การแยกแบคทีเรยแลคติ กที�สามารถผล ติแบคทีร โอซิ นจากผ�ก ผลไม� และธั�ญพื ชหม�ก

ขน ษฐา ปั'ญญา ส(ม ติรา ฤาชา_____________________________

บทีค�ดย+อ

การแยกแบคทีเรยแลคติ กเพื่��อค�ดเล�อกสายพื่�นธุ์��ที�สามารถผล ติแบคทีร โอซิ นจากติ�วอย างผ�ก ผลไม$ และธุ์�ญพื่�ชหม�ก จ)านวน 30 ติ�วอย าง โดยใช$อาหาร MRS agar ที�เติ ม CaCO3 1% พื่บว าสามารถแยกแบคทีเรยแกรมบวก ไม สร$างสปอร� ไม สร$างเอนไซิม�คะติะเลส ที�,งหมด 21 ไอโซิเลที โดยมร-ปร างกลม 12 ไอโซิเลที และร-ปที อน 9 ไอโซิเลที เม��อน)าแบคทีเรยแลคติ กที�แยกได$ที�,งหมดไปติรวจหาแบคทีร โอซิ นที�ย�บย�,งการเจร ญของแบคทีเรยทีดสอบ 4 ชน ด ค�อ Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus และ Salmonella sp. ด$วยว ธุ์ agar well diffusion

assay พื่บว าแบคทีเรยแลคติ กไอโซิเลที E1, E2 และ I2 มความสามารถในการผล ติแบคทีร โอซิ นย�บย�,งการเจร ญของ B.

cereus ได$ เม��อจ�ดจ)าแนกสายพื่�นธุ์��แบคทีเรยแลคติ กที�ผล ติแบคทีร โอซิ นโดยช�ดทีดสอบส)าเร/จร-ป API 50 CHL (BioMerieux) พื่บว าแบคที เรยแลคติ กไอโซิเลที E1 และ E2 ค�อ Lactobacillus

acidophilus แ ล ะ ไ อ โ ซิ เ ล ที I2 ค� อ Pediococcus sp.

การศึ1กษาค�ณสมบ�ติ เบ�,องติ$นของแบคทีร โอซิ นที�ผล ติจากเช�, อ Lb. acidophilus E1 สามารถทีนความร$อนได$ดที�ส�ดที�อ�ณหภู-ม 63 และ 80 องศึาเซิลเซิยส มความคงติ�วในช วง pH 5-7

ใ น ข ณ ะ ที� แ บ ค ที ร โ อ ซิ น จ า ก Lb. acidophilus E2 แ ล ะ

Pediococcus sp.ไอโซิเลที I2 ส-ญเสยความสามารถในการย�บย�,ง B. cereus เม�� อผ านความร$อนและการเปล� ยนแปลงค า pH

น ยามศั�พืที- : แบคทีร โอซิ น, แบคทีเรยแลคติ ก

Isolation of lactic acid bacteria with produced bacteriocin from fermented of vegetable, fruit and cereal products

Khanitha Panya, Sumitra Ruecha

________________________

Abstract

Isolation of lactic acid bacteria (LAB) with produced bacteriocin from 30 fermented vegable,fruit and cereal product samples by using MRS agar with 1% CaCO3. The results showed that, 21 LAB isolates were gram positive, nonsporing, catalase negative, 12 isolates were cocci shaped and 9 isolates were rod shaped. Furthermore, agar well diffusion assay was used to detect the bacteriocin activity by using indicator strains, Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Salmonella sp. LAB isolate E1, E2 and I2 could inhibit B. cereus. The results from identification using a commercial test kit API 50 CHL system (Biomerieux), isolate E1 and E2 were

Lactobacillus acidophilus and I2 was Pediococcus sp.

The primary characterization of bacteriocin activity from Lb. acidophilus E1 showed that its activity was not affected when treated at 63 and 80 ๐ C and was stable at pH 5-7. Wherease Lb. acidophilus E2 and Pediococcus sp. I2 were lost bacteriocin activity when heat treated and pH changed.

Keyword: Bacteriocin, Lactic acid bacteria

บทีน.า

แบคทีร โอซิ น (Bacteriocin) เป6นสารย�บย�,งการเจร ญของจ�ล นทีรย�ที�มโครงสร$างเป6นโปรติน ที�สามารถซิ1มผ านเย��อของเซิลล�จ�ล นทีรย�เป7าหมายได$ ที)าให$เก ดร-ร� �วของเย��อเซิลล�และเก ดการร��วไหลขององค�ประกอบเซิลล�ติ ดติามมา (สาโรจน�, 2543) กลไกการที)างานของแบคทีร โอซิ นเก ดจากการที�แบคทีร โอซิ นเข$าจ�บก�บเซิลล�เป7าหมายที)าให$เย��อห�$มเซิลล�ถ-กรบกวน ที)าให$เก ดร-หร�อช องว างที�มล�กษณะคล$ายช ,นไม$ที�น)ามาประกอบก�นเป6นถ�งมร-ติรงกลาง ส งผลให$เก ดการร��วขององค�ประกอบภูายในเซิลล�เป6นกรดอะม โน สารประกอบอน นทีรย�ในกล� มฟอสเฟติซิ1�งเป6นสารให$พื่ล�งงานของเซิลล�และไอออนของสารที�จ)าเป6นติ อการด)ารงชว ติของเซิลล� ในกรณสปอร�พื่บ

ว าเย��อห�$มเซิลล�จะถ-กที)าลายอย างรวดเร/วในระหว างที�สปอร�งอกข1,นมา และแบคทีร โอซิ นที�ความเข$มข$นส-งสามารถย�บย�,งการสร$างเพื่ปติ โดกล�ยแคน (peptidoglycan) ซิ1�งเป6นส วนประกอบที�ส)าค�ญของผน�งเซิลล�ของ Bacillus sterothermophillus และ Escherichia

coli ได$ (ส�พื่รรณ การ�, 2548)

