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RECUENTO CELULAR MANUAL Y AUTOMATIZADO
LIC. TM Ronald Luis León Soto
Los recuentos celulares son una serie de procedimientos que tiene por objeto determinar el numero de cada uno de los tipos celulares
Todos los recuentos constan de 3 fases◦Dilución de sangre◦Computo del numero de células◦Calculo del numero de células en 1mm3 de
sangre
Recuento Manual
RECUENTO LEUCOCITARIO
La sangre anticoagulada se deposita en un líquido que permite evidenciar los leucocitos, manteniéndolos visibles, mientras que los eritrocitos son hemolizados.
El recuento del número de leucocitos o glóbulos blancos se expresa por mm3
Equipos◦Microscopio.
◦Hemocitómetro (Cámara de Neubauer).
Pipeta de glóbulos blancos (De Thoma)
Pipeta Automática
SOLUCIÓN DE TURK
Reactivos◦Ácido acético glacial 2,0 mL◦Solución acuosa de violeta de genciana al 1%
1,0 mL◦Agua destilada c.s.p. 100 mL
Procedimiento◦Mezclar los reactivos y guardar en frasco
ámbar en lugar fresco.
Cámara de Neubauer
Consiste en una placa gruesa de cristal en forma de porta, cuya porción central está dividida en tres bandas perpendiculares al eje longitudinal de la cámara.
De ellas, las dos laterales se hallansobreelevadas 0´1 mm con respecto a lacentral, y en esta última hay grabado unretículo cuadrangular.
La banda central puede estar, a su vez,subdividida en dos semibandas idénticas yseparadas por un surco paralelo al ejelongitudinal de la banda.
En cada una de estas dos semibandas hay grabado un retículo idéntico.
Cada cuadrícula mide 3 mm de
lado y se divide en 9 cuadrados
grandes.Cada uno de los cuales mide 1
mm2 de superficie, que se subdivide a
suvez en 16 cuadrados
medianos. El cuadrado grande central se divide
en25 cuadrados
pequeños y cada uno de ellos en 16 cuadraditos. Cadacuadrado pequeño mide 0,2 mm de
lado (0,04 mm2 de superficie), y cadacuadradito mide 0,05 mm de lado (0,0025 mm2 de
superficie)
3 mm
1mm2
1 2 3 4
5 6 7 8
9 10 11 12
13 14 15 16
Procedimiento
Aspirar la sangre con la pipeta de glóbulos blancos hasta la marca de 0,5 y a limpiar la punta con papel absorbente.
Introducir la pipeta en el tubo que contenga solución de Turk y absorber hasta la marca de 11 (no debe haber burbujas).
Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente.
Monte la laminilla de vidrio en la cámara para recuento que debe estar limpia y seca.
Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocar una gota pequeña de esta solución en la cámara.
Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las células se sedimenten.
Cuando se usa la pipeta automática, se toma 20 mL (0,02 mL) de sangre total anticoagulada y se diluye en un tubo que contenga 380 mL de solución de Turk (aquí tenemos una dilución 1:20).
Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angulares
RECUENTO DE GLÓBULOS ROJOS
Equipos y reactivos◦Microscopio.◦Hemocitómetro (cámara de Neubauer).◦Pipeta de glóbulos rojos (De Thoma) o pipeta
automática (de 0-100 mL).◦Diluyente de glóbulos rojos:
Cloruro de Sodio al 0,9% Diluyente de Hayem
SOLUCIÓN DE HAYEM
Reactivos◦Bicloruro de mercurio 0,5 g◦Sulfato de sodio 5,0 g◦Cloruro de sodio 1,0 g◦Agua destilada 200 mL
Procedimiento◦Se mezclan todos los reactivos y se guarda en
frasco de vidrio en lugar fresco.
procedimiento
Llenar la pipeta de glóbulos rojos con sangre hasta la marca de 0,5 para realizar una dilución de 1/200, y si se carga hasta 1, la dilución será 1/100. Limpiar la punta con gasa o papel absorbente.
Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem) y llenar de líquido de dilución hasta la marca de 101.
Mesclar bienAgitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas
del tallo, luego colocar una gota pequeña cerca de un extremo de la cámara para que por capilaridad se llene exactamente.
Hacer el recuento con objetivo de 40x
Se puede realizar con la pipeta automática, se toma 20 ul (0,02mL) de sangre total con 4 mL de solución de Hayem (aquí se tiene una dilución de 1:200).
Se deja reposar aproximadamente 5 minutos y se procede a cargar la cámara con la misma pipeta usando un nuevo tip.
Dejar en reposo por 3 minutos.
