatp RNA sentezini arttrarak yalanmann geciktirilmesi ya da azaltlmas eklinde rol oynamaktadrlar.

Sitokinin

Doku kltr ortamnda oksin/sitokinin oran yksekse kklenme, sitokinin/oksin oran yksekse srgn oluumu grlr.

Bu iki hormonun oran dengelenince hcre ktlesi bymeyi srdrmekle birlikte farkllamaz ve kme oluturur.

Farkllamam bu hcre kmesi kallus olarak isimlendirilir.

Giberellinler hem hcre blnmesini uyararak hem de uzamay salayarak gvdenin uzamasna neden olur.

Tohum imlenmesinde depo niastasnn hidrolizini gerekletiren -amilaz enziminin oluumunu salayarak, niastann embriyo tarafndan kolaylkla kullanlabilen ekerlere dnmne yardmc olur ve imlenmeyi kolaylatrr.

Gibberellinler

Donma, yksek tuz ierikleri ve kuraklk gibi uygun olmayan koullarda kalan bitkilerde ortaya kan deiimleri kontrol eder. rnein tuz stresi osmotin denilen yeni baz proteinlerin sentezlenmesine neden olur.Absisik asit ekerlerin ve aminoasitlerin tanmasnda, depo maddelerinin sentezinde ya da her ikisinde etkili olabilmektedir. Tohumdaki depo rnlerinin hidrolizi iin gerekli enzimlerin sentezini engellemektedir. Ayrca embriyonun bymesi iin gerekli artlar salanncaya kadar tohumun uyku halinde kalmas da absisik asit sayesinde gerekletirilir.

Absisik asit

Meyve olgunlamas srasnda etilen sentez hz artar. Kuraklk, su baskn, souk veya mekanik bir etki olarak rzgar gibi stres koullar etilen sentezini arttrr.

Etilen zellikle dikotil bitkilerde yapraklarn st ksmndaki parankimatik hcrelerin uzamasna ve yapran kalnlamasna neden olurken genellikle kklerin ve gvdelerin uzamasn engeller.

Bu durumda gvde ve kk daha kaln bir hal alr.

Etilen

Bitki Byme DzenleyicilerKsaltmalarMol.ArlBenziladenin

STOKNNLERBA225.3Izopentil Adenin2-iP203.2KinetinKIN215.2ZeatinZEA219.2

Indol 3-Asetik asit

OKSNLERIAA175.2Indol 3-Btrik asitIBA203.21-Naftelenasetik AsitNAA186.22,4-Diklorofenoksiasetik Asit2,4-D2,4,5-Triklorafenoksiasetik Asit2,4,5-T255.5PikloramPIC241.5

Amino asitler; glisin, arginin, glutamin, prolin, aspartik asit

Kimyasal olarak tanmlanamayanlar; Hindistan cevizi st, kazamino asit, maya z (yeast extract)

Organik asitler; fumarik asit, malik asit, sitrik asit ve sodyum piruvat

Antibiyotikler; Karbenisilin, sefotaksim, eritromisin, genetisin, higromisin, kanamisin, streptomisin ve gentamisin

En ok hazrlanan stok solsyonlar; tuzlar, mikro elementler, bitki byme dzenleyicileri, vitaminler ve antibiyotiklerdir.

Bunlar hazrladktan sonra ambalaj zerine kullanlan madde, forml, konsantrasyonu ve hazrlama tarihi mutlaka yazlmaldr. Bitki byme dzenleyicilerinin stok solsyonlar 1 mL svda 0.1-5.0 mg etkili madde bulunacak ekilde yaplabilir.

Dondurucuya konulan stok solsyonlarn kaplar orannda doldurulmal, kullanmdan en az yarm saat nce kartlp, oda scaklnda, iinde su bulunan bir kapta tutularak zldkten sonra ortama ilave edilmelidir. Stok solsyonlarn hazrlanmas ve saklanmas

Kltr artlar

Scaklk

Ik

Nem

kltr odalarnda kullanm amacna gre 18, 22 ve 25 Cye ayarlanr.beyaz serin floresan lambalaryla salanr.%50-70 arasnda bir deere ayarlanr.

n vitro Bitki RejenerasyonuOrganogenesisSomatik embriyogenesisProtoplast kltrHaploid hcre kltrMeristem kltrTotipotensi: Bir bitki hcresinin yeni bir bitkiyi meydana getirebilme potansiyelidir. Totipotensi rejenerasyonun temelidir.

OrganogenesisDllenme : Haploid kromozomlu iki farkl gametin (erkek ve dii) bir araya gelerek, zigot ad verilen tek hcreli ve diploid bir yapy meydana getirmesidir.

Organogenez kelime anlam olarak organ (kk veya srgn) oluumu demektir. n vitro artlarda organogenez, Hcrelere ve dokulara bask uygulayp baz deiikliklere sebep olarak srgn veya kk tasla diye adlandrlan tek kutuplu ve vaskler sistemi kkenini ald dokuya bal olan bir yapnn meydana gelmesine yol aan ilemdir. n vitro artlarda organogenez, oksin ve sitokinin arasndaki denge ile kltr sresince dokularn bitki hormonlarna kar gsterdikleri tepki yeteneine baldr.

