ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA KUMARIN DARI TANAMAN

ARTIKEL

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA KUMARINDARI TANAMAN ARTEMISIA ANNUA (L).

Ani Isnawati,* Harfia Mudahar,* Kamilatunisah**

AbstractThe invention of new entity from plant was the basic step for chemistry and another sciencesdevelopment, such as: pharmacy, biology, and medical. Besides that, it is needed to fulfill people needson food, medicine, cosmetics, etc. Coumarine is fenilpropanoid that has biological activity to stimulateskin pigmentation, influence enzyme activity, anti coagulant, anti microbial and inhibition ofcarcinogenic effect. One of the plants that contain coumarine is Artemisia annua L, because of that weinterested in isolating coumarine and it's derivate in Artemisia annua L with expectation that studyresulted in discovering anti cancer agent. The method that we use is extraction and soxhletation usingmethanol and fractionation using dichloromethane. The separation was done by columnChromatography with silica gel and eluent n-hexane:etil acetate. Purification was done byrecrystalization. Isolate is identified using KLT, GC-MS, Spectrophotometer UV, IR and NMR. Thisstudy shows that isolate was coumarine named 2H-l-Benzopyran-2-one, 7-hydroxy-6-methoxy orScopoletin with molecular weight 192

Keywords: Coumarine, Artemisia annua L, TLC, FTIR, GC-MS, NMR

Pendahuluan

T umbuhan merupakan penghasil puluhanjenis senyawa organik yang digunakansebagai sumber penghasil senyawa-

senyawa berkhasiat. Penemuan senyawa-senyawaaktif baru dari tumbuhan di samping merupakandasar untuk perkembangan ilmu kimia, juga telahmemacu berkembangnya disiplin ilmu yangterkait, seperti: farmasi, biologi, kedokteran, danilmu yang lainnya. Kecuali itu juga dapat meng-hasilkan senyawa-senyawa kimia yang dapatdimanfaatkan oleh masyarakat untuk memenuhikebutuhannya seperti bahan makanan, obat-obatan, zat pewangi, dsb.1

Pemanfaatan tumbuhan sebagai penghasilsenyawa-senyawa kimia aktif baru yang unik danpotensial secara ekonomi selalu menarik perhatianahli kimia organik dan alam, mengingat jumlahdan varietasnya yang demikian banyak. Dari

semua itu sebagian belum diketahui kandungansenyawa aktifnya. Oleh karena itu penelitiansenyawa aktif yang sistematis terhadap tumbuhanperlu dilakukan dalam rangka memanfaatkan danmengembangkan lebih lanjut senyawa tersebut.1

Kumarin merupakan golongan senyawafenilpropanoid yang memiliki cincin laktonlingkar enam dan memiliki inti 2H-l-benzopiran-2-on dengan rumus molekul C9H5O2.2 Kumarindan rurunannya banyak memiliki aktifitas biologisdiantaranya dapat menstimulasi pembentukanpigmen kulit, mempengaruhi kerja enzim, anti-koagulan darah, antimikroba dan menunjukkanaktifitas menghambat efek karsinogen.3 Di sisilain senyawa turunan kumarin polisiklik aktifsebagai antikarsinogen yang disebabkan hidro-karbon aromatik polisiklik karsinogen seperti 6-metil (a) piran.4

* Puslitbang Biomedis dan Farmasi** Universitas Tujuh Belas Agustus

Media Litbang Kesehatan Volume XVIII Nomor 3 Tahtm 2008 107

Salah satu tanaman yang mengandungkumarin adalah Artemisia annua L Artemisiaannua L yang dikenal sebagai sweet annie atauannual wormwood. Tanaman herba asli Cina yangdikenal sebagai qinghao5 ini sudah dibudidayakandi banyak negara seperti Argentina, Bulgaria,Francis, Hongaria, Romania, Italia, bekasYugoslavia, Spanyol dan USA.6 Tanaman ini kiniherba Artemisia annua L telah dibudidayakan diBalai Penelitian Tanaman Obat (BPTO) Tawang-mangu.

Dari data literatur herba Artemisia annua Lberkhasiat sebagai antimalaria, antibakteri, anti-inflamasi, antitumor dan antipiretik, dan dinyata-kan mengandung senyawa terpenoid, flavonoid,kumarin, artemisinic acid, artennuin B, fenol,saponin dan lemak.5

Tertarik akan kandungan kimia danaktivitas farmakologi senyawa kumarin danturunannya, maka dilaksanakan isolasi senyawakumarin yang terdapat pada herba Artemisiaannua L. yang berasal dari BPTO Tawangmangudengan harapan kedepan,kumarin hasil isolasi inidapat ditelti untuk mengetahui efek farmako-logisebagai anti-kanker.

Bahan dan CaraBah an

Bahan yang digunakan dalam penelitian iniadalah simplisia herba Artemisia annua L. yangsudah siap panen. Pelarut untuk ekstraksidigunakan metanol, n-heksan dan diklormetan.Selain itu, digunakan pula aqua destilata, asamsulfat pekat, asam asetat anhidrat, ammoniumhidroksida, asam asetat 10%, asam klorida 2 N,alkohol, besi (III) klorida, asam klorida pekat,kalium hidroksida, logam magnesium, kaliumbromida, etil asetat (didestilasi ulang), kloroform(p.a), metanol (p.a), pereaksi mayer, dragendorf,plat silica gel 60 GF254 E Merck, silica gel 60.

