Közönséges trágyalégy fejlődésére gyakorolt

toxikus hatás vizsgálat

Készítette: Ladoneczki Gábor 2010.11.29.

OECD 228 teszt

2

Bevezetés Ez a teszt vegyi anyagok trágya-függő kétszárnyú

fajokra gyakorolt hatását méri Két fő indikátorfajt alkalmaz rovarirtók

toxicitásának vizsgálatára, a hatások előrejelzésére (többnemzedékes, könnyen tenyészthető, rövid életciklusú rovarok): Scathophaga stercoraria Musca autumnalis

A fauna védelmét szolgálja a trágya szennyezettségétől nagy érzékenységű indikátorfajok segítségével

Ez a két faj nem reprezentálja az összes trágyalakó élőlényt

3

A tesztorganizmusok – Scathophaga stercoraria

Forrás: http://bugguide.net

Kerry S. Matz (2005)

Forrás: http://bugguide.net

Tim Nichols (2004)

4

A tesztorganizmusok – Musca autumnalis

Forrás: http://www.eol.org/pages/730042

BioImages (2007)

Forrás: http://en.wikipedia.org

James K. Lindsey (2006)

5

A teszt alapelve Trágyához köthető életciklusokban történő

fejlődést gátló, befolyásoló hatásokat méri Marhatrágyába jutatott vegyi anyagot vizsgál A trágyába petéket (S. stercoraria) illetve lárvákat

(M. autumnalis) helyezünk tesztelés céljából Lehetséges hatások vizsgálata a tesztorganiz-

musok kifejlődésére (viszonyítás a negatív kontrollhoz)

Végpontok kontrollált körülmények közti mérése

6

Lehetséges mérési végpontok Kifejlődött legyek száma és neme Fejlődésgátlás, a fejlődési rátával kifejezve Alaktani változások:

testméret változása fejlődési rendellenességek stb.

Származtatott végpontok: NOEC ECx

7

A tesztvegyület tulajdonságai Erősen javasolt a következők ismerete:

vízoldhatóság, Kow, gőznyomás, tesztvegyület lebomlási ideje.

Szükséges még a teszt- és referenciavegyületek eredetének, Mennyiségének és tisztaságának ismerete.

Ez a teszt vízoldható vagy gyengén vízoldható anyagokhoz használható

8

Referenciaanyag Ivermectin javasolt

referenciaanyagként Rendszeresen tesztelendő:

ECx meghatározása évi 1-2 alkalommal vagy

Párhozamosan a vizsgált vegyi anyaggal (javasolt)

Új legyek első vizsgálata esetén a referenciaanyag mindig újra tesztelendő

Forrás: http://www.inchem.org

9

Érvényesség A teszt érvényesnek tekinthető ha a kontroll

mintákban: az elhelyezett lárvák kikelése a petékből ≥ 70%

(S. stercoraria) felnőtt egyedek kialakulása a kikelt lárvákból ≥ 70%

(S. stercoraria) felnőtt egyedek kialakulása az elhelyezett petékből ≥ 60%

(M. autumnalis) a felnőtt egyedek kifejlődése elkezdődik 18 ± 2 nap

(S. stercoraria) illetve 13 ± 2 nap alatt (M. autumnalis) Ellenkező esetekben a teszt nem érvényes

(kivéve indokolt esetekben)

10

A szükséges felszerelés Megfelelő méretű edények Pamut anyag a szellőzés biztosítására Szárítószekrény Sztereomikroszkóp Ecset a lávák/peték elhelyezéséhez pH-mérő, fényerősségmérő Hitelesített mérleg Megfelelő eszköz a hőmérséklet szabályozására Megfelelő eszköz a páratartalom szabályozására

11

Trágya kiválasztása és begyűjtése Dokumentált állatorvosi kórtörténettel rendelkező

szarvasmarha-állományból származó, nem szennyezett (gyűjtést megelőzően minimum 8 hétig

gyógyszerészeti készítmény, illetve minimum 5 hónapig féregirtó

használatának mellőzése) marhatrágya. A trágya közvetlenül az állatból vagy a földről (2

órásnál frissebb) gyűjthető. A trágya fagyasztható. A minták víztartalma és pH-ja meghatározandó.

Forrás: http://www.righthealth.com

12

A tesztállatok kiválasztása és előkészítése A trágyalegyek ismert laboratóriumi tenyészetből

szerzendők be. A fajok azonosítása szükséges. Az egyedek forrása és eredete dokumentálandó. A frissen rakott petéket/lárvákat (12 óránál

fiatalabbak) kell a tesztekhez felhasználni.

