Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme din genul Brucella Genul Brucella cuprinde 7 specii, cu numeroase biotipuri, care infectează animalele şi se pot transmite de cele mai multe ori accidental omului de ex. Brucella melitensis (capre, oi), Brucella abortus (vaci), Brucella suis (porci), Brucella canis (câini). Sunt cocobacili gram negativi (de multe ori coloraţi bipolar), cu dimensiuni de 0,5-0,6 m / 0,6-1,5 m, imobili, prezentând eventual o structură capsulară, nesporulaţi, localizaţi în mod caracteristic intracelular, aerobi facultativ anaerobi, catalazo pozitivi, relativ inactivi metabolic, care se dezvoltă relativ dificil pe mediile de cultură intrând în categoria bacteriilor pretenţioase cu necesităţi nutritive complexe, sunt bacterii fastidioase (mai ales atunci când se realizează cultivarea iniţială, din p.p.).Brucelele sunt microorganisme parazite pentru o serie de animale sau pentru om, capabile să determine infecţii acute, cronice sau infecţii inaparente. Cronicizarea depinde de capacitatea de multiplicare în celule fagocitare. Formele cele mai grave apar ca urmare a infecţiei cu Brucella melitensis, urmată de infecţia cu Brucella suis, Brucella abortus şi respectiv Brucella canis.Transmiterea la om poate fi realizată pe cale digestivă, cutanată şi mai rar pe cale respiratorie. De la nivelul porţii de intrare, microorganismele ajung la nivelul ganglionilor limfatici regionali, depăşesc această barieră şi pe calea ductului toracic ajung în sânge iar pe cale sangvină în organele cu sistem reticulohistiocitar şi la nivel osos. Incubaţia este în medie de 2-3 săptămâni, însă uneori pot trece câteva luni între momentul infectării şi apariţia fenomenelor clinice. Debutul este de obicei insidios, manifestat prin astenie, indispoziţie, cefalee, artralgii, febră moderată, transpiraţii abundente.În perioada de stare simptomele sunt polimorfe, bruceloza fiind una din bolile extrem de greu de recunoscut clinic. Febra ondulantă (care creşte în cursul după amiezii şi scade în timpul nopţii) însoţită de frisoane are o valoare istorică. În realitate, curba febrilă are un aspect variabil. Transpiraţiile abundente nocturne, cu un miros caracteristic, astenia, durerile sub diverse forme reprezintă alte elemente care pot fi comune în cursul bolii. S-au descris circa 200 de semne clinice care pot apare în bruceloză.Durata bolii poate fi de 3-4 săptămâni, dar cel mai frecvent depăşeşte 3 luni, ajungând în formele cronice la ani de zile. În formele cronice diagnosticul se stabileşte foarte dificil.Diagnosticul brucelozeiÎn principiu, în realizarea diagnosticului se porneşte de la aspecte clinice şi epidemiologice, însă diagnosticul de laborator este esenţial, reprezentând unica metodă certă pentru un diagnostic pozitiv.Diagnosticul de laborator în bruceloză poate fi bacteriologic (direct) sau serologic. Diagnosticul bacteriologic include următoarele etape.1.      Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile cunoscute (vezi capitolul 6), în special cât mai rapid după debutul bolii şi înainte de iniţierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de sânge, dar s-ar putea recolta şi prin puncţie ganglionară, puncţie medulară (rata de izolare creşte),  puncţie hepatică sau splenică, sau ar putea fi reprezentat de LCR, urină, bilă, lapte, materiale necroptice etc în funcţie de simptomatologie şi stadiul bolii. În continuare vom discuta situaţia în care se

