R. H A ~ : Chemische und physikalische Ver~nderungen beim Erhitzen yon Fleisch. IX 113

Verh/~ltnis erwarten, da die Untersuchungen an den gleichen Organismen vorgenommen wurden und die gefundenen Aktivit/iten gleicher t terkunft (Fallout) sind. Eine ein- faehe Deutung dieser Erscheinung ist aul]erordentlieh schwierig, da es sieh bei einem Binnensee oder Flul~ um ein biologisehes System handelt, in dem eine Vielzahl ver- sehiedener Umweltfaktoren die gefundene Diskrepanz der Aktivit/£tsverh/~ltnisse verursaehen kann (z. B. selektive Anreieherung yon Nukliden dutch andere Organis- men, Unterschiede in den Ern/~hrungsgewohnheiten der Brassen versehiedener Her- kunft, untersehiedliehe Kaliumkonzentrationen der Gew£sser).

4. Aus den Abb. l l u. 13 entnimmt man weiterhin, dab die Aktivit/~tswerte in Strontium- und C/~siumeinheiten in den Organen yon Fischen eines Fangortes nieht konstant sind. Es ist anzunehmen, dal~ sieh die Konzentrationswerte der beiden Ele- mentepaare beim Durchgang durch den TierkSrper fiber mehrere Stoffweehselstufen verschieben 1.

Zusammen]assung

Es wurden Brassen aus flieBenden und stehenden Gew/~ssern auf ihren Gehalt an s°Strontium und 187C/~sium untersueht. Die Fische aus stehenden Gew/~ssern zeigten gegenfiber den Proben aus der Elbe einen erhShten Kontaminationsgrad. Besonders gilt das ffir 137C/isium. Das s°Strontium sammelt sieh - wie erwartet - bevorzugt in den calciumreichen Organteilen (Gr/£ten) an, w/~hrend das 137C/£sium bevorzugt in den kaliumreiehen Organen (Muskelfleiseh) auftritt. Die s°Sr/g Ca- und 137Cs/g K- Werte sind im Organismus nicht konstant.

Chemische und physikalische Ver~inderungen beim Erhitzen von Fleisch

I I . Mit tei lung

Eintlul~ des Erhitzens auf den Bindungszustand yon Magnesium, Calcium und Phosphat im Rindermuskel

Von

E. HAMM Mitteilung aus dem Institut /i~r Chemie und Physik der Bundesanstalt /i~r Fleisch/orschung,

K ulmbach *

Mit 4 Text~bbfldungen

(Eingegangen am 21. Oktober 1961)

Rohes, mageres Rindfleisch enth/~lt etwa 24 mg Magnesium und 4 mg Calcium in 100 g frischen Gewebes. Geringe Vergnderungen in der Struktur und in der elektri- schen Ladung des Muskeleiweil~es geben sich, wie frfihere Untersuchungen gezeigt haben 2, in einer signifikanten Jxnderung der Bindungsfestigkeit dieser Metaile an die Muskelproteine zu erkennen. Eine so geringfiigige Denaturierung, wie sie durch die Ge~riertrocknung yon Fleisch hervorgerufen wird a, fiihrt bereits zu einer merklichen Abnahme der Erdalkalibindung 4.

1 Schriftenreihe d. Bundesministers f. Atomkernenergie u. Wasserwirtsohaft, Strahlensehutz, Heft 18 (1961).

* Fraulein HEDWlG Bt~EI-I~ danken wit fiir ihre fleiBige und gewissenhafte Mitarbeit. 2 H~vcM, R.: Fleisehwirtseh. 8, 266, 340 (1956); diese Z. 107, 423 (1958); 110, 95 (1959).

H~M, R., u. F. E. DEAThtrAPS: Food Res. ~g, 573 (1960). 4 HAMM, 1~. : Fleisehwirtseh. 14, 204 (1962).

8a

114 R. H ~ :

Es ersehien daher ffir das Vers tgndnis der Muskeldena~nrierung, die bei der Ver- a rbe i tung des Fleisches eine wichtige I~olle spielt , yon Interesse, den Einflul3 des Erh i tzens anf die E rda lka l ib indung zu untersuehen. Diese Versuehe s ind eine Erg/in- zung der l~esultate, die wir 1 auf Grund der Bes t immung yon Hydra ta~ ion , p g - W e r t und E iweig ladung erhielten. I n einer vorlgufigen Mit te i lung h a t t e n wir schon frtiher 2 kurz fiber die Fre i se tzung von Erda lka l i ionen aus ihrer fes ten Bindung an das Mnskel- eiweiB du tch Hi t zedena tu r i e rung bei 45 ° und 65°C ber iehte t . Es wurde nunme hr die Wi rkung des Erhi tzens yon Z i m m e r t e m p e r a t u r beginnend bis auf 120°C auf die Ka t i onenb indung s tudier t . Diejenige Menge an Magnes ium und Calcium, die ffei dissoziiert oder nu t sehr locker gebunden v o r l i e g t , wnrde durch Behand lung des w/~Brigen Muske lex t rak tes mi t Ka t ionenaus t ausehe r e rmi t te l t , wobei nach Wasehen des Aus tausehers die yon ihm gebundenen Erda lka l i ionen mi~ S/~ure eluier t und komplexomet r i seh b e s t i m m t wurden. I n einigen Ansgtzen wurde gleichzeit ig anch die insgesamt im Ex t r akb en~haltene Menge Magnesium, Calcium und EiweiB b e s t i m m t und so Iestgestel l t , ob die w/~hrend der t t i t z edena tu r i e rung freigesetzten Ionen an das s t rukture l le EiweiB des Muskels gebunden waren. Schlieglich wurde durch ersch6p- fende E x t r a k t i o n die Bindung yon Magnesium, CMeium und Zink an die s t ruk ture l le Subs tanz des Muskels ermi~tel~.