13

A tesztkörülmények S. stercoraria

T = 20°C ± 2°C Relatív páratartalom (RH) > 60%

(a teszt első fázisában) M. autumnalis

T = 26°C ± 2°C

16:8 órás világos:sötét ciklusok A fényintenzitás a teszt elején feljegyzendő

14

Eljárás – a trágya előkészítése 1/2 A friss vagy a kiolvasztott trágyát homogenizálni

kell ~10 percig A nedvességtartalom megváltoztatása nem

szükséges A nitrogén- és széntartalmat meg kell határozni,

az eljárást fel kell jegyezni

15

Eljárás – trágya előkészítése 2/2 A koncentrációkat száraz tömegre kell megadni Ismert mennyiségű trágya bemérése a keverőbe A tesztelt és a referenciavegyületeket fel kell

oldani vízben vagy szerves oldószerben Majd 10 percig kevertetni kell a rendszert Kontrollhoz az oldószer vagy a víz hozzáadása Oldószer használata esetén minimum 4 óráig

(szobahőmérsékleten) állni kell hagyni, hogy elillanjon

Az alkalmazott vegyi anyagok koncentrációját pontosan meg kell határozni

16

Eljárás – tesztállatok elhelyezése 100 g (frissen mért) trágyát kell elhelyezni az

edényekben úgy, hogy 5—8 cm mély legyen A peték vagy a lárvák szolgálnak a teszt

kezdőpontjaként A lárvák/peték kis csoportokban helyezendők el A vizsgálatig a petéket nedvszívó papíron kell

tárolni 10 lárvát/petét kell elhelyezni a trágya felületén A petéket (S. stercoraria) nedvszívó papírra kell

rakni, hogy kikeljenek, a kikelést követően belemásznak a trágyába

Amikor a M. autumnalis lárvák elmerülnek a trágyába és már nem láthatóak felitatószerrel (száraz vermikulit) kell betakarni 3 cm vastagon

17

Eljárás - megfigyelések Peték alkalmazása esetén a kikelt lárvák

számának meghatározása az elhelyezést követően 48 órával

A tesztidőszak alatt a kifejlett példányok számának, nemének és a túlélésének dokumentálása naponta

Alaktani megfigyelések Kifejlett állatok eltávolítása naponta Kikelés:

S. stercoraria a 18. napra tehető M. autumnalis a 13. napra tehető

A teszt vége 5 nappal az utolsó felnőtt egyed felbukkanását követően

18

A teszt típusa Hatásos koncentrációtartomány keresése

(angolul: Range Finding Test): Ismeretlen toxicitású vegyi anyag esetén Koncentrációk: 0,1; 1; 10; 100 és 1000 mg/kg

(trágya száraz tömege) Kontroll és szerves oldószer esetén oldószeres kontroll

minta Határteszt

(angolul: Limit vagy Definitive Test): Ha NOEC nagyobb az 1000 mg/kg-nál Jellemzően 1000 mg/kg koncentrációban 8 vegyi

anyaggal (plusz 8 kontroll, referencia oldószeres kontroll)

OECD 54-es dokumetum alapján

19

NOEC és ECx meghatározása NOEC

Minimum 5 koncentrációban mérendő 4 párhozamossal és 8 kontrollal javasolt A koncenrációköz ne haladja meg az 1,8-as faktort

ECx

Minimum 12 koncentrációban mérendő Minimum 2 párhuzamos és 6 kontroll javasolt A koncenrációköz 2-es faktornál legyen kisebb, a várt

értékeknél A statisztikai kiértékelés típusa szabadon

megválasztható

20

Jelentés 2/1A teszt végeztével összefoglaló jelentést kell

készíteni, melynek a következőket kell tartalmaznia:

Tesztvegyület: vegyi anyag, referencia anyag és tulajdonságaik

Tesztorganizmusok: felhasznált fajok és kezelésük, koruk az edényekbe való elhelyezéskor

21

Jelentés 2/2 A teszt körülményei:

trágya származása és tulajdonságai, a trágyaszint az edényekben, felhasznált eszközök, hígítási sorok és párhozamosok száma, a tesztelt és felhasznált vegyi anyagok előkészítésének folyamata, a teszt körülményei

Eredmények:kifejlett nőstény és hím egyedek száma (db/nap/edény), százalékos eredmények, élettani elváltozások, fejlődési ráták, kikelési ráták, eredmény a referencia anyagra viszonyítva, eredmények numerikus és grafikus formában, végpontok meghatározása

Az eredmények értékelése:érvényesség-vizsgálat, az eredmények értékelése, levont következtetések

22

Forrás OECD Test No. 228: Determination of

Developmental Toxicity of a Test Chemical to Dipteran Dung Flies (Scathophaga stercoraria L. (Scathophagidae), Musca autumnalis De Geer (Muscidae))http://puck.sourceoecd.org