Metabolizam ksenobiotika

ksenobiotik (gr. xenos stranac) je supstancija koja je strana tijelu

Produktimikrobnesinteze

KemikalijePušenje

Brza hrana, a posebno ona s roštilja

Lijekovi

Osnovna podjela ksenobiotika od medicinskog značaja:

1. lijekovi2. kemijski karcinogeni3. različiti toksikanti (pesticidi)

Značaj u biomedicini

Poznavanje metabolizma ksenobiotika je izuzetno važno u razumijevanju

farmakologijetoksikologijeistraživanja rakauvođenja lijekova u kliničku praksu

"Kemikalije koje nas okružuju nisu ništa manje pogubne za život no što je to bila toljaga pećinskog pračovjeka“

Rachel Carson

l Postoji više od 200.000 kemikalija u okolišu proizvedenih od strane čovjeka.

l Mnoge od tih supstancija se metaboliziraju (kemijski mijenjaju) u tijelu čovjeka, gdje je jetraglavni organ uključen njihov metabolizam.

l Neki od ksenobiotika izlučuju se nepromijenjeni.

ApsorpcijaDistribucijaMetabolizamEliminacija

farmakokinetičkadostupnost

6

Ulazak ksenobiotika u organizam preko gastrintestinalnog trakta

U jetri se događaju brojne metaboličke transformacije.

Metabolizam preobražaja ksenobiotika se može podijeliti u 2 faze:

l Faza 1.:Reakcije oksidacije su jedne od najvažnijih reakcija pri transformaciji ili preobražaju ksenobiotika.

Provode ih: CITOKROM P-450 VRSTE (MONOOKSIGENAZE)

Ti enzimi mogu katalizirati i reakcije deaminacije, dehalogenacije, desulfuriranja, epoksidacije, peroksigenacije i reakcije redukcije.

Faza 2.:

nakon faze 1 - hidroksilirane ili na neki drugi način promjenjene supstancije prevode pomoću specifičnih enzima u različite polarne metabolite reakcijama:

1. konjugacije s glukouronskom kiselinom, sulfatima, acetatima, glutationom ili s nekim aminokiselinama

2. metilacijom

l Glavna svrha provođenja faze 2. u metabolizmu ksenobiotika je:l povećanje njihove polarnosti ( topljivosti u vodi), a time je olakšano i

izlučivanje iz organizma.

l Hidrofobni ksenobiotici koji se ne mogu prevesti u polarni oblikzadržavaju se u adipoznom tkivu.

Citokrom P-450

l citokrom-P450 potječe od apsorpcijskog maksimuma u vidljivom području pri valnoj duljini od 450 nm koji je dobiven pripravom mikrosoma koji su prethodno kemijski reducirani, a zatim izloženi djelovanju ugljikovog monoksida.

l Mikrosomi sadrže fragmente endoplazmatske mrežice gdje su smješteni mnogi citokromi P450

10

Citokromi P450Nad-obitelj enzima citokroma P450 ima ključnu ulogu u

metabolizmu ksenobiotika.

Gotovo se svi ksenobiotici transformiraju u organizmu pomoću tih enzima.

Enzimi CYP P450 su izuzetno strukturno polimorfni(razlike su nađene u kodirajućoj regiji)

Citokrom p-450 su velika obitelj koja imaju u svom sastavu hem, i kataliziraju reakcije tipa:

RH + O2 + NADPH + H+ → R-OH + H2O + NADPH (1)

RH – različiti lijekovi, karcinogeni, zagađivači ili neke endogene supstancije kao što su steroidi i brojni drugi lipidi

Reducirani citokrom p-450 → Oksidirani citokrom p-450RH + O2 → R-OH + H2O (2)

11

Metabolizam ksenobiotika uz CYP (citokrom P450)

Tijekom prvog prolaska kroz jetru događaju se ekstenzivne kemijske transformacije lipofilnih ili teških (MW >500) spojeva. Oni postaju značajno hidrofilniji i prema tome lakše se mogu izlučiti.