Ffir die En tsehe idung der Frage , in welcher Weise dig an das wasserunl6sl iehe struk~urelle Eiweig gebundenen K a t i o n e n freigesetzt werden, sollte eigentl ieh die Erh i t zung des zuvor ersehSpfend ex t rah ie r t en FMsc he s und die Bes t immung der hier- bei freigesetzf~en Ionen der naheliegends~e Weg sein. Dureh die erseh6pfende E x t r a k - t ion aber sehfife man Bedingungen, die yon denen der normalen Fle ischerh i tzung s ta rk abwiehen. Mit dem Fleisehsaf t n/~mlieh en t fe rn te man eine erhebliehe Menge an muskele igenen SalzenS; Salze aber vermSgen die Dena tn r i e rung ~ und wahrseheinl ieh auch den Bindungszus tand yon K a t i o n e n zu beeinflussen. Aus diesem Grunde sahen wir zun/ichs~ davon ab, den EinfluB der Hi t zedena tu r i e rung auf die Ionenb indung im ersehSpfend ex t rah ie r t en Muskel (Myofibrfllen) zu s tudieren.

Methodik

Untersuchungsmaterial: Von Fe~t und grobem Bindegewebe befreiter M. Longissmus dorsi 5--7j~hriger Kiihe der Handelsklasse B. Der Muskel wurde zweimal im Fleischwolf zerk]einert.

Verteilung der wasserlSslichen Substanzen im Muskel. Bei Untersuchungen der Ionenbindung im Muskel sollte eine drastische Ver~nderung der ionalen Verh~ltnisse dutch zu starkes Verd/innen mi~ It:O oder gar durch erschSpfende Ex~raktion des Gewebes nach MSglichkeit vermieden werden. Auch gegen das iibliche Verfahren einer erschSpfenden Extrak~ion mi~ 0,1 m-XC1-L6sung (vgl. z. ]~. 5) bestehen Bedenken, da hierdurch dem Muskel grSl3ere Mengen an Fremdionen zugefiihrt werden, wenn aueh die Ionenst~rke etwa aufrecht erhalten bleibt. Am zweckmgA3ig- sten schein~ uns eine Extraktion des Muskels mit dest. Wasser im Verh/~ltnis 1 : 1 zu sein. Unter diesen Bedingungen wird die Ionenstgrke des Muskels noeh nicht so weir herabgesetzt, dab es zu einer Ausflockung der im Muskelsaft gel6sten Proteine kommt. Am einfachsten wgre es nun, aus der in 1 g Extrak~-Wasser enthaltenen Menge an dissoziierten und nieht dissozfierten Ionen diejenige Menge zu bereehnen, die in der gesamten Fliissigkeit (Wassergehalt des Muskels d- zu- gesetztes Wasser) enthalten ist. Xenn~ man den Gesamtgehalt des Nuskels an ErdMkMien, so lieBe sieh daraus aueh die an die wasserunl6sliehe Substanz gebundene Erdalkalimenge bereehnen. Ein solches Vorgehen ist jedoch nur zulgssig, wenn die gelSsten Stoffe in der gesamten Muskel- fliissigkeit, d. h. im Extraktwasser wie in dem im Extraktions-l~fiekstand verbliebenen Wasser,

1 ttA~IM, R., u. F. E. D]~ATgERAG]~: ]rood Res. 25, 587 (1960). 2 IIAMM, g. : Jahresber. Bundesforschungsanstal~ fiir Fleischwirtsch. 1956.

HAyI~, R.: Diese Z. 117, 8 (i962). ttAM~r, R., u. R. G~Av: Diese Z. 108, 28, 280 (1958); H A ~ , R.: Diese Z. 117, 20 (1962). ttAssEL~AG~, W. : Bioehim. biophys. Acta 25, 562 (1957).

Chemisehe und physikalisehe Veriinderungen beim Erhi tzen yon Fleisch. I I 115

gleichm~l~ig vertei l t sind. Es war dies nicht als selbstverst~ndlich vorauszusetzen, da hydrat isch gebundenes Wasser ein geringeres LSsungsverm5gen ha t als freies Wasser ~.