แบคทีร โอซิ นที�สร$างจากแบคทีเรยแลคติ ก ส วนใหญ จะย�บย�,งการเจร ญของแบคทีเรย สายพื่�นธุ์��ที�ใกล$ช ดก�บแบคทีเรยแลคติ กชน ดที�สร$างแบคทีร โอซิ นน�,น อย างไรก/ติามมรายงานว า แบคทีร โอซิ นจากแบคทีเรยแลคติ กบางชน ดสามารถย�บย�,งแบคทีเรยแกรมบ ว ก ที� ที)า ใ ห$ เ ก ด โ ร ค อ า ห า ร เ ป6 น พื่ ษ ไ ด $เ ช น Bacillus cereus,

Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes แ ล ะ Staphylococcus aureus ด�งน�,นจ1งที)าให$มผ-$สนใจศึ1กษาเก�ยวก�บแบคทีเรยแลคติ กที�ผล ติแบคทีร โอซิ นได$จากผล ติภู�ณฑ์�อาหารชน ดติ างๆก�นอย างกว$างขวาง เพื่��อหาแนวทีางในการน)ามาใช$เป6นสารก�นเ ส ย ติ า ม ธุ์ ร ร ม ช า ติ (ส ม ใ จ แ ล ะ ค ณ ะ , 2550)

การค$นพื่บแบคทีร โอซิ นจากแบคทีเรยแลคติ ก มรายงานคร�,งแรกติ�,งแติ ป; ค.ศึ. 1928 โดยRogers พื่บว า Lb. lactis สามารถสร$างสารย�บย�,งการเจร ญของ Lb. bulgaricus ได$ ติ อมาในป; ค.ศึ. 1947 Mattick และ Hirsch ได$ศึ1กษาพื่บว าสารที�ย�บย�,งการเจร ญของ Lb. bulgaricus ได$น, มโครงสร$างทีางเคมเป6นเปปไทีด�และติ�,งช�� อว าไนซิ น หล�งจากน�,นมการศึ1กษาพื่บว าไนซิ นนอกจากจะย�บย�,งการเจร ญของ lactobacilli ได$แล$ว ย�งสามารถย� บ ย�, ง ก า ร เ จ ร ญ ข อ ง จ� ล น ที ร ย� อ�� น ไ ด$ อ ก ห ล า ย ช น ด ค� อ streptococci, staphylococci, Bacillus sp. แ ล ะ Clostridium และมรายงานว าแบคทีเรย แลคติ กสายพื่�นธุ์��ที�ส ร$า ง ไ น ซิ น ไ ด$ ส า ม า ร ถ ย� บ ย�, ง ก า ร ง อ ก ข อ ง ส ป อ ร�ข อ ง Cl.

botulinum และย�บย�,งการเจร ญของ L. monocytogenes ในระหว างการผล ติ Camembert cheese ได$ ป<จจ�บ�นไนซิ นได$ร�บการยอมร�บในสหร�ฐอเมร กาว าปลอดภู�ย (GRAS) และมการน)าไปใช$เป6นสารเสร มเพื่�� อช วยย�บย�,งการเจร ญของจ�ล นทีรย�ก อโรคในผล ติภู�ณฑ์�อาหารหลายชน ดที��วโลก (สมใจ และคณะ , 2550)

การศึ1กษาเก�ยวก�บการผล ติแบคทีร โอซิ นจากแบคทีเรยแลคติ กที�แยกได$จากผล ติภู�ณฑ์�อาหารชน ดติ างๆ ก�นอย างกว$างขวาง แ ล ะ ม ร า ย ง า น ว า แ บ ค ที เ ร ย แ ล ค ติ ก ห ล า ย ช น ด ใ น จ น� ส Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Weissella และ Vagococcus สามารถส ร$ า ง แ บ ค ที ร โ อ ซิ น ไ ด$

ประเทีศึไทียมผล ติภู�ณฑ์�พื่�ชหม�กพื่�,นบ$านหลายชน ดที�ผล ติ เช น กะหล)�าปลดอง มะม วงดอง ผ�กกาดดอง ขนมจนหม�ก เป6นติ$น ซิ1�งส วนใหญ มการผล ติในระด�บคร�วเร�อนโดยอาศึ�ยก จกรรมของแบคทีเรย แลคติ กที�ปนเป>, อนมาในว�ติถ�ด บติามธุ์รรมชาติ ด�งน�,นงานว จ�ยน,จ1งสนใจที�จะค�ดแยกแบคทีเรยแลคติ กที�มความสามารถผล ติแบคทีร โอซิ นจากผล ติภู�ณฑ์�พื่�ชหม�กและศึ1กษาค�ณสมบ�ติ บางประการของเช�,อที�แยกได$ เพื่��อเป6นแนวทีางในการน)าสายพื่�นธุ์��ของแบคทีเรยแลคติ กที�สามารถสร$าง แบคทีร โอซิ นไปพื่�ฒนากระบวนการหม�กที�เหมาะสมของผล ติภู�ณฑ์�พื่�ชหม�กที$องถ �นติ อไป

อ( ปั ก ร ณ์- แ ล ะ วิ ธั ก า ร ที ด ล อ ง

ติ�วิอย+างอาหารหม�ก เก/บติ�วอย างอาหารหม�กจากผ�ก ผลไม$ และธุ์�ญพื่�ช ได$แก ได$แก หน อไม$ดอง กระเทียมดอง ห�วไชโป@ มะนาวดอง ผ�กกาดดอง ก� มดอง มะด�นดอง อง� นดอง ขนมจนหม�ก ข$าวหมาก ล-กแป7งสาโที เติ$าเจ,ยว

เติ$าห-$ย, น),าหม�กล-กยอ มะยมดอง และมะม วงดอง จากร$านค$าในติลาดจ�งหว�ดลพื่บ�ร ส งห�บ�รและสระบ�รจ)านวน 30 ติ�วอย าง

จ( ล น ที ร ย- ที� ใ ช� เ ปั3 น เ ช 4 อ ที ด ส อ บ Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus และ Salmonella sp.