AlatPeralatan yang digunakan adalah alat

soxhlet beserta pendingin balik, alat destilasi, danrotary evaporator, serta peralatan gelas yanglazim digunakan dalam laboratorium. Untukkeperluan identifikasi digunakan : GC-MS,Spektrofotometer UV,FT-IR, 13C NMR dan ]HNMR.

Cara Kerja1. Pengambilan sampel

Sampel diambil dari perkebunan BPTOTawangmangu Solo, dikumpulkan sewaktu

tanaman berbunga umur sekitar 6 bulan. Bahansimplisia yang telah dibersihkan dari kotoran,diiris, kemudian dikeringkan dengan caramenjemur terlindung dari sinar matahari langsungdan setelah kering simplisia di serbuk denganmenggunakan blender dan diayak melalui ukuran40 mesh.2. Determinasi tumbuhan

Determinasi tumbuhan dilakukan di BPTOTawangmangu Solo Jawa tengah,3. Pemeriksaan shrining fitokimia

Pemeriksaan pendahuluan ini meliputipemeriksaan golongan alkaloid, fenol, flavonoid,minyak atsiri, lemak/lipid, saponin, dan steroid/triterpenoid dan kumarin. Berikut ini carakerjanya.7'8'9

a. Pemeriksaan AlkaloidAlkaloid terdiri dari 2 bentuk, yaitu dalam

bentuk basa larut dalam pelarut semi polar,sedangkan dalam bentuk garam larut dalampelarut air. Ekstrak kental yang telah diencerkandengan metanol ditambahkan HC1 2N. Jika tidakbening maka ditambahkan NH4OH + CHC13 laludikocok, diambil lapisan kloroform. Kedualarutan baik yang jernih maupun yang tidak jernihditambahkan HC1 2N lalu dikocok dan diambillapisan air kemudian dibagi dalam 3 tabung dandiuji, dengan pereaksi mayer terbentuk endapanputih, dengan dragendorf terbentuk endapancoklat/jingga, dan dengan pereaksi bouchardadterbentuk endapan coklat.

b. Pemeriksaan FenolEkstrak kental yang telah diencerkan

dengan metanol ditambahkan larutan Besi (III)klorida lalu amati perubahan warna. Jikaterbentuk warna ungu tua menunjukkan adanyafenol.

c. Pemeriksaan FlavonoidEkstrak kental yang telah diencerkan

dengan metanol ditambahkan HC1 pekat danlogam Mg. Jika terbentuk busa berwama merahatau jingga berarti positif tanin. Kemudiandinginkan dan ditambah arnil alkohol, laludikocok. Jika warna merah dan naik keatas berartipositif flavonoid dan jika warnanya tetap dibawah positif tanin dan flavonoid.

d. Pemeriksaan Minyak AtsiriEkstrak kental yang telah diencerkan

dengan metanol ditambah alkohol, sebagianlarutan alkohol diuapkan dan sebagian lagi untukidentifikasi lemak. Jika larutan alkohol yangdiuapkan berbau aromatis maka positifmengandung minyak atsiri.

108 Media Litbang Kesehatan Volume XVIII Nomor 3 Tahun 2008

e. Pemeriksaan Lemak/asam lemakLarutan alkohol sisa pada identifikasi

minyak atsiri diuapkan hingga kering dandilanjutkan penyabunan dengan 10 ml kaliumhidroksida 0,5 N kemudian diuapkan, jika terdapattetesan-tetesan minyak berarti positif mengandungminyak/lemak/asam lemak.

f. Pemeriksaan SaponinEkstrak kental yang diencerkan dengan

metanol dimasukkan ke dalam tabling reaksikemudian ditambahkan air panas, lalu dikocokkuat-kuat selama 10 detik. Terbentuk buih yangmantap selama tidak kurang dari 10 menit setinggi1 - 10 cm. Pada penambahan 1 tetes HC1 2N buihtidak hilang.

g. Pemeriksaan Steroid dan TriterpenoidEkstrak kental yang telah diencerkan

dengan metanol dimasukkan ke dalam tabungreaksi lalu ditambahkan asam asetat anhidrat,ditambah kloroform dan asam sulfat pekat melaluidinding tabung reaksi. Jika terbentuk cincin yangberwarna hijau atau merah berarti positifterpenoid dan jika terbentuk cincin yang berwarnahijau atau biru positif steroid. Ekstrak dalam plattetes ditambahkan asam sulfat pekat ditambahasam asetat anhidrat. Jika warna ungu merah ataucoklat berarti positif terpenoid dan jika warnahijau atau biru positif steroid,

h. Pemeriksaan kumarinEkstrak diuapkan sampai kering tambahkan

air panas dan dinginkan. Setelah dingin bagimenjadi dua tabung. Tabung I diberi ammonia10% dan tabung II sebagai pembanding. Dilihat dibawah lampu UV, jika terdapat fluoresensi kuningkehijauan atau kebiruan berarti positifmengandung kumarin.4. Ekstraksi

Simplisia Artemisia annua L. yang sudahdihaluskan diekstraksi secara soxhletasi denganmetanol, tiap satu jam pelarut metanol digantiagar senyawa yang didapat tidak rusak. Semuasari terekstraksi keluar dapat dilihat pada warnaekstrak terakhir metanol tidak lagi berwarna..Ekstrak metanol yang didapatkan selanjutnyadipekatkan dengan menggunakan rotaryevaporator sampai diperoleh ekstrak kental.Kemudian ekstrak metanol yang didapat dihitungrendemennya.5. Pemisahan

a. FraksinasiEkstrak kental metanol ditambahkan air

panas kemudian difraksinasi dengan n-heksanmenggunakan corong pisah, kocok lalu dipisahkan

antara lapisan rc-heksan dari lapisan air. Lapisanair kemudian difraksinasi dengan diklor metanmenggunakan corong pisah, dikocok laludipisahkan antara lapisan air dengan diklor metan.Fraksinasi dilakukan berulang kali sampai tiap-tiap fraksi terakhir yang didapat jernih. Masing-masing fraksi dipekatkan dengan menggunakanrotary evaporator. Kemudian masing-masingfraksi dilakukan KLT dengan menggunakan eluenn- Heksan: etil asetat dengan perbandingan (4:1),(2:1) dan (1:1).

b. Kromatografi kolomPemisahan kromatografi kolom dilakukan

dengan fase diam silika gel dan fase geraknyayaitu «-heksan: etil asetat secara gradien padaekstrak kental diklor metan.