ORGANOGENESS ETLERndirekt organogenesisDirekt organogenesisKallusSrgn veya kkBitkiSrgn veya kkBitki

Direkt Organogenez

Kallus aamas olmakszn dokulardan direkt olarak tomurcuk veya srgn retimidir. Bitkilerin etkin oaltm, transgenik bitki retimi ve en nemlisi klonal oaltm iin direkt organogenez baaryla uygulanan bir yntemdir. Ancak transgenik bitki retimi iin indirekt organogenez daha ok tercih edilmektedir.

ndirekt Organogenez (Kallus yoluyla indirekt olarak organ oluumu) Bu yolla elde edilen bitkilerin klon olma garantisi yoktur. Fakat istenilen karakterdeki somoklonal varyantlarn seimi ve kitlesel oaltm asndan ideal bir yntemdir. Kallus yoluyla bitkilerin retimi, transgenik bitkilerin elde edilmesinde u ekillerde kullanlabilir :Kallus hcrelerine gen aktarlr ve daha sonra bu kallus hcreleri rejenere edilir. Veya balangta explant hcrelerine gen aktarlr, daha sonra bu explantlardan kallus elde edilir ve son olarak da bu kallustan transgenik bitkiler elde edilir.

In vitro organogenesisde etkin bitki rejenerasyonu iin gerekli artlar

Uygun eksplantn seilmesiBymede aktif maddeleri ieren uygun bir besin ortamnn seilmesiFiziksel evre koullarnn kontrol

Eksplant seimiDoku kayna olarak kullanlan organOrgann ontogenetik ve fizyolojik yaEksplantn bitkiden alnd dnemEksplantn byklEksplantn alnd bitkinin dier zellikleri

Besin ortamnn temel ierikleri

norganik maddelerOrganik maddelerBitki byme dzenleyicileriDoal kompleksler

Kltr artlar

Ortamn fiziksel haliOrtamn pH deeriNemIkScaklk

Organogenesis

Avantajlar;Hcre veya dokulardan yeni bitki bireyleri meydana getirmeye imkan tand iin, generatif yoldan oaltlmas zor olan bitkilerin retimine kolaylklar salamaktadr.Bitki transformasyon almalarnda olduka nemlidir.Dezavantajlar;Btn bitki trleri iin evrensel bir rejenerasyon protokol yoktur. Her bitki tr, hatta her bitki eidi iin spesifik bir sistemin optimize edilmesi edilmesi gerekir.

Pamuk nod eksplantlarndan kallus oluumu ve rejenerasyon

Pamuk nod eksplantlarndan direkt gvde rejenerasyonu

Pamukta kk rejenerasyonu

n vitroda rejenere olan pamuk bitkisinin topraa aktarm

SOMATK EMBRYOGENEZBamsz vaskler sistemi olan ve kk ile srgn aksini ieren iki kutuplu (bipolar) bir yapnn olumasna yol aan bir sretir. Vejetatif (somatik) hcrelerden gelien embriyolar da somatik embriyo olarak adlandrlr.

Bireysel bitkilerin hcrelerinden gelitikleri iin somatik embriyolardan elde edilen bitkiler genetik olarak klon olutururlar.Dllenmi yumurtadan gelien embriyoda olduu gibi, iki enekli bitkilerde somatik embriyolar da globular, kalp, torpedo ve kotiledon oluum safhalarn geirirler.Gvde-kk eksenine ayn zamanda sahip olup, asl doku ile vaskular balantlar olmadndan dolay dokudan kolaylkla ayrlabilirler.

Somatik Embriyo RejenerasyonuDirekt embriyogenesis EksplantSomatik embriyolarndirekt embriyogenesisEksplantPro-embriyolarBipolar embriyolarBitki

Somatik embriyogenezin kullanm alanlarKlonal oaltmSentetik tohum retimiGen aktarm

Digitalis trojana bitkisinde direkt somatik embriyogenez

Paulownia elongatada indirekt somatik embriyogenesis

Pterocarpus marsupium da indirekt somatik embriyogenez

Somatik embriyogenez doku kltrnde kitlesel klonal oaltm iin en gl tekniklerden birisidir. Direkt somatik embriyogenez, somoklonal varyasyon oluturma ansnn dk olmas nedeniyle klonal oaltm iin daha ok tercih edilir. ndirekt somatik embriyogenez ise, bazen istenilen somoklonal varyantlarn seleksiyonu ve transgenik bitki retimi iin tercih edilir. Biyoreaktrler kullanlarak somatik embriyolarn byk lekli retimi ve somatik embriyolardan sentetik tohum retimi dnyada baarl bir ekilde uygulanmaktadr. Somatik embriyogenezin bir dier avantaj ise , somatik embriyolarn organogeneze ihtiya duymadan direkt olarak imlendirilerek, btn bir bitkiye dntrlebilmesidir.

Sentetik Tohum : Kaplanm somatik embriyolar sentetik tohum olarak adlandrlr. Somatik emriyolar, yapay tohum kabuu olarak grev yapacak olan bir aljinat matriksi ile kaplanr. Kaplanm somatik emriyolar bitkiciklerin oluturulmas iin ex vitro ve in vitro artlarda imlendirilebilir.