ก า ร แ ย ก แ บ ค ที เ ร ย แ ล ค ติ ก

ช��งติ�วอย างอาหาร 10 กร�ม ใส ลงในอาหาร MRS broth

ปร มาติร 90 ม ลล ล ติร น)าไปบ มที�อ�ณหภู-ม 37 องศึาเซิลเซิยส เป6นเวลา 48 ช��วโมง น)า มาเจ�อจางด$วย โซิเดยมคลอไรด� 0.85

เปอร�เซิ/นติ� ให$ได$ระด�บการเจ�อจางที�เหมาะสม จากน�,นปAเปติมา 1

ม ลล ล ติร ลงในจานเพื่าะเช�, อ แล$วเทีอาหาร MRS agar ที�เติ ม CaCO3 1 % เทีที�บด$วยอาหาร MRS agar บ มที�อ�ณหภู-ม 37

องศึาเซิลเซิยส เป6นเวลา 48 ช��ว โมง ในสภูาวะไร$ออกซิ เจน

ก า ร แ ย ก เ ช 4 อ บ ร ส( ที ธั 5

แยกแบคทีเรยแลคติ กซิ1�งมบร เวณใสรอบโคโลน โดยที)าการขดเช�,อ (cross streak) บนอาหารแข/ง MRS agar ที�เติ ม CaCO3 1 % บ มที�อ�ณหภู-ม 37 องศึาเซิลเซิยส เป6นเวลา 48 ช��วโมง ในสภูาวะไร$ออกซิ เจน ที)าการเพื่าะเล,ยง 2 คร�,ง และติรวจสอบเช�,อบ ร ส� ที ธุ์ B ด$ ว ย ก า ร ส อ ง ก ล$ อ ง จ� ล ที ร ร ศึ น�

เก/บร�กษาเช�,อโดยการเข�ยเช�,อบร ส�ทีธุ์ Bโคโลนเด�ยวมาแทีงในหลอดอาหาร MRS agar บ มที�อ�ณหภู-ม 37 องศึาเซิลเซิยส ในสภูาวะไร$ออกซิ เจน เป6นเวลา 24 ช��วโมง เก/บที�อ�ณหภู-ม 4 องศึาเซิลเซิยส และที)าการติ อเช�,อที�ก 1 เด�อน

การศั6กษาอน(กรมวิ ธัานของแบคทีเรยแลคติ กที�แยกได�

เล,ยงเช�, อบร ส�ทีธุ์ Bบนอาหาร MRS agar บ มที�อ�ณหภู-ม 37

องศึาเซิลเซิยส เป6นเวลา 24 ช��วโมง แล$วน)า มาทีดสอบ ด�งน,

1.ก า ร ติ ด ส แ ก ร ม ร- ป ร า ง แ ล ะ ก า ร จ� ด เ ร ย ง ติ� ว2.ก า ร ที ด ส อ บ ก า ร ส ร$ า ง เ อ น ไ ซิ ม� ค ะ ติ ะ เ ล ส 3.ก า ร ที ด ส อ บ ก า ร ส ร$ า ง กC า ซิ4.การทีดสอบการเจร ญที�อ� ณหภู-ม 10 และ 45 องศึาเ ซิ ล เ ซิ ย ส 5.การทีดสอบการทีนเกล�อที�ระด�บโซิเดยมคลอไรด� 6.5 และ 18 เ ป อ ร� เ ซิ/ น ติ�6.การทีดสอบความสามารถในการเจร ญที� pH 4.5 และ 9.6

7.ก า ร ศึ1 ก ษ า ค� ณ ส ม บ�ติ ก า ร ห ม� ก ย อ ย ค า ร� โ บ ไ ฮ เ ด ร ติ

ก า ร ที ด ส อ บ โ ด ย วิ ธั agar well diffusion assay

ก า ร เ ติ ร ย ม เ ช 4 อ ที ด ส อ บน)าแบคทีเรยก อโรคในระบบทีางเด นอาหารมาทีดสอบ 4

ช น ด ไ ด$ แ ก Bacillus cereus, Escherichia coli,

Staphylococcus aureus และ Salmonella sp. มาที)าการเพื่าะเล,ยงบนอาหาร TSA (ภูาคผนวก ก) บ มที�อ�ณหภู-ม 37 องศึาเซิลเซิยส เป6นเวลา 24-48 ช��วโมง เข�ยเช�,อลงในโซิเดยมคลอไรด� 0.85 เปอร�เซิ/นติ� ปร�บความข� นของเช�,อให$มความข� นเที าก�บความข� นของสารละลายมาติรฐาน Mc Farland No.0.5 จากน�,นใช$ไม$พื่�นปลายส)าลจ� มน),าเล,ยงเช�,อ ที)าให$หมาด โดยการกดที�ผ วข$างในหลอดทีดลองเกล�ยให$ที��วบนผ วหน$าอาหาร TSA ที ,งไว$ประมาณ 10 นาที