Zur Priifung dieser Frage wurde die Verteilung der 15slichen Substanz im Muskel untersucht, wobei wir als typisehe und raseh best immbare Stoffe die Stickstoff- und Phosphorverbindungen wgMten 2. Hierzu wurden (a) 100 g des abgeh~ingten Muskels mit 75 ml 0,1 m-KC1-LSsung ira Starmix zerkleinert, die Mischung 10 rain gerfihrt, zentrifugiert und der Rfiekstand 6mal mi t 0,1 m-t(C1-LSsung extrahiert . Der letzte Ex t r ak t war praktisch frei yon P und N. S~mtliche Wasehfliissigkeiten (Zentrifugate) wurden vereinigt, mi t 0,1 m-XC1 ~uf 21 aufgefii]lt und darin nach nasser Verasehung die Gehalte an Stiekstoff and Phosphor best immt. Zum Vergleieh wurden (b) 100 g desselben Muskels mit 100 ml Eiswasser im Starmix zerkleiner~ und bei 13000 U/rain in der Ki~lte zentrifugiert, h n Zentr ifugat wurden der Wassergehalt und, naeh nasser Verasehung, die Gchalte an Stickstoff und Phosphor ermittelt . Aus der in 1 g Ex t rak t -Wasser enthal tenenMenge wurden dann die im gesamten Wasser des Homogenates (Wasser- gehalt des Muskels + zugesetztes Wasser) enthal tenen Mengen an P und N bercchnet. Fiir jedes Fleiseh wurden beide Verfahren in Doppel- ans~tzen dnrchgefiihrt.

Bei den Stiekstoffverbindungcn liegen die Werte der Methode (b) etwas hSher als die yon Methode (a) (um 2- -10%) (Tab. 1). MSg- licherweise wird unter den ]~edin- gungen der ersehSpfenden Extrak- t ion ein kleiner Teil der 15sliehen

Tabelle 1. Verteilung yon Stie/csto#- und Phosphorverbin- dungen im Mus/celsa]t (mg, bezogen auf 100 g Muskel)

(n~heres vgl. Text)

5~ethode

1 P 2

• .. [ Fleisch III Fleisch I ]71eiscn ii l bei 8 n° C

roh roh 60 min e'rhitzt

mg mg I mg mg I mg mg

1260 1258

180 180

1270 1278

177 177

10O0

1060

171

168

1100 1092

165 164

416 431 414 430

142 145 143 144

Proteine durch Denaturierung un- 16slieh. Im iibrigen aber zeigt die gute Obereinst immung der (a)-Werte mit den (b)-Werten, dab die Verteflung der wasserl6slichen Substanzen des Muskels zwischen dem abzentrifugierten Wasser des 1 : 1-Extraktes und dem im Riickstand verbliebenen Wasser sowohl beim rohen wie beim hitzedena~urierten Material nahezu gleiehm~Big ist. Es ist daher zul~ssig, aus der in 1 g Ext rak t -H20 enthal tenen Menge an gel6ster Substanz auf die im Muskel insgesamt enthal tenen wasserlSslichcn Substanzen umzureehnen. Der ,,niehtlSsende R a u m " des zerldeinerten post- morta len Muskels ist offenbar nur sehr klein.

Untersuchung des Muskels. Im Muskel wurden H20, Gesamt-Phosphor (naeh nasser Ver- asehung mit H2SO~/HsO~) sowie die Gesamtgehalte an Calcium und Magnesium - - in einigen Proben aueh an Zink - - ermittelt . Eine Methode zur ]~estimmung yon Mg, Ca und Zn im Gewebe 3 und in Gewebsextrakten 4, s war bereits friiher mitgeteil t worden.

Gehalt des Muslcelsa/tes an dissoziiertcn oder sehr locker gebundenen ]onen (Methode A ). 40 g Rindermuskel wurden in 40 ml Eiswasser homogenisiert (Homogenisator der F~. Biihler, Tiibin- gen). Nach Zentrifugieren des Homogenates bei 12000 U/rain (0°C) wurde das Zentr ifugat dureh WeiBbandfilter filtriert. In 1 ml des Fil trats wurde naeh einer friiher ~ngegebenen Methode 5 das anorganische Phospha t best immt. 10 ml des Zentrifugates wurden mit 1 g des Kat ionenaustau- sehers (Lewatit in der Na+-Form) 15 rain bei 0°C geriihrt. Der Austauseher wurde dann durch sorgf~ltiges Wasehen unter mehrfachem Dekantieren veto anh~ngenden Muskels~ft befreit. Die Elut ion der ] (a t ionen aus dem Austauseher mi t Saure und die komplexometrisehe Best immung yon Magnesium und Calcium geschah in der gleiehen Weise wie es bei der Analyse yon Fleiseh- asehe angegeben wurde ~. Dabei war zu beriicksichtigen, dab der aus tI+-Lewati t dutch Behand- lung mi t l~atriumchloridlSsung hergestellte Na+-Austauseher aueh bei Verwendung yon analysen- reinem NaC1 (Merck, pro anal.) stets eine geringe, aber stSrende Menge an Ca ++ enthielt. Dieser Leerwert mul~te subtrahicr t werden. Es erwies sieh ferner als notwendig, das saure Eluat ve t der komplexometrischen Titrat ion zum Abrauchen des HC1 auf dem Sandbad zur Troekne einzuengen.

1 Vgl. R. I-h~I~: Advanc. Food Res. 10, 355 (1960). 2 Bei diesen Subs~anzen war mit einer Freisetzung proteingebundener Antefle durch die bei

erschSpfender Ext rakt ion gegebenen Bedingungen nicht zu rechnen. HARM, 1~.: Biochem Z. 327, 149 (1955).