Recuento de Plaquetas
Se realiza
◦En un microscopio de contraste de fases
◦Un microscopio convencional.
Recuento en Cámara
Materiales◦Hemocitómetro o cámara de Neubauer.◦Solución de procaína (Anexo A).◦Pipetas automáticas de 100 a 1000 mL y 0 a
100 mL.◦Cámara húmeda.◦Tubos de plástico de 12 x 75.◦Microscopio convencional.
Método
Mezclar bien la muestra de sangre obtenida con EDTA.
Hacer una dilución de 20 uL de sangre total con 380 uL de solución de procaína en un tubo de plástico de 12 x 75 (dilución 1/20).
Dejar en reposo por 15 minutos en una gradilla.De esta dilución, llenar en cámara de Neubauer.Dejar en reposo por 15 minutos en cámara húmeda.Enfocar con objetivo de 40x y contar las plaquetas
en el retículo central de 1 mm2 cuadrado.
Resultados Valores de referencia150 000 - 450 000 plaquetas/mm3
Recuento en Lámina
Se cuentan 10 campos con objetivo de 100x y se multiplica por 1000 que es la
Valores de referencia◦150 000 - 450 000 plaquetas/mm3
Recuento Automatizado
La automatización proporciona mayor exactitud y precisión que los métodos manuales.
Resultados en menos TiempoMuchos mas parámetros que los
habituales Menor volumen de sangreMayor rendimientoDiagnóstico y Tratamiento más oportuno
de la enfermedad.
Principios Generales del Equipamiento
Utilizan sobre todo dos principios básicos:
◦La Impedancia Electrónica, o la Resistencia a la Corriente Continua (CC) de Bajo Voltaje
◦Radiofrecuencia RF, o corriente electromagnética de alto voltaje
◦La Dispersión óptica
La Impedancia Electrónica, o la Resistencia a la Corriente Continua (CC) de Bajo Voltaje
Desarrollada por Wallace Coulter 1950Metodología utilizada con mayor
frecuenciaSe basa en la detección y la medición de
cambios en la resistencia eléctrica producida por las células cuando atraviesan una apertura pequeña.
Las células suspendidas en un diluyente conductor de la electricidad, como solución fisiológica, se arrastran a través de una apertura (orificio) en un tubo de vidrio.
En la cámara de recuento, o ensamblaje del transductor, se aplica la corriente eléctrica de baja frecuencia entre un electrodo externo (suspendido en la dilución celular) y uno interno (alojado dentro del tubo de apertura). La resistencia eléctrica entre los dos electrodos, o la impedancia en la corriente, se produce a medida que las células atraviesan la apertura, que tiene sensores y produce pulsos de voltaje medibles
El número de pulsos es proporcional al número de células contadas.
El tamaño del pulso de voltaje es directamente proporcional al tamaño de la célula
Los datos se trazan en un gráfico de distribución de frecuencia, o histograma de distribución de tamaño
Factores que Afectan la Medición
El Tamaño de la Apertura:◦La Acumulación de proteínas
Recuentos celulares más bajos con volúmenes celulares con elevaciones falsas.
El pasaje coincidente de más de una célula◦volúmenes celulares aumentados falsos y recuentos
celulares disminuidos falsos.La orientación de la célula en el centro de la
apertura y la capacidad de deformación de los eritrocitos
La recirculación de las células hacia atrás◦Recuentos celulares con elevaciones falsas
Radiofrecuencia RF, o corriente Electromagnética de alto voltaje
La impedancia de CC de bajo voltaje puede utilizarse junto con la resistencia de RF, o corriente electromagnética de alto voltaje
El volumen total de la célula es proporcional al cambio en la corriente continua, la densidad interna celular (volumen nuclear, etc.) es proporcional al tamaño del pulso o el cambio en la señal de RF.
La conductividad, medida por esta sonda electromagnética de alta frecuencia, se atenúa por la relación núcleo-citoplasma, la densidad nuclear y la granulación citoplasmática.
Por lo Tanto
El uso de varios métodos en un equipo dado para la determinación de por lo menos dos propiedades celulares permite la separación diferencial de los leucocitos en cinco componentes (neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos)
Dispersión Optica
En los sistemas de dispersión óptica (citómetros de flujo) una masa de muestra (centrada en forma hidrodinámica) se dirige por un canal de cuarzo que genera un “flujo celular” (de a una por vez), sobre el que impacta la luz también “centrada”.
La fuente suele ser de luz halógena, de tungsteno, o laser de helio y neón.