ก า ร เ ติ ร ย ม ส า ร ที ด ส อ บ

ถ ายเช�,อแบคทีเรยแลคติ กลงในอาหาร MRS broth

ปร มาติร 10 ม ลล ล ติร ในหลอดทีดลอง บ มที�อ�ณหภู-ม 37 องศึาเซิลเซิยส เป6นเวลา 48 ช��วโมง ปร�บ pH ด$วยสารละลายโซิเดยมไฮดรอกไซิด� 1 นอร�ม�ล ที�ปราศึจากเช�,อ ให$ได$ค า pH ให$เป6นกลาง จากน�,นน)าไปป<� นแยกเซิลล�ด$วยเคร��องป<� นเหว�ยงที�ความเร/วรอบ 6000 รอบติ อนาที เป6นเวลา 15 นาที ที�อ�ณหภู-ม 4 องศึาเซิลเซิยส กรองให$ปราศึจากเช�,อโดยกระดาษกรอง 0.45 ไมโครเมติร จะได$เป6น crude filtrate supernatant fluid (CFSF)

ก า ร ที ด ส อ บ ส า ร ย� บ ย�4 ง แ บ ค ที เ ร ย ที ด ส อ บ

น)า CFSF ปร มาติร 50 ไมโครล ติร ใส ลงในจานเพื่าะเช�,ออาหารแข/ง TSA ที� swab แบคทีเรยทีดสอบซิ1�งเจาะหล�มไว$แล$ว บ มที�อ�ณหภู-ม 37 องศึาเซิลเซิยส เป6นเวลา 24 ช��วโมง ส�งเกติการเก ดบ ร เ ว ณ ใ ส ร อ บ ๆ ห ล� ม

การทีดสอบค(ณ์สมบ�ติ เบ 4 องติ�นของแบคทีร โอซิ นที�ผล ติได�

ถ ายเช�,อแบคทีเรยแลคติ กลงในอาหาร MRS broth

ปร มาติร 10 ม ลล ล ติร บ มที�อ�ณหภู-ม 37 องศึาเซิลเซิยส เป6นเวลา 48 ช��วโมง ปร�บ pH ให$เป6นกลาง จากน�,นน)า ไปป<� นแยกเซิลล�ที�ความเร/วรอบ 6,000 รอบติ อนาที เป6นเวลา 15 นาที ที�อ�ณหภู-ม 4

องศึาเซิลเซิยส กรองด$วยกระดาษกรอง 0.45 ไมโครเมติร จากน�,นน)า ไ ป ที ด ส อ บ ด� ง น,

การทีดสอบควิามสามารถในการทีนควิามร�อนของแบคทีร โอซิ น

น)า CFSF ไปให$ความร$อนที�อ�ณหภู-ม 63, 80 และ 100

องศึาเซิลเซิยส เป6นเวลา 10, 20 และ 30 นาที จากน�,นทีดสอบโดยว ธุ์

agar well diffusion assay เปรยบเทียบก�บ CFSF ที�ไม ได$ผ านค ว า ม ร$ อ น

การทีดสอบควิามคงติ�วิของแบคทีร โอซิ นที� pH ติ+างๆ น)า CFSF มาปร�บ pH ที�ระด�บ 3, 5, 7 และ 9 โดยใช$ 1

โมลาร� ไฮโดรคลอล ก หร�อ 1 นอร�ม�ล โซิเดยมไฮดรอกไซิด� บ มที�อ�ณหภู-ม 37 องศึาเซิลเซิยส เป6นเวลา 4 ช��วโมง จากน�,นน)ามาปร�บ pH

ให$เป6นกลาง แล$วจ1งน)าไปทีดสอบ โดยว ธุ์ agar well diffusion assay

ผ ล ก า ร ที ด ล อ ง

จากการแยกแบคที เรยจากติ�วอย างอาหารพื่�ชหม�ก 30

ติ�วอย าง โดยใช$อาหาร MRS agar ที�เติ ม CaCO3 1% พื่บว าได$แบคทีเรยแกรมบวก จ)านวน 21 ไอโซิเลที แบ งออกเป6น ร-ปร างกลม 12 ไอโซิเลที ร-ปร างที อนส�,น 3 ไอโซิเลที และร-ปร างที อน 6 ไอโซิเลที ค�ณสมบ�ติ ส)าค�ญของแบคทีเรยกล� มน,มค า pH ของอาหารอย- ในช วง 3.23-4.83 จากน�,นน)าแบคทีเรยที�แยกได$มาทีดสอบค�ณสมบ�ติ ทีางเคม ได$แก เอนไซิม�คะติะเลส การสร$างกCาซิคาร�บอนไดออกไซิด� การเจร ญที�อ�ณหภู-ม 10 และ 45 องศึาเซิลเซิยส การเจร ญในอาหารที�มโซิเดยมคลอไรด� 6.5 และ 18 เปอร�เซิ/นติ� และการเจร ญที� pH 4.5

และ 9.6 พื่บว า แบคทีเรยแลคติ กที�,ง 21 ไอโซิเลที ให$ปฏิ ก ร ยาคะติะเลสเป6นลบ ไม สร$างกCาซิคาร�บอนไดออกไซิด�จากการหม�กกล-โคสจ1งจ�ดอย- ในกล� ม homofermentative ซิ1�งแบคทีเรยกล� มน,เม�� อเก ดกระบวนการหม�กผลผล ติที�ได$ ค�อ กรดแลคติ กเป6นผล ติภู�ณฑ์�ส วนใหญ สามารถเจร ญได$ที�ช วงอ�ณหภู-ม ส-ง แติ ไม เจร ญช วง

อ�ณหภู-ม ติ)�า เจร ญเติ บโติในอาหารเหลวที�เติ มเกล�อโซิเดยมคลอไรด� 6.5 แติ ไม เจร ญที� 18 เปอร�เซิ/นติ� และเจร ญเติ บโติในอาหารเหลวที�มค า pH 4.5 แ ติ ไ ม เ จ ร ญ ที� pH 9.6

ก า ร ที ด ส อ บ ก า ร ส ร� า ง แ บ ค ที ร โ อ ซิ น โ ด ย วิ ธั agar well diffusion assay

จากการศึ1กษาความสามารถการย�บย�,งแบคทีเรยทีดสอบ 4

ชน ด โดยว ธุ์ agar well diffusion assay พื่บว าแบคทีเรยแลคติ ก 3 ไอโซิเลที ค�อ E1, E2 และ I2 สามารถย�บย�,งการเจร ญของ B. cereus ได$มากที�ส�ด โดยที)าให$เก ดบร เวณใสมเส$นผ านศึ-นย�กลาง 15, 11 และ 11 ม ลล เมติรติามล)าด�บ ซิ1�งเปรยบเทียบก�บช�ดควบค�ม ค�อ อาหาร MRS broth ที�ไม มการย�บย�,งแบคทีเรยทีดสอบ ส วนแบคทีเรยทีดสอบ E. coli, S. aureus และ Salmonella sp.

