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Informe de
Técnicas de
Aglutinación
por
Miguel Angel Figueroa Núñez
Inmunología Clínica
TM. Marcelo Ramirez Sandoval
1
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN 2
¿DE QUE SE TRATA LA TECNICA DE ELECTROFORESIS PARA PROTEÍNAS? 2
¿CÓMO FUNCIONA? 2
SU UTILIDAD EN LA INMUNOLOGÍA CLÍNICA 3
OBJETIVOS 3
MATERIALES Y METODOS 4
MATERIALES UTILIZADOS 4
METODO OCUPADO 4
CONTROL DE CALIDAD 5
INTERPRETACIÓN 6
RESULTADOS OBTENIDOS 6
VALORES DE REFERENCIA 9
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 10
INTERPRETACIÓN Y ANALISIS DE LOS RESULTADOS 10
SIGNIFICADOS CLÍNICOS 11
DISCUSIÓN Y CONCLUCIÓN 12
BIBLIOGRAFÍA 13
2
INTRODUCCION
¿QUÉ SON LAS TECNICAS ELECTROFORETICAS PARA
PROTEÍNAS?
Por mucho y desde el descucbrimiento de la tecnica de electroforetica que hemos tratado
de maximisar su uso para el diagnostico de patologias y revelarnos nuevas aristas acerca
de quienes somos y como funciona nuestro cuerpo.
En esa misma arista que desde hace un tiempo hemos utilizado esta tecnica para el campo
de la inmunología, con el fin de describir y descubrir el desarrollo de enfermedades
infecciosas y procesos crónicos que hoy son tratables a traves de la identificación y
pesquiza de los elementos que son de importancia inmunoclínica.
La electroforesis es el movimiento de partículas (o moléculas) que son separadas de
acuerdo a su carga neta en presencia de un campo eléctrico aplicado externamente. La
eficiencia de una corrida electroforética dependiente de varios factores como pH y fuerza
iónica de la solución buffer, soporte, voltaje aplicado y del calor generado en el proceso
(temperatura).
¿CÓMO FUNCIONAN?
Se basa en la propiedad de las proteínas para ser separadas de acuerdo con sus respectivas
cargas eléctricas a un pH 8,8 sobre una placa de acetato de celulosa o gel de agarosa usando
tanto las fuerzas electroforéticas como electroendosmóticas presentes en el sistema.
Después que se separen las proteínas la placa se coloca en una solución de ácido
sulfosalicílico y de ácido tricloroacético (para inmovilizarlas) y colorante Rojo Ponceau S
(para teñir las bandas de proteínas). La intensidad de coloración tiene relación con la
concentración de proteínas. Después de la deshidratación en metanol, el fondo de la placa
se convierte en transparente por el tratamiento con una solución de limpieza.
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SU UTILIDAD EN LA INMUNOLOGÍA CLÍNICA
Su utilidad es gigantesca, pudiendo ser parte del rol diario de un laboratorio, pero además
es decidora en cuanto a patologías como Hiperinmunoglobulinemias o desnutrición, o
sindrome nefrotico. Todo depende del liquido que se use para su analisis y del cual el
medico sospecha de un acercamiento a la alamnesis del paciente.
Es importante destacar que a pesar de lo sofisticado que hoy es el metodo por el uso de
lectores computarizados con la interpretación de cada banda como un valor aproximado en
mg/dL. Este debe ser acompañado de otros analisis, ya que por si solo no contribuye como
criterio diagnostico y el tecnologo debe estar atento a que esta tecnica es una contribucion
a la ayuda de esclarecer una patología, o simplemente el segumiento de algún tratamiento.
OBJETIVOS
1. Utilizar la técnica de electroforesis para separar las diferentes regiones de
proteínas séricas en muestras problemas, y así ayudar en el diagnóstico de
gamapatías monoclonales y otras patologías.
2. Identificar los diferentes patrones electroforéticos de diagnóstico clínico mediante
la utilización de muestras clínicas patológicas.
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MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES UTILIZADOS
INSUMOS
Electra HR buffer (cat. n° 5805), Tris-Barbital-Barbital sódico pH 8.6 - 9.0
Proveedor Diagnostico Ltda.)
Placas Acetato celulosa Titan III n° catalogo 3023 Diagnostico Ltda.)
Ácido Acético Glacial n° catalogo 1.00063.2500
Metanol n° de catalogo 1.06009.2500
Probeta de 100 mL.
Papel filtro
Contenedores plásticos
Guantes
Tijeras
Pinzas
Horno o Estufa para secado
Micropipeta de 20 a 200 uL
EQUIPOS
Densitómetro
Fuente de poder
Cámara de Electroforesis
METODO OCUPADO
PRUEBA ELECTROFORETICA PARA LA
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
PROCEDIMIENTO
1. Sumergir lentamente la placa a utilizar en buffer barbital pH 8.6 por 15 min.
Aproximadamente.