Esto permite la detección de “interferencia” en el haz de luz y posibilita su cuantificación, de modo tal de dar valores que “caracterizarán a cada tipo celular”. Este sistema de dispersión óptica permite identifica leucocitos, plaquetas y eritrocitos.
Por lo Tanto
A medida que las células circulan por la “región sensora”, la luz impacta sobre ellas y se interrumpe el flujo lumínico unidireccional.
La luz se dispersa en todas direcciones con ángulos de desvío relativos a las características (densidad y tamaño) del cuerpo golpeado.
Se generan a su vez procesos de absorción, difracción y de dispersión lumínica
Principales Instrumentos para el Recuento de
Células
Son Fabricados
Abbott Laboratories ABX DiagnosticsBayer DiagnosticsBeckman Coulter, IncSysmex Corporation.
Componentes
Los analizadores hemáticos tienen algunos componentes básicos comunes, como los sistemas:◦Hidráulicos◦Neumáticos◦Eléctricos
Componentes
Sistema Hidráulico◦La unidad de aspiración◦Los dispensadores◦Los diluyentes◦Las cámaras de mezclado◦Los baños de apertura◦El flujo de células o ambos◦Un hemoglobinómetro.
Componentes
El sistema Neumático◦Se incluye el sistema de vacío y las presiones
requeridas para que operen las válvulas y transporten la muestra a través del sistema hidráulico
El sistema eléctrico ◦controla las secuencias operacionales del
sistema total e incluye analizadores electrónicos y circuitos computarizados para el procesamiento de los datos generados
El Grado de Automatización. ◦Depende de cómo se manejen las muestras
Los equipos varían desde ◦Los Analizadores "paso a paso" SemiAutomatizado
◦Los Sistemas fáciles de usar con capacidad de "carga frontend“ Totalmente Automatizado
SemiAutomatizado
Totalmente Automatizado
Las funciones de la computadora también varían◦Los software pueden incluir
Inicio y Apagado Automáticos Autocontroles internos de diagnóstico Cierto grado de mantenimiento Control de calidad (QC), con revisión automática de datos del
QC Cálculos Gráficos Promedios Dinámicos Almacenamiento de Archivos del QC Almacenamiento y Recuperación de datos del Paciente Señalización de los valores de Emergencia o Críticos Sistema de información del laboratorio o del hospital
Equipos CoulterBeckman Coulter, lnc
La Serie ONIX◦Análisis completo de eritrocitos, plaquetas y
leucocitos con recuento diferencial de tres componentes
MAXM y STKS◦RCS con recuento diferencial de cinco
componentes y análisis de ReticulocitosGEN-S System
◦Análisis de Reticulocitos en línea ◦Automatizado por completo. ◦Realizar recuento de CD4 y CD8
Los Recuentos de Eritrocitos y Leucocitos, y la determinación de Hemoglobina (HGB) se miden en forma directa
El VCM es un promedio tomado de los datos de distribución de tamaño.
El Hto, la HbCM, la CHbCM, EL RDW se calculan
Recuento de Hematíes y PlaquetasPor la Impedancia Eléctrica
◦Las partículas entre 2 y 20 fL se cuentan como plaquetas
◦Las partículas de más de 36 fL, como Eritrocitos
Determinación de la concentración de la Hemoglobina
Después de que se completan los ciclos de recuento, la dilución de leucocitos pasa al hemoglobinómetro para la determinación de la concentración de la hemoglobina
Recuento de Leucocitos
Basado en su Impedancia◦En Tres Componentes
En Linfocitos Células Mononucleares Granulocitos
Entre 35 y 90 fL “Linfocitos "Entre 90 y 160 fL “Mononucleares"
(monocitos, blastos, granulocitos inmaduros y linfocitos atípicos)
Entre 160 y 450 fL “ Los Granulocitos maduros "
Recuento Diferencial de Leucocitos
Usa Tecnología VCS◦La CC de baja
frecuencia ◦Sonda electromagnética
de alta frecuencia ◦Luz láser
monocromático◦En cada muestra se
analizan más de 8.000 leucocitos
VOLUME:La CC de baja frecuencia mide el tamaño
CONDUCTIVITY:sonda electromagnética de alta frecuencia midela conductividad, un indicador del contenido internocelular
SCATTER:Cada célula también se analizacon luz láser monocromático que revela informaciónsobre la superficie celular como su estructura,forma y reflectividad
Equipamiento SysmexSysmex Corporation, antes TOA Medical Electronics, Co.,
Ltd ahora ROCHE
El KX-21 pequeño y El K-4500◦Proporcionan análisis completos de eritrocitos,
plaquetas y leucocitos con recuento diferencial de tres componentes
El SF-3000 más grande y el SE-9000 ◦Realizan un recuento diferencial de cinco componentes
Los sistemas más nuevos que proporcionan además un recuento de Reticulocitos
El Sysmex XE-2100 ◦Tiene citometría de flujo fluorescente agregada para
aumentar la capacidad de análisis celular del equipo. permite el recuento directo
◦Los Recuentos de Leucocitos◦Eritrocitos◦La Determinación de Hemoglobina (Hb)◦El Hematocrito (Hto) ◦Las Plaquetas (PL)
Se calculan de forma directa
Recuento de Leucocitos, Eritrocitos y Plaquetas◦Método de Impedancia (detección de CC) para el
recuento y la determinación del tamaño celular◦Usando umbrales de Discriminación
El hematocrito es entonces la altura del pulso acumulativa del eritrocito y se considera un volumen verdadero del porcentaje relativo de Eritrocitos“
La hemoglobina se convierte a Metahemoglobina q se convertirse en una molécula hemicromática y se mide como absor - bancia a 555 nm.