Mula-mula masukkan kapas pada dasarkolom untuk menyangga fase diamnya. Lalu fasediam (silika) disuspensikan dengan menggunakaneluen (fase gerak) sampai terbentuk bubur silikakemudian dimasukkan ke dalam kolom. Selamaproses pengendapan, kolom kromatografi tersebutdapat diketuk-ketuk pada semua sisi secaraperlahan-lahan agar diperoleh lapisan yangseragam. Keran dapat dibuka atau dirutup selamapenambahan, asal permukaan pelarut tetap diataspermukaan penjerap (fase diam/silika).10'11'12'13'14'15

Ekstrak kental kemudian ditimbangsebanyak 22,69 g digerus bersama fase diam,dimasukkan ke dalam kolom. Setelah itu dielusidengan fase gerak n-heksan : etil asetat denganperbandingan (4 : 1), (2 : 1), dan (1 : 1). Tiap-tiap fraksi yang keluar ditampung denganerlenmeyer 20 ml dan 50 ml. Lalu fraksi dalamerlenmeyer tersebut dipekatkan menggunakanrotary evaporator sampai didapat fraksi yanglebih pekat dari sebelumnya. Kemudian fraksitersebut diujikan pada plat KLT silica gel 60GF254 E Merck dengan eluen yang sama dengansebelumnya. Fraksi yang sama Rf-nya kemudiandigabung menjadi satu fraksi.6. Pemurnian

Kristal yang terbentuk direkristalisasidengan menggunakan pelarut metanolkloroform. Hal ini dilakukan berulang-ulangdengan pelarut yang dapat melarutkan senyawatersebut sehingga diperoleh senyawa murni.7. Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi

a. Secara organoleptisPemeriksaan ini meliputi pemeriksaan

bentuk kristal, warna kekuningan, rasa pahit, danbau agak harum.

Media Litbang Kesehatan Volume XVIII Nomor 3 Tahun 2008 109

b.MetodekimiaTambahkan air panas suhu + 80°C,

kemudian didinginkan. Setelah dingin dibagimenjadi dua tabung. Tabling I diberi ammonia10% dan tabung II sebagai pembanding. Dilihatdibawah lampu UV, jika terdapat fluoresensikuning kehijauan atau kebiruan berarti positifkumarin

c. Metode kromatografiPemeriksaan ini menggunakan fase diam

plat silica gel GF254 dan fase gerak n- heksan : etilasetat (1:1). Sebagai pendeteksi digunakan lampuUV akan terbentuk 1 noda fluorosensi birudibawah lampu UV 366 nm8. Elusidasi struktur

a. GC-MSSetelah pengkondisian alat kromatografi

gas dan spektrometri massa, cuplikan diinjeksikanmelalui lubang masuk cuplikaa Pada suhu tinggicuplikan tersebut akan berubah menjadi gas;bersama gas pembawa pada kenaikan suhukomponen yang mempunyai titik lebur yangsama, secara otomatis data terekam di dalamkomputer. Bandingkan dengan data spektrumyang terdapat pada bank data NIST (NationalInstitute of Standard and Technology).

b. Spektrofotometri Ultra Violet (UV)Pemeriksaan spektrofotometri UV meng-

gunakan ± 1 mg sampel yang dilarutkan denganmetanol (p.a) sampai larut, dan dideteksi meng-gunakan spektrofotometri UV sehingga terlihatpuncak panjang gelombang yang merupakankarakteristik suatu senyawa, kemudian grafikyang terbentuk direkam. Grafik yang terbentuk

menampilkan serapan dan panjang gelombangdari sampel tersebut.

c. Spektrofotometri infra merah (IM)Senyawa yang didapat kemudian dilanjut-

kan identifikasi dengan spektrofotometri inframerah (FT-IR) dengan tujuan untuk mengetahuigugus fungsi apa saja yang terdapat dalamsenyawa. Caranya, cuplikan/sampel dilarutkandengan pelarut kloroform atau karbon tetrakloridaatau karbon disulfida, dan dicatat spektrum darilarutan ini. Larutan biasanya (1 - 5%)ditempatkan dalam sel larutan yang terdiri daribahan transparan. Sel yang kedua berisi pelarutmurni ditempatkan pada berkas sinar.

d. Spektroskopi ]H NMR dan13 C NMRSenyawa dilarutkan dalam deuterochloro-

form (CDCls), kemudian dimasukkan ke dalamtabung dengan sejumlah pelarut dicukupkansampai setinggi ± 5 cm. Setelah itu, dideteksidengan alat spektrofotometri NMR (Varian UnityINOVA 500 MHz NMR).16

Basil PenelitianDeterminasi

Hasil determinasi yang dilakukan di BPTOTawangmangu Solo Jawa Tengah, menunjukkanbahwa tumbuhan ini termasuk ke dalamsuku/famili Asteraceae, genus/marga Artemisiadan spesies Artemisia annua.