Sentetik Tohumlarn Avantajlar

allmas kolaydr.Potansiyel olarak uzun sre saklanabilirler.Byk lekli retimleri dk maliyetlerle gerekletirilebilir.

PROTOPLAST KLTRHcre eperleri yok edilmi hcre zar ile evrili hcrelerin kltrdr. Bir hcrenin duvar uzaklatrldnda geriye kalan ksmna protoplast denir. Protoplastlar izotonik ortamlarda canlln srdrp, yeni duvar oluturup, mitozla blnebilir, yeni hcre gruplar ve daha sonra da yeni bitkiler oluturabilirler.

Protoplast izolasyonu, kltr ve rejenerasyonunda nemli aamalar

Protoplast izolasyonu, saflatrlmas ve testlera. nkbasyon metodub. Saflatrma yntemleric. Hcre duvar kalnts, canllk ve verim testleriProtoplast kltra. Besin ortamlarnn zellikleri ve bitki byme dzenleyicilerib. Kltr younluuc. Kltr sistemleriProtoplastlardan kallus oluumu ve bitki rejenerasyonua. Besin ortamlar ve yaplacak deiikliklerb. Ozmotik basncn azaltlmasc. Kallusun rejenerasyon ortamna transferi ve srgn oluumuProtoplast izolasyonu, kltr ve rejenerasyonunda nemli aamalar

Protoplast teknolojisi ile en kk canl niteye ulalabilmekte, hcre fzyonu, seleksiyonu ve klonlanmas ile genetik transformasyona imkan salanmaktadr.Protoplast kltr ve somatik melezleme bitki slahnda daralan genetik varyabiliteyi geniletmede nemli metodlardan biridir.Son yllarda bakteriler ve dier yollarla aktarlan kimerik genleri tayan transgenik trlere kar byk bir reaksiyonun ortaya kmas bu almalarn nemini daha da arttrmaktadr.Protoplast Fzyonu ve Somatik Melezleme

Protoplast kltr ve fzyonu klasik slah yntemleriyle gerekletirilemeyen ve eitli uyumazlklar gsteren cins ve trler aras melezleme, ve hatta yeni trlerin elde edilmesinde bir ara olabilir.Protoplast fzyonu ve bu yolla bitki rejenerasyonu ayn zamanda cins ve trler aras mitokondriyel DNA (sitoplazmik erkek ksrl), kloroplast ve sitoplazma gibi ekirdek d genetik elementlerin transferine de imkan salamaktadr.Protoplast Fzyonu ve Somatik Melezleme

Yeni eit gelitirmede somatik melezlemenin uygulan

Somatik melezleme, iki protoplastn ekirdek, sitoplazma veya her ikisininde birbiriyle belirli ortam ve artlarda birletirilmesidir. Fzyon sonucu oluan yaplara fzyon rnleri veya heterokaryon denir. Bu birleme sonucu oluan bitki sitoplazmalar (sibrit), ekirdekler (hibrit) veya her iki bakmdan da somatik melez olabilir.

Fusion of protoplasts of potato and tomato, and production of hybrid plant (pomato).

Protoplastlarn kimyasal ve elektriksel fzyonu ve somatik melezlerin elde edilmesi

Protoplast kltrnn dezavantajlarHer bitki tr iin tekrarlanabilir bir ekilde protoplasttan bitki elde etme metodu gelitirilmi deildir.Heterokaryonlarn etkin bir ekilde ayrm yaplamamaktadr.Somatik melez bitkiler genellikle steril olmakta, dl vermemekte veya fertil olmas durumunda ok geni bir somaklonal varyasyon gstermektedir.

Somatik melezleme teknii1. Protoplastn izolasyonu

2. stenen trlerin protoplastlarnn fzyonu (Elektrofzyon veya kimyasal fzyon

3. Somatik hibrid hcrelerinin tanmlanmas ve seimi

4. Hibrid hcrelerin kltr

5. Rejenere edilmi hibrit bitki

Protoplast izolasyonu(Protoplastlarn bitki dokularndan ayrlmas)1. Mekanik Metot2. Enzimatik Metot

1. Mekanik Metot Bitki Dokusu

Hcre Plazmolizi

Hcrelerin mikroskopta gzlenmesi

Hcre duvarlarnn bakla kesilmesi

Protoplastlarn serbest kalmasProtoplast topluluu

Mekanik Metot

Soan, turp ve pancar kk gibi vakooll hcrelerde kullanlr.Dk miktarda protoplast elde edilmesiZahmetli ve can skc bir sre

Enzimatik Metot

Yaprak sterilizasyonu ve Epidermisin uzaklatrlmas

Plazmolize hcrelerPectinase +cellulaseProtoplastlarn serbest kalmasPlazmolize hcrelerPectinase Protoplastlarn serbest kalmasHcrelerin serbest kalmascellulasezole protoplazma

