Cinetica propriu-zisa Fermentarea = cultivarea pe scara larga a celulelor

Optimizarea productiei:

- maximum de produs;

- in cel mai scurt timp;

- cat mai putine costuri

- descrierea cantitativa a sistemului culturii celulelor. Determinarea cineticii sistemului previziuni pentru:

- productie;

- timpii de reactie;

- marimea bioreactorului.

Cinetica reactiilor - inainte de costructia sistemului la scara dorita (industriala, pilot).

Sistemele de culturi de celule:

- multe intrari;

- multe iesiri;

- reactiile catalitice proprii se propaga singure

Cuantificarea sistemelor de culturi celulare - modele matematice.

Model matematic = descrierea matematica a unui sistem fizic.

Modelul matematic aspectele importante ale proceselor.

Modele matematice

Ex. reactia chimica de ordinul 1, in care o molecula de reactant (S) este convertit la produsului (P), are urmatoarea ecuatie:

care poate fi exprimata ca o ecuatie diferentiala cu forma:

in care [S] este concentratia reactantului si k este o rata constanta

Se observa ca pentru aceasta reactie, o ecuatie diferentiala a formarii produsului este:

-

sau

[P] = concentratia produsului; n = constanta stoechiometrica ce descrie relatia dintre consumul lui S si formarea lui P. - descresterea concentratiei lui S conduce la cresterea lui P si de aici semnul negativ in ecuatiile 4 si 5. Prin rezolvarea celor doua ecuatii este posibil sa se afle valorile lui S si a lui P in orice timp.

Ecuatia Michelis Menten este un model matematic ce descrie activitatea diferitor enzime:

[S] este concentratia substratului;

V este rata de consum a substratului;

Vmax este maximum al ratei specifice;

Km este constanta de saturatie.

Ecuatia Michaelis Menten descrie rata de substrat degradata de enzime si care poate fi scrisa si sub forma:

Rata de formare a produsului [P] din aceasta reactie este:

[P] = este concentratia produsului; Y = un coeficient stoichiometric de productie.

Utilizarea ecuatiilor diferentiale

- descriu ratele de schimb in cadrul unui sistem.

- fiecare ecuatie contine variabile si parametri

Variabilele in modelul Michaelis Menten sunt: [S] si [P];

Valorile lor se schimba in timp;

Variabilele sunt exprimate deobicei in concentratii (g/l).

Vmax, Km si Y sunt parametri si nu se schimba in timp.

Parametrii sunt termeni constanti in anumite conditii date. Pentru fiecare conditie (pH, T, catalizatori) sunt necesari un set diferit de parametri.

Din modelele matematice prezentate mai sus se pot observa urmatoarele:

In modelul Michaelis Menten (ecuatiile 6-8), temperatura si pH-ul raman constante.

Aceasta inseamna ca modelul va fi aplicat numai in acele conditii de pH si temperatura. Modelul presupune de asemenea ca temperatura este cea corepunzatoare activitatii enzimei (nu este prea mare pentru a nu cauza denaturarea enzimei).

Temperatura si pH-ul pentru care modelul este aplicat sunt exemple de factori limitativi in cadrul carora modelul este valid.

Modelele reactiilor chimice si biochimice descrise,

folosesc coeficienti stoechiometrici pentru a determina cantitatea de produs sau biomasa ce urmeaza a se obtine din fiecare unitate de reactant sau substrat utilizat.

Coeficientii descriu, de asemenea, cat de eficient este convertit un reactant in biomasa.

Exemplu: formarea acidului lactic din glucoza in timpul activitatii musculare mai intense se face dupa urmatoarea ecuatie:

1 mol de glucoza = 2 moli de lactat (10)

Stoichiometria reactiilor biochimice

Productia de lactat din glucoza (YLG) este de 2 moli de lactat (L) pe mol de glucoza (G). Relatia dintre formarea lactatului si utilizarea glucozei este:

Modelul matematic pentru descrierea utilizarii glucozei de

catre celulele musculare si ale ficatului este totusi mult mai

complex. In realitate, productia va fi mai mica decat 2

moli/mol deoarece unii dintre atomii de carbon vor fi folositi

la respiratie sau in alte activitati celulare.

Factorii de productie trebuie determinati experimental,

ecuatia 10 reprezentand o stoechiometrie ideala, care poate fi

utilizata doar ca ghidare.

Cultivarea pe scara larga se face in vase de reactie specializate numite bioreactoare sau fermentatoare. Termenul de fermentatie este adesea utilizat pentru a descrie cultivarea celulelor in fermentatoare. Exista 3 mari categorii de bioreactoare: discontinua, in sarje; semicontinua si continua

Bioreactoare

Dintre cele 3 sisteme, cel semicontinuu este cel mai utilizat pentru a produce produsi biologici. Reactoarele discontinui sunt pe locul doi. Desi cele continui sunt foarte rar utilizate in productia industriala, ele sunt folosite in tratamentul deseurilor.

Bioreactorul este umplut cu mediu proaspat si apoi inoculat. La sfarsitul fermentarii continutul este indepartat iar reactorul este curatat, spalat, sterilizat si reumplut pentru urmatoarea fermentare.

Bioreactoarele continui = mediul proaspat este continuu adaugat si in acelasi timp parte din fluidul din bioreactor este in continuu indepartat. Celulele se propaga continuu, in mediul proaspat ce este introdus continuu si in acelasi timp, produsii metabolici (deseuri) si celulele care sunt indepartate continuu. Celulele pot fi imobilizate pentru a maximiza retinerea lor si astfel pentru a creste productivitatea.

