Título do Projecto:

Esofagite eosinofílica: contribuição para a sua caracterização morfológica

e diagnóstico diferencial com a esofagite de refluxo

Unidades de Investigação da FMUL: 1. Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Santa Maria (HSM), CHLN. Faculdade de

Medicina da Universidade de Lisboa (FMUL)

2. Serviço de Pediatria,Unidade de Gastrenterologia Pediátrica, Departamento da Criança e da Família do HSM-CHLN. FMUL

Nova unidade de Investigação: Área Científica de Anatomia Patológica, Citológica e Tanatológica da Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa (ESTeSL). Instituto Politécnico de Lisboa (IPL).

Nome do responsável: Ana Isabel Gouveia Costa da Fonseca Lopes, Chefe de Serviço de Pediatria, Professora Auxiliar

de Pediatria

Serviço: 1. Unidade de Gastrenterologia Pediátrica, Serviço de Pediatria, Departamento da

Criança e da Família do HSM-CHLN. FMUL

2. Serviço de Anatomia Patológica do HSM-CHLN

Responsáveis dos Serviços: 1. Coordenadora da Unidade de Gastrenterologia Pediátrica: Profª. Doutora Ana Isabel

Gouveia Costa da Fonseca Lopes (Directora do Departamento da Criança e da Família:

Profª. Doutora Maria do Céu Machado);

2. Directora do Serviço de Anatomia Patológica: Dr.ª Madalena Ramos

Duração Prevista 24 meses

Dados do Candidato

Nome: António Joaquim Teixeira Alves, Interno do Complementar do 1º Ano de

Anatomia Patológica do Serviço de Anatomia Patológica do HSM-CHLN. FMUL

Sexo: Masculino

Ano em que terminou a licenciatura: 2009

Média final do Curso: 16 valores

Morada: Rua Paulo Quintela nº24 2E. 2815-691 Sobreda

Telefone/ Telemóvel: 968864053

Email: antoniotalves@gmail.com

Dados dos Orientadores Científicos

Nomes: 1. Ana Isabel Gouveia Costa da Fonseca Lopes

2. Ana Maria Gil Vaz Osório Palha

Morada Institucional: 1. Hospital Santa Maria, CHLN. Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa Avenida

Professor Egas Moniz. 1649-035

2. Hospital Santa Maria, CHLN. Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.

Avenida Professor Egas Moniz. 1649-035

Telefone/ Telemóvel: 1. 919075306

2. 912148673

E-mail: 1. anaisalopes@sapo.pt

2. aopalha@gmail.com

Informações sobre o Projecto:

Palavras-Chave: Eosinophilic esophagitis, Eosinophils, Food allergy, Gastroesophageal Reflux

Introdução:(Contextualizar o interesse do projecto: mencionar a realização do projecto com os interesses

científicos do grupo onde o projecto será realizado) (max 6000 caract)

A presença de eosinófilos no epitélio da mucosa esofágica é um achado frequente nas biopsias

esofágicas em idade pediátrica, tendo sido mais frequentemente associada até há

relativamente pouco tempo, à Doença Refluxo Gastro-Esofágico (DRGE).1

Nas últimas décadas, vários estudos têm chamado à atenção para a existência de uma nova

entidade nosológica com características clínicas, endoscópicas e histológicas semelhantes à

DRGE, mas frequentemente associada a pHmetria normal e refractária à terapêutica com

inibidores da bomba de protões, tendo sido proposta a designação de esofagite eosinofílica

(EoE).

A EoE constitui uma doença esofágica crónica, imunologicamente/antigenicamente

mediada, caracterizada clinicamente por sintomas relacionados com disfunção do esófago

(disfagia e impacto alimentar, podendo levar a estenose esofágica) e histologicamente

por inflamação predominante eosinofílica, limitada ao esófago.2,3,4

Um grande número de estudos têm posto em evidência a associação entre EoE e

hipersensibilidade a alimentos ou a pneumoalergénios5,6, tendo sido propostos mecanismos

imunes e/ou alérgicos na sua etiopatogénese5, que levariam a resposta aberrante devido a

eventual perda da tolerância imunológica da mucosa esofágica.6,7,8,9

Apesar de se assistir, nos últimos anos, à evolução do conhecimento relativamente a esta

entidade, a sua etiopatogénese é complexa e ainda muito pouco elucidada. Por outro lado, nos

planos clínico e anátomo-patológico, nem sempre é fácil a sua distinção da esofagite de refluxo