Enzimatik MetotYaprak, petiol, kk, koleoptil, hipokotil, gvde srgn apikali, embriyo gibi farkl dokularda kullanlabilir Mezofil dokusu en uygun dokudur Protoplast verimi yksektir

Proplast Fzyon(ki farkl genomun protoplastlasrn fzyonu)1. Spontan Fzyon2. Uyarlarak FzyonIntraspecificIntergenericKemofzyon

Mekanik FzyonElektrofzyon

Spontaneous FusionProtoplast temastan dolay kendiliinden dier protoplastla birleir

Uyarlarak FzyonKemofzyon (Kimyasallarla uyarlma)

PEG (Polyethilen Glikol)NaNo3 (Sodyum Nitrate)Ca 2+ ionsPolyvinyl alkolElektro fzyon Elektriksel olarak fzyonun uyarlmasdr.Mekanik fzyon Mikroskop altnda micromanipulator and perfusion micropipette kullanlarak yaplan fiziksel fzyondur.

HAPLOD BTK RETMSomatik hcrelerdeki kromozom says, ait olduklar bitki trnn gamet hcrelerinde bulunan kromozom says kadar olan bitkilere haploid bitkiler denir. Haploid sayda kromozoma sahip hcrelerde (polen/mikrospor veya megaspor) veya bu hcreleri ieren bitki ksmlarnn (anter veya ovl) doku kltr yoluyla elde edilen hcrelerinde veye rejenerantlarnda yaplan kromozom katlanmas sonucu homozigot bitkiler elde edilebilir. Bu teknie in vitro haploidi teknii denir.

Haploid bitki retimi iki farkl ekildeyaplabilirErkek gametten haploid uyartm (Androgenesis)- Anter kltr- Mikrospor kltrDii gametten haploid uyartm (Ginogenesis ve partenogenesis) - Ovl ve ovaryum kltrleri

Haploid bitkilerin salam olduklar baz avantajlar;Tam bir homozigotiyi ok ksa srede elde etmek mmkndr.Resesif mutasyonlarn aa kartlmasnda bavurulan en etkin yntemdir.Haploidler ve bunlarn katlanmas ile gelitirilen dihaploidler sitolojik, fizyolojik ve genetik adan nemli deneysel materyallerdir.Dioik trlerde veya klasik yntemlerle homozigotiye ulamann zor olduu trlerde dihaploidizasyon yntemi kullanlarak bu sorun bir generasyonda giderilebilir. ok yllk meyve aalar ve orman bitkileri gibi tohumdan ieklenmeye kadar olduka uzun bir genlik ksrl olan trlerde de haploidizasyon nem kazanmaktadr.Haploid bitkiler, farkl patojenlere kar in vitro seviyede seime olanak vermekte, hastalklara dayankllk almalarnda yer, zaman ve maddi kazan salamaktadr

MERSTEM KLTRMeristematik hcreleri kullanarak gerekletirilen doku kltr zellikle virsten arndrlm bitkilerin elde edilmesinde yaygn olarak kullanlan bir yntemdir. Apikal srgn ve kk meristemi hcrelerinin virs ierme ihtimali olduka dktr.

Meristem ve srgn ucu kltrlerinin uygulama alanlarVirssz materyal elde etmekGermplazm muhafazas (Meristem ucu, soukta muhafaza ve kk olmas bakmndan ok uygundur)Meristem ucu kltrleri, karantina uygulamalarna gre uluslararas tasmada ounlukla kabul edilen kltrlerdendirBakteri ve mantarlardan arndrlm bitkilerin retimi

Meristem ucu kltr tekniinin snrlamalar Virsten arndrmada eksplant boyutu ile kontaminasyon derecesi arasnda negatif bir iliski vardr. Virsten arndrlms bitkilerin elde edilmesinde stok bitkinin fizyolojik durumu etkili olmaktadr. Meristem kltrnn virs eliminasyonunda etkili bir yntem olarak tanmlanmasna karsn meristemlerin her zaman virsten arndrlms olmad da unutulmamaldr.

Virsten ari bitkilerin retilmesindekullanlan yntemler Meristem ucu kltr Scaklk uygulamas (termoterapi) Meristem kltr ile birlikte scaklk uygulamas Kimyasal madde kullanm (kemoterapi) Souk uygulamas (kriyoterapi) Mikroalama Virsten ari bitkilerin kallus ve protoplasttan elde edilmesi Virsten ari dier eksplantlarn kullanlmas

Scaklk uygulamas (termoterapi) Scak uygulamas aktif olarak byyen vegetatifmateryal zerinde etkili olmaktadr. Scaklk uygulamas ile ou virsler ve baz sistemikbakteriyal hastalklar elimine olmaktadr. Scaklk uygulamasnda byme iin gerekli optimumscakln zerinde bir scaklk semek gereklidir. Scaklk uygulamasnda bitki ksmlar (elikler veyasoanlar, yumrular) scak suda ya da scak havada (50-52 C) belirli srelerde (10-30 dk) braklmaktadr

Meristem kltr ile birlikte scaklkUygulamas

Scaklk uygulamas, ounlukla sadece meristem kltr ile uzaklastrlmas zor olan virslerin eliminasyonu iinkullanlmaktadr.