4 HAMM, R.: Diese Z. 107. 423 (1958). 5 HAivn% R. : Diese Z. 110, 95 (1959).

116 R. HAMM:

Erhitztes t~leisch: 40 g des wolfzerkleinerten Muskels wurden im I-Iomogenisatorgefgg (Glas) in dtinner Sehicht erhitzt, bis die thermoelektriseh gemessene Innentemperatur der Sehichg die Temperatur der umgebenden Thermostatenfliissigkeig erreichg hat*e. Die Probe wurde 30 rain auf dieser Temperatur gehalten 1 und nach Abkiihlen und Zusatz yon 40 ml Eiswasser homogeni- siert. ])as bei 12000 U/rain (0°C) erhaltene Zentrifugat wurde dureh Weil3bandfilger filtriert und in der beim Rohfleisch angegebenen Weise aufgearbeitet.

Bei der einen Versuchsreihe wurde der pmWert des Muskelhomogenates nich~ verindert. Bei der anderen Versuchsreihe wurde der pH-Wert sowohl des rohen als such des erhitzten Fleisches auf 10n 7 (± 0,05) eingestellt, indem vor der Zerkleinerung im Homogenisator mit dem Eiswasser die notwendige Menge an NaOI-I zugesetzt wurde. Der gesamte Wasserzusatz (einschlieBlich NaOH) betrug such hier 40 ml. Es sei betont, da$ such bei dieser Serie das Fleisch bei seinem natiirliehen p~-Wer~ erhitzt wurde und nur die Extraktion und der Kationenaustausch bei p~ 7 erfolgten.

Fiir jede Temperagur wurden zwei Proben angesegzg und separat aufgearbeitet. Mit dem Zen~rifugat jedes Ansatzes wurden zwei Austauschversuche durchgefiihrg.

Gehalt des Muskels an ]reien und gebundenen Erdalkalien. Bindung an strukturelles Eiwei/3 (Methode B). Eiweil~bestimmung im Muskelgewebe: 1 g des

wolfzerkleinerten Muskels wurden in 5 ml dest. Wasser homogenisiert. Nach 30 rain Stehen (2°C) wurden 20 ml 15°/oige Triehloressigs~ure zugesetzt und die Misehung unter gelegentlichem Umrtihren 60 rain bei 2°C aufbewahr~. Die Eiweil~fillung wurde abzentrifugiert, zweimal mit 10 ml H~O gewasehen und darin nach nasser Veraschung der Stiekstoffgehal~ nach KJELDAI-IL ermittelt.

40 g des Gewebes wurden rob oder naeh Erhitzen (vgl. oben) wie bei Methode A in 40 ml Wasser homogenisiert und zentrifugiert. Im Zentrifugat wurden I-I20, Gesamt-N und Rest-N 3, Gesamt-P und anorganischer p4 sowie naeh trockener Veraschung Calcium und Magnesium komplexomebriseh ,, 5 bestimm~. Ferner wurde die Menge der im Zentrifugat enthaltenen freien oder nur sehr locker gebundenen Erdalkali-Ionen dureh Behandlung mit Kationenaustauseher nach Methode A ermittelt. Die Menge der an die strukturelle Substanz gebundenen Metalle ergibt sieh aus der Differenz zwischen der im Muskel insgesamt entha]tenen Menge an Erdalkalien und der im Muskelsaft vorliegenden Gesamtmenge. Die Differenz zwischen der im Muske]saft ins- gesamt enthaltenen und der durch Na+-Lewatit austauschbaren Erdalkalimenge stellt den an die wasserlOslichen Substanzen gebundenen Anteil der Metalle dar.

Ersch6p]ende Extraktion des Muskels (Methode C). 80 g Muskel wurden roh und nach 30 rain Erhitzen auf 90°C mit 240 ml 0,1 m-KC1-LSsung im Starmix homogenisiert. Die Mischung wurde bei 0 ° C 10 rain geriihrt und in der K~lte zentrifugiert. Der l~fiekstand wurde fiinfmal mit 0,1 m-KC1 (1 : 8) und ansehliel~end zweimal mit Wasser (1 : 8) gewaschen (0°C). Die ]etzte Wasehfiiissigkeit war praktiseh frei yon Trockensubstanz und Asehe. Der Rfickstand wurde troeken verascht. In der sauren AschelSsung wurden Magnesium, Calcium und Zink bestimmt.

Bestimmung der sauren und basischen Gruppen im Muskel. Die Anwendung der Methode yon FI~A~XKEL-Co~c~iT (Bindung yon sauren und basischen Farbstoffen) auf den rohen und erhi~zten Muskel wurde bereits frfiher beriehtet 3.

Bestimmung der Leit/dihigkeit der Gewebehomogenate. In dem unter 100°/o Wasserzusatz zer- ldeinerten rohen und hitzedenaturierten Muskelgewebe wurde die Leitf/~higkeit bei 20°C (Thermo- stat) unter Anwendung yon 25 kHz gemessen (Ger/~t-Type LBI~, wissensehaftl.-teehn. Werkstitten Weilheim).