แบคทีเรยแลคติ กที�แยกได$ไม สามารถย�บย�,งการเจร ญได$ ซิ1�งการทีดสอบว ธุ์น,เป6นการน)าสารทีดสอบที�ผล ติจากแบคทีเรยแลคติ กที�อย- ในอาหาร MRS broth และที)าการปร�บ pH ของสารทีดสอบให$เป6นกล า ง จ1 ง ม แ น ว โ น$ ม ว า เ ป6 น แ บ ค ที ร โ อ ซิ น

การทีดสอบควิามสามารถในการทีนควิามร�อนของแบคทีร โอซิ น

เม��อน)าแบคทีร โอซิ นที�ผล ติจากไอโซิเลที E1 มาผ านความร$อนที�อ�ณหภู-ม 63 และ 80 องศึาเซิลเซิยส เป6นเวลา 10, 20 และ 30 นาที พื่บว า ก จกรรมของการย�บย�,งไม เปล�ยนแปลง ด�งแสดงในภูาพื่ที� 5

แสดงถ1งความสามารถในการสร$างแบคทีร โอซิ นที�สามารถทีนความร$อนได$ในระด�บน, ในขณะที�ให$ความร$อน 100 องศึาเซิลเซิยส พื่บว าก จ ก ร ร ม ก า ร ย� บ ย�, ง B. cereus ล ด ล ง

แบคทีร โอซิ นที�ผล ติจากไอโซิเลที I2 เม�� อผ านความร$อนที�อ�ณหภู-ม 63 องศึาเซิลเซิยส ก จกรรมการย�บย�,งลดลง เม��อเปรยบเทียบก�บที�ไม ผ านความร$อนและจะส-ญเสยความสามารถในการย�บย�,งเม��อผ านความร$อนที�อ�ณหภู-ม 80 และ 100 องศึาเซิลเซิยส ในขณะที�แบคทีร โอซิ นที�ผล ติจาก ไอโซิเลที E2 ส-ญเสยความสามารถในการย�บย�,งเม��อผ านความร$อนที�อ�ณหภู-ม 63 องศึาเซิลเซิยส ด�งแสดงใ น ติ า ร า ง ที� 1

ติารางที� 1 ผลการทีดสอบความสามารถทีนความร$อนของแบคทีร โ อ ซิ น ที� ผ ล ติ จ า ก แ บ ค ที เ ร ย

แ ล ค ติ ก จ า ก ไ อ โ ซิ เ ล ที E1, E2 แ ล ะ I2

อ(ณ์หภู9ม /เวิลา บร เวิณ์ใสของการย�บย�4งแบคทีเรยทีดสอบ (ม ลล เมติร)

E1 E2 I2

ไม ผ านความร$อน 16 8 8

63 °C 10 นาที 16 - 8

63 °C 20 นาที 16 - 8

63 °C 30 นาที 16 - 8

80 °C 10 นาที 16 - -

80 °C 20 นาที 16 - -

80 °C 30 นาที 16 - -

100 °C 10 นาที 11 - -

100 °C 20 นาที 11 - -

100 °C 30 นาที 10 - -

หมายเหติ� - หมายถ1ง ไ ม ม บ ร เ ว ณ ใ ส

การ ที ดสอบค วิามคง ติ� วิ ข อ ง แ บ ค ที ร โ อ ซิ น ที� pH ติ+ า ง ๆ

จากการทีดสอบแบคทีร โอซิ นที�ผล ติจากไอโซิเลที E1 มความสามารถในการย�บย�,ง B. cereus ที� pH 5 และ 7 โดยไม มการเปล�ยนแปลงเม��อเปรยบเทียบก�บช�ดควบค�มที�ไม ผ านการปร�บค า pH ในขณะที�การย�บย�,งไม เก ดข1,นที� pH 3 และ pH 9 แสดงว าแบคทีร โอซิ นที�ผล ติจากไอโซิเลที E1 มความคงติ�วดที� pH 5 และ 7 แบคทีร โอซิ นที�ผล ติจากไอโซิเลที E2 มความสามารถในการย�บย�,งที� pH 9 โดยมบร เวณย�บย�,งมากกว าช�ดควบค�มที�ไม ผ านการปร�บค า pH และ แบคทีร โอซิ นที�ผล ติจากไอโซิเลที I2 มความสามารถย�บย�,งได$ดในช วง pH ที�เ ป6 น ก ร ด ด� ง แ ส ด ง ใ น ติ า ร า ง ที� 2

ติารางที� 2 ผลการทีดสอบความคงติ�วของแบคทีร โอซิ นที� pH

ติ างๆ ของแบคทีเรยแลคติ ก ไอโซิเลที E1, E2 และ I2

ระด�บ pH บร เวิณ์ใสของการย�บย�4งแบคทีเรยทีดสอบ (ม ลล เมติร)