Scaklk uygulamas 3 farkl ekildeyaplmaktadr;

Bulask olan bitkiler nce artan scaklklara maruz braklr sonra meristem ular kltre alnr. Meristemlerin kltre alnmasndan nce in vitro srgnlere yksek scaklk uygulamas yaplr. Kltre alnan meristemlere scaklk uygulamas yaplr.

Kimyasal madde kullanm

Yaygn olarak ribavirin (virazole-1.-Dribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide) kullanlmaktadr.

Souk uygulama (kriyoterapi)

Yksek scaklk uygulamalar ile meristem kltrnn kombinasyonuna benzer sekilde meristem ucu kltr ile birlikte dsk scaklk uygulamalarnn da virs eliminasyonu konusunda basarl olmaktadr.

Mikroalama Virusten ari analarn (cr) uzerine meristemlerin aslanmas tekniidir. Virusle bulask olmayan tohumlar kk stoklar olarakkullanlmaktadr. Virusle bulak ana bitkiden direkt olarak aseptikon islemler ile ayrlan meristem ucu ya da mersitemucunun in vitro kulturunden sonuclanan kucuk birsurgun ucu virusten ari anaca aslanmaktadr. Bu tur mikroaslama meristem ucu kulturunun basarsz olduu turlerde virusten ari stoklar retmek iin kullanlmaktadr.

Virsten ari bitkilerin kallus veprotoplasttan elde edilmesi Adventif tomurcuk veya somatik embriyogenesis yoluyla elde edilen kallustan rejenere olan bitkicikler yksek derecede virsten aridir.

Virsten ari dier eksplantlar

Virsle bulask olan bitkilerin yapraklar patojenin penetrasyon yapamad yerlerde koyu yesil alanlara sahiptir. Byle blgelerden alnan eksplantlardan elde edilen rejenerantlarn ou virsten ari olmaktadr.

Sekonder Metabolitlernsanolu yaamn srdrebilmek iin gerek duyduu besinleri bitkilerden karlar. Bitkiler, temel besin ihtiyalarn karlamak iin gereken karbohidrat, protein ve yalarn, yani primer metabolitlerin kaynan oluturmaktadrlar. Besinsel nemi ok byk olan bu bileiklerden baka odun, selloz, zamk ve lastik gibi dier baz yararl maddelerde bitkilerden salanmaktadr. Besin ve enerji salama gibi yaamsal nem tayan rnleri salamakla beraber, bata ila sanayi olmak zere, kimya, gda, kozmetik ve zirai mcadele gibi alanlarda ekonomik adan ok nemli ve yeri doldurulamaz baz kimyasallrda yine bitkilerden elde edilmektedir. Bu kimyasallara genel olarak " sekonder (ikincil) metabolitler " ad verilmektedir. Sekonder metabolitlerin say ve yap itibar ile ok byk eitlilikte retilmeleri yksek bitkilere has bir zelliktir.

Sekonder metabolitler, bitkinin ekosistemle olan iliskisinde, evresel kosullara uyumunda, savunma, korunma, hayatta kalma, nesillerini srdrme gibi nemli olaylarda esitli avantajlar saglayan kimyasal maddelerdir. Bunlar arasnda; bitkiyi patojenlere kars koruyan antibakteriyel, antifungal, antiviral; diger bitkilere kars dogal yasamda rekabet gcn arttrananti-germinatif ve toksik maddeler; UV snlar, tuzluluk, kuraklk gibi zararl evresel etmenlerin neden oldugu stres kosullarnda diren arttrc metabolitler; zararl hayvanlar ve otlara karskorunmay saglayan insektisit, pestisit, molluskusit ve herbisidler; polinasyon ve tohum daglmn saglamak zere hayvanlar cezbedecek renkli ve gzel kokulu metabolitler bulunmaktadr

nceleri bu rnler bitkiler tarafndan oluturulan ve hibir ilevi olmayan atk maddeler olarak kabul edilmekteydi. Ancak daha sonra bu metabolitlerin savunma, korunma, ortama uyum, hayatta kalma ve nesillerini srdrmek iin bitkiler tarafndan gelitirilmi olduka karmak mekanizmalarn rnleri olduu anlalmtr.Sekonder metabolitlerin bitkilerdeki ilevleri unlardr;Kuraklk, tuzluluk, UV nlar vs. gibi deiik evresel etkenlerin oluturduu stres ortamlarna kar koymaHerbivorlara (bcekler, srngenler vb.) kar savunmaMikroorganizmalara (bakteriler, virsler, mantarlar vb) kar savunmaBaz metabolik ve daha gelimi ekolojik ilevler (Tozlamay ve tohum dalmn salamak iin hayvanlar ve tayclar cezbetme gibi)Btn bu mekanizmalarn yan sra bitkiler, fiziksel etkenlerin veya mikrobiyal enfeksiyonlar sonucu oluan hasar ve yaralanmalar esnasnda, aktif savunma mekanizmalarn devreye sokarak fitoaleksinler ad verilen kimyasallar retir