CH3 COOHO N

H

COOH

phase I phase II

CYP enzimi sudjeluju u reakcijama monoksigenacije

12

Metabolizam uz CYP

Monoksigenacija supstrata

Drug-RCYP

+ O2 Drug-OR + H2O

NADPH NADP

13

Metabolizam pomoću CYP

Citokromi - monooksigenaze uključeni su u biosintezu steroida i masnih kiselina

Do danas je otkriveno 17 obitelji CYP i opisano oko 150 izooblika

klasifikacija: CYP 3 A 4

obitelj>40% o sekvenci ovisne homologije

podobitelj>55% o sekvenci ovisne homologije

izoenzim

*15 A-B

alel

14

Obitelj gena citokroma P450

CYP450

Čovjek 57

Biljke 22

Insekti 3

Gljive 11 Kvasci 2 Nematode 3

Bakterije 18

Mekušci 1

15

Obitelj humanih CYP

CYP 1-5, 7, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26, 27, 39, 46, 51

Funkcija:

metabolizam ksenobiotika: CYP 1, 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 3

metabolizam steroida: CYP 2G1, 7, 8B1, 11, 17, 19, 21, 27A1, 46, 51

metablizam masnih kiselina - CYP 2J2, 4, 5, 8A1

vCYP 24 (vitamin D), 26 (retinoična kiselina), 27B1 (vitamin D), ...

16

CYP

Izoenzim flavin-monoksigenaze

Alkohol dehidrogenaza

Aldehid oksidaza

Monoamin dehidrogenaza (MAO)

Oksidoredukcijski potencijal posredovan je porfirinskim željezom u aktivnom mjestu

Drug-RCYP

+ O2 Drug-OR + H2O

NADPH NADP

17

CYP• tercijarna struktura ima je visoko konzervirana unatočrazlikama u sekvenci

Za razliku od bakterijskih CYP, mikrosomalni CYP-ovi sisavaca imaju i dodatnu transmembransku uzvojnicu koja služi kao sidro u membrani

SuperpozicijahCYP 2C9 (1OG5.pdb) iCYP 450 BM3 (2BMH.pdb)Bacillus megaterium

18

CYP

Strukture nekoliko CYP sisavaca danas su detaljno određene i mogu se naći na:

Brookhaven Database:

http://www.pdb.mdc-berlin.de/pdb/

1DT6.pdb CYP 2C5 rabbit Sep 2000

1OG5.pdb CYP 2C9 human Jul 2003

1PO5.pdb CYP 2B4 rabbit Oct 2003

1PQ2.pdb CYP 2C8 human Jan 2004

19

CYPv Glavnina se nalazi u jetri, no neki se nalaze i na stijenci tankog crijeva.

vCYP sisavaca vezani su za membranu endoplazmatskog retikuluma

CYP distribution

CYP 2C1116%CYP 2E1

13%

CYP 2C66%

CYP 1A68%

CYP 1A213%

CYP 2A64%

CYP 2D62% other

7%CYP 331%

CYP 3CYP 2C11CYP 2E1CYP 2C6CYP 1A6CYP 1A2CYP 2A6CYP 2D6other

20

CYP

CYP 3A4, CYP 2D6 i CYP 2C9 sudjeluju u metabolizmu ksenobiotika.

Metabolic Contribution

CYP 2D630%

CYP 1A22%CYP 2C9

10%

other3%

CYP 3A455%

CYP 3A4CYP 2D6CYP 2C9CYP 1A2other

hepatic only

also small intestine

21

Specifičnost za supstrat

CYP 1A2 verapamil, imipramine, amitryptiline,caffeine (arylamine N-oxidation)

http://medicine.iupui.edu/flockhart/

CYP 2A6 nicotine

CYP 2C9 diclofenac, naproxen, piroxicam, warfarin

CYP 2C19 diazepam, omeprazole, propanolol

CYP 2D6 amitryptiline, captopril, codeine, mianserin, chlorpromazine

CYP 2E1 dapsone, ethanol, halothane, paracetamol

CYP 2B6 cyclophosphamid

CYP 3A4 alprazolam, cisapride, terfenadine, ...