Ergebnisse und Diskussion

Beim Erh i tzen des Rindfleisches yon 20 ° auf 40°C bleibt, wie Abb. 1 zeigt, die Ionenbindung nahezu unver/~ndert, gleichgfiltig, ob der pi~-Wert des Fleisches nach dem Erhi tzen auf ptI 7 eingestell t wird oder nicht. Zwischen 40 ° und 45°C setzt eine Zunahme an dissoziiertem Ca ++ und Mg ++ ein. Mit s teigender Tempera tu r n i m m t die Menge an n ich tgebundenen Erdalkal i ionen zu. Beim normalen pi~-Wert des Muskels (vari iert yon e twa pl~ 5,5 bei 20°C bis pI~ 5,8 nach Erh i tzen auf 120 ° C) erfolgt die

Nach dieser Erhitzungsdauer sind bei allen untersuchten Temperaturen die Denaturierungs- vorg/~nge abgeschlossen 3.

HAKIM, R.: Zig. S. 114, Anm. 4. HAM~, 1~., u. F. E. D~AT~rERAGE : Zig. S. 114, Anm. 1. ttx~I~, R.: Zig. S. 115, Anm. 5. H A ~ , R. : Zi*. S. 115, Anm. 3.

Chemische und physikMische Veri~nderungen beim Erhitzen yon Fleisch. I I 117

stgrkste Freisetzung der Ionen zwischen 4:0 ° und 70 ° C. Zwisehen 70 ° und 120 ° C is~ der EinfluB steigender Tempera tur auI die Ionenbindung nur noch gering, aber doch signifikan~. Dies weist darauf hin, dab auch in diesem letzteren Temperaturbereich noch EiweiBver/~nderungen vor sich gehen. I n I tomogena ten yon Rindermuskel, der auf 120 ° C erhitzt wurde, liegen 86~o ( ± 50/o) des insgesamt vorhandenen Magnesiums

/20 %

~ /00

80

2O

Ca++

,H5,5-5,8

fo 60 80 /oo 72o °F

%

~82

' 78

÷

20

=,<.... /)//5,5-5,8

i I I I / ~o 60 80 [00 12o°C

Abb. 1. EinfluB des Erhitzens au] die freisetzung muskeleigenen Magnesiums und Calciums aus ihrer Bindung an die Muskelproteine bei unterschiedlichem p~-Wert (Methode A). - - pH 7 win'de erst naeh Erhitzen des 5[uskels bei seinem

nati ir l ichen p~-Wert eingestellt

und 90% ( ± 5%) des Claciums im ionisierter Form vor (im rohen Fleiseh 78 ± 2% Mg ++ und 40 =~ 10% Ca++). Dureh Erhi tzen yon 20 ° C auf 90 ° C werden aus 100 g Muskel 92 ± 12 #mol Mg ++ und 40 ± 5 #mol Ca ++, dutch Erhi tzen yon 90 ° C auf 120 ° C 10 ± 4: #tool Mg ++ und 10 ± 0 #mol Ca ++ aus gebundener Fo rm freigesetz~.

Wie in frfiheren Arbeiten 1 gezeigt wurde, ist die Kat ionenbindung im rohen Muskel bei p~ 7 wesentlich h6her _~ als beim normMen pR-Wert des abge- hgngten Fleisehes (pit 5,5). Der starke pR-EinfluB ist, wie fiir den Temperatur- .~,~ bereich zwisehen 20 ° C und 120 ° C fest- gestellt wurde, auch nach Erhi tzen vor- -~ handen (Abb. 1). Die Abnahme des qa

Calciumbindungsverm6gen bei Erhit- zen yon 20 ° auf 120 ° C (55//tool/100 g ~ Muskel) ist bei p~ 7 (eingestellt n a c h

Erhitzen) etwa die gleiehe wie beim natfirlichen p~-Wert des Fleisehes, die Abnahme des Magnesiumbindungsver- m6gens (70 #mol/100 g Muskel) hinge-

aM x 70 .3

7,o

~C

5A

4~

,o . ._- - -co

i / / ~ "4~''''~C0++

I / / I /

pHgO I I I I I

80 :00 :20°~

Abb. 2. Freisetzen ton Erdalkaliionen dutch Erhitzen des Muskels von 70 ° aul 120 ° C bei seiuem nati~rlichen p~ .Wer t

(Aus tauschversuch bei !0~ 7)

gen wesentlieh geringer. Bei pg 7 t r i t t - - ~hnlich wie beim natCirliehen pg-Wer t des Fleisehes - - die stgrkste Abnahme der CMeiumbindung zwisehen 40 ° und 60°C ein, w/ihrend die Magnesiumbindung yon 40°--90 ° C ziemlieh gleiehm~gig abnimmt. Die starke Zunahme an dissoziiertem Ca ++ und Mg ++ zwisehen 70 ° und 120°C

1 H A ~ , R.: Zi~. S. 113, Anm. 2.

118 R. I~AMM :

l&gt den Sehlug zu, dab aueh in diesem Temperagurbereich die Denaturierung des MuskeleiweiBes noeh weiter fortsehreitet (Abb. 2).