Fitoaleksinler dk molekl arlkl antimikrobiyal kimyasallardr. Sekonder Metabolitlerin Ekonomik nemi Son yllarda birok endstriyel alanda insan saglgn tehdit edici sentetik rnlerin yerini, dogal olan bitkisel sekonder metabolitler almstr. Gda sektrnde tatlandrc, kvam arttrc, renk ve koku verici birok madde; kozmetik endstrisinde parfm ve kozmetik rn (krem, tonik, maske), tarm alannda insektisit gibi kimyasallar; tekstilde kumas boyamada kullanlan dogal boyalar esitli bitkisel sekonder metabolitlerden elde edilmektedir. Ayrca, Dnya Saglk rgt tarafndan temel ilalar kapsamnda ilan edilen 252 ilacn %11i bitkisel sekonder metabolitlerden retilmektedir. Bunlardan en nlleri; Salix trlerinden izole edilen antipiretik ve analjezik zelligi olan salisin (aspirin), Taxus brevifoliadan elde edilen anti kanser etkisi olan taxol (paclitaxel) ve Papaver sominiferumdan elde edilen gl analjezik, narkotik etkisi olan morfindir.

Bunun yansra, sekonder metabolitlerin dogal kosullar altnda bitkilerden elde edilmesi; genellikle zorlu evresel kosullarda yetisen bitkilerin toplanmasnn zor ve pahal olmas, bitkilerin dogadan toplanmas sonunda bitki trlerinin zamanla soylarnn tkenmesi, sekonder metabolit miktar ve kalitesinin evresel ve iklimsel kosullardan etkilenmesi, belli gelisim evrelerinde ve ok az miktarda retilmeleri gibi sorunlar nedeniyle zordur ve bu nedenle gn getike artan talep karslanamamaktadr.

Sekonder metabolitler birincil metabolizma yollarnn ara rnlerinden, zel metabolik yollarla retilmektedirler ve genellikle biyosentez yollarna gre snflandrlrlar. Bu metabolitler, bitkiler tarafndan ok az miktarlarda retilirler ve baz bilesikler belirli trlere zeldirler. ogunlukla bitkilerin belli organlarnda, hatta belli organlarn belli hcrelerindeki belli kompartmanlarda bulunurlar ve bitkinin belli bir gelisim periyodu sresince retilirler.

la Etken MaddesiElde Edildii BitkiTedavi leviAtropinAtropin belladonaAntikolinerjikDigoksinDigitalis lanataKardiotonikDigitoksinDigitalis purpureaKardiovasklerEmetinCaphelis spp.Amipli Dizanteri tedavisiEfedrinEphedra sinicaBron acFilokarpinPilocarpus jaborandiKolinerjikHiyosiyaninHyosycamus nigerAntikolinerjikKinin,KinidinCinchona ledgerianaStma tedavisiKodeinPapaver somniferumksrk kesici, analjezikReserpinRauwolfia serpentiaAntihipertansifVinkristin,Vinblastin, AymalisinCatharantus roseusKanser tedavisi

Bitki Doku Kltr Yntemleriyle Sekonder Metabolit EldesiFarkllasmams ve organize olmams kltrlerden sekonder metabolit eldesi iin; hcre sspansiyon kltrleri ile alsan arastrmaclar, yeterli miktarda metabolit eldesinin yaplamadgn, ancak dsardan esitli rn arttrmna dayal teknik yaklamlarda bulunulmas gerektigini bildirmislerdir. Kallus kltrleri ile yaplan alsmalarda ise kltrn balatld doku paras (eksplant) orijininin sekonder metabolit retiminde nemli oldugu, alt kltrlemelerde genetik stabiliteyi saglamann gerekli, ancak zor oldugu belirtilmistir. Ayrca zellikle, belli bir organ (kk, srgn veya embriyo benzeri yaplar) olusturmak zere farkllasan kallus kltrlerinde sekonder metabolit birikiminin daha fazla oldugu gzlenmistir. Bu nedenle, son yllarda farkllasms ve organize olmus kltrler ile yaplan sekonder metabolit eldesinin, farkllasmams ve organize olmams kltrlere gre ok daha avantajl oldugu bilinmektedir.

Farkllasms ve organize olmus kltrler ile sekonder metaboliteldesinde, metabolitin sentezlendigi organ dikkate alnmaktadr. Bitki tarafndan retilen maddenin sentez yerinin kklerde bulundugu durumlarda, kk kltrlerinin kullanm tercih edilmektedir. Ancak kk kltrlerinde kk bymesinin devamllgn saglamak iin bitki byme dzenleyicilerine ihtiya vardr. Bu byme dzenleyicilerinden gerek oksin ve sitokininlerin niteligi ve miktar, gerekse birbirlerine oranlar kk gelisimini ve dogrudan sekonder metabolit sentezini nemli lde etkilemektedir. Bu nedenle son yllarda, Agrobacterium rhizogenes ile enfeksiyon sonucu elde edilen, bitki byme dzenleyicilerine gereksinim duyulmayan, basit besin ortamlarnda ok hzl gelisim gsteren saakl kk kltrleri tercih edilmektedir

