PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI … · Yang berrancia tangan cli bawah ini. siiya rtrahasisu,a L,nivcrsitas Siutata DhiLn-na: Nau-rii : Yuliana Rati Karnat'a Dcw,i ... dari

PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS

ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL

DAUN LADA (Piper nigrum L.)

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Yuliana Rati Kamara Dewi

NIM: 128114017

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2016

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i



DAUN LADA (Piper nigrum L.)

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:


NIM: 128114017

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2016


Persetujuan Pembimbing


ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL-ASETAT EKSTRAK METANOL

DAUN LADA (Piper nigrumL.)

Skripsi yang diajukan oleh:

Yuliana Ratih Kamara Dewi

NIM: 128114017

Telah disetujui oleh:

Pembimbing Utama

-/11"/ {rI

Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si.. Apt.)7 lu

tarrggal ....'.....J...h, ,D jL


Pengesahan Skripsi Berjudul

PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTNTTAS


DAUN LADA (Piper nigrumL;1

Oleh:


NIM: lz81l4}n

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

pada tanggal: 20 Juli 2016

Mengetahui

(Aris ;M.Si., Ph.D., Apt.)

Panitia Penguji:

L Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt.

2. Yohsnes Dwiatmaka, M.Si.

3. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt.

rll

'pEilT, U;'7^r Y.'i'

\ -b#


PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya rnc'rr1'lLtakan ilengrin sesunggr-rhnya bahrva skripsi vang sa\a 1r-rlis ini

ticlak rnemuat kar,va atau bagian dalj karya ()riu-r-s lain- kccuali van-rr tclah

disebr-rtlian dalan-r kr-rtipan rian clatir"u-trustaka, seba-qaimana layakn.,'a kar-y'a rlrniah.

Apabila di kemudian hari ciiternukan inclikasi plagiarisme dalanr nasl.:alr

ini, rnaka saya berseclia rnenanggung segala sanksi peraturan pcrunclang-uurlarrgan

vzrng berlaku.

Yogyakaria. 27 Juni 20I(r

Penr-rlis

\''uiiana Riiti Kamara Dcui

iv


LEi\'IB;\R PERNI'A]-AAN PERSETUJUi\N I'}LjBLIK'\S! KARYA II,NIIAHTINTTIK KEPENTINGAI\ AKADE} I IS

Yang berrancia tangan cli bawah ini. siiya rtrahasisu,a L,nivcrsitas Siutata

DhiLn-na:

Nau-rii : Yuliana Rati Karnat'a Dcw,i

Norror N,lahasisu,a : 1281 14011

l)enti ircngerrbangan ihnu ncngetahuan. siiy;a rnerrberikan kcpacia Pcrpustakaan

Ljniversitir*s Saniita f)hanna kary,'a ilrniah sa-va vang beriutlul:

PENETAPAN KA]\T,UNGAN FENOLIK TOTAT- DAN T].II AKTI\IITAS

,{NTI0KSID.\N FIIAKSI ETIL ASETAI- EKSTR..\K }tE'I\NOL DATJN

LADA (Piper nigrum L.).

Besefia peratrgltat y'ang diperiukan (bila ada). Deng_ran cletrikiair sa\ r tnentbcrikan

keparia Petpustlrkaan Universitas Sanata Dhai'nra hak Llntrlk nrelvir-r-rpiir-r.

rnengalihkatt clalam bentuk meclia lain. mengcloian\a cialarn hentuk pangkalan

clata" tnenclistribusikan scoaril terbatas, c'ian mcutpr-rbliiiasikai-lt_r'a ili iitiernet ataur

media lain rurtuk kepentrngan akadenris tanpa perlu ntentirrta ijin dari sa1,a

lllallpuil rnen-,berikan royalti kepada saYa selarna tctap rnenclrntLu.nkan narla saya

sebagai penulis.

Dcngiur clernikian pcnrr,irtaan ini saya buat clengan sebenarnva.

DibLrat di Yog,vakarla

Pacla tan ugal 2 7 jLili 20 I (r

Yang nrer-ivatakait

(\'Lrliana Rali l(antar-a Deu'i)


vi

HALAMAN PERSEMBAHAN

Dear God,

Thank you for creating such a magical piece Known as a “smile”. It’s

indescribable, the feeling when someone smiles at you sincerely, and their eyes

sparkle as they do so. No matter how close, no matter how much of a stranger, a

sincere smile just melts the heart.

Dear God,

Thank you for creating another magical piece known as a “cry”. The

feeling of seeing someone cry warms my heart, because it simply shows how

fragile and connected we all are. And, the feeling when i my self cry, it brings

relief and appreciation to life.

Dear God,

I enjoy talking to You

~Dian Rikasari~

Ku persembahkan karya ini untuk:

Tuhan Yesus Kristus, Bunda Maria

Papa Kolai, Mama Emma, dan Kakak ku tercinta Maria

Semua keluarga besar serta para sahabat yang selalu mendukung & medoakan ku

He has made everything beautiful in it’s time.

Ecclesiastes 3 : 11


vii

PRAKATA

Puji dan syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan rahmat-

Nya serta segenap kasih-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi

dengan baik yang berjudul “Penetapan Kandungan Fenolik Total dan Uji

Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Daun Lada (Piper

nigrum L.)”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat untuk

memperoleh gelar Sarjana Strata Satu (S1) Program Studi Farmasi (S.Farm) di

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Dalam proses penyusunan skripsi ini penulis banyak mendapat bantuan

dan bimbingan dari berbagai pihak, sehingga penulis ingin mengucapkan terima

kasih kepada:

1. Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt. sebagai Dosen Pembimbing yang telah

memberikan bimbingan, pengarahan, serta ilmu dalam penelitian dan

penyusunan skripsi ini.

2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. sebagai Dosen Penguji atas masukan, kritik,

saran dan kesediaannya menguji skripsi ini.

3. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. sebagai Dosen Penguji atas masukan,

kritik, saran dan kesediaannya menguji skripsi ini.

4. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. sebagai Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma.

5. Agustina Setiawati, M.Sc., Apt. sebagai Kepala Penanggung Jawab

Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas izin

penggunaan laboratorium yang diberikan kepada penulis.

6. Segenap laboran dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma,

khususnya Pak Wagiran, Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Sigit, Mas Agung, dan

Pak Ketul atas bantuan dan kerjasamanya selama ini.

7. Mama, Papa, Kak Maria, atas dukungan, doa, kasih sayang dan semangat

yang diberikan, yang selalu mengingatkan penulis untuk tidak mudah


viii

menyerah dan selalu menyertakan Tuhan Yesus Kristus dan Bunda Maria

dalam menjalani segala sesuatu.

8. Sepupu-sepupuku tercinta Gita, Andri, Kori, Tuti,Yuyun, Titin, Sari, Fran dan

segenap keluarga besar yang tidak bisa saya sebutkan satu per satu atas

dukungan dan doanya.

9. Teman-teman skripsi payung piperaceae, Violeta Jesmile, Maria Indah

Rosari, Agatha Herny Sekar Natalia, dan Clementia Nova, terimakasih atas

suka, duka dan kerjasmanya yang telah dilewati bersama selama penelitian

ini.

10. Sahabat penulis: Violeta, Hossianna Yosi Agustina, Elisabeth Sarci Fitriwati

Enny, Fransisca Melani, Monika Meitasari Astuti, Dewi Anugrah Fitriani,

Indah, Agtha yang selalu menjadi tempat berbagi suka dan duka, selalu

memberikan dukungan dan semangat. Terima kasih atas kebersamannnya

selama ini, senang bisa mengenal kalian.

11. Teman-teman KKN reguler kelompok 32: Agustinus Bambang Satria Utama,

Lucia Ida Ayu Kristiana, Kurnia Novariany, terima kasih atas dinamika, tawa,

canda dan persahabatannya selama KKN sampai KKN berakhir. Bisa bertemu

dan mengenal kalian adalah salah satu anugerah terindah dalam hidupku.

12. Teman-teman kost Amakus: Kak Ita, Kak seruni, Kak Herta, Kak Nita, Kak

Intan, Kak Dewi, Kak Geka, Eni, Esthy, Friesca, Ratri, Indah, Herlina,

Karina, Penina, Chyntia, Valent terima kasih atas kebersamaannya selama ini.