22

Polimorfizmi u genima za CYP

„Svaki čovjek se razlikuje od drugog čovjeka više ili namje “

Genotip je određen sekvencom DNA.

Čovjek ima 2 seta kromosma - Što znači da isti genotip može dati različita fenotipska obilježja

Fenotipovi mogu biti različiti na osnovi aktivnosti ili sadržaja eksprimiranih CYP.

U ovisnosti o metaboličkoj aktivnosti, razlikujemo 3 glavna tipa metabolizanata:

intenzivni metabolizant (normalan)

slab metabolizant

ultra-brz metabolizant (povećan metabolizam ksenobiotika)

Lit: K. Nagata et al. Drug Metabol. Pharmacokin 3 (2002) 167

Metabolizam tetrahidrokanabinola

Kao primjer, citokrom P-450 posreduje pri oksidaciji Δ9-tetrahidrokanabinol-a i to na poziciji alila:

Metabolizam naftalena

Mehanizam karcinogeneze benzopirena

Mehanizam karcinogeneze aflatoksina

Hidroksilacija kolesterola citokrom P450 monoksigenazama

Kisik se za potrebe reakcije hidroksilacije aktivira pomoću citokrom P450 oksigenaza. Ti na membarnu vezani proteini sadrže hem kao prostetičku skupinu

Kao reducens u reakcije ulazi NADPH, koji prenosi elektron na flavoprotein koji ga zatim prenosi na adrenodoksin, protein koji sadrži nehemsko željezo.

Adrenoksin prenosi elektron i reducira Fe3+ u F2+ u hemu. Bez tog elektrona P450 ne veže kisik.

Reakcije hidrokislacije vrlo su značajne u sintezi kolesterola iz skvalena i pretvaranju kolesterola u žućne soli i steroidne hormone

Mitohondrijski p-450 sustavse razlikuje od mikrosomalnog po tome što koristi NADPH-vezan flavoprotein – pa se nazivaju flavinske monoksigenaze (FMO). slično citokromu P-450 imaju mješovitu ulogu oksidaza i zatijevaju kisik i NADPH kao kosupstrate. Ovi enzimi primarno kataliziraju oksidaciju nukleofilnih skupina kao što su amini i tioli.

Oba enzima traže NADP+ ili NAD+ kao kosupstrate.

Metabolizam etilnog alkohola

Disulfiram

Enzim aldehid dehidrogenaza se inhibira fungicidom disulfiramom, koji se u klinici koristi u terapiji alkoholizma.

Pacijent se spriječava u konzumiranju alkohola na razini acetaldehida, koji se vrlo brzo akumulira i izaziva glavobolju i mučninu i povraćanje.

Faza 2.

Postoji 5 tipova reakcija faze 2. metabolizma ksenobiotika:

REAKCIJE KONJUGACIJE U SVRHU PREOBRAZBE KSENOBIOTIKA U OBLIK PODESAN ZA IZLUČIVANJE

1. Glukouronidacija:

Reakciju kataliziraju glukouronil transferaze, prisutne u ER i citosolu.

Molekule poput 2-acetilaminofluoren, anilin, benzoična kiselina, meprobromat, fenol i mnogi steroidi se izlučuju kao glukouronidi.

Glukouronidi se mogu vezati na kisik, dušik ili sumporom bogate skupine što čini glukouronidaciju jednom od najčešćih reakcija konjugacije.

UDP-glukouroniča kiselina je donor glukouronila

(Uridin-5’-difosfo- alfa-D-glukouronska kiselina)

2. Sulfoniranje:

Neki alkoholi, akrilamini i fenoli se sulfuriraju uz enzim sulfotransferazu i

kosupstrat 3'-fosfoadenozin-5'-fosfosulfat (PAPS), koji donosi sulfatnu skupinu

Donor sulfata u drugim reakcijama (primjer: sulfuriranje steroida, glukozaminoglikana, glukopipida i glukoproteina) je adenozin 3'-fosfat-5'-fosfosulfat (aktivni sulfat)