2. Preparar la cámara de electroforesis: poner aproximadamente 100 ml. en cada
uno de los compartimentos exteriores de la cámara de incubación.
3. Sumergir dos papeles filtros en el buffer para humedecerlos y utilizarlos como
puentes entre la placa y el buffer, pegar cuidadosamente, sin que queden burbujas
en las paredes interiores,
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4. Verificar que queden sumergidos en el buffer. Cubrir la cámara para evitar
evaporación.
5. Poner 10 ul de cada una de las muestras de suero u orina en cada pocillo del porta
muestras (hasta 7 muestras más un control de calidad interno)
6. Sacar placa, y secar entre dos papeles filtros o blotters, y cortar esquina superior
izquierda, para indicar lado de aplicación de muestras. Colocar gota de buffer en
base del soporte y colocar la placa sobre este.
7. Aplicación de la muestra: presionar el aplicador 3 - 4 veces sobre la muestra y
luego probar aplicando en un papel. Si es correcto volver a tomar muestra y cargar
la placa centralmente, dejar presionando aproximadamente 5 segundos.
8. Control de Calidad: Colocar en cada corrida electroforetica en la posición nº 8 un
control, normal o bajo, registrar
9. Electroforesis: Colocar la placa con el acetato de celulosa hacia abajo, como es
aplicación central, no es necesario dirigirla hacia el cátodo.
10. Esperar 30 segundos y colocar voltaje 180 volts por 15 minutos, después de 2
minutos de haber estado la placa en la cámara (aproximadamente 5mAmp.).
11. Tinción: Colocar en rojo ponceau por 6 minutos.
12. Desteñir en ácido acético al 5 % por 2 minutos agitando, volver a lavar en ácido
acético al 5% por 2 Minutos.
13. Deshidratar colocando la placa en metanol absoluto por 2 minutos, dos veces.
14. Preparar solución de Clear Aid:
i. 30 partes Ac. Acético glacial
ii. 70 partes metanol absoluto
iii. 4 partes Clear Aid.
iv. Mezclar bien, estable a 15 - 30 °C
15. Transparentar la placa en Clear aid por 8 minutos.
16. Secar en horno o estufa a 37°C por 10 minutos. O a temperatura ambiente.
CONTROL DE CALIDAD
Como se menciona anteriormente el control de calidad se debe colocar en cada corrida
electroforética en la posición nº 8 como Control Normal.
También es importante considerar estos puntos:
• Calidad de resolución de la técnica de electroforética (Separación de
las bandas).
• Capacidad para detectar bandas inusuales.
• Ser metódico en el uso de los materiales para esta técnica y así
observar una buena corrida electroforética.
• Seguir las instrucciones de la técnica.
• Tener precaución con el tiempo que las muestra biológicas están
expuestas después de aplicarlas al pocillo ya que se pueden secar y
no serán visibles.
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INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.
Lectura: Leer la placa en densitómetro a 525 nm.
Análisis: Después de Escanear corrida electroforética, interpretar y analizar.
INTERPRETACIÓN
RESULTADOS OBTENIDOS
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
MUESTRA N°1
1 2 3 4 5 6 7 C
7
MUESTRA N°2
MUESTRA N°3
8
MUESTRA N°4
MUESTRA N°5
9
MUESTRA N°6
MUESTRA N°7
Como observamos en las anteriores imágenes, cada banda fue interpretada por su
intensidad de color y fue interpretada bajo una concentración lo que nos servirá comparar
los valores de proteínas totales y el patrón electroforético.
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VALORES DE REFERENCIA
FRACCIONES (g/dL) NORMAL
Albumina 3,0-5,0
Alpha 1 0,2-0,6
Alpha 2 0,5-1,1
Beta 0,6-1,2
Gamma 1,0-2,0
Proteínas Totales 6,7-8,8
IgA 70-400 mg/dL
IgG 700-1600 mg/dL
IgM 40-240 mg/dL
INTERPRETACIÓN Y ANALISIS DE LOS RESULTADOS
Con respecto a la muestra n° 1 podemos observar que existe un claro peack en la zona de
la fracción Gamma y el analizador nos dijo que el valor de esta aumento a 3,3 g/dL lo que
nos dice que en este trazado se observó un SMC (Spike Monoclonal Component), en la
región Gamma).
Las proteínas Totales de estas muestras observamos un aumento de 9,0 cuando su valor de
referencia máximo es de 8,8.
Respecto a sus distintos componentes Inmunoglobulinicos, IgA (<50 mg/dL) e IgM (<25
mg/dL) están bajas a comparación de IgG que está sumamente alta. (3490 mg/dL).
Por el contrario la muestra 2 es totalmente normal y esta bajo los rangos de referenica.
En la muestra n°3 nuevamente nos encontramos con un SMC Gamma que de 3,8 g/dL y
así aumentando los valoresde Proteninas Totales.
La muestra n°4 muestra una hipoalbuminemia y una hipergamaglobulinemia difusa,
explicada por los valores de las 2 primeras bandas son bajos, sin embargo existe un peack
monoclonal que eleva los valores. También mostro altos valores de IgA y IgG.