SkriningFitokimiaHasil pemeriksaan fitokimia herba

Artemisia annua L., dalam tumbuhan terdapatgolongan fenol, flavonoid, minyak atsiri, lemak,saponin, dan triterpenoid dan kumarin.

label l.Hasil Pemeriksaan Skrining Fitokimia Pada Ekstrak Metanol Herba Artemisia annua L.

No Pemeriksaan golongan Pereaksi Hasil Keterangan1 Alkaloid

2 Fenol3 Flavonoid

4 Minyak atsiri5 Lemak/asam lemak6 Saponin7 Steroid/triterpenoid

8 Kumarin

MayerDragendorfBouchardadFeCl3

HClp + logam Mg, dinginkan + amilalkohol, dikocok.Alkohol, diuapkanAlkoholAir panas 10 ml, dikocok vertikalAsam asetat anhidrat + H2SO4 +CHC13

+NH4OH 10% pada lampu UV

++++

1 endapan# endapan^ endapanUngu tuaMerah tetap di bawah

Bau minyak atsiri-Terdapat tetesan-tetesan minyakBusa stabilCincin merah

Fluoresensi biru


Ekstraksi dan FraksinasiNilai rendemen ekstrak metanol adalah

19,62%. Dari 1100 gram simplisia Artemisiaannua L. yang sudah dihaluskan diperoleh 215,52gram ekstrak kental metanol, sedangkan nilairendemen pada fraksi diklormetan adalah 2,06%.

Ekstrak kental metanol, fraksi n-heksan danfraksi diklormetan yang diperoleh kemudiandilakukan uji KLT dengan fase gerak «-heksan :etil asetat (1 : 1).Gambar dapat dilihat padagambar 1.

Hasil PemisahanPada pemisahan fraksi diklor metan dengan

kromatografi kolom diperoleh beberapa fraksiyaitu fraksi 1(1 - 14), 2(16 - 42), 3(43 - 50), 4(51- 57), 5(58-61), 6(62-70), 7(71-84), 8(885-91),9(92-114), 10(115-170), 11 (171-190), 12(191-220), 13(221-245), 14(246-274), 15(275 - 310),16 (311-339), 17(340-366), 18(367-378), 19(379-390). Dari fraksi-fraksi tersebut diketahui padaperbandingan fase gerak «-heksan : etil asetat (1 :1), yaitu fraksi yang ke-19 diperoleh kristal yangbelum murni. (Gambar 2)

I M H D II M H D

Gambar 1. Kromatogram KLT ekstrak metanol, fraksi «-heksan dan fraksi diklor metanKeterangan :Fase diam = plat silika gel GF254Fase gerak = w-heksan : etil asetat ( 1 : 1 )M = ekstrak metanol, H = fraksi «-heksan, D = fraksi diklor metanI. Dengan mata langsung : warna kuning kecoklatanII.Dengan sinar UV 366 nm : Berfluoresensi himDari hasil KLT diketahui fraksi yang mengandung kumarin terdapat pada fraksi diklor metan.

1 2Gambar 2. Kromatogram KLT Hasil Pemisahan dengan Kromatografi Kolom

pada Fraksi 19 Sebelum direkristalisasi.Keterangan:1. Secara visual: Warna kuning kecoklatan2. Dengan UV 366 nm : Berfluoresensi biru


Hasil PemurnianPemurnian dilakukan dengan cara

rekristalisasi pada fraksi ke-19 menggunakanpelarut campuran metanol dan kloroform. Didapatkristal yang berwarna putih kekuningan yangmengkilat. Hasil KLT dua arah dengan eluen yangberbeda «-hexan : etil asetat ( 1 : 1 ) dankloroform : metanol ( 1 : 1 ) memberikan satunoda yang berwarna kuning kecoklatan dan jikadilihat di bawah lampu UV 366 nm berfluoresensiwarna biru.Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi16'17-18'19'20

a. OrganoleptisHasil pemeriksaan secara organoleptis

menunjukkan bentuk kristal berwarna putihkekuningan yang mengkilat berbau aromatis, rasapahit.b. Metode Kimia

Senyawa kumarin ditambah air panasdengan suhu + 80°C dan didinginkan. Setelahdingin dibagi menjadi dua tabung. Tabung I diberiamonia 10% dan tabung II sebagai pembanding.

Setelah dilihat di bawah lampu UV terdapatfluoresensi biru.c. Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

KLT menggunakan eluen «-heksan : etilasetat ( 1 : 1 ) tinibul satu bercak berwarnakuning kecoklatan, dengan bantuan sinar UV 366nm akan berflorosensi warna biru dan mempunyaihargaRf= 0,523.d. Elusidasi Struktur1. GC- MS

Hasil analisis kromatografi gas spektrometrimassa pada RT 29,23 menit Gambar memberikanpuncak-puncak molekul m/e = 192, yangmenandakan berat molekul dari senyawa tersebutadalah 192. Puncak-puncak fragmentasinyaadalah m/e = 192, 177, 164, 149, 121, 79, 69, dan51.

Setelah dibandingkan dengan data LibrarySearched menunjukkan bahwa senyawa hasilisolasi adalah 2H-l-Benzopyran-2-one,7-hydroxy-6-methoxy (skopoletin) memiliki formula molekulC10H8O3 dan berat molekul 192 dengankesamaan 96%.