En el microprocesador se calculan los siguientes índices, que utilizan parámetros medidos en forma directa o derivados: ◦VCM◦HbCM◦CHbCM◦RDW-SD◦RDW-CV◦VPM◦Plaquetocrito (Pto).
Utiliza cuatro cámaras de detección las cámaras DIFF, IMl, Ea y BASO para Recuento diferencial de cinco componentes
Los Leucocitos se analizan con método de detección CC y RF
La cámara DIFF permite separar los leucocitos en Linfocitos, Monocitos y Granulocitos
En la cámara IMI establecer "información sobre (leucocitos) inmaduros“ a partir de los Granulocitos
En las cámaras Ea y Baso se analizan y cuentan los Eosinofilos y Basofilo
Por Diferencia se calcula los Neutrofilos
Equipamiento CELL-DYN
Abbott Laboratories
El CELLDYN 1700 más pequeño◦Proporciona análisis completo de eritrocitos,
plaquetas y leucocito s con recuento diferencial de los tres componentes;
Los CELL-DYN más grandes 3500R y 3700◦Realizan un HC con recuento diferencial de
cinco componentes y análisis de reticulocitosEl CELL-DYN 4000 más nuevo
◦Proporciona un análisis de reticulocitos automatizado por completo
Usa la Impedancia para el Recuento celular
Usa tres canales de medición independientes para determinar el hemograma y el recuento diferencial
Tiene un canal de impedancia adicional para determinar para control interno del recuento óptico de leucocitos primario
Se consideran que los valores de leucocitos, eritrocitos, hemoglobina y plaquetas se miden en forma directa.
El VCM es obtenido de los datos de distribución de su tamaño.
La Hemoglobina se mide en forma directa mediante el método de cianhemoglobina
El Hto, la HbCM y la CHbCM se calculan.
La RDW, equivalente al coeficiente de variación, es un valor relativo, derivado del histograma
Otros índices son el VPM y Pto
Los recuentos leucocitario y diferencial derivan del canal óptico que utiliza la separación por dispersión polarizada con múltiples ángulos (M.A.P.S.S.)
Se utilizan varias combinaciones de estas cuatro mediciones para diferenciar y cuantificar las cinco subpoblaciones leucocitarias principales: neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos
Equipamiento Bayer (Siemmens)
Bayer Corporation
ADVIA 120◦Los leucocitos, los eritrocitos, la hemoglobina y
las plaquetas se miden en forma directa.La HB se determina con el método de
cianmetahemoglobinaEl método para Eritrocitos y PL utiliza
mediciones de dispersión de la luz por citometría de flujo
Utilizan cuatro canales de medición independientes para determinar el hemograma y el recuento diferencial: ◦Canal para eritrocitos y PL ◦Canal para Hemoglobina◦Canal para Peroxidasa (PEROX)◦Canal para Lobularidad de Basófilos (BASO)
para recuento Leuocitario y datos diferenciales.
Angulobajo [2° a 3°], se correlaciona con el volumen celularo e! tamaño,Angulo alto [5 a 15°] se correlacionacon la complejidad interna
El VCM y el VPM son la media del histograma del volumen eritrocitario y el histograma de las plaquetas
El Hematocrito, la HbCM y la CHbCM se computan en forma matemática a partir de los valores de eritrosis-tos, hemoglobina y VCM.
La RDW se calcula como el CV del histograma de volumen eritrocitario
La amplitud de distribución de hemoglobina (HbDW), se calcula como la desviación estártdar del histograma de concentración de la Hb eritrocitaria.