E1 E2 I2

ไม ปร�บ pH 15 8 10

pH 3 - - 8

pH 5 15 7 10

pH 7 15 - -

pH 9 - 15 -

หมายเหติ� - หมายถ1ง ไ ม ม บ ร เ ว ณ ใ ส

การจ�ดจ.าแนกชน ดแบคทีเรยแลคติ กที�สามารถผล ติแบคทีร โอซิ น

จากการจ�ดจ)าแนกชน ดแบคทีเรยแลคติ กไอโซิเลที E1 และ E2

มความสามารถในการหม�กย อยคาร�โบไฮเดรติได$ใกล$เคยงก�น ค�อ ส า ม า ร ถ ห ม� ก ย อ ย น),า ติ า ล glucose, fructose, salicin,

cellubiose, sucrose, trehalose และ gentiobiose ส วนแบคที เรยแลคติ กไอโซิเลที I2 สามารถหม�กย อย ribose, galactose, glucose, fructose, mannose, N-Acetyl-Glucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, cellubiose, maltose, sucrose, trehalose, gentiobiose แ ล ะ d-tagalose

จากการน)าข$อม-ลการผล ติกรดจากแหล งคาร�โบไฮเดรติชน ดติ างๆ มาว เคราะห�ด$วยโปรแกรม apiwebTM identification

software และพื่ จารณาจากร-ปร างเซิลล� พื่บว า ไอโซิเลที E1 และ E2 ค�อ Lactobacillus acidophilus ที�ระด�บความถ-กติ$องของการจ�ดจ)าแนก 98.5 % และ 99.5 % ติามล)าด�บ และไอโซิเลที I2

ค�อ Pediococcus pentosaceus ที�ระด�บความถ-กติ$องของการจ� ด จ)า แ น ก 8.3 % ด� ง แ ส ด ง ใ น ติ า ร า ง ที� 3

ติารางที� 3 ผลการทีดสอบการหม�กคาร�โบไฮเดรติ 49 ชน ด โดยช�ดทีดสอบส)าเร/จร-ป API 50 CHL ของแบคทีเรยแลคติ กจากไ อ โ ซิ เ ล ที E1, E2 แ ล ะ I2

คาร-โบไฮเดรติ E1 E2 I2

1. Glycerol - - -

2. Erythritol - - -3. D-Arabinose - - -4. L-Arabinose ? ? -5. Ribose - - +6. D-Xylose - - -7. L-Xylose - - -

8. Adonitol - - -9. -methyl-D-xyloside

- - -

10. Galactose ? ? +11. Glucose + + +12. Fructose + + +13. Mannose + + +14. Sorbose - - -15. Rhamnose - - -16. Dulcitol - - -17. Inositol - - -18. Mannitol ? ? -19. Sorbitol - ? -20. -Methyl-D-Mannoside

- - -

ติ า ร า ง ที� 3 (ติ อ )

คาร-โบไฮเดรติ E1 E2 I2

21. -Methyl-D-Glucoside

- - -

22. N-Acetyl-Glucosamine

? ? +

23. Amygdalin + + +

24. Arbutin - - +

25. Esculin + + +26. Salicin + + +27. Cellubiose + + +28. Maltose - - +29. Lactose ? - -

30. Melibiose - - -31. Sucrose + + +32. Trehalose + + +33. Inulin - - -34. Melezitose - - -35. Raffinose ? + -36. Starch - - -37. Glycogen - - -38. Xylitol - - -39. Gentiobiose + + +40. D-Turanose - - -41. D-Lyxose - - -42. D-Tagalose - - +43. D-Fucose - - -44. L-Fucose - - -45. D-Arabitol - - -46. L-Arabitol - - -47. Gluconate - - -48. 2-keto-gluconate - - -49. 5-keto-gluconate - - -

หมายเหติ� + ใช$เป6นแหล งคาร�บอนได$ - ใช$เป6นแหล งคาร�บอนไม ได$ ? ผ ล ก า ร ที ด ส อ บ ไ ม ช� ด เ จ น

ส ร( ปั แ ล ะ วิ จ า ร ณ์- ผ ล ก า ร ที ด ล อ งการแยกแบคทีเรยแลคติ กจากผ�ก ผลไม$ และธุ์�ญพื่�ชหม�ก และ

น)ามาทีดสอบความสามารถในการผล ติแบคทีร โอซิ นในเบ�,องติ$นโดยว ธุ์การแยกเช�,อในอาหาร MRS agar ที�เติ ม CaCO3 1%พื่บว า จากติ�วอย างผ�ก ผลไม$ และธุ์�ญพื่�ชหม�กจ)านวน 30 ติ�วอย าง สามารถแยกแบคทีเรยแลคติ กได$จ)านวน 21 ไอโซิเลที โดยที�,งหมดเป6นแบคทีเรยแกรมบวก ร-ปร างกลม12 ไอโซิเลที และร-ปร างที อน 9 ไอโซิเลที ไม สร$างสปอร� ไม สร$างเอนไซิม�คะติะเลส ไม สร$างกCาซิคา ร�บอนไดออกไ ซิด� จ า กกา รห ม�กก ล- โคส จ1 ง จ�ดอ ย- ใ นก ล� ม homofermentative สามารถเจร ญได$ที�อ�ณหภู-ม 45 องศึาเซิลเซิยส เจร ญได$ในที�มเกล�อ 6.5% สามารถผล ติกรดในอาหาร

เหลวได$ เม��อน)าแบคทีเรยแลคติ กไปทีดสอบความสามารถในการย�บย�,งแบคทีเรยทีดสอบ 4 ชน ด ได$แก B. cereus, E. coli, S.

aureus และ Salmonella sp. โดยว ธุ์ Agar well diffusion

assay พื่บว าม 3 ไอโซิเลที ค�อ E1, E2 และ I2 ที�สามารถย�บย�,ง B.