II

Gambar 3. Kromatogram KLT Dua Arah Hasil RekristalisasiKeterangan:1. Secara visual2. Secara UV 366 nm

112 Media Litbang Kesehatan Volume XVIIINomor 3 Tahun 2008

Ekstraksi dan FraksinasiNilai rendemen ekstrak metanol adalah

19,62%. Dari 1100 gram simplisia Artemisiaannua L. yang sudah dihaluskan diperoleh 215,52gram ekstrak kental metanol, sedangkan nilairendemen pada fraksi diklormetan adalah 2,06%.

Ekstrak kental metanol, fraksi n-heksan danfraksi diklormetan yang diperoleh kemudiandilakukan uji KLT dengan fase gerak «-heksan :etil asetat (1 : 1).Gambar dapat dilihat padagambar 1.

Hasil PemisahanPada pemisahan fraksi diklor metan dengan

kromatografi kolom diperoleh beberapa fraksiyaitu fraksi 1(1 - 14), 2(16 - 42), 3(43 - 50), 4(51- 57), 5(58-61), 6(62-70), 7(71-84), 8(885-91),9(92-114), 10(115-170), 11 (171-190), 12(191-220), 13(221-245), 14(246-274), 15(275 - 310),16 (311-339), 17(340-366), 18(367-378), 19(379-390). Dari fraksi-fraksi tersebut diketahui padaperbandingan fase gerak «-heksan : etil asetat (1 :1), yaitu fraksi yang ke-19 diperoleh kristal yangbelum murni. (Gambar 2)

1 M H D II M H D

Gambar 1. Kromatogram KLT ekstrak metanol, fraksi n-heksan dan fraksi diklor metanFCeterangan :Fase diam = plat silika gel GF254Fase gerak = w-heksan : etil asetat ( 1 : 1 )M = ekstrak metanol, H = fraksi w-heksan, D = fraksi diklor metanI. Dengan mata langsung : warna kuning kecoklatanII.Dengan sinar UV 366 nm : Berfluoresensi biruDari hasil KLT diketahui fraksi yang mengandung kumarin terdapat pada fraksi diklor metan.

1 2Gambar 2. Kromatogram KLT Hasil Pemisahan dengan Kromatografi Kolom

pada Fraksi 19 Sebelum direkristalisasi.Keterangan:1. Secara visual: Warna kuning kecoklatan2. Dengan UV 366 nm : Berfluoresensi biru


Hasil PemurnianPemurnian dilakukan dengan cara

rekristalisasi pada fraksi ke-19 menggunakanpelarut campuran metanol dan kloroform. Didapatkristal yang berwarna putih kekuningan yangmengkilat. Hasil KLT dua arah dengan eluen yangberbeda «-hexan : etil asetat ( 1 : 1 ) dankloroform : metanol ( 1 : 1 ) mcmberikan satunoda yang berwarna kuning kecoklatan dan jikadilihat di bawah lampu UV 366 nm berfluoresensiwarna biru.Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi161718'1920

a. OrganoleptisHasil pemeriksaan secara organoleptis

menunjukkan bentuk kristal berwarna putihkekuningan yang mengkilat berbau aromatis, rasapahit.b. Metode Kimia

Senyawa kumarin ditambah air panasdengan suhu + 80°C dan didinginkan. Setelahdingin dibagi menjadi dua tabung. Tabung I diberiamonia 10% dan tabung II sebagai pembanding.

Setelah dilihat di bawah lampu UV terdapatfluoresensi biru.c. Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

KLT menggunakan eluen «-heksan : etilasetat ( 1 : 1 ) timbul satu bercak berwarnakuning kecoklatan, dengan bantuan sinar UV 366nm akan berflorosensi warna biru dan mempunyaihargaRf= 0,523.d. Elusidasi Struktur1. GC- MS

Hasil analisis kromatografi gas spektrometrimassa pada RT 29,23 menit Gambar memberikanpuncak-puncak molekul m/e = 192, yangmenandakan berat molekul dari senyawa tersebutadalah 192. Puncak-puncak fragmentasinyaadalah m/e = 192, 177, 164, 149, 121, 79, 69, dan51.

Setelah dibandingkan dengan data LibrarySearched menunjukkan bahwa senyawa hasilisolasi adalah 2H-l-Benzopyran-2-one,7-hydroxy-6-methoxy (skopoletin) memiliki formula molekulC10H8O3 dan berat molekul 192 dengankesamaan 96%.

II

Gambar 3. Kromatogram KLT Dua Arah Hasil RekristalisasiKeterangan:1. Secara visual2. Secara UV 366 nm


FilfJpsracorAcquired

Vlsi Dumber

C,\HPCHf-H\l\BATA1070424-A\02O10OS.OTAJJ4 Apr 07 10:53 u»ina ftiqilechod BftHAUUH

GC/HS B

i4_oo 16-00 is:oo SSM 32-00 2*,«j zs-ye JAW SJ.QO 5290 34-50 34 w Js.oo «.fle «2-» «4w

Gambar 4. Spektrum GC-MS

Gambar 5. Spektrum MS

Tabel 2. Hasil Spektrofotometri UV Senyawa Isolat

Panjang gelombang (nm) Serapan346,0298,0230,0210,0

1,55600,65671,72782,4362


Spektrofotometri UVHasil pengukuran spektrum senyawa isolat

dengan pelarut metanol (p.a) dapat dilihat padalabel 2.