Los analizadores hemáticos de Bayer determinan el recuento leucocitario total y diferencial de seis componentes (neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos, basófilos y células no coloreadas grandes por citoquímica y citometría de flujo óptica, utilizando los canales PEROX y BASO
Canal de Peroxidasa (PEROX)◦En el canal PEROX, los eritrocitos se lisan y los
leucocitos se tiñen por su actividad de peroxidasa (PX)
Los Neutrófilos y los eosinófilos contienen la máxima cantidad de PX y un cúmulo a la derecha del citograma
Los Monocitos adquieren una coloración débil y por consiguiente el cúmulo se observa en la región media del citograma.
Los linfocitos, los basófilos y los LVC (que abarca los linfocitos atípicos y los blastos) no contienen PX y aparecen en la izquierda del citograma
Canal de Lobularidad de Basófilos (BASO)◦En el canal BASO las células se tratan con un re
activo, Los basófilos tienen una resistencia particular a la lisis, mientras que los eritrocitos y las plaquetas se lisan y otros leucocitos (no basófilos) se despojan de su citoplasma
Por diferencia se calculan el porcentaje total de leucocitos
Recuento Automatizado de
Reticulocitos
El recuento de Reticulocitos fue el último de los procedimientos manuales de conteo celular en automatizarse
La imprecisión y la inexactitud del recuento manual de Reticulocitos se deben a numerosos factores, como:◦Variabilidad de la coloración◦Errores de distribución en el porta objeto◦Errores estadísticos de muestreo◦Errores surgidos entre los observadores
Los analizadores automatizados de Reticulocitos pueden contar hasta 32.000 eritrocitos comparado con las 1.000 células del método manual habitual.
Equipos◦Becton Dickinson FACS ◦Culter EPICS◦Sysmex R-3S00, R-SOO y SE- 9S00/9000+RAM-1 ◦Sistemas CELL-DYN 3500R, 3700 Y 4000◦Coulter GEN-S, STKS ◦Sistemas MAXM◦Sistemas Bayer ADVIA 120 ◦Technicon H-3 RTC y RTX.
Todos estos analizadores evalúan los Reticulocitos basados en la dispersión óptica o la fluorescencia después de tratar los eritrocitos con colorantes fluorescentes o la coloración del ácido nucleico para teñir el RNA residual en los reticulocitos.
Se Sintetizan los métodos para la determinación diferencial de los leucocitos en los mismos cuatro analizadores
Utilidad Clínica de los Equipos Automatizados en
Hematología
Mejoraron La disponibilidad, la exactitud y la utilidad clínica del Hg y el recuento leucocitario diferencial.
Nuevos parámetros hematológicos◦La RDW◦CHb eritrocitaria◦VPM◦Recuento leucocitario diferencia◦Mayor Rendimiento en el Laboratorio◦Alerta de Hematíes nucleados y plaquetas Agregadas◦Alarmas sobre patologías Leucocitaria e Eritrocitaria
Limitaciones Debidas a la Muestra
Incluye la presencia de factores como◦Crioaglutininas
VCM aumentado (con frecuencia mayor que 130 fL) Recuentos de Eritrocitos notablement disminuidos CHbCM aumentada (con frecuencia mayor que 40
gldL).◦Ictericia◦Lipemia
Afectan las mediciones de la Hb y los índices relacionados
◦Tiempo de procesamiento Aumento de la fragilidad de los leucocitos Aumento del tamaño celular Posible lisis Eritrocitaria Alteración de las plaquetas
◦Anticoagulante usado y cantidad
Limitaciones del Equipo
Incapacidad de un instrumento para distinguir las células de otras partículas o fragmentos de células del mismo tamaño de manera confiable
Por ejemploPueden contarse los fragmentos celulares como
plaquetasLos esquistocitos o eritrocitos pequeños pueden
interferir en el recuento de las plaquetasLos cúmulos de plaquetas más grandes pueden
contarse como leucocitosLos Micromegacariocitos pueden contarse como
eritrocitos nucleados o leucocitosLos Eritrocitos que contienen alguna variante de
hemoglobina como S o C a menudo son resistentes a la lisis
CALIBRACION
Puede lograrse con el uso apropiado de métodos de referencia, materiales de referencia, calibradores preparados en forma comercial o cualquier combinación de ellos
La calibración debe realizarse en el momento de la instalación inicial y debe verificarse al menos cada 6 meses
Pueden requerirse calibraciones periódicas después de reparaciones importantes del equipo que requieren alineación óptica o 'reemplazo de partes.