cereus ได$โดยบร เวณใสมเส$นผ านศึ-นย�กลาง 15, 11 และ 11

ม ลล เมติร ติามล)าด�บ ซิ1�งแบคทีเรยแลคติ ก 3 ไอโซิเลทีแยกได$จากน),าหม�กล-กยอและเติ$าห-$ย, เม��อที)าการจ�ดจ)าแนกแบคทีเรยแลคติ กที�สามารถผล ติแบคทีร โอซิ นในระด�บสป;ชส�โดยใช$ช�ดทีดสอบส)าเร/จร-ป API 50 CHL พื่บว าแบคทีเรยแลคติ กไอโซิเลที E1, E2 และ I2 ค�อ Lactobacillus acidophilus และ Pediococcus sp. จากการศึ1กษาค�ณสมบ�ติ เบ�,องติ$นของแบคทีร โอซิ นได$ผล ด�งน, แบคทีร โอซิ นที�ผล ติจากเช�,อ Lactobacillus acidophilus E1 สามารถทีนความร$อนที�อ�ณหภู-ม 63 และ 80 องศึาเซิลเซิยสได$ มความ คงติ�วดในช วง pH 5-7 ส ว น แ บ ค ที ร โ อ ซิ น ที� ผ ล ติ จ า ก เ ช�, อ Lactobacillus

acidophilus E2 ไม สามารถทีนความร$นได$ มความคงติ�วในช วง pH

9 และแบคทีร โอซิ นที�ผล ติจากเช�, อ Pediococcus sp. I2

สามารถทีนความร$อนที�อ�ณหภู-ม 63 องศึาเซิลเซิยส มความคงติ�วดใ น ช ว ง pH 3-5

จากงานว จ�ยน, จ ะ เห/น ได$ ว า Lb. acidophilus E1, Lb.

acidophilus E2 และ Pediococcus sp.I2 สามารถย�บย�,งการเจร ญของแบคทีเรยก อโรคอาหารเป6นพื่ ษได$ ค�อ B. cereus ด�งน�,นจ1งอาจน)าไปใช$เป6นกล$าเช�,อในการผล ติอาหารหม�กที�ปลอดภู�ยและได$มาติรฐาน หร�อน)าไปใช$ในการผล ติสารย�บย�,งเช�,อโรคอาหารเป6นพื่ ษในอ า ห า ร ไ ด$

เ อ ก ส า ร อ� า ง อ ง

1. จาร�วรรณ มณศึร. 2551. เทีคโนโลยอาหารหม�ก. กร�งเทีพื่ฯ:

ส)า น� ก พื่ ม พื่� โ ฟ ร เ พื่ ซิ

2. ช ดชม ฮ รางะ มาล�ย บ�ญร�ตินกรก จ มณฑ์าที พื่ย� ย� นฉลาด และ กร�ณา วงษ�กระจ าง. 2550. การเปล�ยนแปลงชน ดและปร มาณจ�ล นทีรย�ระหว างการหม�กยอ ในกระบวนการผล ติเคร��องด��มน),าล- ก ย อ ไ ที ย . วิ . วิ ช . (วิ ที ย- ). 39 (1): 95-104.

3. ช�ติ น�นที� ร�ตินไพื่บ-ลย�สว�สด B. 2547. การศั6กษาค(ณ์ล�กษณ์ะของแบคที เรยกรดแลคติ กที�ผล ติสารย�บย�4งการเจร ญของ Staphylococcus aureus. ว ทียาน พื่นธุ์�ว ทียาศึาสติรมหาบ�ณฑ์ ติ,สาขาเทีคโนโลยชวภูาพื่ ภูาคว ชาเทีคโนโลยชวภูาพื่ ม ห า ว ที ย า ล� ย เ ก ษ ติ ร ศึ า ส ติ ร� .

4. ณ�ฐพื่ร ภู�ทีรส นไพื่บ-ลย�  อรอนงค� พื่ร ,งศึ�ลกะ  อ�จฉร ยา ร�งษ ร�จ และ ณ�ฏิฐ กา ส�วรรณาศึร�ย. 2552. การแยกแลบเฟจจากติ� วิ อ ย+ า ง แ ห น ม ใ น ปั ร ะ เ ที ศั ไ ที ย วิ า ร ส า ร วิ ที ย า ศั า ส ติ ร- ม ศั วิ .  25(1): 101-113.  

5. ดวงพื่ร ค�นธุ์โชติ . 2537. อน(กรมวิ ธัานของแบคทีเรยและปัฏิ บ�ติ การ . กร�งเทีพื่ฯ: ส)า น�กพื่ มพื่� โอเดยนสโติร �

6. น ดา อาบส�วรรณ�. 2550. การผล ติแบคทีร โอซิ นจากแลคติ กแอซิ ดแบคทีเรยที�ทีนอ(ณ์หภู9ม ส9ง. ว ทียาน พื่นธุ์�ว ทียาศึาสติรมหาบ�ณฑ์ ติ,สาขาเทีคโนโลยชวภูาพื่ บ�ณฑ์ ติว ทียาล�ย มหาว ทียาล�ยข อ น แ ก น .

7. ปA� นมณ ขว�ญเม�อง. 2547. แบคทีเรยกรดแลคติ กในผล ติภู�ณฑ์�อาหารหม�กดอง. วิารสารคร(ศัาสติร-อ(ติสาหกรรม. 3(1): 65.

8. มาติรฐานผล ติภู�ณฑ์�ช�มชนน),าล-กยอ. (2553, ม ถ�นายน 23).

มาติรฐานผล ติภู�ณ์ฑ์-ช(มชนน.4าล9กยอ. [ออนไลน�] เข$าถ1งได$จาก: http://www.tisi.go.th.