13. Teman-teman angkatan 2012 yang luar biasa, khususnya FSM A dan FKK A

2012 yang telah memberikan semangat dan dukungan bagi penulis, terima

kasih atas kebersamaannya.

14. Semua pihak yang turut membantu dalam penyusunan skripsi ini yang tidak

dapat disebutkan satu persatu.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan baik dari segi penelitian

maupun penyusunan skrips. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan

saran yang membangun. Semoga penulisan skripsi ini dapat memberikan manfaat

bagi seluru pihak serta mendukung perkembangan ilmu pengetahuan.


ix

Yogyakarta, ……Juni 2016

Penulis


x

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ...................................................... iv

PERSETUJUAN PUBLIKASI .................................................................... v

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... vi

PRAKATA .................................................................................................. vii

DAFTAR ISI ................................................................................................. x

DAFTAR TABEL ........................................................................................ xi

DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xii

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xii

ABSTRAK ................................................................................................. xiv

ABSTRACT ................................................................................................. xv

PENDAHULUAN ....................................................................................... 1

METODE PENELITIAN .............................................................................. 2

HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................... 6

KESEMPULAN DAN SARAN .................................................................. 13

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 14

LAMPIRAN ................................................................................................ 16


xi

Daftar Tabel

Halaman

Tabel I. Hasil pengukuran absorbansi kurva baku asam

galat replikasi 3 ..................................... .................................... 8

Tabel II. Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat

daun Lada ....................................................................................... 9

Tabel III. Perhitungan persen inhibisi berdasarkan

absorbansi hari ke-6 ....................................................................... 11

Tabel IV. Aktivitas antioksidan sampel (Fraksi Etil Asetat Ekstrak

Metanol Daun Lada) dengan metode TBA ........................................... 13


xii

Daftar Gambar

Halaman

Gambar 1. Reaksi Reagen Folin-Ciocalteu Dengan .......................................

Senyawa Fenol ............................................................................. 8

Gambar 2. Reaksi Pembentukan Kompleks Fe3+-Tiosianat dari

Kompleks Fe2+ Tiosianat oleh Hiperoksida ................................ 9

Gambar 3. Profil Kenaikan Rata-Rata Absorbansi Kontrol Negatif

Kontrol Positif, dan Sampel Fraksi Etil Asetat Ekstrak

Metanol Daun lada ................................................................... 11

Gambar 4. Reaksi Pembentukan Kompleks MDA-TBA ............................ 12


xiii

Daftar Lampiran

Halaman

Lampiran 1. Surat Determinasi Tanaman ................................................. 17

Lampiran 2. Klasifikasi Tanaman Lada ................................................... 18

Lampiran 3. Perhitungan Penetapan Kadar Air ........................................ 18

Lampiran 4. Perhitungan Rendemen Ekstrak dan Fraksi ......................... 19

Lampiran 5. Data Penimbangan Untuk Kandungan Fenolik Total .......... 19

Lampiran 6. Data Perhitungan Konsentrasi Asam GalatDan Fraksi

Etil Asetat Untuk Penetapan Kandungan Fenolik Total ...... 20

Lampiran 7. Hasil Optimasi Operating Time Untuk Penetapan

Kandungan Fenolik Total .................................................... 22

Lampiran 8. Optimasi Panjang Gelombang Maksimum Untuk


Lampiran 9. Hasil Pengukuran Kurva Baku Untuk Penetapan


Lampiran 10. Perhitungan Kandungan Fenolik Total

Fraksi Etil Asetat ................................................................. 27

Lampiran 11. Data Penimbangan untuk Uji Aktivitas Antioksidan

Metode FTC-TBA ............................................................... 28

Lampiran 12. Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan FTC-TBA ...... 29

Lampiran 13. Perhitungan Persen Inhibisi Uji Aktivitas Antioksidan

Metode FTC-TBA ............................................................... 33

Lampiran 14. Hasil Pengukuran Uji Aktivitas Antioksidan

Dengan Metode TBA ........................................................... 35

Lampiran 15. Gambar Proses Penelitian .................................................... 37


xiv

ABSTRAK

Tanaman Lada (Piper nigrum L.) termasuk dalam famili Piperaceae yang

diketahui memiliki kandungang kimia yaitu Flavonoid yang termasuk dalam

golongan senyawa polifenol. Polifenol merupakan senyawa utama yang paling

banyak terdapat pada tanaman, yang memiliki potensi sebagai antioksidan. Tujuan

dari penelitian ini adalah untuk mengetahui seberapa besar kandungan fenolik

total dan aktivitas antioksidan yang terdapat dalam fraksi etil asetat ekstrak

metanol daun lada (Piper nigrum L.). Penetapan kangungan fenolik total

dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu, sedangkan untuk pengukuran aktivitas

antioksidan dilakukan dengan metode Ferric Thiocyanate (FTC) dan

Thiobarbituric Acid (TBA) dengan menggunakan BHT (butylated hydroxy

toluene). Jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lemak diukur dengan

metode FTC, sedangkan jumlah peroksida pada tahap kedua diukur dengan

metode TBA. Hasil penelitian menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak

metanol daun lada mempunyai kandungan fenolik total sebesar 133,83 ± 5,4365

mg ekivalen asam galat. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol

daun lada dengan metode FTC dan TBA secara berturut-turut sebesar (5,061 ±

0,598)%, dan (93,19 ± 2,245)%.

Kata kunci: Lada, Piper nigrum L. Fenolik Total, Metode Folin-Ciocalteu,

Antioksidan, Metode Ferric Thiocyanate (FTC), Metode Thiobarbituric Acid

(TBA).


xv

ABSTRACT

Pepper is a plant in piperaceae family which has been known to have

phytochemical content such as flavonoid included in the polyphenol group.

Polyphenol is the most numerous main compound in plant which have a potential

as antioxdant. The aim of this research were to measure total phenolic content and

antioxidant activity in ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves

(Piper nigrum L.) total phenolic content were measured by Folin-Ciocalteu

method mean while antioxidant activity were measured by ferric thiocyanat (FTC)

method and thiobarbituric acid (TBA) using BHT (butylated hydroxy toluene.

Peroxide amount in the first stage of lipid peroxidation were measured by FTC

method, meanwhile ferric-thiocyanate complex reaction and to measure peroxide

amount in the secound stage of lipid peroxidation were measured by TBA metho.

The result showed that ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves

has a total phenolic content of 133,83 ± 5,4365 mg gallic acid equivalents (GAE).

Antioxidant activity of ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves

showed as percent inhibition value was (5,061 ± 0,598)%, and (93,19 ± 2,245)%

for FTC and TBA method respectively.

Keywords: Piper nigrum L., Phenolic Content, Antioxidant, Folin-Ciocalteu

Method, Ferric Thiocyanat (FTC) Method, Thiobarbituric Acid (TBA).


1

1. Pendahuluan

Berbagai penyakit dalam tubuh disebabkan oleh adanya radikal bebas.

Radikal bebas merupakan molekul berbasis oksigen atau nitrogen dengan elektron

tidak berpasangan yang umumnya dihasilkan di dalam tubuh pada saat proses

metabolisme. Radikal bebas yang berlebihan dapat mengakibatkan penyakit-

penyakit degeneratif seperti diabetes, penyakit jantung dan kanker (Winarsi,

2011).

Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat melindungi kerusakan

sel karena mampu menetralkan radikal bebas dengan mekanisme mendonorkan

atom hidrogen ke atom yang tidak memiliki pasangan elektron (Muhtadi, 2014.)

Senyawa fenolik dari tanaman obat memiliki berbagai bioaktivitas yang

memainkan peran penting dalam pencegahan kanker. Bioaktvitas dari senyawa

fenolik memiliki efek misalnya, antioksidan, anti kanker, antimutagenik dan anti

inflamasi (Huang dan Cai, 2010). Senyawa fenolik berfungsi sebagai antioksidan

karena senyawa fenolik dapat bereaksi dengan reactive oxygen species (ROS) dan

menghilangkan aktivitas radikalnya sehingga tidak berbahaya lagi terhadap sel

tubuh manusia (Sochor et al., 2010).

Rempah-rempah dan tanaman herbal merupakan salah satu sumber

antioksidan alami dan memiliki peran penting dalam pencegahan penyakit kanker

dan penuaan dini. Salah satu famili tanaman yang telah diketahui menunjukkan

potensi yang besar sebagai antioksidan adalah Piperaceae (Dodson, et al., 2000).