(DRGE), com base nos critérios de diagnóstico actualmente propostos (≥ 15 eosinófilos/ campo

de grande ampliação (cga) (valor máximo) no epitélio da mucosa esofágica).2

Os mecanismos imunorreguladores envolvidos na EoE e DRGE ainda não estão bem definidos,

tendo sido recentemente sugerido um potencial papel das células Treg. As células T

reguladoras CD4+CD25+FoxP3+ (Tregs) são um subtipo de células T que expressam receptores

IL-2 de cadeia alfa (CD25) e reguladores transcripcionais (FOXP3). São importantes na

supressão imunorreguladora da função e proliferação das células T. A expressão de FOXP3 nas

células T é actualmente considerada a mais importante para definir o fenótipoTregs, tal como

os eosinófilos, suprimem directa ou indirectamente as células efectoras da inflamação

associada a alergias. A sua disfunção ou número anormal podem levar a doença inflamatória

da mucosa.10

Por outro lado neste contexto, tem vindo a ser considerada de interesse a identificação de

biomarcadores adicionais (histologia convencional e/ou imunohistoquímica) para o diagnóstico

diferencial entre EE e DRGE.2,11,12

O epitélio pavimentoso estratificado da mucosa esofágica normal, não tem eosinófilos.13 Estes,

quando presentes poderão, em determinadas circunstâncias, ter capacidade de sintetizar e

libertar um grande número de moléculas, que podem iniciar ou perpetuar uma resposta

inflamatória. Recentemente, alguns escassos estudos têm detectado no adulto a presença de

grande quantidade de proteína granular (eosinophil-derived granule proteins, EDGPs) nos

eosinófilos. Cinco proteínas associadas aos eosinófilos foram já descritas (peroxidase

eosinofílica, proteína catiónicaeosinofílica, neurotoxina derivada dos eosinófilos, proteína

eosinofílica X e a proteína básica major), sendo a proteína básica major (MBP) uma das mais

abundantes nos tecidos com inflamação envolvendo os eosinófilos.10,14,15 Estes estudos têm

sugerido que os depósitos de EDGPs identificados pela presença de grânulos extracelulares e

de outros factores derivados dos eosinófilos podem contribuir para a patogénese e

cronicidade da doença. Desconhece-se ainda o significado e especificidade da determinação da

presença destes depósitos no diagnóstico da EoE.

A desgranulação eosinofílica parece estar associada a fibrose na EoE, assim como noutras

entidades clínicas como na síndrome hipereosinofílica, asma, eczema e doença inflamatória

intestinal. Foi muito recentemente descrita, numa população pediátrica com EoE, a presença

de fibrose da lâmina própria subepitelial, utilizando histologia convencional,16,17bem como

expressão aumentada de TGF-β18. Sabe-se que para além do seu papel na remodelação dos

tecidos (fibrose), TGF-β1 leva a hiperplasia do músculo liso, sugerindo a sua implicação na

formação de estenose e da perda da elasticidade da parede do esófago, uma complicação

reconhecida da doença ao longo da sua evolução. Um estudo recente mostrou que o

estiramento mecânico, um fenómeno que pode ocorrer no esófago espessado da

EoE,19aumenta a expressão de periostin em miocitos cardíacos e fibroblastos.20 Periostin

parece estar envolvido na adesão de eosinófilos, sendo quase exclusivamente expresso por

fibroblastos ou células que adoptam características fibroblásticas após lesão, sendo

importante reconhecer o seu papel na EoE e na fibrose.2,21

Os eosinófilos são associados, classicamente, ao perfil de quimocinas das células T helper tipo

2 (TH2) incluindo interleucinas IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 o que suporta o seu papel na resposta de

tipo alérgico.9,22,23 A IL-5, regula e estimula a proliferação, diferenciação e activação dos

eosinófilos ao nível da medula óssea após exposição ao alergénio e facilita a sua migração para

o sangue e para os locais de inflamação; actua ainda em sinergia com eotaxina.24 IL-13,

aumenta a libertação de eotaxina-3, potente quimo-atractor de eosinófilos.25 Para além desta

associação, os eosinófilos secretam quimocinas tais como eotaxina (-1, -2, -3, potentes quimo-

atractores de eosinófilos), RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and