3’-fosfoadenozin-5’-fosfosulfat

3. Konjugacija karboksilnih kiselina s aminokiselinama (najčešće glicinom) preko njihovih tiolestera.

Aminokiselinska konjugacija benzojeve kiseline

Reakciju katalizira aminoacid N-aciltransferazu

4. Konjugacija s glutationom

Glutation je tripeptid (gama-glutamilcisteinilglicin).Brojni potencijalni toksični elektrofilni ksenobiotici su konjugirani na nukleofilni GSH reakcijom:

R + GSH → R-S-G

Glutation, γ-glutamil peptid, služi kao sulfurhidrilni pufer i antioksidant

R – elektrofilni ksenobiotik

Glutation

l Glutation ima izuzetno važnu ulogu u stanici jer štiti crvene krvne stanice od oksidativnog oštećenja

l Glutation-S-transferaze - prisutne su u velikim količinama u citosolu jetre i u manjim količinama u drugim tkivima. U ljudskim tkivima nalazimo različite glutation S-transferazel pokazuju različitu specifičnost prema supstratu i mogu

se razdvojiti metodama elektroforeze

Glutation

l Ako se potencijalno otrovni ksenobiotici ne bi konjugirali s GSH, ostali bi slobodni za kovalentno vezanje s DNK, RNK ili staničnim proteinima, te bi tako mogli prouzročiti znatna oštećenja u stanicama.

l Kada se smanji koncentracija GSH u tkivima, kao što je jetra, tkivo postaje podložnije oštećenjima uzrokovanima spojevima koji bi se inače konjugirali s GSH.

l Prije izlučivanja konjugati glutationa prolaze kroz daljni metabolizam.

l Aminokiseline glutamin i glicin iz glutationa uklanjaju se putemspecifičnih enzima, a acetilna skupina (dobivena iz acetil-CoA) veže se na amino- skupinu preostalog cisteinskog dijela glutationa.

l Dobiveni spoj je merkapturna kiselina (konjugat L-acetilcisteina) koja se izlučuje mokraćom.

Glutation - funkcije u ljudskim stanicama

l sudjeluje u razgradnji potencijalno otrovnoga vodikovog peroksida u reakciji kataliziranoj glutation-peroksidazom

l važan je unutarstanični reducens koji pomaže u održavanju esencijalnih SH enzimskih skupina u reduciranom stanju

l metabolički ciklus za koji se pretpostavlja da prenosiaminokiseline kroz membrane bubrega, uključuje GSH kao nosača:

Aminokiselina + GSH → g-glutamilamino kiselina + cisteinilglicin

5. Metilacija

Manje je značajna u procesu transformacije ksenobiotika

Tioli, fenoli i amini se mogu metabolizirati uz S- adenozil-metionin

S-adenozilmetionin je aktivirani oblik metilne skupine

U reakcijama biosinteze:-fosfatidilkolina

-adrenalina-kreatina-cisteina

-acetilkolina

Metabolizam adrenalina

Metablizam paracetamola

Metabolizam DPX-H6564

ksenobiotikreaktivan metabolit

netoksičan metabolit

kovalentno vezanje za makromolekule

hapten

stvaranje protutijela

oštećenje stanice

mutacija

karcinom

oštećenje stanice

Citokrom P450

GSH-S-transferaza ili epoksid-hidrolaza

Pojednostavljena shema koja prikazuje kako metabolizam ksenobiotika može uzrokovati oštećenje stanice, imunološki poremećaj ili karcinom

U ovom je slučaju pretvorba ksenobiotika u reaktivni metabolit katalizirana CYP dok je konverzija tog reaktivnog metabolita (npr. epoksida) u netoksični spoj katalizirana s glutation-S-transferazom ili epoksid-hidrolazom

Toksični učinci ksenobiotika obuhvaćaju široki spektar djelovanja, ali se glavni učinci kreću u tri opća smjera :