9. มช�ย ล�ดด. 2552. บทีปัฏิ บ�ติ การที� 2 การค�ดแยกแบคทีเรยก ร ด แ ล ค ติ ก . [อ อ น ไ ล น� ]. เ ข$ า ถ1 ง ไ ด$ จ า ก :

http://www.agro.kmutnb.ac.th. (ว� น ที� ค$ น ข$ อ ม- ล :10

ธุ์�นวาคม 2553)

10. วราย�ทีธุ์ ส�ระนราก�ล ส�มภูาษณ� ค�ณส�ข ปาร ชาติ พื่� มขจร พื่งศึ�ศึ�กด B ร�ตินช�ยก�ลโสภูณ. 2550. ค�ณสมบ�ติ ของแบคทีร โอซิ นที�สร$างโดยแลคติ กแอซิ ดแบคที เรยที�แยกได$จากอาหารหม�ก.วิารสารวิ จ�ยมหาวิ ทียาล�ยขอนแก+น 7(1): 17-26.

11. ว เชยร ลลาว�ชรมาศึ. 2534. อาหารจากแลคติ คแอซิ ดแบคทีเรยในอ(ติสาหกรรมไทีย. โปรซิดด ,งส� แลคติ คแอซิ ด แ บ ค ที เ รย ใ น อ� ติ ส า ห ก ร ร ม ไ ที ย ค ร�,ง ที� 1.ม ห า ว ที ย า ล� ยเ ก ษ ติ ร ศึ า ส ติ ร� ก ร� ง เ ที พื่ ม ห า น ค ร .

12. สมใจ ศึ ร โภูค ประว�ติ อ�งประภูาพื่รช�ย ขจนาฏิ โพื่ธุ์ เวชก�ล และอรอนงค� พื่ร ,งศึ�ลกะ. 2550. การค�ดเล�อกและการจ�ดจ)าแนกชน ดแบคทีร โอซิ นได$จากอาหารหม�ก และการศึ1กษาค�ณสมบ�ติ เบ�,องติ$นของแบคทีร โอซิ นที�ผล ติได$. บทีควิามวิ จ�ย วิารสารวิ ทียาศัาสติร- ปั>ที� 23 (ฉบ�บที� 2 ) มหาวิ ทียาล�ยศัรนคร นทีรวิ โรฒ .

13. สาโรจน� ศึ ร ศึ�นสนยก�ล. 2543. แบคทีร โอซิ น: สารย�บย�4งจ( ล นที รย- ใน อ า ห า ร . ภู า ค ว ช า เ ที ค โน โล ย ช ว ภู า พื่ ค ณ ะอ� ติ ส า ห ก ร ร ม เ ก ษ ติ ร ม ห า ว ที ย า ล� ย เ ก ษ ติ ร ศึ า ส ติ ร� .

14. ส�พื่รรณ การ� ศึรบ�วทีอง. 2548. การค�ดเล อกแบคทีเรยกรดแลคติ กจากข� าวิหม�ก เพื � อ ใช� เปั3นกล� า เช 4 อขนมจนแปัAงหม�ก.ว ทียาน พื่นธุ์�ว ทียาศึาสติรมหาบ�ณฑ์ ติ, สาขาว ทียาศึาสติร�การอาหาร ภูาคว ชาว ทียาศึาสติร�และเทีคโนโลยการอาหาร.

15. ส�มณฑ์า ว�ฒนส นธุ์��. 2545. จ(ลชวิวิ ทียาทีางอาหาร.

ก ร� ง เ ที พื่ ฯ : โ ร ง พื่ ม พื่� ม ห า ว ที ย า ล� ย ธุ์ ร ร ม ศึ า ส ติ ร� .

16. ศึร�ณย� พื่รหมสาย. 2549. การแยกและการค�ดกรองแบคทีเรยกรดแลคติ กที�สามารถผล ติ แบคทีร โอซิ น.ว ทียาน พื่นธุ์�ว ทียาศึาสติรมหาบ�ณฑ์ ติ, สาขาชวว ทียา คณะว ที ย า ศึ า ส ติ ร� ม ห า ว ที ย า ล� ย เ ช ย ง ใ ห ม .

17. อรอนงค� พื่ร ,งศึ� ลกะ . 2550. แบคทีร โอซิ นที� สร$างจากแบคทีเรยแลคติ ก. บทีควิามวิ ชาการ วิารสารวิ ทียาศัาสติร- ปั>ที� 23 (ฉ บ� บ ที� 2) ม ห า วิ ที ย า ล� ย ศั ร น ค ร น ที ร วิ โ ร ฒ .

18. อ�จฉรา เพื่ �ม. 2549. แบคทีเรยแลคติ ก. กร�งเทีพื่ฯ:

ห จ ก . ภู า พื่ พื่ ม พื่�

19. Axelsson, L. 2004. Lactic acid bacteria : classification and physiology. In Salminen, S. and A. Wright. Lactic acid bacteria: microbiology and functional espects : third edition, revised and expanded. Marcel Dekker, Inc., New York.

20. Jones, R.J., Hussein, H.M., Zagorec, M., Brightwell, G. and Tagg, J.R.2008. Isolation of lactic acid bacteria with inhibitory activity against

pathogens and spoilage organisms associated with fresh meat. Food Microbiology. 25: 228-234.

21. Tamang, J.P., Tamang, B., Schillinger, U., Guigas, C., Holzapfel , W.H. 2009. Funtional properties of lactic acid bacteria isolated from ethnic fermented vegetables of the Himalayas. International Journal of Food Microbiology 135, 28-33.

22. Thongsanit, J., Tanikawa , M., Yano, S., Tachiki, T., and Wakayama, M. 2009. Identification of glutaminase-producing lactic acid bacteria isolated from Nham, a traditional Thai fermented food and characterisation of glutaminase activity of isolated Weissella cibaria. Annals of Microbiology. 59 (4): 715-720.