Secreted) e proteína alfa inflamatória dos macrófagos (MIP-1α) que estão envolvidas no seu

recrutamento assim como no recrutamento e activação de outros leucócitos. Assim parece

que o eosinófilo tem um papel importante na mediação do aparecimento e da manutenção do

ambiente imune após a activação e na perpetuação de uma resposta inflamatória. Eotaxina

atrai os eosinófilos via interacção com o receptor de quimiocinas 3 (CCR3) que é quase

exclusivamente expresso pelos eosinófilos.26

Tem sido reportada muito recentemente evidência preliminar a favor de a EoE constituir uma

doença inflamatória associada a resposta imune T helper tipo 2 (TH2).

Os estudos publicados, não têm avaliado os achados histopatológicos e imunohistoquímicos de

forma integrada e simultânea, nem nenhum estudo prévio identificou aspectos distintivos

entre EoE e outras causas de eosinofilia esofágica, em particular da DRGE.

Estudos desta natureza, sobretudo se realizados em idade pediátrica (estadio inicial de uma

doença crónica com evolução progressiva da infância à idade adulta), constituirão certamente

um contributo relevante para uma melhor caracterização clínica e etiopatogénica desta

entidade e para eventual identificação de alvos celulares de interesse para o desenvolvimento

de terapêuticas selectivas.

Objectivos:(max 2000 c)

Objectivos Gerais

1- Contribuição para a caracterização histológica e imunofenotípica da EoE em idade

pediátrica.

2- Contribuição para a compreensão da sua etiopatogénese, através do estudo descritivo

do perfil imunofenotípico (subpopulações celulares e marcadores relevantes

associados e presentes no epitélio esofágico).

3- Eventual identificação de biomarcadores que possam ajudar no diagnóstico diferencial

entre EoE e DRGE em idade pediátrica.

Objectivos específicos

1. Caracterização histopatológica da EoE (hematoxilina-eosina (HE) e imunohistoquímica(IHQ))

Eosinófilos Descamação epitelial

Mastócitos

(Imunomarcação especifica)

Hiperplasia da camada basal

Formação de microabcessos Alongamento das papilas

Eosinófilos na superfície do epitélio Dilatação do espaço intercelular

2. Avaliação da fibrose na lâmina própria subepitelial (Marcação específica e IHC)

Tricrómio de Masson

TGF-α

Periostin

3. Avaliação da desgranulação de eosinófilos (IHQ)

Proteína básica major dos eosinófilos (MBP)

Eotaxina 3

IgE

4. Caracterização do perfil imunológico (IHQ)

Linfócitos B IL13

Linfócitos T Tregs

IL5

Programa de Trabalho e Calendarização: (o PT deve ser conciso, especificar tarefas ou etapas e indicar metodologia a utilizar. A calendarização deverá ter em

conta as necessidades do projecto e a disponibilidade do candidato, sendo desejável a inclusão de um cronograma

detalhado por tipo de actividade no ficheiro com a descrição do projecto, a anexar a este formulário) (max 1600c)

Calendarização

1. Selecção das amostras M1-M3

2. Execução técnica M4-M12

3. Leitura M13-M20

4. Análise dos resultados e redacção do

manuscrito

M21-M24

M= meses de estudo

1. Selecção das amostras

Ana Maria Gil Vaz Osório Palha António Joaquim Teixeira Alves Ana Isabel Gouveia Costa da Fonseca Lopes 1.1 Serão seleccionadas retrospectivamente do Arquivo do Serviço de Anatomia Patológica do HSM-CHLN, um total de 100 biopsias representativas da mucosa esofágica proximal e distal, obtidas de crianças e jovens com idades compreendidas entre 0 a 16 anos, previamente submetidas, pela primeira vez, a esofagogastroduodenoscopia por sintomas do tracto gastrointestinal alto, nas quais foi previamente estabelecido o diagnóstico de:

EoE (total decasos - 40) Grupo de estudo

DRGE (total de casos - 40) Grupo de controlo patológico

Adicionalmente será incluído um terceiro grupo de crianças / jovens com sintomatologia dispéptica (tendo justificado endoscopia alta) mas sem alterações endoscópicas e histológicas esófago-gastroduodenais (ausência de inflamação e ausência de alterações epiteliais) (grupo de controlo sem doença, N= 20 casos) 1.2 Os critérios clínico-histológicos de EE incluem: 1) presença de >15 eosinófilos/cga no epitélio da mucosa esofágica distal, e proximal; 2) ausência de infiltração significativa por eosinófilos, nas mucosas gástrica e duodenal; 3) exclusão de DRGE baseada em pHmetria e ausência de resposta à terapêutica com inibidores da bomba de protões.