DOB, SPOL I DRUGI ČIMBENICI UTJEČU NA AKTIVNOSTI ENZIMA KOJI METABOLIZIRAJU

KSENOBIOTKE

AKTIVNOST ENZIMA KOJI SUDJELUJU U METABOLIZMU KSENOBIOTIKA

postoje značajne razlike u aktivnostima enzima između vrstapostoje značajne razlike u aktivnosti enzima među pojedincima, od koje su mnoge zbog genetičkih faktoraaktivnost nekih od tih enzima je različita i povezana sa spolom i starošćuunos različitih ksenobiotika, kao što su fenobarbital, poloklorirani bifenili ili neki ugljikovodici, mogu prouzročiti indukciju enzimametaboliti nekih ksenobiotika mogu inhibirati aktivnosti ksenobiotik-metabolizirajućih enzima.

Barem jedan od gena drugačiji od onog koji kodira rajanodinski receptor uključen je u nekim slučajevima malignih hipertenzija.Poznati su mnogi drugi primjeri djelovanja lijekova koji se temelje na polimorfizmu ili mutacijama.

Enzim ili protein Posljedična reakcijagGlukoza-6-fosfat-dehidrogenaza(G6PD) [mutacija] (OMIM 305900)

hemolitička anemija kao posljedica uzimanja lijeka kao što je, primjerice, primakin

Ca2+-otpuštajući kanal (receptor rijanodina) u sarkoplazmatskom retikulu [mutacije] (OMIM180901)

maligna hipertermija (OMIM 145600) kao posljedica primjene nekih anestetika, npr. halotana

CYP2D6 [polimorfizam] (OMIM 124030) spori metabolizam pojedinih lijekova (npr. debrisokin), što dovodi do njihovog nakupljanja

CYP2A6 [polimorfizam] (OMIM 122720) onemogućen metabolizam nikotina, nemogućnost izazivanja ovisnosti o pušenju.

Neke važne reakcije lijekova koje su posljedica mutiranih ili polimorfnih oblika enzima ili proteina

FARMAKOGENOMIKA ĆE DOVESTI DO RAZVOJA NOVIH I SIGURNIJIH LIJEKOVA

l farmakogenomika proučava genetičke različitosti u odgovoru na terapiju lijekovima.

l Definirana je kao upotreba genomske informacije i tehnologija u optimizaciji otkrivanja i razvoja lijekova i ciljnih tkiva.

l Informacije dobivene genomikom, proteomikom, bioinformatikom, biokemijom i toksikologijom, koriste se u objedinjavanju znanja za sintezu novih i sigurnijih lijekova.

Pojednostavljena shema pristupa otkrivanju novih lijekova

kombinatorna kemija

računalne studije

Odabir ciljeva lijeka

(geni, RNA, proteini, glikonjugati itd.)

stvaranje lijekova prema modelu i interakcije između lijekova i ciljnih molekula te daljnje usavršavanje na temelju temelju testova

različiti testovi (in vitro, in vivo)

moguća klinička ispitivanja lijeka

poznavanje patogeneze specifičnih bolesti

glikomikaproteomika genomika

l Mikropostroji (engl. microarrays) visoke učinkovitosti koji mogu odrediti veliki broj različitih proteina doprinose probiru pojedinaca s potencijalno opasnim polimorfizmom prije no što se započne terapijom lijekovima.

l Genski čipovi za analizu određenih genotipa P450 (primjerice za CYP2D6), čiji je genski produkt uključen u metabolizam mnogih antidepresiva i antipsihotika, b-blokatora i nekih kemoterapeutika.

l Glavna smjernica u razvoju novih lijekova ide k poboljšanju djelovanja lijekova, ali i prema sigurnijoj i individualiziranoj terapiji lijekovima uzimajući u obzir polimorfizam i ostale važne čimbenike.

l Procijenjuje se da će oko 100 000 smrti svake godine samo u SAD-u uzrokovati neželjene reakcije na lijekove. l Vjeruje se da će nove informacije u različitim područjima istraživanja promijeniti ovu

statistiku i dovesti do učinkovite terapije, a možda i u konačnici do nove dobi "individualizirane" terapije za svakog pojedinca.