Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

  • View
    2.613

  • Download
    91

Embed Size (px)

Text of Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

I.

Tujuan Menentukan kadar protein dalam sampel putih telur ayam ras dengan metoda Lowry.

II.

Prinsip Reduksi Cu2+ menjadi Cu+ oleh asam amino aromatik dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan Fosfotungsat dan Fosfomolibdat dalam reagen Fenol membentuk warna biru sehingga dapat menyerap cahaya dan dapat diamati secara spektrofotometri.

III. Teori Pendahuluan Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel hidup dan merupakan 50% atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan dalam semua sel dan semua bagian sel. Protein juga amat bervariasi, ratusan jenis yang berbeda dapat ditemukan dalam satu sel. Semua protein, baik yang berasal dari bakteri yang paling tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan tertinggi, dibangun dari rangkaian dasar yang sama dari 20 jenis asam amino yang berikatan kovalendalam urutan yang khas. Karena masing-masing asam amino mempunyai rantai samping yang khusus, yang memberikan sifat kimia masing-masing individu, kelompok 20 molekul unit pembangun ini dapat dianggap sebagai abjad struktur protein. Yang paling istimewa adalah bahwa sel dapat merangkai ke-20 asam amino dalam berbagai kombinasi dan urutan, menghasilkan peptida dan protein yang mempunyai sifat-sifat dan aktivitas berbeda. Dari unit pembangun ini organisme yang berbeda dapat membuat produk-produk yang demikian bervariasi, seperti enzim, hormon, lensa protein pada mata, bulu ayam, jaring laba-laba, dan sebagainya.

Protein yang ditemukan kadang-kadang berkonjugasi dengan makromolekul atau mikromolekul seperti lipid, polisakarida dan mungkin fosfat. Protein terkonjugasi yang dikenal antara lain nukleoprotein, fosfoprotein, metaloprotein, lipoprotein, flavoprotein dan glikoprotein. Protein yang diperlukan organisme dapat diklasifikasikan menjadi dua golongan utama, yang pertama adalah protein sederhana yaitu protein yang apabila terhidrolisis hanya menghasilkan asam amino dan protein terkonjugasi, yaitu protein1

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

yang hidrolisis tidak hanya menghasilkan asam amino tetapi menghasilkan juga komponen anorganik yang disebut gugus prostetic.

Langkah awal dalam pemurnian protein ialah menentukan bahan alam yang akan diproses. Penentuan ini didasarkan pada kadar protein yang ada didalamnya. Tentu saja dipilih bahan alam yang mempunyai kadar protein yang tinggi dan mudah diperoleh. Analisis terhadap kadar protein dalam bahan alam tersebut perlu dilakukan untuk memperoleh data tentang kadar protein yang akan dimurnikan. Bila protein yang diinginkan tahan terhadap panas, campuran protein dapat dipanaskan sebentar untuk mengendapkan protein lain yang diinginkan. Disamping itu protein juga sensitif terhadap asam dan basa dengan konsentrasi tinggi, dan biasanya pemurnian protein dilakukan pada pH mendekati netral dengan menggunakan buffer tertentu. Setelah diperoleh larutan yang berisi beberapa macam protein maka proses selanjutnya ialah fraksionasi, yaitu memisahkan masing-masing protein dalam campuran secara fraksi demi fraksi. Dua cara yang biasa digunakan untuk proses fraksionasi ini yaitu pengendapan dan kromatografi.

Sampel Putih Telur Putih telur merupakan komponen terbesar dari sebuah telur utuh, yang menyusun sekitar 58% dari sebuah telur, dibandingkan dengan kuning telur yang hanya 31% saja. Komponen putih telur terdiri dari air (87%), protein (12%), dan lemak (0,3%). Kuning telur memiliki komponen protein lebih tinggi (17%) namun juga memiliki lemak yang jauh lebih besar (32,2%). Putih telur juga dinilai sebagai sumber protein yang baik karena mampu diserap tubuh secara sempurna untuk digunakan sebagai bahan pembentuk otot. Putih telur juga kaya akan asam amino esensial seperti Lisin, Threonin, Valin, Isoleusin, Leusin, Metionin, Fenilalanin, Tryptophan, dan Histidin. Putih telur juga disarankan sebagai sumber asupan protein berkualitas tinggi dalam pola diet. Konsumsi asupan tinggi protein telur dapat merangsang pembentukan otot (muscle protein synthesis).

2

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

Penentuan Konsentrasi Protein Penentuan konsentrasi protein merupakan proses yang rutin digunakan dalam kerja Biokimia. Ada beberapa metoda yang biasa digunakan dalam rangka penentuan konsentrasi protein, yaitu metoda Biuret, Lowry dan lain sebagainya. Pemilihan metoda yang terbaik dan tepat untuk suatu pengukuran bergantung pada beberapa faktor, seperti banyaknya material atau sampel yang tersedia, waktu yang tersedia untuk melakukan pengukuran dan alat spektrofotometer yang tersedia (VIS atau UV).