Die Abnahme der Bindung yon Calcium und Magnesium an das MuskeleiweiB durch Hitzedenaturierung ist zwischen 50 ° und 55°C signifikan~ verz6gert. Es ist interessant, dab im gleiehen Temperaturintervall die dureh Erhitzen bedingte Ab- nahme an sauren Grupioen des MuskeleiweiBes ebenfalls eine Verz6gerung aufweist (die Zahl der basischen Gruppen wird durch I-Ii~zedenaturierung nicht ver&ndert) ~,

wie fiberhaupt die Anderung a/l Mg++ _ ~

.'<,+0 -s . . . . . . . . . o 76

10 ..i,.,

15

' t

x ×#

, y - \ ..<

t o - - - i . . . . ~, 20 ~o eo eo'c

Abb. 3. EinfluB des Erhitzens aul die Freisetzung yon Calcium urM Magnesium aus ihrer JBindung an das Muskeleiwei/3 und au] die ZahI saurer Gruppen im Muskeleiwei/3 (Ionenbindung beim nattirlichen

pg -Wer t des Muskels)

der Menge an sauren Gruppen in der Muskelsubstanz mit stei- gender Temperatur weitgehend der J~nderung der Kationen- bindung beim Erhitzen ent- spricht (Abb. 3). Hieraus kann gefolgert werden, dag - -wie zu erwarten - - die KaHonen an die sauren Gruppen des Eiwei- Bes gebunden sind und in glei- ehem MaBe freigesetzt werden, in welehem diese Ladungs- gruppen infolge Hitzedenatu- rierung verschwinden. Der Knickpunkt der Ionenbin- dungs- Temperatur- Kurve is~ beim natfirliehen p~I-Wert des Fleisches ausgepr/~gter als bei pit 7 (eingestellt nach Erhitzen).

Diese Resultate lassen darauf schlieBen, dab Carboxyl-Seitengruppen der Pelo~id- ketten an der Bindung yon Erdalkalimetallen im Muskel beteiligt sind. Ohne hier auf die Natur der Wechselwirkung zwischen Erdalkali-Ionen und Muskelproteinen, die neuerdings auch die Muskelphysiologen in zunehmendem MaBe interessiert, n/iher einzugehen, sei nur darauf hingewiesen, dab wahrscheinlich neben den Carboxyl- gruppen auch Sulfhydryl-, Hydroxyl- und Aminogruppen zur Bindung yon Erdalkali- Ionen an das Myosin des Muskels beitragen. Es ist offenbar eine ganz spezifische r£umliche Stellung dieser Gruppen notwendig, um Calcium und Magnesium - - etwa in der Form eines Chelats oder Chlatrats - - f e s t in das Muskeleiweil3 einzubauen. Wird die spezifische Lage dieser Gruppen durch ttitzedenaturierung ver&ndert, so lockert sich die Bindung und das Erdalkalime~all wird gegen andere Ionen leich~ austausch- bar. Die Vermutung yon GURD und WILCOX 2, dab bei Denaturierung yon Proteinen die Mctallbindung zunehmen sollte, da durch das Auffalten der ~-Helix des Proteins mehr Bindungsstellen ffir die Metall-Ionen verf/igbar wfirden, finder sich im vorliegen- den Falle der Hitzedenaturierung des MuskeleiweiBes in situ nicht best£tigt: Auch bei Temperaturen zwischen 20o--45 ° C, bei welchen eine stabile Vernetzung der sich auL faltenden Peptidketten noch nicht einsetzt 1, ist keine signifikante Erh6hung der Kationenbindung dureh Erw/~rmen zu beobaehten (Abb. 1 u. 3).

WIERBICKI U. a. 3 untersuchten den Einflu] der Erhitzung yon Rindfleiseh auf den Gehalt des Muskelsaftes an Magnesium und Calcium und zogen aus ihren Resultaten

1 H A ~ , JP~., u. F. ]~. D~ATHElCAGE: Zi%. S. 114, Anm. 1. GV~D, F. 1~. N., u. P. E. WILCOX: Advanc. Protein Chem. 11, 311 (1956). WI~BIC~:I, E., L. E. ~ v ~ n u. F. E. D~,tmH~Ri~n: Food Technol. 11, 69 (1957).

Chemische und physikalische Veri~nderungen beim Erhitzen yon Fleisch. I I 119

den SehluB, dab zwisehen 40 ° und 70°C beide Metalle aus gebundener Form frei- gesetzt werden, da6 aber dann zwischen 70 ° und 80°C eine starke Riiekbindung der ErdalkMien an die Mnskelsubstanz erfolgt. Letzteres ist, wie unsere Versuehe zeigen, nieht der Fall. Es k6nnen bei der Untersuehung von WIERBICKI u. a. dadureh Fehler entstanden sein, daft ihre Methode bei den gel6sten Kationen nieht zwisehen disso- ziierter und gebundener Form unterscheidet.

Tabelle 2. Einflufi des Erhitzens yon Fleiseh au] die Kationenbindung beim natiirlichen pH- Wert des Muskel8 (Nethode B). I)ie Prozentangaben beziehen sich auf das insgesam~ im Muskel vorhandene