Piper nigrum atau biasa disebut lada merupakan salah satu tanaman dalam famili

piperaceae. . Pada penelitian yang dilakukan oleh Nahak dan Sahu (2011) daun

lada diketahui memiliki kandungan kimia seperti: alkaloid, glikosida, terpenoid,

steroid, flavonoid, tanin, gula pereduksi, dan antrakuinon. Flavonoid termasuk

dalam golongan senyawa polifenol. Polifenol merupakan senyawa utama yang

paling banyak terdapat pada tanaman, yang memiliki aktivitas antioksidan.

Pemilihan fraksi etil asetat didasarkan pada kemampuannya dalam

menarik senyawa-senyawa yang bersifat kurang polar. Flavonoid yang terkandung

dalam daun lada merupakan senyawa fenolik yang bersifat kurang polar, sehingga

dengan pelarut etil asetat diharapkan senyawa flavonoid yang terdapat dalam daun


2

lada dapat terambil secara optimal (Andersen dan Markham, 2006). Sedangkan

pemilihan ekstrak metanol didasarkan pada penelitian Cowan (1999) yang

menyatakan bahwa metanol dapat menarik lebih banyak senyawa metabolit

dibandingkan dengan air, etanol, klorofrom, diklorometanol, eter dan aseton.

Berdasarkan latar belakang tersebut, maka dalam penelitian ini ingin

mengetahui seberapa besar aktivitas antioksidan dari daun lada (Piper nigrum L.)

dengan menggunakan metode Ferric Thiocyanate (FTC) dan Thiobarbituric Acid

(TBA). Untuk mendukung hasil aktivitas antioksidan yang didapat maka pada

penelitian ini dilakukan penentuan jumlah fenolik total untuk mempresentasikan

jumlah fenolik yang menyebabkan aktivitas antioksidan.

2. Metode penelitian

A. Alat dan Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Daun lada segar yang

diperoleh dari kebun obat “MERAPI FARMA” daerah KM 21,5, Kaliurang,

Cangkringan, Sleman, Yogyakarta. Akuades, metanol teknis,metanol p.a 99,6%,

etanol p.a 99,6 %, etanol 75%, etil asetat p.a, buffer fosfat 0,05m (pH7), asam

galat p.a (sigma), reagen Folin-Ciocalteu, larutan Na2CO3 1 M, amonium tiosianat

30%, FeCl3 0,02 M, asam linoleat 2,5% (sigma), larutan asam trikloroasetat (TCA

10%), larutan tiobarbitarat 0,67%, dan BHT (butylated hydroxy toluene) p.a

(Sigma).

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: neraca analitik (Scalec

SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Junke & Kunkel), waterbath

(labo-tech, Heraeus), vortex (Janke & Kunkel), spektrofotometer UV-VIS

(Shimadzu UV mini), blender, corong Buchner, oven, mikropipet 10-1000µL; 1-

10 mL (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup, dan alat-alat gelas yang

lazim digunakan dilaboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).


3

B. Persiapan sampel

1. Pembuatan simplisa

Tanaman lada diperoleh dari kebun obat “MERAPI FARMA” daerah KM

21,5, Kaliurang, Cangkringan, Sleman, Yogyakarta. Pengumpulan dilakukan pada

bulan maret 2016. Determinasi tanaman Lada dilakukan di Laboratorium

Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

Determinasi tanaman lada ini untuk memastikan bahwa tumbuhan yang

digunakan untuk penelitian benar-benar tumbuhan lada. Daun lada dicuci dengan

cara dialiri dengan air mengalir sambil dibersihkan kotoran yang melekat pada

daun. Pencucian dilakukan sebanyak tiga kali, agar daun lada bersih dari

pengotor. Daun lada dirajang dengan ukuran seragam kurang lebih 1 cm. Daun

lada yang masih basah kemudian dikeringkan menggunakan oven dengan suhu

60o

C. Daun lada yang telah kering ditunjukan dengan mudah hancurnya daun

ketika diremas. Setelah itu, daun lada kering dipisahkan dari bahan-bahan

pengotor yang ikut serta selama proses pengeringan. Daun lada dibuat menjadi

serbuk dengan blender, kemudian dilakukan pengayakan dengan ayakan nomor

mesh 50, kemudian dilakukan uji kadar air dan dilakukan perhitungan rendemen

ekstrak. Serbuk daun lada yang telah diperoleh kemudian disimpan dengan cara

membungkus serbuk menggunakan wadah kedap udara. Penyimpanan serbuk

daun lada dilakukan pada suhu ruangan.

2. Pembutan ekstrak metanol daun lada (Piper nigrum L.)

Pembuatan ekstrak metanol lada mengacu pada jurnal penelitian Artini et

al., (2013) sebanyak 31,509 g serbuk simplisia daun Lada ditimbang, kemudian

dimaserasi dengan pelarut metanol sebanyak 100 mL hingga simplisia terendam

sempurna. Maserasi dilakukan selama 24 jam pada suhu ruangan dan terlindung

dari sinar matahari langsung, dilakukan pengojokan secara otomatis dengan

menggunakan shaker setelah 24 jam dimaserasi, filtrat disaring dengan

menggunakan corong Buchner dan ampasnya diremaserasi dengan metanol

selama 24 jam lalu disaring, proses maserasi dihentikan ketika sudah diperoleh

filtrat yang bening, yang menandakan bahwa senyawa aktif dalam sampel telah

terekstrak secara sempurna. Pelarut pada filtrat dihilangkan dengan cara diuapkan


4

menggunakan vacuum rotary evaporator pada suhu 400C. Kemudian diuapkan

kembali dengan menggunakan water bath ada suhu 40 0C untuk diperoleh ekstrak

kental yang bebas dari penyari yang diketahui melalui selisih antar penimbangan

ekstrak pertama dan penimbangan kedua sebesar 0,0005.

3. Pembuatan fraksi etil asetat ekstrak metanol Daun Lada

Ekstrak kental yang diperoleh difraksinasi menggunakan metode cair-cair.

Ekstrak kental dilarutkan dalam akuades hangat, kemudian difraksinasi

menggunakan etil asetat dengan perbandingan akuades : etil asetat 1:1 v/v

didalam corong pisah. Terbentuk dua lapisan, yaitu lapisan air dan lapisan etil

asetat. Lapisan etil asetat (bagian atas) kemudian diambil dan ditampung dalam

wadah. Lapisan air (bagian bawah) difraksinasi kembali menggunakan etil asetat

dengan perbandingan yang sama. Tahapan ini diulang hingga fraksi jernih. Fraksi

etil asetat kemudian dipekatkan menggunakan vaccum rotary evaporator pada

suhu 770C yang merupakan titik didih dari etil asetat. Fraksi etil asetat pekat

kemudian dikeringkan menggunakan waterbath. Fraksi etil asetat yang diperoleh

kemudian di simpan dalam desikator.

C. Penetapan kandungan fenolik total.

Larutan sampel dibuat dengan menimbang fraksi eti asetat ekstrak metanol

daun lada sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan dalam 10 mL metanol:air (1:1)

sehingga didapatkan konsentrasi larutan stok 1 mg/mL. Kemudian dibuat larutan

intermedietdengan konsentrasi 200 µg/mL. Sebanyak 0,5 mL larutan intermediet

dengan konsentrasi 200 µg/mL. Sebanyak 0,5 mL larutan intermediet dicampur

dengan 2 mL reagen Folin-Ciocalteu dan diinkubasi selama 5 menit. Selanjutnya

ditambahkan 4 ml larutan Na2CO3 1 M kemudian didiamkan selama operating

time yang telah ditentukan sebelumnya yaitu 30 menit dan dibaca pada panjang

gelombang 753 nm,yang merupakan hasil dari penentuan panjang gelombang

maksimum. Replikasi dilkukan sebanyak 3 kali. Kurva baku asam galat dibuat

dengan konsentrasi 40; 50; 60; 70; 80 µg/mL. Hasil dinyatakan sebagai GAE

(gallic acid equivalent)/g ekstrak.