Continuando con el análisis en la muestra n°5 observamos un SMC en la región Gamma y
un aumento de IgG e IgM.
Siguiendo con la muestra n°6 observamos una hipoglobulinemia con un déficit notable de
IgG. Por consiguiente observamos además una disminución de las Proteínas Totales.
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Para finalizar podemos ver en la muestra n°7 un SMC gammaclonal, donde observamos
las 3 fracciones bastante elevadas, estas corresponden a un 10,1 % de las muestra.
SIGNIFICADOS CLÍNICOS
La disminución de la proteína total puede indicar:
Cirrosis
Desnutrición
Síndrome nefrótico
Enteropatía gastrointestinal por pérdida de proteínas
El aumento de las proteínas alpha-1 globulina puede deberse a:
Enfermedad inflamatoria aguda
Cáncer
Enfermedad inflamatoria crónica (por ejemplo artritis reumatoidea, LES)
La disminución de las proteínas alfa-1 globulinas puede ser un signo de:
Deficiencia de alfa-1 antitripsina
El aumento de las proteínas alfa-2 globulinas puede indicar:
Inflamación aguda
Inflamación crónica
La disminución de las proteínas alfa-2 globulinas puede indicar:
Hemólisis
El aumento de las proteínas beta globulinas puede indicar:
Hiperlipoproteinemia (por ejemplo, hipercolesterolemia familiar)
Terapia de estrógenos
La disminución de las proteínas beta globulinas puede indicar:
Trastorno de coagulación congénito
Coagulopatía de consumo
Coagulación intravascular diseminada
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El aumento de las proteínas gama globulinas puede indicar:
Mieloma múltiple
Enfermedad inflamatoria crónica (por ejemplo, artritis reumatoidea, LES)
Hiperinmunización
Infección aguda
Macroglobulinemia de Waldenstrom
Enfermedad hepática crónica
DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN
Como se observó en las imágenes anteriores y en la electroforesis realizada anteriormente
podemos darnos cuenta de distintas elevaciones y disminuciones que pueden ser explicadas
por diversas patologías así como en la muestra n°2 observamos un patrón electroforético
normal.
Si bien es cierto en nuestra electroforesis la región 7 y 8 (esta última correspondiente al
control) se fusionaron parcialmente, se logra evidenciar parte de sus diferencias y se
explica que la placa no estuviese lo suficiente seca previo a la aplicación de las muestras y
el control en esa zona, lo que nos indica que el proceso debió realizarse con más cuidado
y aunque esto ocurrió, nuestras muestras pueden interpretarse y valorarse, por lo que
consideramos que el paso práctico tuvo éxito.
Por lo tanto, concluimos que la importancia de esta técnica radica en no solo en los valores
entregados por el equipo, sino también en el cuidado y manejo que tenga el tecnólogo en
la realización de esta técnica, con el fin de asegurar la calidad y la fiabilidad de los
resultados obtenidos.
Es importante remarcar el rol que juega esta técnica en otros campos, como en la
hematología, bioquímica e incluso en la biología molecular. Pero que es en el campo de la
Inmunología clínica donde se ocupa más y donde la valoración y el conocimiento del
Tecnólogo médico a cargo juegan un rol importantísimo en la validación de los resultados
y en la interpretación definitiva de estos.
Lo anteriormente expuesto en este informe y lo enseñado en este práctico es solo un
ejemplo más de cómo debemos tener en cuenta el rol que juegan nuestros conocimientos a
la hora de exponer resultados o de analizar un caso, puesto que detrás de las muestras hay
pacientes, y es satisfactorio que las equivocaciones ocurran en el aula, pero al momento de
trabajar debemos abordar esto con la experiencia de que un fracaso no se tratara de una
mala calificación, un fracaso puede significar la muerte o el empeoramiento de la calidad
de vida de un ser humano.
No te frustres de fracasar en la escuela, finalmente es un
campo de pruebas, solo intenta practicar mucho para no
hacerlo en la vida real.
Sir Kent Robinson
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REFERENCIAS
1) Ramirez, Marcelo. Manual de Laboratorio de Inmunología
Clínica. Edición 2013. Santiago, Chile. Pags. 3-6.
2) Gersten, J. Et al. Electroforesis de proteínas en suero. Revisión
2012. Medline Plus. EEUU.
www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003540.htm
3) Rajkumar SV. Plasma cell disorders. In: Goldman L, Schafer AI,
eds. Cecil Medicine. 24th ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier;
2011:chap 193.
4) Figueroa, Miguel. Castro, Eduardo. Fotografías prueba de
electroforesis de proteinas. 2013. Universidad Iberoamericana de
Ciencias y Tecnología, Ramo Inmunología Clínica.
5) Imagen Introducción obtenida a traves de Google:
http://oldearth.files.wordpress.com/2008/10/electroforesis-de-
proteinas5.jpg