La acest tip de bioreactoare mediul proaspat este adaugat fara o continua indepartare. Cand volumul

reactorului este plin, fermentatorul este golit, partial sau complet si procesul reincepe.

Curba de crestere exponentiala Cand celulele cresc in cultura, ele trec prin 4 faze:

faza lag, faza exponentiala log, faza stationara si faza mortii.

Realizand un grafic al logaritmului concentratiei de celule functie de timp va rezulta o linie dreapta pentru sectiunea reprezentand faza

exponentiala

Faza exponentiala - are loc cresterea concentratiei de celule si cresterea ratei de crestere a celulelor.

Celulele se autocatalizeaza: ele catalizeaza reactiile si se reproduc pentru a produce mai multi catalizatori.

Considerand o singura celula in reactor, aceasta se divide la fiecare ora.

Populatia celulara la fiecare timp de generatie poate

fi determinat astfel:

Cu fiecare generatie, concentratia celulelor in reactor se dubleaza.

Daca numarul de celule este trecut pe un grafic functie de timp, se obtine o curba exponentiala. Daca conditiile raman constante, rata de crestere a celulelor (sau a biomasei) este dependenta de concentratia celulelor prezente in reactor care va fi mai departe descrisa prin relatia:

dX/dt = X (12)

unde X = concentratia de biomasa din bioreactor. Concentratiile de biomasa sunt exprimate in g/l de

substanta uscata.

Proportionalitatea expresiei in ecuatia 12 poate fi inlocuita cu o constanta, cunoscuta sub numele de rata specifica de crestere ().

dX/dt = X (12)

Ecuatia 12 poate fi rescrisa sub forma:

in care este rata specifica de crestere;

Acest model reprezinta cresterea microbiana si se refera la modelul cresterii exponentiale.

Rata specifica de crestere () descrie cat de repede se reproduc celulele.

Cu cat valoarea ratei specifice de crestere este mai mare, cu atat celulele cresc mai repede.

Cand celulele nu cresc, rata specifica de crestere este zero.

In timpul fazei exponentiale rata specifica de crestere este relativ constanta.

Ecuatia 13 prezinta o relatie intre concentratia biomasei (X) si timp (t).

Rearanjata, ecuatia 13 devine:

si integrand-o in intervalul de timp t0 t1, daca la timpul t0 concentratia biomasei in bioreactor este reprezentata de X0 si la t1 concentratia biomasei este reprezentata de X1, ecuatia 14 devine:

Cand este constant in timpul fazei exponentiale:

Integrand ambele parti, se obtine:

In final:

Ecuatia 19 descrie relatia exponentiala intre concentratia biomasei si timp.

Rata specifica de crestere

Ecuatia 17 reprezentata grafic, ln X functie de timp se va

obtine o linie dreapta.

Panta liniei este echivalenta cu rata specifica de crestere ().

Limitari ale modelului de crestere exponentiala In derivarea ecuatiei 19 se presupune ca rata specifica de crestere

este constanta. Aplicarea ei se poate face numai in faza de crestere exponentiala si

cand cresterea celulelor inceteaza, =0. Modelul de crestere exponentiala arata ca biomasa nu se opreste

din crescut. Cand nutrientii disponibili scad in cantitate, rata de crestere a

celulelor va fi mai lenta sau eventual se opreste. In acelasi timp, celulele vor produce produsi finali metabolici care vor inhiba cresterea celulelor.

Limitari ale modelului de crestere exponentiala Cresterea exponentiala nu va exista daca exista oxigenul ca factor

limitativ sau conditiile de amestecare nu sunt corespunzatoare. In acest caz, cresterea va limitata de transferul de masa.

Cresterea non-exponentiala va apare cand divizarea celulelor nu

este la o rata constanta. Acest fenomen este comun mucegaiurilor si altor organisme multicelulare. Cresterea non-exponentiala a fost observata la multe tipuri de celule animaliere si la cateva organisme care se reproduc prin inmugurire.

Relatia dintre dublarea timpului si rata specifica de crestere

Dublarea timpului (tD) este o expresie utilizata de catre microbiologi pentru a descrie rata de crestere a celulelor. Ea reprezinta timpul necesar ca populatia celulara sa se dubleze.

In timpul fazei exponentiale, tD va fi aproape constant. Relatia dintre dublarea timpului si rata pecifica de crestere este descrisa mai jos. Daca concentratia biomasei se dubleaza de la X1 la 2 X1 peste dublarea timpului tD (= t2-t1), ecuatia 18 devine:

Astfel vom obtine o relatie dintre dublarea timpului si rata specifica de crestere:

Limitarea cresterii de catre nutrienti

Disponibilitatea nutrientilor are o influenta majora in rata

specifica de crestere.

Daca un nutrient este disponibil in concentratii care limiteaza

cresterea celulelor atunci este numit nutrient limitativ de

crestere.

Cand nutrientul care limiteaza cresterea este carbonul si

sursa de energie atunci ne referim la un substrat limitativ de

crestere.

Cateva medii de fermentatie sunt realizate astfel incat la

sfarsitul fermentatiei numai sursa de carbon sa fie furnizata

limitativ. Altele sunt realizate astfel incat azotul sa fie factorul

limitativ.

In cateva fermentatii, disponibilitatea nutrientilor altii decat

carbonul si sursa de energie este intentionat controlata, astfel

incat sa se incetineasca sau previna cresterea celulelor. Aceasta

este realizata pentru a se asigura ca celulele catalizeaza

conversia substratului la un produs si substratul nu este utilizat

pentru sinteza blocurilor celulare.