5

D. Uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC-TBA

a. Pembuatan larutan A

Larutan A dibuat dengan menimbang fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada

sebanyak 4 mg, dilarutkan dengan etanol pada tabung raksi bertutup, kemudian

ditambahkan 4,1 mL asam linoleat 2,5 % , 8 mL buffer fosfat (pH 7) 0,05 m, 3,9

mL aquadest kemudian diinkubasi didalam oven dengan suhu 37-40oC selama 24

jam. Dibuat replikasi sebanyak 3 kali.

b. Pembuatan larutan B

Preparasi larutan B dibuat dengan cara menambahkan 9,7 mL etanol 75% dengan

0,1 mL ammonium thiocyanate 30% dalam tabung flakon, selanjutnya

ditambahkan 100µL sampel larutan A yang sudah diinkubasi selama 24 jam,

100µL FeCl3 0,02 m ditunggu selama operating time yaitu 5 menit dan diukur ada

panjang gelombang 488,5 nm.

E. Penegasan aktivitas antioksidan dengan metode TBA

Larutan sampel dan larutan standar yang digunakan pada metode FTC

pada hari terakhir diambil sebanyak 2 mL dan ditambahkan 1 mL larutan

trikloroasetat 20%, 2 mL larutan asam tiobarbiturat 0,67%. Setelah didihkan

selama 10 menit, sampel didinginkan, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan

3.000 rpm selama 30 menit. Absorbansi supernatan dibaca pada panjang

gelombang 532 dengan spektrofotometer visibel.

F. Analisis data

1. Penetapan kandungan fenolik total

Kandungan fenolik total dinyatakan dalam nilai mg ekivalen asam galat per gram

fraksi etil asetat. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier dengan data

kurva baku asam galat, sehingga diperoleh kandungan fenolik total dengan

perhitungan menggunakan rumus:

Kandungan fenolik total = X

X = kadar fenolik yang diperoleh dari persamaan kurva baku (mg/ml)

v = volume akhir larutan dikali faktor pengenceran (ml)

m = bobot fraksi (gram)

2. Uji aktivitas antioksidan


6

Aktivitas antioksidan dengan metode FTC-TBA dinyatakan dalam persen inhibisi

yang dapat dihitung dengan rumus:

Persentase inhibisi = 100 – [( ) ]

A1 = absorbansi maksimum sampel

A0 = absorbansi maksimum kontrol negatif

3. Analisis statistik

Analisis statistik dilakukan dengan One Sampel T-Test menggunakan program

PSPP untuk persen inhibisi antar kelompok kontrol positif dan sampel (fraksi etil

asetat ekstrak metanol daun Lada) pada FTC dan TBA untuk melihat perbedaan

keduanya.

3. Hasil dan Pembahasan

Senyawa fenolik termasuk fenol sederhana, asam fenolik, kumarin,

flavonoid, stilbenes, hydrolysabl, tanin terkondensasi, lignan, dan lignin. Senyawa

fenolik merupakan metabolit sekunder yang paling banyak terkandung dalam

tanaman. Senyawa tersebut berfungsi sebagai pencegahan proses pigmentasi,

antioksidan dan agen pelindung terhadap sinar UV (Kambojo et al., 2015).

Banyak metode yang digunakan untuk mengkuantifikasi senyawa fenolik.

Salah satu metode yang sering digunakan adalah kuantifikasi dengan

sektrofotometri, karena mudah dilakukan, cepat dan dapat diterapkan

dilaboratorium secara rutin, dan murah. Reaksi kolorimetri banyak digunakan

dalam metode spektrofotometri UV-VIS. Metode ini akan mengukur konsentrasi

senyawa fenolik secara total dalam ekstrak tumbuhan (Blainski, et al., 2013).

Prinsip metode kolorimetri Folin Ciocalteu adalah reaksi oksidasi yang cepat

dengan menggunakan alkali (biasanya natrium karbonat), dimana nilai yang

didapat signifikan dengan ion fenolat (Cicco dan Latanzio, 2011)

Penentuan operating time dilakukan dengan tujuan agar reaksi antara

gugus hidroksi dari senyawa fenolik dan reagen Folin-Ciocalteu dapat berjalan

maksimal. Keadaan reaksi yang optimum ditunjukan dengan nilai absorbansi yang

relatif stabil. Pada saat terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna akan

terus meningkat hingga pada waktu tertentu akan diperoleh absorbansi yang

stabil. Namun semakin lama waktu pengukuran, ada kemungkinan senyawa


7

berwarna tersebut akan mengalami kerusakan sehingga menyebabkan intensitas

warnanya menurun dan absorbansinya juga menurun (Gandjar dan Rohman,

2007).

Penentuan operating time pada metode Folin-Ciocalteu untuk penetapan

kandungan fenolik total ini dilakukan selama 60 menit. Absorbansi larutan diukur

setiap 5 menit pada panjang gelombang teoritis (750 nm). Absorbansi yang

diperoleh selama 60 menit kemudian dilihat pada menit keberapa menghasilkan

absorbansi yang cenderung stabil atau selisihnya kecil. Operating time yang

didapat untuk penetapan kandungan fenolik total adalah 30 menit. Pada waktu

tersebut diperoleh nilai absorbansi yang stabil.

Penentuan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk mendapatkan

nilai serapan maksimum dari hasil reaksi antara asam galat dengan reagen Folin-

Ciocalteu. Pengukuran suatu analit harus pada panjang gelombang maksimum

karena pada panjang gelombang maksimum kepekaannya tinggi, sehingga

perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah paling besar

(Gandjar dan Rohman, 2007). Pada panjang gelombang maksimum digunakan

tiga tingkat konsentrasi yaitu rendah (40 µg/mL), sedang (60 µg/mL), tinggi (80

µg/mL). Tujuan dilakukan scanning pada tiga tingkat konsentrasi yang berbeda

adalah untuk mempresentasikan panjang gelombang maksimum pada tiap

konsentrasi. Pengukuran lambda maksimum dilakukan pada rentang panjang

gelombang 600-800 nm.

Panjang gelombang maksimum yang digunakan adalah 735 nm. Hasil

yang diperoleh dari scanning panjang gelombang maksimum menunjukan hasil

yang berbeda dengan lambda maksimum teoritis. Hal ini dapat disebabkan oleh

beberapa hal antara lain jenis pelarut, pH larutan, suhu, konsentrasi tinggi, dan

zat-zat penganggu (Gandjar dan Rohman, 2007).

Penetapan kandungan fenolik total dimulai dengan membuat kurva baku

asam galat. Asam galat digunakan sebagai standar kurva baku karena asam galat

merupakan senyawa polifenol yang dapat menggambarkan senyawa fenolik dalam

suatu sampel. Tidak semua persamaan regresi linier digunakan dalam menentukan

kandungan fenolik total. Persamaan regresi dengan linearitas terbaik (nilai R


8

mendekati 1) akan digunakan untuk menentukan kandungan fenolik total. Tabel I

berikut ini menunjukkan hasil pengukuran absorbansi kurva baku asam galat yang

digunakan.

Tabel I. Hasil pengukuran absorbansi kurva baku asam galat replikasi 3

Konsentrasi Absorbansi Persamaan regresi

40,4 µg/Ml 0,369 A = 0,0974

B = 0,00662

r = 0,9924

y = 0,00662x 0,0974

50,5 µg/mL 0,424

60,6 µg/mL 0,492

70,7 µg/mL 0,587

80,8 µg/mL 0,622

Persamaan yang digunakan dalam menentukan kandungan fenolik total

adalah persamaan regresi dari replikasi ketiga, yaitu y = 0,00624x + 0,0974

dengan linearitas sebesar 0,9924. Nilai linearitas menunjukan korelasi antara

konsentrasi dan absorbansi yang dihasilkan. Semakin baik nilai linearitas (nilai R

sama dengan 1 atau mendekati 1) maka korelasinya juga semakin baik.