Spektrofotometri FT IRBerdasarkan hasil FT IR dapat diketahui

adanya regang -OH, regang C - O oksiaril,regang C = O terkonjugasi, dan regang C = Cbenzena. Lebih jelasnya dapat dilihat pada label 3dan Gambar 6:Spektrofotometri *H dan 13C NMR

Dari hasil Spektrofotometri !H NMRdiketahui bahwa pada pergeseran kimia 6,20 ppmmuncul satu sinyal doblet dengan konstantakopling J = 1,047 menunjukkan adanya atom Hpada posisi 3 , pada pergeseran kimia 7,85 ppmmuncul satu sinyal doblet dengan konstantakopling J = 1,076 menunjukkan atom H padaposisi 4, pada pergeseran 7,09 ppm muncul satusinyal singlet dengan konstanta kopling J = 1,088menunjukkan atom H pada posisi 5, padapergeseran kimia 4,90 ppm muncul satu sinyalsinglet dengan konstanta kopling .7=1,74menunjukkan atom H pada posisi 7, padapergeseran kimia 6,76 ppm muncul satu sinyal

singlet dengan konstanta kopling J=\ menunjuk-kan atom H pada posisi 8, pada pergeseran kimia3,90 ppm muncul satu sinyal multiplet dengankonstanta kopling 7=3,293 menunjukkan adanyaatom H pada posisi 11.

Sedangkan pada 13C NMR diketahui padapergeseran kimia 164,14 ppm hjuncul satu sinyalkarbon pada posisi 2, pada pergeseran kimia112,62 ppm muncul satu sinyal karbon pada posisi3, pada pergeseran kimia 151,49 ppm muncul satusinyal karbon pada posisi 4, pada pergeserankimia 109,96 ppm muncul satu sinyal karbon padaposisi 5, pada pergeseran kimia 153,06 ppmmuncul satu sinyal karbon pada posisi 6, padapergeseran kimia 146,21 ppm muncul satu sinyalkarbon pada posisi 7, pada pergeseran kimia104,03 ppm muncul satu sinyal karbon pada posisi8, pada pergeseran kimia 147,15 ppm muncul satusinyal karbon pada posisi 9, pada pergeserankimia 112,68 ppm muncul satu sinyal karbon padaposisi 10, pada pergeseran kimia 56,87 ppmmuncul satu sinyal karbon pada posisi 11.

Jika dibandingkan dengan data literaturmaka hasil spektrum 13C NMR dan 'H NMRsenyawa isolat memiliki kemiripan (tabel 4) danGambar 7 dan 8.

Tabel 3. Hasil Spektrofotometri FT -IR Senyawa Isolat

Bilangan gelombang senyawaisolat (cm"1)

Ikatan yang menyebabkanabsorpsi

33371292,114017051607, 1566, 1435

Regang - OHRegang C - ORegang C = ORegang C = C

"V/-40

20

siiS 8; /;,'

4500 4000Ssmpet 385

2500 2000 1500 1000 500Ifcm

Gambar 6. Spektrum FT-IR


Tabel 4.Perbandingan 13 C NMR dan 'H NMR senyawa isolat dengan literatur

No. atomC

234567891011

SC senyawa isolat(ppm)

164,14112,62151,49109,96153,06146,21104,03147,15112,6856,87

8C literatur(ppm)

162116,9145,6113,6145,9142,5109,5144,5121,456,3

5H senyawa isolat(ppm)

-6,20 (d,J= 1,047)7,85 (d,J= 1,076)7,09(^,7=1,088)

*

4,90(5,7 = 4,74)6,76(5, /=!)--3,90 (m,J= 3,293)

5H literatur(ppm)

-6,457,806,97-5,06,56--3.73

K"a!i

Gambar 7. Spektrum 1 H NMR

Gambar 8. Spektrum 13 C NMR


2H-1 -Benzopyran-2-one, 7-hydroxy-6-methoxy

Gambar 9. Struktur Senyawa Isolat

PembahasanPada penelitian ini digunakan herba

Artemisia annua L. yang termasuk Asteraceae.Bahan baku simplisia diperoleh dari tanamanbudidaya BPTO Tawangmangu Solo JawaTengah. Keseragaman umur, masa panen, dangalur (asal-usul, garis keturunan) tanaman dapatdipantau. Hasil determinasi yang dilakukan diBPTO Tawangmangu Solo Jawa Tengahmenunjukkan bahwa tumbuhan ini tennasuk kedalam suku/famili Asteraceae, genus/margaArtemisia annua L. Determinasi dilakukan untukmenghindari kesalahan dalam pengambilansampel.

Sebelum digunakan untuk penelitian,terlebih dahulu herba Artemisia annua L.dilakukan pengeringan dengan cara diangin-anginkan dan tidak terkena cahaya mataharilangsung, karena dikhawatirkan zat-zat berkhasiatyang terkandung didalamnya akan rusak.Pengeringan bertujuan untuk mengurangi kadarair guna mencegah perubahan kimia pada bahan.Setelah pengeringan dilakukan penyerbukan untukmemudahkan pelarut pengekstrak menembus kedalam sel, sehingga ekstraksi lebih sempurna.Penghalusan atau penyerbukan herba Artemisiaannua L. menggunakan blender dan diayakdengan ukuran 40 mesh agar diperoleh hasil yangbaik.

Metode ekstraksi yang dilakukan adalahcara panas yaitu sokhlet, karena pada ekstraksi initerjadi ekstraksi yang kontinyu dengan jumlahpelarut yang relatif konstan dengan adanyapendingin balik, menggunakan pelarut yang selalubaru. Ekstraksi yang digunakan adalah ekstraksilangsung menggunakan pelarut metanol karenametanol merupakan pelarut yang general sehinggasenyawa-senyawa yang terkandung di dalamnyaakan terekstraksi semua.