Metall

Erhitzungs- temperatnr

Freie Kationen Gebundene Kationen

%

°____2___ ~ ~g I °~

2o 9o s4,0 [ 79,1

120 85,2 i 8 5 , ~ . . . . 4

10-5mol pro 100 g ~{uskel

3ig I Ca

87,5 6,7 8s ,81 7,7

% geb. an wasserlSsl. Substanzen

5[g I Ca

8,5 7,3 6,7 1,1

% geb. an . pmol Kation wasserunISsl, Substanzen pro g Protein

l~¢[g I Ca 3/[g I Ca

3,7 7,5 I 18,6 ~,o I o,8 8,1 I 13,5 I 4 ,5 0 ,6

Die durch Hitzedenatnrierung bewirkte Zunahme an h'eien Ionen im Fleiseh kann bedingt sein dureh die Freisetzung aus einer Bindung a) an struktnrelle, wasser- nnl6sliehe Proteine, b) an wasserl6sliehe Proteine und e) an wasserl6sliehe Nieht- eiweigverbindungen. Wie die Analyse der Muskelextrakte ergab (Tab. 2), mfissen mindestens 80% der dutch Erhitzen auf 120°C freigesetzten Calciumionen (Bindung beim natfir- lichen p~-Wer t des Muskels) und nahezu 100% der freigesetzten Ma- gnesiumionen aus den struktnrellen Muskelproteinen stammen. Bei Er- hitzen yon 20 ° auf 90 ° C nimmt die

Tabelle 3. Einflufl des Erhitzens au] die Kationen. bindung an das wasserunlSsliche Eiwei/3 beim nati~r-

lichen p~-Wert des Muskels (Methode C)

Erhitz.- #tool gebundenes Kation pro 1 g Protein temp.-

° C ~'[g Ca Zn

20 90

6,2±0,2 3,9~1,0 1,8±0,2 1,0±0,6 1,1~0,2 1,5~0,1

Bindung an wasserunlSsiiche Proteine (#mol/g Protein) im Falle des Magnesiums yon 13 :~7 auf 2,2 :~ 1,8, im Falle des Calciums yon 4,4 ± 0 , 7 auf 0,9 d : l ab (Tab. 2 nnd 3).

Eigenartig ist die Tatsache, dab der Anteil des Magnesiums, der an die wasserlSs- lichen Substanzen gebunden ist, zwischen 20°C und 90°C stark zunimmt (Tab. 2). M6glieherweise handelg es sich hier um die Abspaltung niedermolekularer, ~agnes ium in fester, thermostabiler Bindung enthaltender Substanzen aus den strukturellen Proteinen (Mg-Nueleotid-Komplexe ?). Vielleicht erfolgt die sehr feste Bindung des Magnesiums an das Muskeleiweig fiber eine abspaltbare prosthetisehe Gruppe.

Auffallend ist ferner, dab zwisehen 90° und 120°C die Bindung yon Magnesium an das struktnrelle Eiweig nieht ab-, sondern sogar etwas zunimmt (Tab. 2). Damit steht im Einklang, dab bei einer Anzahl yon Ansi~tzen die Mg++-Konzentration im Muskelsaft dureh Erhitzen yon 110 ° auI I20°C nicht zu-, sondern etwas abnahm. Es seheint also bei diesen hohen Temperaturen eine gewisse ,,l~fiekbindung" einzutreten. Dies ist allerdings vor allem yore energetischen Standpunkt aus schwer zu verstehen. Es w/ire noeh zu untersuehen, ob dieser Effekt nieht dureh IJberlagerung anderer Effekte, etwa dureh die F/~llung unl6sliehen Magnesiumphosphats, vorget/~uscht wird.

120 R. H ~ : Chemische und physikalische Ver~nderungen beim Erhitzen yon Fleisch. II

Der Anteil der an die strukturelle Substanz gebundenen Kationen ist vor allem im Falle des Magnesiums bei dem in Tab. 3 angef/ihrten Versuch h6her als wir ihn frfiher ~ gefunden hatten. Die Erdalkalibindung im Muskel unterliegt offenbar gr6Beren

Sehwankungen. Innerhalb be-

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6o

% ' 50

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d - 8,O

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20 gO GO 80 700 720°C

Abb. ¢. Einflu/3 des Erhitzens au/ den Gehalt des Muskels an anorgani. schem Phosphat und au] die Leit/ghigkeit des Gewebes. Extraktion beim

natfirlichen pH-Wert des 2~uskels

st immter Gruppen k6nnen abet gleiehwohl die Wer~e ziemlieh konstant sein. So z. B. fanden wir bei der frfiher untersuehten Gruppe yon l~in- dern verMltnism~13ig geringe Unterschiede in der Erdalkali- bindung; das gleiehe gilt ~fir das bei der vorliegenden Arbeit verwendete Tiermaterial. Viel- leieht bestehen Zusammen- hiinge mit der jahreszeitlichen ~nderung der Fiitterungsweise oder mit der Behandlung vor dem Schlachten. Auf eine mSg- liehe Beziehung zwisehen Ffit- terung des Tieres and dem

Mineralgehalt des Fleisches haben wir sehon friiher hingewiesen 2. Man daft ferner die Erdalkalibindung verschiedener Muskeln nut naeh gleieher Abh/~ngezeit post mortem vergleichen a.

Erg/~nzend zu diesen Versuehen wurde die zerkMnerten Muskel beim Erhitzen gemessen.