Uji kandungan fenolik total bertujuan untuk mengetahui jumlah fenol yang

terdapat pada sampel. Uji kandungan fenolik total dilakukan dengan

menggunakan metode Folin-Ciocalteu. Kompleks biru yang terbentuk terjadi

karena reaksi oksidasi reduksi dari fenolat senyawa uji dengan pereaksi fenol

Folin-Ciocalteu. Dimana oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen molibdotungstat

akan membentuk kompleks berwarna biru di sekitar panjang gelombang 745-750

nm (Ronald, et al., 2005). Adapun reaksi yang terjadi sebagai berikut:

Gambar 1. Reaksi reagen Folin-Ciocalteu dengan senyawa fenol


9

Tabel II. Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanol

daun lada

Konsentrasi Absorbansi Kandungan

Fenolik total

Rata-rata

SD % CV

Replikasi 1 200 µg/mL 0,270 130,5 133,83 ±

5,4365 4,0622 % Replikasi 2 200 µg/mL 0,269 129,5

Replikasi 3 200 µg/mL 0,285 141,5

Tabel II menunjukan hasil pengukuran sampel uji pada penetapan

kandungan fenolik total. Absorbansi sampel yang diperoleh kemudian

dimasukkan ke dalam persamaan regresi linier yang telah didapatkan. Hasil

perhitungan menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada

memiliki nilai kandungan fenolik total sebesar 133,83 ± 5,4365 mg ekivalen asam

galat. Radikal bebas dan peroksidasi lemak dalam tubuh dapat menyebabkan

penyakit degeneratif seperti kanker, atherosklerosis dan inflamasi, dengan adanya

senyawa antioksidan kecepatan peroksidasi lemak dapat dikurangi (Thitilertdecha,

et al.,1999).

Salah satu metode penentuan aktivitas antioksidan adalah metode FTC

(Ferri-tiosianat) yang mengukur jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi

lemak (Aris, et al., 2009). Pada metode FTC, asam linoleat yang digunakan

sebagai sumber peroksida. Peroksida yang terbentuk akan bereaksi dengan FeCl2

untuk membentuk ion Fe3+ yang kemudian bereaksi dengan ammonium tiosianat

(SCN) membentuk kompleks ferri-tiosianat (Fe(SCN)3) berwarna merah yang

dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang teoritis

500 nm. Adapun reaksi yang terjadi sebagai berikut

Gambar 2. Reaksi pembentukan kompleks Fe3+-tiosianat dari kompleks Fe2

+

tiosianat oleh hidroperoksida (Moon dan Shibamoto, 2009)

Beberapa penelitian umumnya menggunakan metode FTC untuk

mengukur jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lipid dilanjutkan dengan

penggunaan metode TBA (thiobarbituric acid) untuk mengukur jumlah peroksida


10

pada tahap kedua peroksidasi lipid dan mengukur radikal bebas yang ada setelah

oksidasi peroksida (Aqil, et al., 2006; Rezaeizadeh, et al., 2011).

Penentuan operating time pada uji aktivitas antioksidan dengan metode

FTC dilakukan dengan menggunakan antioksidan sintesis yaitu Butylated

hydroxyrotoluene (BHT) sebagai kontrol positif yang diukur selama 10 menit,

dengan waktu pengukuran pada menit ke- 1,3, 5, 7, dan 10 secara triplo.

Pengukuran dilakukan menggunakan spektrofotometri UV-Vis pada panjang

gelombang teoritis yaitu 500 nm (Aris, et al., 2009). Dari pengukuran diperoleh

operating time untuk metode FTC adalah 5 menit, yang ditunjukkan dengan nilai

absorbansi yang stabil.

Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan bertujuan untuk

mendapatkan daerah serapan maksimum. Pada uji aktivitas antioksidan metode

FTC dilakukan dengan menggunakan tiga kali pengukuran yang diukur pada

rentang 400-600 nm. Lambda yang dipilih adalah pengukuran ketiga yang

absorbansinya paling besar yaitu 488,5 nm dengan absorbansi sebesar 1,222.

Uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC (Ferric Thiocyanate)

dilakukan pengukuran selama beberapa hari hingga kontrol negatif menunjukkan

absorbansi maksimum yang ditunjukan dengan larutan berwarna merah yang

diakibatkan oleh pembentukan kompleks ferri-tiosianat yang semakin pekat. Hal

ini menunjukan bahwa proses peroksidasi lipid asam linoleat sudah berjalan

secara maksimal. Pengukuran absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan

sampel dilakukan selama 7 hari dengan rentang waktu pembacaan sampel setiap

24 jam. Absorbansi maksimal kontrol negatif dicapai pada hari keenam yang

menandakan semakin banyak peroksida atau radikal bebas yang terbentuk.


11

Gambar 3. Profil kenaikan rata-rata absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan

sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada.

Hasil yang diperoleh menunjukkan kesesuaian dengan mekanisme reaksi

di mana nilai absorbansi kontrol negatif lebih tinggi dibandingkan nilai absorbansi

kontrol positif dan sampel. Hal tersebut disebabkan karena tidak ada senyawa

antioksidan pada kontrol negatif yang dapat menghambat proses peroksidasi lipid,

sehingga ion Fe3+

yang terbentuk semakin banyak dan menyebabkan warna merah

akibat pembentukan kompleks ferri-tiosianat lebih pekat dibandingkan kontrol

positif yang berisi BHT (kontrol positif) dan sampel yang berisi fraksi etil asetat

ekstrak metanol daun lada. Pengukuran dilakukan pada hari keenam, saat proses

proksidasi lipid sudah berjalan secara maksimal.

Tabel III. Perhitungan % inhbisi berdasarkan absobansi hari ke-6

Kontrol positif

Absorbansi % inhibisi

Rata-rata ±

SD %

inhibisi

% CV

Replikasi 1 1,952 10,989 10,746

± 0,310 2,885 Replikasi 2 1,965 10,397

Replikasi 3 1,955 10,853

Sampel

Replikasi 1 2,094 4,514 5,061

± 0,598 11,816 Replikasi 2 2,068 5,699

Replikasi 3 2,084 4,970

Dari hasil perhitungan persen inhibisi diketahui bahwa kontrol positif,

menunjukan nilai % inhibisi yang lebih besar dibandingkan fraksi etil asetat

ekstrak metanol daun Lada, yaitu sebesar (10,746 ± 0,310) % , sementara fraksi

etil asetat ekstrak metanol daun Lada sebesar (5,061 ± 0,598)%. Secara statistik

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

1 2 3 4 5 6 7

Ab

sorb

an

si

Hari ke-

kontrol negatif

kontrol positif

sampel


12

nilai persen inhibisi kedua sampel tersebut berbeda bermakna (P<0,05). Hal ini

menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun Lada kurang mampu

menghambat peroksidasi yang terbentuk jika dibandingkan dengan kontrol positif

(BHT). Meskipun demikian ekstrak metanol daun Lada tetap memiliki akivitas

antioksidan yang ditunjukan dengan nilai absorbansi yang lebih kecil

dibandingkan kontrol negatif.

Pada hari kedelapan setelah pengujian aktivitas antioksidan dengan

metode FTC dilakukan penegasan dengan menggunakan metode TBA

(Thiobarbituric Acid) untuk mengukur nilai MDA, yang merupakan produk

oksidasi sekunder yang terbentuk setelah tahap pertama peroksidasi lipid. Pada

tahap kedua peroksidasi lipid, asam linoleat yang sudah banyak terbentuk menjadi

radikal terkomposis menjadi senyawa yang lebih sederhana dan relatif stabil, yaitu

MDA (malondialdehida). Malondialdehida digunakan sebagai biomarker untuk

mengetahui tahap akhir peroksida lipid. Prinsip metode ini adalah pengukuran

serapan dengan spektrofotometer dari reaksi MDA dengan asam tiobarbiturat

yang berwarna merah muda pada panjang gelombang 532 nm. Adapun reaksi

yang terjadi sebagai berikut:

Gambar 4. Reaksi pembentukan kompleks MDA-TBA (Moon dan Shimbamoto,

2009)

Pada hari ketujuh, jumlah peroksida yang terbentuk sudan menurun yang

ditunjukan dengan menurunnya nilai absorbansi kontrol positif. Hal ini

disebabkan karena sudah mulai terbentuknya senyawa MDA dari asam linoleat

sehingga pengukuran TBA dilakukan pada hari kedelapan.