1

realizează o hemocultură prin metode clasice sau în sisteme de cultivare rapide, de tipul BactAlert, Bactec sau Septi-Chek (vezi şi capitolul 31).2.      Examinarea microscopică a produsului patologic nu aduce de regulă informaţii utile diagnosticului, în special dacă este vorba de sânge. Se poate folosi tehnica imunofluorescentă care uneori duce la rezultate pozitive.3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi capitolele 9 şi 10). Toate speciile au cerinţe nutritive complexe necesitând pentru dezvoltare medii îmbogăţite cu substanţe nutritive (aminoacizi, proteine serice, glucoză, săruri, vitamine, ser, sânge etc). Se recomandă efectuarea hemoculturilor în mediul bifazic (solid-lichid), ex. tip Castaneda. Cultura se incubează în atmosferă de 5-10% CO2, la 37ºC pentru o perioadă de minim 2-3 zile; culturile negative trebuie urmărite până la 4 săptămâni. În cazul mediului bifazic, vom însămânţa panta de mediu solid la fiecare 2-3 zile, fără a deschide flaconul.4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:·         Caractere morfotinctoriale: Sunt cocobacili gram-negativicu cu dimensiuni de 0,5-0,6 m / 0,6-1,5 m, dispuşi izolat sau în perechi, lanţuri scurte, grupat. Se pot colora bipolar. Poate fi necesară o prelungire a timpului de recolorare cu fucsină, altfel sunt palid coloraţi.·         Caractere de cultură:·         Pe mediile îmbogăţite corespunzătoare nutritiv, pot produce după 2-3 zile colonii de tip S, cu un diametru de circa 1 mm; dimensiunea coloniilor se măreşte astfel încât la 1 săptămână de incubare diametrul poate fi de 6-7 mm; pot fi identificate (în special după incubare prelungită) colonii de tip R sau M·         Examinate folosind o sursă de lumină la 45º, coloniile apar transparente, galben-deschis, asemănător „picăturilor de miere” în timp ce în lumina reflectată prezintă o transparenţă cenuşiu-albăstruie·         Caractere biochimice:·         Brucella spp.  după repicare pe un mediu neselectiv prezintă un metabolism oxidativ·         Microorganismele sunt catalazo pozitive, în timp ce testarea reacţiilor oxidazei, ureazei şi producerii de H2S pot da rezultate variabile; se pot utiliza sisteme clasice de testare, dar este posibilă şi utilizarea galeriilor API (ex. API 20E)·         Testăm necesitatea în CO2, pentru izolare·         Se mai pot verifica metabolizarea glucozei, lactozei precum şi sensibilitatea la diferiţi coloranţi incluşi de ex. în medii de cultură (ex. tionină sau fucsină bazică)·         Caractere antigenice:·         Utilizăm seruri imune anti-Brucella adsorbite, prin reacţii de aglutinare pe lamă (există reacţii încrucişate); în cazul unei reacţii pozitive, la nivelul laboratoarelor de referinţă se pot realiza reacţii de aglutinare pe lamă cu seruri imune monospecifice (anti-A, M sau anti-R în cazul coloniilor de tip R)·         Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza în studii epidemiologice sau în scop de cercetare, fiind rezervată laboratoarelor de referinţă; spre exemplu fagul Tbilisi lizează tulpinile de B. abortus, poate liza la concentraţii crescute tulpinile de B. suis, dar nu lizează tulpinile de B. melitensis, B. canis sau tulpinile în formă R·         Alte teste utilizate în identificare la  nivelul centrelor de referinţă:·         tehnici ale biologiei moleculare (există sonde nucleotidice specifice pentru diferite biotipuri izolate mai frecvent, de ex. 1 şi 3 aparţinând B. melitensis; se încearcă punerea la punct a PCR, pentru diagnosticul brucelozei).

2

5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice) se realizează prin metoda difuzimetrică standardizată, şi este utilă atât în scopul supravegherii apariţiei unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene cât şi pentru stabilirea tratamentului corespunzător în cazul unei maladii infecţioase în general dificil de tratat.Diagnosticul serologicEste de multe ori necesar, ţinând cont de dificultăţile întâlnite în cursul diagnosticului bacteriologic. Utilizăm antigene cunoscute şi încercăm să determinăm prezenţa anticorpilor specifici în sângele pacientului, valoarea titrului anticorpilor şi respectiv evoluţia acestui titru în dinamică. Trebuie să menţionăm că anticorpii de tip IgM cresc în infecţia acută (în câteva săptămâni) dar persistă şi în infecţia cronică sau chiar şi după tratamentul antibiotic realizat corespunzător (timp de 1-2 ani). Anticorpii de tip IgG apar după circa 3 săptămâni de la debutul brucelozei, ating o valoare maximă la 6-8 săptămâni şi persistă în cazul unei infecţii cronice.În special din punct de vedere istoric discutăm şi putem practica în cadrul lucrărilor practice, aglutinarea pe lamă (Huddleson, reacţie calitativă, de screening). Cea mai cunoscută şi utilizată tehnică de diagnostic serologic este reacţia de aglutinare în tuburi (Wright) prin care putem determina atât titrul anticorpilor de tip IgM cât şi cel al anticorpilor de tip IgG.Având în vedere faptul că în bruceloză apar şi anticorpi blocanţi (Ac de tip IgA care blochează activitatea aglutinantă a Ac IgM sau IgG), care pot persista ani de zile, există dificultăţi şi în ceea ce priveşte interpretarea rezultatelor obţinute în diagnosticul serologic.Pentru a simplifica, considerăm că un titru ≥ 1/160 este sugestiv, în timp ce o creştere de 4 ori în dinamică a titrului, poate confirma diagnosticul de bruceloză.Există o serie de variante tehnice care permit reducerea erorilor de interpretare:·         diluarea suplimentară a serurilor de cercetat·         testul de blocare (adăugăm tuburilor în care reacţia Wright este negativă câte 1 picătură de ser imun anti-Brucella; dacă reacţia rămâne negativă şi nici în acest caz nu apare aglutinarea, concluzionăm că în serul de cercetat există anticorpi blocanţi)·         testul Coombs·         utilizarea unei tehnici de tip ELISA pentru detectarea Ac de tip IgM şi IgG care apar faţă de proteinele membranei externe etc.Diagnosticul imunobiologicDatorită faptului că în infecţia cu Brucella spp. este stimulat în special răspunsul imun mediat celular, diferiţi autori menţionează utilizarea intradermoreacţiei cu brucelină în investigarea unui caz suspect de bruceloză. IDR cu brucelină poate identifica existenţa unei stări de hipersensibilitate de tip IV, faţă de antigenul brucelos.

3