Tabelle 4. Einflu[3 des Erhitzens au] die Bindung yon Phosphat beim natiirlichen p~-Wert des Muskels (Methode B). Die Prozentgehalte beziehen sieh auf den insgesamt im Muskel vorhandenen Phosphor

P, gebunden an P, gebunden an Erhitz.- wasserlSsl, wasserunl6sl. temp.- Anorgan. P "Subs~nzen Substanzen

°c % % %

20 90

120

38 43 65

44 39 24

Jmderung der Phosphatbindung im Bis 90°C lieg sieh keine signifikante Zunahme an anorganischem Phos- phat feststeUen, dagegen wird durch Erhitzen yon 90 ° auf 120 ° C eine mit zunehmender Temperatur anstei- gende Menge an freigesetztem Phos- phat beobachtet (Abb. 4). In diesem Temperaturbereich werden 1,75 ± ± 0,05 mmol Phosphat pro 100 g ,das

18 sind 78--79% des ursprtinglich vor- 18 handenen anorganisehen Phosphats, 11 aus gebundener Form in Freiheit ge-

setzt, wobei etwa 80~o dieses freige- Substanzen ents tammen und wahrscheinlieh setzten Phosphats wasserlSslichen

dnrch t tydrolyse aus den Phosphors/tureestern des Muskels abgespalten wurden. Auf eine Spaltung yon Phosphors/iureestern des Fleisehes beim Erhitzen unter

Druck hat bereits BENDALL ~ aufmerksam gemacht. Die tIi tzedenaturierung bedingt jedoch aueh eine Abspaltung yon Phosphat, das an wasserunl6sliche Substanzen gebunden ist (Tab. 4). So nahm z. B. bei Erhitzen von 90 ° auf 120°C die Phosphat- bindung pro 1 g unlSsliehes Protein yon 59 #tool auf 36 #tool ab.

1 HAM, 1~.: git. S. 115, Anm. 5. I-I~?~, 1~. : Fleisehwir~sch. 8, 266, 340 (1956).

3 H~tss~r.BAc~, W.: Zit. S. 114, Anm. 5; I-I~M, l~.: Zit. S. 114, Anm. 2. 4 BE~DemT., I. I~. : J. Soc. Chem. 65, 225 (1946).

W. }:IEIMANN und ST. ANDLEI~: Zur Aktivit&tsbestimmung der Polyphenoloxydase. I 121

Die Anderung der Leitfi~higkeit der Gewebehomogenate mit der Temperatur ent- sprieht der Freisetzung yon Phosphat.

Zusammen/assung

Ffir das Verst~ndnis dcr Muskeldenaturierung, die bei der Verarbeitung des Flei- sches eine wichtige Rolle spielt, war es yon Interesse, den TemperatureinfluB auf den Bindungszustand der muskeleigenen Erdalkalimetalle (Mg, Ca) zu studieren. Wie Versuche mit Kationenaustauscher ergaben, werden beim Erhitzen des Fleisches mit zunehmender Temperatur zunehmende Mengen an freien Magnesium- und Calcium- Ionen aus ihrer Bindung an das MuskeleiweiB freigesetzt. Die Temperatur-Ionen- bindungs-Kurve zeigt cinen stufenfSrmigen Verlauf. Die Erdalkalimetalle werden in gleichem Mage aus gebundener Form freigesetzt, in welchem die Zahl der sauren Gruppen der Muskelproteine durch ttitzedenaturierung abnimmt.

In rohem wie im hitzedenaturierten Gewebe ist die Kationenbindung bei p~ 7 grSBer als bei p~ 5,5. Der grSBte Tell der durch Erhitzen freigesetzten Erdalkali- Ionen wird aus den strukturellen Muskelproteinen abgespalten. Die Versuche zeigen, dag auch zwischen 90 ° und 120°C die Denaturierung des Muskcleiweiges noch in gewissem Grade mit steigender Temperatur fortschrcitet.

Die Freisctzung yon anorganischem Phosphat aus gebundener Form beginnt erst bei Temperaturen > 90°C und schreitet dann mit steigender Temperatur fort. Der Hauptteil dieses frcigesetzten Phosphates entstammt wasserl6slichen Substanzen; es wird jedoeh aueh ein erheblicher Tell des an die strukturellen Proteine gebundenen Phosphats bei hSherer Temperatur abgespalten.

Zur Aktivit~itsbestimmung der Polyphenoloxydase I. Mitteilung

Untersuchungen iiber die Anwendung der colorimetrischen Methoden

Von

W. HEIMANN und ST. ANDLER a

Mitteilung aus dem Institut ]i~r Lebensmittelchemie der T. H. Karlsruhe

Mit 7 Textabbildungen

(Eingegangen am 16. November 1961)

Die Polyphenoloxydase, aueh Tyrosinase oder Phenolase genannt, ist eine im Pflanzenreich weitverbreitete und an vielen bioehemisehen Prozessen beteiligte Oxydo-Reduktase, die die Oxydation phenolischer Verbindungen dureh den Luft- sauerstoff katalysiert. Die dabei prim~tr entstehenden reaktionsfghigen Chinone kondensieren zu gefgrbten Verbindungen. So ist das Dunkelwerden yon besch~digtem Pflanzengewebe, wie angeschnittenen Kartoffeln, Apfeln, Pilzen, mit auf die Wirkung der Polyphenoloxydase zurfickzuffihren. Aueh bei lebensmitteltechnologisehen Pro- zessen ist die Wirksamkeit der Polyphenolase yon Bedeutung. Ihre Beteihgung ist teilweise erwfinseht, z. B. bei der Tee- und Kakaofermentation, bei der Aromabildung

* Auszug aus der Dissertation yon ST. A~DL~: Beitr&ge zur Untersuchung der Polyphenol- oxydase. T. H. Karlsruhe 1961.