13

Tabel IV. Aktivitas antioksidan sampel (fraksi etil asetat ekstrak metanol daun

lada) dengan metode TBA

Absorbansi % Inhibisi

Kontro negatif 1,001 ± 0,004 0

Kontrol positif 0,168 ± 0,009 83,217 ± 0,888

Fraksi etil asetat ekstrak metanol

daun lada 0,069 ± 0,022 93,19 ± 2,245

Tabel IV menunjukan bahwa nilai absorbansi persen inhibisi fraksi etil

asetat ekstrak metanol daun Lada terhadap MDA lebih besar dibandingkan kontrol

positif (BHT). Nilai persen inhibisi fraksi etil asetat ekstrak metanol daun Lada

sebesar (93,19 ± 2,245) %, sedangkan nilai persen inhibisi kontrol positif (BHT)

sebesar (83,217 ± 0,888) %. Hal tersebut menunjukan bahwa pada tahap kedua

peroksidasi lipid, aktivitas penghambatan radikal bebas oleh fraksi etil asetat

ekstrak metanol daun lada lebih besar dibandingkan pada tahap pertama

peroksidasi lipid.

4. Kesimpulan dan Saran

Kandungan fenolik total per gram sampel pada fraksi etil asetat ekstrak

metanol daun Lada sebesar 133,83 ± 5,4365 mg ekivalen asam galat. Aktivitas

antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada yang dinyatakan dalam

persen inhibisi untuk metode FTC dan metode TBA berturut-turut sebesar (5,061

± 0,598)%, (93,19 ± 2,245)%.

Saran untuk penelitian selanjutnya perlu dilakukan penambahan jumlah

replikasi sampel untuk mengatasi masalah ketidakakuratan pembacaan absorbansi

dengan metode FTC akibat kelemahan dalam pembentukan kompleks warna.

Selain itu perlu dilakukan penelitian lain dengaan menggunakan metode DPPH

untuk mengatahui senyawa yang terkandung dalam daun lada, yang berperan

dalam penghambatan lipid peroksida.


14

Daftar Pustaka

Andersen, O.M., Markham, K.R., 2006, Flavonoids: Chemistry, Biochemistry, and

Application, Taylor & Francis Group, London, P.2.

Aris, S. R. S., Mustafa,S., Ahmat, N., Jaafar, F.Moh. & Ahmad, R, 2009, Phenolic

Content and Antioxidant Activity of Fruit Ficus dettoidea var, Angustifolis sp., The

Malaysian Journal of Analytical Sciences, 13 (2), Pp. 146-150.

Artini, P. E. U. D., Astuti, K. W., Warditiani, N. K., 2013, Uji Fitokimia Ekstrak Etil

Asetat Rimpang Bangle (Zingiber purpureum Roxb.) Jurnal Farmasi Udayana,

Indonesia.

Blanski, A., Lopes,G.C., and De Mello, J. C. P., 2013, Application and Analysis of the

Follin Ciocalteu Method for Determination of the Total Phenolic Content from

Limonium brasiliense L., Molecules,18, Pp. 6852-6865.

Cicco, N., and Lattanzio, V., 2011, The Influence of Initial Carbonate Concentration

on the Folin-Ciocalteu Micro-Method for the Determination of Phenolic with

Low Concentration in the Presence of Methanol: A Comparative Study of

Real-Time Monitored Reactions, Am. J. Anal. Chem., Pp.840-845.

Cowan, M.M., 1999, Plant Products as Antimicrobial Agents, Clinical Microbiology

Review,Vol.12, No. 4, Pp.564-582.

Dodson, C. D., Dyer, L. A., Searcy, J., Wright, Z., and Letoumeau, D. K., 2000,

Cenocladamide: A Diydropyridone Alkaloid from Piper Cenocladum,

Phytochemistry, Vo. 53, pp. 51-54.

Gandjar, I. G., Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta,

Hal.220-265.

Huang, Y. W., Cai, Z. Y., 2010, Natural Phenolic Compounds From Medicina Herbs

and Ditary Plants: Potenttial Use for Cancer Prevention, Nutrion and Cancer, Pp.

1-2.

Kamboj, A., Rana, A., Kaur, R., Jain, U., 2015, Application and Analysis of the Follin

Ciocalteu Method for the Determination of the Total Phenolic Content from

Leaves, Stems and Seeds of Cucumis sativus L., Journal of Pharmacy

Research, Pp.323-329.

Moon, J.K., Shibamoto, T., 2009, Antioxidant Assays for Plant and Food Components, J.

Agric. Chem., Vol. 57, Pp.1655-1666.

Muhtadi, Hidayati, A.L., Suhendi, A., Sudjono, T.A., Haryanto., 2014, Pengujian Daya

Antioksidan Dari Beberapa Ekstrak Kulit Buah Asli Indonesia dengan Metode

FTC, Simposium Nasional RAPI XIII, Hal.1-9.

Nahak dan Sahu, 2011, Phytochemical Evaluation and Antioxidant Activity of

Piper nigrum, Journal of Applide Pharmaceutical Science, pp. 153-157.


15

Prakash, A., 2001, Antioxidant Activity, Takes you into the Heart of a Giant Resource,

Vol 19, No.2, Pp. 1-2.

Ronald, L., Piror, Wu, X., and Schaica, K., 2005, Standardized Methods for the

Determination of Antioxidant Capacity and Phenolics in Food and Dietary

Supplemnts, J. Agr. Food Chem., Pp. 4290-4302

Sochor, J., Zitaka, O., Skutkova, H., Pavlik, D., Babula, P., Krska, B., Homan, A.,

Adam, V., Provaznik, I., and Kizek, R., 2010, Content of phenolic Compounds

and Antioxidant Capacity in Fruits of Apricot Genotypes, Molecule, pp. 6285-

6305.

Thitilertdecha, N., Teerawutgulrag, A., and Rakariyatham, N., 2010, Identification of

Major Phenolic Compound from Nephelium lappaceum L. and Their Antioxidant

Activities, Molecules, 15, Pp. 1453-1465.

Winasari, H., 2011, Antioksidan alami & radikal bebas, Penerbit Kanisius, Yogyakarta,

hal.71-76.


16

LAMPIRAN


17

Lampiran 1. Surat Determinasi Tanaman


18

Lampiran 2. Klasifikasi Tanaman Lada (Piper nigrum L.)

Menurut United States Departement of Agriculture klasifikasi dari tanaman lada,

yaitu:

Kerajaan : Plantae

Sub kerajaan : Tracheobionta

Super divisi : Spermatophyta

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Sub kelas : Magnoliidae

Ordo : Piperales

Suku : Piperaceae

Genus : Piper L.

Spesies : Piper nigrum L.

Lampiran 3. Perhitungan Pentapan Kadar Air Daun Lada

Kadar Air Simplisia =

Keterangan Berat Simplisia (g)

Kadar Air (%) Rata-Rata Awal Akhir

Replikasi 1 5.019 4.659 7,173

7,418 Replikasi 2 5.020 4.643 7,509

Replikasi 3 5.018 4.638 7,573

Replikasi 1


= 7,173%

Replikasi 2


= 7,509 %


19

Replikasi 3


= 7,573 %

Lampiran 4. Perhitungan rendemen ekstrak dan fraksi

a. Ekstrak metanol daun lada

Bobot (gram)

Bobot simplisia yang digunakan 31,509

Bobot cawan kosong 80,3737

Bobot cawan + ekstrak 81,5782

Bobot ekstrak 1,2247

% rendemen ekstrak =

% rendemen ekstrak =

x 100 = 3,886%

b. Fraksi etil asetat daun lada

Bobot (gram)

Bobot simplisia yang digunakan 31,509

Bobot cawan kosong 22,3606

Bobot cawan + fraksi etil asetat 22,5707

Bobot fraksi etil asetat 0,2101

% rendemen fraksi =

% rendemen fraksi =

Lampiran 5. Data penimbangan untuk penetapan kandungan fenolik total

a. Penimbangan asam galat

1. Asam galat untuk operating time

Replikasi 1

(gram)

Replikasi 2

(gram)

Replikasi 3

(gram)

Bobot bekker 63,7284 61,4635 62,1535

Bobot bekker + zat 63,7385 61,4735 62,1636

Bobot zat 0,0101 0,0100 0,0101

b. Penimbangan fraksi etil asetat

Replikasi 1

(gram)

Replikasi 2

(gram)

Replikasi 3

(gram)


20

Bobot bekker 61,7794 61,5234 61,6027

Bobot bekker

+ zat

61,7894 61,5334 61,6127

Bobot fraksi 0,01 0,01 0,01

Lampiran 6. Data perhitungan konsentrasi asam galat dan fraksi etil asetat

untuk penetapan kandungan fenolik total

a. Contoh perhitungan konsentrasi asam galat

Bobot asam galat replikasi 1 = 0,0101g = 10,1 mL

Konsentrasi larutan stok asam galat =

= 1010 µg/mL

Perhitungan seri konsentrasi replikasi 1

Seri 1 :

V1 . C1 = V2 . C2

0,4 mL . 1010 µg/mL = 10 mL . C2

C2 = 40,4 µg/mL

Seri 2 :

V1 . C1 = V2 . C2

0,5 mL . 1010 µg/mL = 10 mL . C2

C2 = 50,5 µg/mL

Seri 3 :

V1 . C1 = V2 . C2

0,6 mL . 1010 µg/mL = 10mL . C2

C2 = 60,6 µg/m

Seri 4 :

V1 . C1 = V2 . C2

0,7 mL . 1010 µg/mL = 10mL . C2

C2 = 70,7 µg/mL


21

Seri 5 :

V1 . C1 = V2 . C2

0,8 mL . 1010 µg/mL = 10 mL . C2

C2 = 80,8 µg/mL

Replikasi 2 Replikasi 3

Seri 1 40 µg/mL 40,4 µg/mL





b. Contoh perhitungan konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada.