1.3 Avaliação histopatológica: cortes finos (4 µm), seriados, de fragmentos de cada biopsia, fixados (logo após a colheita) em formol tamponado a 10%, processados segundo técnica histológica convencional, incluídos em parafina e corados com hematoxilina-eosina (HE). Estes cortes serão avaliados retrospectivamente, por um patologista experiente, sem conhecimento prévio do diagnóstico.

2. Execução técnica

Mário Alberto Ferreira Maia Matos Catarina Isabel da Silva Talina 2.1 Técnica histológica convencional: Serão utilizados fragmentos de biopsia da porção distal do esófago, fixados (logo após a colheita) em formol tamponado a 10%, processados em concentrações crescentes de álcool e impregnados e incluídos em parafina. Para avaliação histológica será efectuada a coloração de hematoxilina - eosina(HE) 2.2 Técnica de histoquímica (TH): Periodic acid Schiff (PAS) após diastase (para exclusão de microorganismos) e Tricrómio de Masson (para avaliação da fibrose na lâmina própria subepitelial). 2.3 Técnica de imunohistoquímico (IHQ): Serão subsequentemente submetidos a uma técnica de imunomarcação em cortes de 2 µm de espessura, utilizando os anticorpos primários descritos no quadro 1, com detecção pelo método indirecto do polímero com peroxidade e 3,3’-diaminobenzidina (DAB). Quadro 1. Anticorpos primários para o estudo Imunohistoquímico

Anticorpo Célula reactiva

Anti-Triptase monoclonal (clone AA1) Mastócito

PRG-2 (clone BMK-13) “Major basic protein” dos eosinófilos (MBP)

Anti-CD3 Linfócitos T

Amti-CD20 (clone L26) Linfócitos B

Anti-CD8 (Clone 144-B) CD8+

Anti-CD4 CD4+

Anti-FOXP3 FoxP3

Anti-Ig E policlonal CélulasIgE+

Anti-IL-5 (clone:9906) IL-5

Anti-CCL-26/Eotaxin 3 (clone:115002) Eotaxin-3

Anti-periostin periostin

Anti-IL-13 IL-13

TGF-ß1

3. Leitura.

Ana Maria Gil Vaz Osório Palha António Joaquim Teixeira Alves 3.1 Caracterização dos achadoshistopatológicosna totalidade dos cortes corados com HE

Microabcessos de eosinófilos Hiperplasia da camada basal

Eosinófilos na superfície do epitélio Alongamento das papilas

Descamação epitelial Dilatação do espaço intercelular

3.2Contagem do infiltrado celular exclusivamente efectuada no epitélio pavimentoso estratificado, nos cortes coradoscom hematoxilina-eosina e imunohistoquímicaem 3 cga (x40)/ selecção dos campos com maior densidade de células. Resultados expressos emnº máximo, mínimo e médio de células /cga.

HE Eosinófilos

IHQ Mastócitos Linfócitos T (CD3 +;

CD8+)

Linfócitos B (CD20)

Células Tregs (CD8+ e

FOXP3)

Citoquinas (IL5; IL13;

TGF- ß; Eotaxina-3)

Células IgE+

3.3Avaliação semiquantitativada presença de“Majorbasicprotein” dos eosinófilos (MBP) indicador de desgranulação de eosinófilos Graduação

0 ausência de desgranulação

+ <10% de eosinófilos com desgranulação

++ 10-50% de eosinófilos com desgranulação

+++ > 50% de eosinófilos com desgranulação

Resultados expressos em ausente, ligeiro (+), moderado (++) e intenso (+++). 3.4Avaliação do padrão de fibrose subepitelial (lâmina própria) pelo método de Tricrómio de Masson, avaliando a intensidade de marcação, de forma semiquantitativa, em toda a extensão da lâmina própria. Avaliação da intensidade da marcação de periostin, na lâmina própria, de forma semiquantitativa. Graduação Fibrose Subepitelial Marcação de periostin