Sekonder metabolitleri doku kltr ile retmek avantajldr!!!Doadan Toplama Az miktarlarda ve belli geliim evrelerinde retilirler,Baz trlerin zamanla soylarnn tkenmesi tehlikesi vardr,Baz bitkilerin toplanmas ok gtr ve maliyeti yksektir, Doku Kltr stenilen zamanda, istenilen kadar retimTrlerin kaybolma tehlikesi yokStandart kalitede ve bol miktarda retimstenildii kadar bitkinin elde edilme kolayl

Sekonder Metabolit retimini etkileyen faktrlerSekonder metabolit retimi evresel faktrlerden byk lde etkilenir. Bitki doku ve hcre kltrlerinde kltr ortamnda yer alan beslenme faktrleri; yani karbon, fosfor, azot kaynaklar ve diger makro elementler ile bitki byme dzenleyicileri, yani oksin ve sitokininler hem metabolit olusumuna, hem de bymeye etki etmektedir. Kimyasal etkenlerin yan sra, ortamdaki fiziksel faktrler de in vitro sekonder metabolit retiminde dogrudan veya dolayl etkide bulunabilmektedir. Bu faktrlerin her biri kltr yaplan bitkiye, kltr tipine, hcre hattna ve hatta kltrn yasna gre etkide bulunmaktadr

A. Bitkisel artlarKltrlerin baslatlmasna kaynak teskil eden hcre veya dokular, sekonder metabolit retimi zerinde nemli bir faktr olarak kabul edilirler. Kuramsal olarak herhangi bir metabolit asndan verimi yksek bitkinin uygun ksmndan baslatlan doku veya hcre kltrlerinden in vitro kosullarda da yksek verim beklenir.B. Kltr Ortamndaki Kimyasal artlarBitki doku ve hcre kltrleri iin besin ortamnda yer alan her kimyasal, aslnda hem byme, hem de sekonder metabolit retimi iin tesvik edici veya kstlayc faktr olabilmektedir. rnegin, besin ortamnda yer alan herhangi bir madde bymeyi tesvik ederken, metabolit birikimini azaltabilmektedir. Dolays ile sekonder metabolit retimi sz konusu oldugunda besin ortamnn kimyasal bilesenleri asndan hem byme, hem de metabolitretimi iin her hcre kltrnn kendine has istekleri oldugu da hatrda tutulmaldr.

-Karbon Kaynag; Birka istisna hari, bitki hcre kltrlerinin pek ou heterotrofik (dbeslek) olarak bymektedir. Bir baka deyile fotosentez yapamazlar, kltrlerin ihtiya duyduklarkarbon kaynann kltr ortamna verilmesi gerekmektedir. Karbon kaynann besleyici rolnn yan sra sekonder metabolit retiminde dzenleyici rol oynar. Karbon kaynann besin ortamndaki deriimi metabolit retimi asndan nemli birfaktrdr. zellikle yksek deriimde karbon kayna kullanldnda, kltr yaplan hcre ve dokular ozmotik strese uramakta, bylece hcre bymesi ve blnmesi basklanmaktadr.Bylece kltr, sekonder metabolit retimine doru bir eilim gstermektedir.

-Azot Kaynag; Bitki doku ve hcre kltrlerinde kullanlan pek ok besin ortamnda nitrat ve/veya amonyum azot kaynag olarak islev grmektedir. Tek basna kullanldklarnda amonyum, nitrata gre daha zayf byme saglamaktadr. Bu nedenle hcre sspansiyon kltrlerinde genelde nitrat azot kaynag olarak tercih edilmekle beraber her ikisinin kullanldg kltrlerde ktlesel hcre verimi ok daha yksek olmaktadr. Genellikle nitrat/amonyum oran 1:1 olmakla beraber, bu orann degistirilmesi ile birok sekonder metabolitin in vitro retilmesinde azalsa veya artsa neden oldugu grlmektedir.-Fosfor Kaynag; Bitki hcre kltrlerinde fosfor kaynag olarak fosfat kullanlmaktadr. Fosfor; gerek nkleik asit, gerekse enerji metabolizmasnda gerekli oldugundan, bitki hcreleri iin ok nemli bir elementtir. Fosfor hcre miktarnda arts saglamakta ve fosfat miktar arttka biyomas verimi artmaktadr. Dolays ile fosfat sekonder metabolitlerin in vitro retiminde nemli bir madde olmaktadr. Byme ile sekonder metabolit retimi arasndaki zt iliski gz nne alndgnda, fosfatn bymeyi snrlandrc bir faktr olarak hcre kltrlerinin baslangcnda dsk miktarda yer almas genellikle metabolit retimini arttrmakta, bymeyi ise snrlamaktadr.

-Bitki Byme Dzenleyicileri; Bitki byme dzenleyicileri sekonder metabolitlerin biyosentetik yollarnn basklanmas ya da aktive edilmesinde nemli rol oynarlar. Gerek kullanlan oksin ve sitokininlerin niteligi ve miktar, gerekse oksin/sitokinin oran bymeyi ve dogrudan sekonder metabolit birikimini etkilemektedir.-Diger Elementler; Kltr ortamnda bulunan baz makro (S, Ca, Mg, K) ve mikro (Cu, Mo, Mn) elementler de sekonder metabolit retiminde etkili olabilirler.-pH; Kltr ortamnn pH snn degismesi, hem byme, hem de sekonder metabolit retimini etkileyebilmektedir.-Ozmotik Basn; Yksek seker ve tuz derisimi genelde metabolit verimini arttrmakta, ancak bymeye olumsuz etki yapmaktadr.