a. Metoda Kjeldahl Metoda Kjeldahl merupakan metoda yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan dengan alkali kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi. Metoda ini telah banyak mengalami modifikasi. Metoda ini cocok digunakan secara semimikro, sebab hanya memerlukan jumlah sampel dan pereaksi yang sedikit dan waktu analisa yang pendek. Cara Kjeldahl digunakan untuk menganalisis kadar protein kasar dalam bahan makanan secara tidak langsung, karena yang dianalisis dengan cara ini adalah kadar nitrogennya. Dengan mengalikan hasil analisis tersebut dengan angka konversi 6,25; diperoleh nilai protein dalam bahan makanan itu. Untuk beras, kedelai, dan gandum angka konversi berturut-turut sebagai berikut: 5,95; 5,71 dan 5,83. Angka 6,25 berasal dari angka konversi serum albumin yang biasanya mengandung 16% nitrogen. Prinsip cara analisis Kjeldahl adalah sebagai berikut: mula-mula bahan didestruksi dengan asam sulfat pekat menggunakan katalis selenium oksiklorida atau butiran Zn. Amonia yang terjadi ditampung dan dititrasi dengan bantuan indikator. Cara Kjeldahl pada umumnya dapat dibedakan atas dua cara, yaitu cara makro dan semimakro. Cara makro Kjeldahl digunakan untuk contoh yang sukar dihomogenisasi dan besar contoh 1-3 g, sedang semimikro Kjeldahl dirancang untuk contoh ukuran kecil yaitu kurang dari 300 mg dari bahan yang homogen. Cara analisis tersebut akan berhasil baik dengan asumsi nitrogen dalam bentuk3

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

ikatan N-N dan N-O dalam sampel tidak terdapat dalam jumlah yang besar. Kekurangan cara analisis ini ialah bahwa purina, pirimidina, vitamin-vitamin, asam amino besar, kreatina, dan kreatinina ikut teranalisis dan terukur sebagai nitrogen protein. Walaupun demikian, cara ini kini masih digunakan dan dianggap cukup teliti untuk pengukuran kadar protein dalam bahan makanan. Analisa protein cara Kjeldahl pada dasarnya dapat dibagi menjadi tiga tahapan yaitu proses destruksi, proses destilasi dan tahap titrasi. 1. Tahap destruksi Pada tahapan ini sampel dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga terjadi destruksi menjadi unsur-unsurnya. Elemen karbon, hidrogen teroksidasi menjadi CO, CO2 dan H2O. Sedangkan nitrogennya (N) akan berubah menjadi (NH4)2SO4. Untuk mempercepat proses destruksi sering ditambahkan katalisator berupa campuran Na2SO4dan HgO (20:1). Gunning menganjurkan menggunakan K2SO4 atau CuSO4. Dengan penambahan katalisator tersebut titk didih asam sulfat akan dipertinggi sehingga destruksi berjalan lebih cepat. Selain katalisator yang telah disebutkan tadi, kadang-kadang juga diberikan Selenium. Selenium dapat mempercepat proses oksidasi karena zat tersebut selain menaikkan titik didih juga mudah mengadakan perubahan dari valensi tinggi ke valensi rendah atau sebaliknya. 2. Tahap destilasi Pada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH3) dengan penambahan NaOH sampai alkalis dan dipanaskan. Agar supaya selama destilasi tidak terjadi superheating ataupun pemercikan cairan atau timbulnya gelembung gas yang besar maka dapat ditambahkan logam zink (Zn). Ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap oleh asam khlorida atau asam borat 4 % dalam jumlah yang berlebihan. Agar supaya kontak antara asam dan ammonia lebih baik maka diusahakan ujung tabung destilasi tercelup sedalam mungkin dalam asam. Untuk mengetahui asam dalam keadaan berlebihan maka diberi indikator misalnya BCG + MR atau PP. 3. Tahap titrasi Apabila penampung destilat digunakan asam khlorida maka sisa asam khorida yang bereaksi dengan ammonia dititrasi dengan NaOH standar (0,1 N). Akhir4

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

titrasi ditandai dengan tepat perubahan warna larutan menjadi merah muda dan tidak hilang selama 30 detik bila menggunakan indikator PP.

%N = N. NaOH 14,008 100%

Apabila penampung destilasi digunakan asam borat maka banyaknya asam borat yang bereaksi dengan ammonia dapat diketahui dengan titrasi menggunakan asam khlorida 0,1 N dengan indikator (BCG + MR). Akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna larutan dari biru menjadi merah muda.

%N = N.HCl 14,008 100 %

Setelah diperoleh % N, selanjutnya dihitung kadar proteinnya dengan mengalikan suatu faktor. Besarnya faktor perkalian N menjadi protein ini tergantung pada persentase N yang menyusun protein dalam suatu bahan.

b. Metoda Biuret Uji Biuret adalah tes yang digunakan untuk mendeteksi adanya ikatan peptida. Bersama peptida, ion tembaga (II) membentuk kompleks berwarna ungu dalam larutan alkali. Beberapa varian pada tes telah dikembangkan. Reaksi biuret dapat digunakan untuk uji konsentrasi protein karena ikatan peptida terjadi dengan frekuensi yang sama per asam amino dalam peptida. Intensitas warna, dan karenanya serapan pada 540 nm, berbanding lurus dengan konsentrasi protein, menurut hukum Beer-Lambert. Terlepas dari namanya, reagen tidak ternyata mengandung biuret ((H 2N-CO-) 2NH). Tes ini dinamakan demikian karena ia juga memberikan reaksi positif terhadap ikatan peptida dalam mol