Bobot fraksi etil asetat replikasi 1 = 0,0100 gram = 1000 µg/mL

Pengenceran fraksi etil asetat replikasi 1

V1 . C1 = V2 . C2

2 mL . 1000 µg/mL = 10mL . C2

C2 = 200 µg/mL

Replikasi 2 Replikasi 3

Konsentrasi fraksi 200 µg/mL 200 µg/mL


22

Lampiran 7. Hasil optimasi operating time untuk penetapan kandungan

fenolik total

a. Replikasi 1

Pada replikasi 1, operating time yang didapat menit ke 30

b. Replikasi 2

Menit ke -

Absorbansi pada panjang gelombang 750 nm

40 µg/ml 60 µg/ml 80 µg/ml

5 0.344 0.408 0.581

10 0.368 0.490 0.610

15 0.377 0.532 0.627

20 0.384 0.544 0.636

25 0.386 0.549 0.640

30 0.386 0.548 0.641

35 0.387 0.548 0.640

40 0.386 0.549 0.640

45 0.386 0.549 0.640

50 0.386 0.550 0.639

55 0.385 0.537 0.638

60 0.385 0.546 0.638

Pada replikasi 2 operating time yang didapat menit ke 30

Menit ke- Absorbansi pada panjang gelombang 750 nm

40 µg/mL 60 µg/mL 80 µg/mL

5 0,341 0,401 0,574

10 0,366 0,482 0,607

15 0,376 0,528 0,626

20 0,382 0,545 0,635

25 0,385 0,549 0,640

30 0,386 0,551 0,640

35 0,386 0,550 0,640

40 0,386 0,551 0,639

45 0,386 0,549 0,639

50 0,386 0,552 0,639

55 0,385 0,533 0,638

60 0,385 0,533 0,638


23

c. Replikasi 3

Menit ke -

Absoorbansi pada panjang gelombang 750 nm

40 µg/mL 60 µg/mL 80 µg/mL

5 0.345 0.406 0.581

10 0.362 0.487 0.606

15 0.379 0.529 0.633

20 0.387 0.535 0.650

25 0.399 0.538 0.653

30 0.402 0.544 0.664

35 0.404 0.543 0.664

40 0.414 0.543 0.661

45 0.418 0.544 0.659

50 0.420 0.543 0.665

55 0.423 0.544 0.667

60 0.425 0.544 0.665

Pada replikasi 3 operating time yang didapat menit 30

Lampiran 8. Optimasi panjang gelombang maksimum untuk penetapan

kandungan fenolik total

a. Konsentrasi 40 µg/m


24

b. Konsentrasi 60 µg/m


25

c. Konsentrasi 80 µg/mL


26

Lampiran 9. Hasil pengukuran kurva baku untuk penetapan

kandungan fenolik total

a. Replikasi 1

b. Replikasi 2

Seri Konsentrasi Absorbansi Persamaan kurva baku

1 40,0 µg/mL 0,390 A = 0,1264

B = 0,00618

r = 0,9894

y = 0,00618x + 0,1264

2 50,0 µg/mL 0,419

3 60,0 µg/mL 0,484

4 70,0 µg/mL 0,569

5 80,0 µg/mL 0,624


1 40,4 µg/mL 0,349 A = 0,07

B = 0,00711

r = 0,9831

y = 0,00711x + 0,07

2 50,5 µg/mL 0,430

3 60,6 µg/mL 0,499

4 70,7 µg/mL 0,606

5 80,8 µg/mL 0,620


27

b. Replikasi 3

Lampiran 10. Perhitungan kandungan fenolik total fraksi etil asetat

Konsentrasi Absorbansi Kandungan

Fenolik total

Rata-rata % CV

Replikasi 1 200 µg/mL 0,270 130,5 133,83 ±

5,4365

4,0622 %

Replikasi 2 200 µg/mL 0,269 129,5

Replikasi 3 200 µg/mL 0,285 141,5

Contoh perhitungan kandungan fenolik total:

a. Replikasi 1

y = 0,00662x + 0,0974

0, 270 = 0,00662x + 0,0974

x = 0, 270- 0,0974/0,00662

= 26,0725 µg/mL

x = 0,0260725 mg/mL 0,0261mg/mL

bobot fraksi = 0,0100 gram

b. Replikasi 2

y = 0,00662x + 0,0974

0,269 = 0,00662x + 0,0974

x = 0, 269- 0,0974/0,00662

= 25,9214 µg/mL

= 0,0259214 mg/mL 0,0259 mg/mL

Bobot fraksi = 0,0100 gram

c. Replikasi 3

y = 0,00662x + 0,0974

0,285 = 0,00662x + 0,0974x

x = 0, 285- 0,0974/0,00662


1 40,4 µg/mL 0,369 A = 0,0974

B = 0,00662

r = 0,9924

y = 0,00662x + 0,0974

2 50,5 µg/mL 0,424

3 60,6 µg/mL 0,492

4 70,7 µg/mL 0,587

5 80,8 µg/mL 0,622


28

= 28,3384 µg/mL

= 0,0283384 mg/mL 0,0283 mg/mL

Bobot fraksi = 0,0100 gram

Rumus perhitungan kandungan fenolik total

Kandungan fenolik total = x

a. Replikasi 1

Kandungan fenolik total = 0,0261 x 50/0,0100

= 130,5 mg/gram

Jadi, kandungan fenolik total dalam sampel replikasi 1 sebesar 130,5 mg

asam galat ekuivalen per gram fraksi etil asetat.

b. Replikasi 2


= 129,5 mg/gram

Jadi, kandungan fenolik total dalam sampel replikasi 1 sebesar 129,5 mg


c. Replikasi 3


= 141,5 mg/gram

Jadi, kandungan fenolik total dalam sampel replikasi 1 sebesar 141,5mg


Lamiran 11. Data Penimbangan untuk Uji Aktivitas Antioksidan Metode

FTC-TBA

a. Penimbangan BHT untuk Optimasi Metode

OT (gram)

Lamda (gram)

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Berat Cawan Kosong 63.0377 61.5081 61.7617 63.6569

Berat Cawan + sampel 63.0418 61.5122 61.7657 63.6609

Berat Sampel 0.0041 0.0040 0.0040 0.0040


29

b. Penimbangan Sampel Uji

BHT

(gram)

Replikasi 1

(gram)

Replikasi 2

(gram)

Replikasi 3

(gram)

Berat Cawan Kosong 62.4275 27,9617 27,2143 20,6965

Berat Cawan + sampel 62.4316 27,9657 27,2183 20,7005

Berat Sampel 0.0041 0,0040 0.0040 0.0040

Lampiran 12. Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan FTC-TBA

a. Penentuan Operating Time (OT)

Hasil OT, CBHT = 4 mg

OT (Menit ke-

)

Absorbansi (Triplo)