C. Kltr Ortamndaki Fiziksel Kosullar-Isk; Sekonder metabolitlerin retimi sz konusu oldugunda sk, doku ve hcrelerde metabolit birikimini etkilemekte ve fotoperiyod, sk kalitesi ve siddeti nemli parametreler olmaktadr.

-Scaklk; Kltrlerin byme ve gelismesinin yan sra, sekonder metabolitlerin retiminde scaklk nemli bir faktrdr.

-Diger; Havalandrma ve kltr ortamnn alkalanmas gibi fiziksel etmenler de kltrlerin byme ve sekonder metabolit retiminde nemli etkide bulunmaktadr .

Bitki Doku ve Hcre Kltr le Sekonder Metabolit retimiFarkllam ve Organize olmu kltrler ile metabolit retimia) Kk Kltrleri: Bitki tarafndan retilen metabolitin sentez yerinin kklerde bulunduu durumlarda, bu organdan alnan paralarn, teorik olarak, ana bitkideki kk hcreleri kadar veya daha yksek dzeyde olamas beklenir. Ancak ok az bitki hcre kltrnde snrsz byme ile birlikte metabolit retimi salanabilmitir. Son yllarad , bir bitki patojeni olan Agrobacterium rhizogenes ile yaplan almalar bu durumda kkl deiikliklere yol amtr.b) Srgn Kltrleri: Bu tip kltrler nod veya srgn ucundaki meristem dokusundan alnan paralarn uygun besi ortamnda bytlmeleri ile gerekletirilir. Srgn ucu kltrleri, farkllamam kltrlere, yani sspansiyon ve kallus kltrlere, oarnla daha fazla sekonder metabolit retmektedirler.

c) Embriyo Kltrleri: ayet bir metabolit embriyoda retiliyor veya birikiyorsa, bu metabolitleri retimi embriyo kltrleri ile gerekletirilir. Ancak burada kastedilen kaynak bitkiden karlp kltr yaplan embriyodan ziyade, somatik embriyo kltrleridir.2. Farkllamam ve Organize Olmam Kltrler le Metabolit retimia) Kallus Kltrleri : Kallus kltrleri ana bitkiden alnan ve blnme zelliini yitirmemi organ ve doku paralarnn karbon kayna ve bitki byme dzenleyiciler (oksin ve sitokinin) ieren yar kat besin ortamnda bytlmesi sonucu oluan morfolojik dzensizlie sahip, organize olmam kltrler olarak tanmlanabilir. Dolays ile kallus kltrnn balatld doku parasnn orijini sekonder metabolit retiminde nem kazanmaktadr. rnein, tropan alkaloidlerinin retimi hedefleniyorsa, Solanacea familyasna ait bitkilerin kk dokularnda bu maddelerin biriktii blgeler seilmelidir. Kallus ve hcre sspansiyon kltrlerinin uzun sre srdrlebilmesi alt kltrlerini yapma potansiyeline baldr.

Kltrler morfolojik olarak ne kadar uniform hcre ieriyorsa, o kltrlerin alt kltrleride o denli stabil olacaktr. Bu stabilite ile balang kltrnden farkl alt kltrler ortaya kmas nlenebilir. b) Hcre Sspansiyon Kltrleri : Hcre sspansiyon kltr tek hcrelerin veya kk apta hcre gruplarnn sv byme ortamnda dalm gsterdii bitki hcre kltr tekniidir.Hcrelerin sv kltr ortamnda dzenli olarak dalmn salamak iin alkalama ilemi yaplr. Bu ayn zamanda, hcre gruplarndan ziyade tek hcrelerin yer ald ideal bir hcre sspansiyon kltr iin gereklidir. Bu kltrler dorudan ana bitkiden alnan uygun doku paras ile balatlabilir. Herhangi bir sekonder rn sz konusu ise, o metabolitin yksek oranda bulunduu bitkiden alnan uygun doku paras ile hcre sspansiyon kltr balatlabilir. Kallus kltrleride hcre sspansiyon kltrleri iin balang materyali olabilir. Bu durum teknik olarak avantajldr. nk in vitro ortama ortam uyum salam, belli bir byme oran satbilitesine sahip kallus kltrlerinden alnan paralar, ana bitkiden alnan paralara gre sv ortama daha hzl adapte olabilmektedirler. Kallustan alnan paralarn kolayca ayrlp sv ortam ierisinde daha homojen dalm gstermesi ise sspansiyon kltrne balamada avantaj salamaktadr. SEKONDER METABOLTLERN RETLMES KONUSUNDA HCRE SSPANSYON KLTRLER DER KLTR TEKNKLERNE GRE VE KALLUS KLTRLERNE GRE DAHA AVANTAJLI SSTEMLERDR !!!!

**