Ekstrak yang diperoleh dipekatkan denganrotary evaporator sampai didapat ekstrak kental,setelah itu ekstrak kental dilakukan skriningfitokimia. Pemeriksaan ini merupakan pemeriksa-an pendahuluan dimaksudkan untuk memberikangambaran atau mengetahui kelompok senyawayang terkandung dalam herba Artemisia annua L.,kemudian dilakukan uji KLT dan dihitungrendemennya.

Pemisahan ekstrak metanol dilakukandengan dua cara yaitu fraksinasi dan kromatografikolom. Ekstrak kental metanol difraksinasimenggunakan pelarut rc-heksan dan selanjutnyamenggunakan diklormetan. Fraksinasi denganberbagai pelarut dengan kepolaran berbedabertujuan untuk memisahkan senyawa berdasar-kan kelarutannya, sehingga senyawa yang terdapatpada ekstrak dapat larut pada pelarut yang sesuaidengan kelarutannya.

Masing-masing fraksi dilakukan uji KLTmenggunakan eluen n-heksan : etil asetat ( 1:1 ),dari hasil uji KLT diketahui bahwa fraksidiklormetan positif mengandung kumarin denganadanya noda yang dilihat di bawah lampu UVakan berfluoresensi warna biru. Berdasarkanliteratur diketahui bahwa kebanyakan senyawakumarin ternyata aktif terhadap sinar UV, hal inidisebabkan karena kumarin memiliki ikatanrangkap terkonjugasi, dan diketahui sinar serapanUV mampu menyerap suatu ikatan yangterkonjugasi atau memiliki gugus khromofor.Fraksi yang mengandung kumarin dilakukanpemisahan dengan kromatografi kolom, denganmenggunakan fase diam silika gel 60 dan fasegerak «-heksan : etil asetat dengan perbandingangradien (4:1,2:1, 1:1) berdasarkan hasil orientasiKLT.

Hasil pemisahan pada fraksi diklormetandidapat 19 fraksi pada eluen w-heksan: etil asetatdengan perbandingan ( 1 : 1 ), di mana fraksi 19


membentuk kristal yang belum murni, untuk itudilakukan pemurnian dengan cara rekristalisasimenggunakan pelarut campuran metanol -kloroform. Hasil rekristalisasi tersebut diperolehkristal yang berwarna purih kekuningan yangmengkilat dan memiliki satu noda pada uji KLT.Kemudian senyawa tersebut dilakukanidentifikasi.

Hasil identifikasi terhadap senyawa isolatmenggunakan kromatografi gas spektrometrimassa pada RT 29,23 menit memberikan puncak-puncak molekul m/e = 192, yang menandakanberat molekul dari senyawa tersebut adalah 192 .Puncak-puncak fragmentasinya adalah m/e = 192,177, 164, 149, 121, 79, 69, dan 51. Setelahdibandingkan dengan data Library Searchedmenunjukkan bahwa senyawa isolat yang terdapatpada herba Artemisia annua L. adalah 2H-1-Benzopyran-2-one,7-hydroxy-6-methoxy(skopoletin) memiliki formula molekul C10H8O3dan berat molekul 192, merupakan golongansenyawa kumarin, yang memiliki kesamaan 96 %,untuk itu perlu dilakukan identifikasi lagi secaraUV, IR dan NMR.

Karekterisasi senyawa hasil isolasi denganspektrum UV memberikan serapan pada panjanggelombang 346 nm dan 298 nm yang karesteritikuntuk senyawa golongan kumarin.

Elusidasi struktur spektrofotometer inframerah (FT IR) sangat berguna untuk mengetahuigugus fungsi suatu senyawa. Gugus fungsi yangdiperoleh pada FT - IR ini meliputi gugus -OHpada bilangan gelombang 3337 cm"1, C - O oksiaril pada bilangan gelombang 1292 cm"1, C=Oterkonjugasi pada bilangan gelombang 1705 cm"1,dan C=C benzene pada bilangan gelombang 1607cm"1, 1566 cm"1 dan 1435 cm"1. Dimana gugus-gugus fungsi tersebut merupakan gugus-gugusfungsi pada senyawa kumarin.

Untuk dapat memastikan struktur senyawatersebut diperlukan elusidasi struktur denganspektrofotometri 1E dan 13C NMR. Dari hasilspektrofotometri 'H NMR diketahui bahwa padapergeseran kimia 6,20 ppm muncul satu sinyaldoblet dengan konstanta kopling J = 14,07menunjukkan adanya atom H pada posisi 3 , padapergeseran kimia 7,85 ppm muncul satu sinyaldoblet dengan konstanta kopling J = 1,076menunjukkan atom H pada posisi 4, padapergeseran 7,09 ppm muncul satu sinyal singletdengan konstanta kopling J = 1,088 menunjukkanatom H pada posisi 5, pada pergeseran kimia 4,90ppm muncul satu sinyal singlet dengan kc istanta

kopling J = 1,74 menunjukkan atom H pada posisi7, pada pergeseran kimia 6,76 ppm muncul satusinyal singlet dengan konstanta kopling J = 1menunjukkan atom H pada posisi 8, padapergeseran kimia 3,90 ppm muncul satu sinyalmultiplet dengan konstanta kopling J = 3,293menunjukkan adanya atom H pada posisi 11.