0 ausência de fibrose ausência de marcação

+ <10% de fibrose subepitelial <10% de marcação celular de periostin

++ 10-50% de fibrose subepitelial 10-50% de marcação celular de periostin

+++ > 50% de fibrose subepitelial > 50% de marcação celular de periostin

Resultados expressos em ausente, ligeiro (+), moderado (++) e intenso (+++). 3.5Análise estatística: serão comparados os achados histológicos, nos três grupos, de forma idependente da clínica; será avaliada a densidade de eosinófilos, mastócitos e de linfócitos T e B no epitélio e comparada nos três grupos; será avaliada a densidade de marcação para PGR-2 e comparada nos três grupos; será avaliada a intensidade da fibrose subepitelial nos três

grupos; o coeficiente de correlação de Spearman’s, será calculado para avaliar as correlações entre variáveis numéricas.

4. Análise dos resultados

Ana Isabel Gouveia Costa da Fonseca Lopes Ana Maria Gil Vaz Osório Palha António Joaquim Teixeira Alves

Equipa do Projecto (referir as atribuições de cada elemento da equipa no projecto, em particular o papel e as actividades) (max 4000c)

Nome Função Grau académico

António Joaquim Teixeira Alves Investigador principal Mestrado

Ana Isabel Gouveia Costa da Fonseca Lopes

Investigador Doutoramento

Ana Maria Gil Vaz Osório Palha Investigador Licenciatura

Mário Alberto Ferreira Maia Matos Técnico Licenciatura

Catarina Isabel da Silva Talina Técnico Licenciatura

Resultados Previsiveis: (max 4000c)

Contribuições esperadas:

1. Caracterização morfológica detalhada da EoE em idade pediátrica;

2. Identificação de padrões histológicos e / ou imunohistoquimicos distintintivos entre a EoE e

Esofagite de Refluxo, com potencial aplicabilidade na prática clínica ao diagnóstico diferencial

entre as duas entidades.

3. Contribuição para a o conhecimento da etiopatogénese da EoE e em particular do papel dos

eosinofilos e mastócitos.

Estas contribuições poderão traduzir-se especificamente pela confirmação dos seguintes

achados nos casos de EoE relativamente aos grupos de controlo:

- Maior densidade de eosinófilos na porção mais superficial do epitélio, presença de

microabcessos de eosinófilos, presença de células pavimentosas descamadas,

- Maior número intraepitelial de eosinófilo, mastócitos, de células T reguladoras e células B .

- Maior quantidade de depósitos epiteliais de EDGPs.

- Fibrose mais intensa na lâmina própria subepitelial.

- Expressão aumentada de periostin e de eotaxin-3/CCL26, na lâmina própria.

- Níveis aumentados de IL-13, IL-15 e TGF-beta 1, no epitélio e na lâmina própria

Implicações Éticas (max 4000c)

O estudo não tem implicações éticas específicas (casos seleccionados do arquivo do

Departamento de Anatomia Patológica, de modo retrospectivo; protocolo de abordagem

diagnóstica convencional).

Será pedida autorização à comissão de ética da FMUL e ao Concelho de Administração do

HSM-CHLN

Proposta de Orçamento:

Aquisição de equipamentos: Será utilizado o equipamento existente nos respectivos serviços

Aquisição de Serviços:

Estudo estatístico: 500 EUROS

Despesas Correntes:

Material/Reagente Valor

Lâminas (1000) 490,00 €

Rabbitanti-IgE (Poli) 300,00 €

Mouse anti-IL-5 (9906) 250,00 €

Mouseanti- CCL-26/Eotaxina 3 (115002) 250,00 €

Mouse anti-PRG-2 (BMK-13) 804,00 €

Mouse anti-TGF-b (TB21) 440,00 €

Rat anti-IL-13 (JES10-5A2) 256,00 €

Rabbit anti-rat (para IL-13) 300,00 €

Rabbitanri-periostin (Poli) 350,00 €

Mouse anti-CD4 (4B12) 350,00 €

Mouse anti-CD8 (1A5) 350,00 €

Mouse anti-FOXp3 (22510) 350,00 €

Total 4.490,00 €

Deslocações: nenhuma

Despesas gerais (justificar): as despesas serão com os anticorpos necessários para o

estudo

Total: 5.000 euros

Referências bibliográficas: (max 4000c)

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26Blanchard C, Wang N, Stringer KF, Mishra A, Fulkerson PC, Abonia JP, et al. Eotaxin-3 and a

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