Pengukuran 1 Pengukuran 2 Pengukuran 3

1 0.985 0.959 0.948

3 0.918 0.907 0.899

5 0.875 0.875 0.874

7 0.864 0.862 0.860

10 0.855 0.853 0.853


30

b. Penentuan Lamda max

Replikasi 1


31

Replikasi 2


32

Replikasi 3


33

Lampiran 13. Perhitungan Persen Inhibisi Uji Aktivitas Antioksidan FTC-

TBA

a. Nilai absorbansi kontrol negatif, kontrol positif dan sampel fraksi etil

asetat ekstrak metanol daun lada

Hari

ke-

Kontrol (-) Kontrol (+) Sampel

R 1 R 2 R 3 R 1 R 2 R 3 R 1 R 2 R 3

1 1,604 1,587 1,599 1,457 1,426 1,466 1,381 1,372 1,364

2 1,729 1,716 1,722 1,474 1,495 1,470 1,560 1,545 1,556

3 2,081 2,057 2,065 1,927 1,930 1,939 1,764 1,750 1,773

4 2,135 2,145 2,168 1,933 1,935 1,949 1,901 1,931 1,931

5 2,157 2,194 2,208 1,955 1,942 1,954 1,950 1,936 1,959

6 2,157 2,159 2,263 1,952 1,965 1,955 2,094 2,068 2,084

7 1,959 1,946 1,945 1,749 1,889 1,885 1,853 1,860 1,878

Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi kontrol negatif dengan

spektrofotometer UV/Vis maka dapat disimpulkan bahwa pada hari ke-6 reaksi

peroksidasi lipid telah mencapai batas maksimum.

b. Profil absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel fraksi etil


Hari

ke-

Rata-rata ± SD %CV

Rata-rata ± SD %CV

Rata-rata ± SD %CV

Kontrol (-) Kontrol (+) Sampel

1 1,597 ± 0,009 0,563 1,450 ± 0,021 1,488 1,372 ± 0,009 0,678

2 1,722 ± 0,007 0,406 1,480 ± 0,013 0,878 1,554 ± 0,008 0,515

3 2,068 ± 0,012 0,580 1,932 ± 0,006 0,310 1,762 ± 0,012 0,681

4 2,149 ± 0,017 0,791 1,939 ± 0,009 0,464 1,921 ± 0,017 0,885

5 2,186 ± 0,026 1,189 1,950 ± 0,007 0,359 1,948 ± 0,012 0,616

6 2,193 ± 0,061 2,781 1,957 ± 0,007 0,357 2,082 ± 0,013 0,624

7 1,950 ± 0,008 0,410 1,841 ± 0,080 4,345 1,864 ± 0,013 0,697


34

c. Grafik rata-rata absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan

sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada selama 7 hari

d. Perhitungan % inhibisi berdasarkan data absorbansi hari ke-6

Rata-rata absorbansi kontrol negatif hari ke-6 = 2,193

Rumus Perhitungan:

Persen Inhibisi = ( A0 – A1 / A0 ) x 100%

Kontrol

positif

Absorbansi % inhibisi Rata-rata

± SD %

inhibisi

% CV

Replikasi 1 1,952 10,989 10,746

± 0,310 2,885 Replikasi 2 1,965 10,397

Replikasi 3 1,955 10,853

Sampel

Replikasi 1 2,094 4,514 5,061

± 0,598 11,816 Replikasi 2 2,068 5,699

Replikasi 3 2,084 4,970

Contoh perhitungan nilai % inhibisi sampel replikasi 1 hari ke-6

1. Kontrol positif

Persen inhibisi =

= 10,895 %

2. Sampel

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 2 3 4 5 6 7

Ab

sorb

an

si

Hari ke-

Grafik Rata-rata Absorbansi Kontrol Negatif,

Kontrol Positif, dan Sampel

kontrol negatif

kontrol positif

sampel


35

Persen inhibisi =

= 4,514 %

e. Grafik rata-rata nilai % inhibisi kontrol positif dan sampel fraksi etil


Lampiran 14. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan metode

TBA

a. Nilai absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel fraksi etil

asetat daun lada.

Absorbansi kontrol (-) Absorbansi kontrol (+) Absorbansi Sampel

R.1 R.2 R.3 R.1 R.2 R.3 R.1 R.2 R.3

1,000 1,005 0,998 0,178 0,165 0,161 0,074 0,088 0,044

b. Profil absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel fraksi etil


Rata-rata ± SD

Kontrol negatif Kontrol positif Sampel

1,001 ± 0,004 0,168 ± 0,009 0,069 ± 0,022

c. Perhitungan nilai % inhibisi dengan metode TBA

% inhibisi = (A0-A1/A0) x 100%

d. Contoh perhitungan nilai % inhibisi sampel replikasi 1:

Persen inhibisi = (

) = 83,217 %

0 2 4 6 8 10 12

% Inhibisi

Nilai % Inhibisi Kontrol Positif dan Sampel

Rata-rata % inhibisisampel

Rata-rata % inhibisikontrol positif


36

Absorbansi

Kontrol

Negatif

Kontrol positif Rata-

rata ±

SD %

Inhibisi

Abs

Rep 1

%

inhibisi

Abs

Rep 2

%

inhibisi

Abs

Rep 2

%

inhibisi

1,001 0,178 82,218 0,165 83,516 0,161 83,916 83,217

± 0,888

Absorbansi

Kontrol

Negatif

Sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada Rata-

rata ±

SD %

Inhibisi

Abs

Rep 1

%

inhibisi

Abs

Rep 2

%

inhibisi

Abs

Rep 2

%

inhibisi

1,001 0,074 92,607 0,088 91,209 0,044 95,604 93,19

± 2,245


37

Lampiran 15. Gambar-gambar Proses Penelitian

Lampiran 1. Proses Pembuatan Simplisia Daun Lada

a. Proses pencucian daun lada

b. Proses penyerbukan daun lada


38

c. Proses pengayakan daun Lada

d. Uji kadar air


39

Lampiran 2. Proses pembuatan fraksi etil-asetat ekstrak metanol

daun Lada

1. Proses penguapan dengan menggunakan vacuum rotary evaporator

2. Ekstrak metanol daun Lada


40

3. Pemisahan antara air dan etil asetat

4. Uji pendahuluan penetapan kandungan fenolik total dengan metode

folin-ciocalteu.

Lapisan etil asetat

Lapisan air

A

B

C


41

Keterangan

A = kontrol negatif (metanol : air (1:1) + reagen Folin-Ciocalteau +

Na2CO3)

B = Kontrol positif (asam galat + reagen Folin-Ciocalteau +

Na2CO3)

C = Sampel (fraksi etil asetat ekstrak metanol daun Lada + reagen

Folin-Ciocalteau + Na2CO3)

5. Asam galat

6. Hasil penetapan kandungan fenolik total replikasi

Replikasi 1 Replikasi 2 Replik


42

Lampiran 3. Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode FTC-TBA

1. Pengukuran menggunakan metode FTC selama 7 hari

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3

Relikasi 1

Replikasi 2

Replikasi


43

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3


44

2. Pengukuran TBA pada hari ke delapan

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3

Sampel replikasi 1

Sampel replikasi 2

Sampel replikasi 3

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3


45

BIOGRAFI PENULIS

Penulis lahir di Tanjung Kerja pada tanggal 21

Juni 1994. Penulis memiliki seorang ayah bernama

Kolenius Kolai dan seorang ibu bernama Emma, serta

seorang kakak bernama Maria Magdalena. Penulis

menyelesaikan pendidikan dasar di SDN. 09 Banua

Tengah pada tahun 2006. Setelah itu, penulis

melanjutkan pendidikan menengah di SMP Karya Budi

Putussibau pada tahun 2006 hingga 2009, SMA Karya

Budi Putussibau pada tahun 2009 hingga 2012. Penulis

kemudian melanjutkan di Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta dari tahun

2012 hingga 2016.

Selama menjadi mahasiswa, penulis terlibat dalam beberapa kegiatan

kemahasiswaan dan keorganisasian antara lain, kepengurusan UKM Komunitas

Jalinan Kasih Mahasiswa Katolik (JKMK) periode 2013-2014 sebagai Co-Humas,

penulis aktif sebagai anggota UKF voli Fakultas Farmasi dari tahun 21012-2014.

Disamping itu penulis juga aktif dalam berbagai kegiatan kemahasiswaan

diantaranya sebagai anggota seksi konsumsi pada Kampanye Informasi Obat

tahun 2012, divisi medis pada Festival Sanata Dharma tahun 2015.


Documents

PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI … · Yang berrancia tangan cli bawah ini. siiya rtrahasisu,a L,nivcrsitas Siutata DhiLn-na: Nau-rii : Yuliana Rati Karnat'a Dcw,i ... dari