Sedangkan pada 13C NMR diketahui padapergeseran kimia 164,14 ppm muncul satu sinyalkarbon yang spesifik untuk ( C = O ), padapergeseran kimia 153,06 ppm dan 56,87 ppmadanya gugus ( C - O - C ), pada pergeseran kimia112,62 ppm,151,49 ppm, 109,96 ppm dan 104,03ppm muncul sinyal karbon ( - C = ), padapergeseran kimia 146,21 ppm muncul sinyalkarbon untuk gugus ( C - OH ), pada pergeserankimia 112,68 ppm dan 147 ppm adanya gugus C.Dari data spektrum !H NMR dan 13C NMRsenyawa isolat dengan literatur skopoletin makasenyawa tersebut memiliki inti cincin yang sama .

KesimpulanBerdasarkan data yang diperoleh melalui

hasil identifikasi secara organoleptis, uji KLT,GC-MS, spektrofotometri UV, FT IR danspektrofotometri 'H dan 13C NMR sertadibandingkan dengan literatur 2H-l-Benzopyran-2-one,7-hydroxy-6-methoxy maka senyawa hasilisolasi yang terkandung di dalam herba Artemisiaannua L merupakan senyawa golongan kumarindengan nama 2H-l-Benzopyran-2-one,7-hydroxy-6-methoxy atau dengan nama lain skopoletindengan bobot molekul 192 dengan strukturmolekul sebagai berikut :

HO

2H-l-Benzopyran-2-one, 7-hydroxy-6-methoxy

SaranPerlu dilakukan uji farmakologi senyawa

tunggal kumarin sebagai antikanker dari herbaArtemisia annua L

Daftar Pustaka1. Ahmad, S.A., E.H. Hakim dan I. Makmur,

1991, Beberapa Upaya Pencarian BahanKimia untuk Senyawa-senyawa Bioaktifdari Tumbuhan Lauraceae Indonesia.Makalah Ilmiah, UNESCO Workshop on


Isolation and Bioactivity Studies in Natural 12.Product Research, Padang: 3-5

2. Murray,R.D.H.,J.Mendes, and SABrow,1982,The Natural Coumarin, John Willeyand Son Ltd,New York

3. Syarif, Amir, Farmakologi dan Terapi, edisi 13.IV, Penerbit: Bagian Farmakolgi FKUI,Jakarta.

4. Kusuma,TS., 1997, Mempelajari Sifat 14.Antikarsinogen Alamiah Turunan Fenol,Kumarin, Kromon, Flavon dan Isokumarin,Jurnal Andalas No. 15, Januari Tahun VI

5. Juliarni Muji dan Ermayanti Muji, 2004,Studi Karakter Anatomi Daun dari KulturTunas Artemisia Annua L Penghasil Obat 15.Antimalaria Artemisin, Tesis, FakultasMatematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,IPB.

6. Bhakuni R.S, P.C.Jain, R.P.Sharma andS.Kumar, Secondary Metabolites of 16.Artemisia annua and Their BiologicalActivity. Current science, vol.80 No.l

7. Banarti, S, 1993, Skrining AktivitasAntibakteri dari Beberapa Tanaman SukuGuttiferae dan Isolasi Senyawa Aktifnya, 17.Tesis, Program Pascasarjana UniversitasAirlangga, Surabaya

8. Anonim, 1987, Analisis Obat Tradisional,Jilid I, Departemen Kesehatan RepublikIndonesia, Jakarta. Hal. 43 - 53 18.

9. Anonim, 2000, Parameter Standar UmumEkstrak Tumbuhan Obat, DepartemenKesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Hal.9-12 19.

10. Gritter R.J., Bobbitt J.M., dan SchwartingA.E., 1991, Pengantar Kromatografi,penerbit: ITB, Bandung. 20.

11. Harborne J.B., 1987, Metode FitokimiaPenuntun Cara Modern MenganalisisTumbuhan, penerbit: ITB, Bandung. Hal. 1-42,184-196

Kartasubrata, 1991, Dasar-dasarKromatografi Lapisan Tipis, SeminarAplikasi TLC Dalam Bidang Obat danMakanan, Puslitbang Kimia Terapan danLembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia : 1-4Johnson, E.L dan R.Stevenson, 1991,Dasar-dasar Kromatogafi Cair, TerjemahanKosasih Padmawinata, ITB, Bandung:365.Sidik dan Mudahar, 2000, EkstraksiTumbuhan Obat, Metode dan Faktor-faktoryang mempengaruhi Muru Produksinya,Presiding Seminar PERHIBA KomisariatJakarta dan Fakultas Farmasi UNTAG 1945Jakarta, Jakarta: 12-15.Banarti, S, 1993, Skrining AktivitasAntibakteri dari Beberapa Tanaman SukuGuttiferae dan Isolasi Senyawa Aktifnya,Tesis, Program Pascasarjana UniversitasAirlangga, Surabaya.Cresswel C.J., Runguist O.A., danCampbell M.M., 1982, alibahasaPadmawinata, Sudiro,!, Analisis SpektrumSenyawa Organik, penerbit: ITB, Bandung.Hal.60-181Silverstein,Basseler and Morrill, 1984,alihbahasa Hartomo.AJ, Purba,A.V,Penyidikan Spektrometrik SenyawaOrganik, Edisi 4, PenerbitErlangga, Surabaya.Ewing, G.W., 1985, Instrumental Methodsof Chemical Analysis, Fifth edition, MeGraw-Hill Book Company, Singapore: 171-172Touschone,J.C,1983, Practice of ThinLayer Chromatography, 2nd Edition, JohnWiley and Sons Inc, Canada : 122-123Pine.S.H.J.B.Hendrikson, dan D.J. Cram.1988, Spektroskopi, Kimia Organik, Edisi I,ITB, Bandung, 147-194


Documents

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA KUMARIN DARI TANAMAN