258 Immunoanal Biol Spec (1993) 8, 258-261 © Elsevier, Paris

Que peut attendre le malade aujourd'hui des dosages des marqueurs tumoraux ? Pi ges en immuno-analyse

JC Rymer

Laboratoire de biochimie (Pr J Rosa), Laboratoire associ6 de m6decine nucleaire, CHU Henri-Mondor, 94010 Cr~teil, France

R~sum~ -- Les methodes de dosage des marqueurs tumoraux ne faisant pas appel a. un isotope radioactif ont eu te grand avantage de permettre une automatisation quasi totale de ces dosages et leur diffusion & I'ext6rieur du cercle etroit des laboratoires agr~s. Paradoxalement, du fait que ces methodes demeurent dans leur principe des m6thodes immunologiques, il subsiste de nombreux pro- blames poses par la diversite des r6actifs et par leurs modes d'emploi. Leur apparente facilite de mise en aeuvre ne doit pas dissimuler le fait qu'elles sont des m~thodes complexes n6cessitant une grande et permanente vigilance de la part des biologistes et des cliniciens. Quelques pi~ges evoques doivent 6tre absolument 6v{tes pour garantir une biologie de routine de qualit&

marqueurs tumoraux / standardisation / qualit6

Summary - - Present patients' expectations concerning tumor marker assays. Immuno-analysis pitfalls. Methods using a non-radio- active label for the assay of tumor markers have the great advantage to allow a quite total automatisation; they can be used everywhere, and not only in the few laboratories which have the agreement for radioactive materials. But, in fact, these methods remain immunological methods and many difficult problems are encountered especially concerning the variability of reagents. If the use of these methods seems to be easy, it must not hide the complex reality of antigen-antibody reactions; biologists and practitioners must be very careful to the quality of data obtained with tumor markers assays. A certain number of traps must be kept in mind for a good use of routine biology of malignant diseases.

tumor markers / standardization / quality

Piege •nm. Engin pour attirer et prendre cer- tains animaux. Fig : artifice dont on se sert pour tromper quelqu'un. Syn : attrape, embeche, embuscade, gu6pier, traquenard, guet-apens (d'apres Le Pet i t Larousse Il lustr#).

Introduct ion

Nos activites conjointes, la mise en commun de nos comp~tences de biologistes, de cliniciens, ont pour finalit6 la prise en charge du malade ; c'est & lui que doit profiter notre savoir. Les mar- queurs tumoraux (MT) sont devenus des outils de rout ine gr&ce & la t res large d i f fus ion des methodes d'immuno-analyse (IA). Les m~thodes << f ro ides ,, d6r iven t dans leur p r inc ipe des m~thodes de la rad io- immunolog ie dont une Iongue pratique remonte aux travaux de Yalow et Berson en 1956. En immuno-analyse, on ren- contre donc des problemes tr~s g~neraux, de nature <, analytique ,,, des probl~mes de nature immunologique et des problemes specifiques &

I'association ,, immunologie et analyse ,,. S'ajou- teront eventuellement des problemes li6s & ta nature m#me du constituant dose ; pour cela, les marqueurs tumoraux sont exemplaires.

Probl~mes g~neraux de nature analyt ique ou prob l~mes de ,, basse cuisine ,,

Ce sont des problemes que connaissent bien les biologistes car ils sont communs & toute activit6 de laboratoire ; aussi ne nous 6tendrons-nous pas sur cet aspect des choses ; citons cependant dans cet te rubr ique des causes c lass iques d'erreur telles que confusion de tubes (Iors du prel~vement, de la decantation...), non-respect de la chafne du froid pendant la conservation ou le transport intersites, contamination inter~chan- tillons... Tout ceci est connu ; la prevention en releve de bonnes pratiques de laboratoire, sans plus. Mais remarquons d~j& qu'une erreur commi- se & ce niveau de ,< basse cuisine ,, sera certaine- ment plus Iourde de cons6quences s'agissant d'un MT que s'il s'agit d'un chlore urinaire.

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Mais il existe un autre piege veritable : les methodes froides, mises entre les mains du plus grand nombre, mesurent en fin de compte une densite optique, une intensit6 de fluorescence... et beaucoup utilisent alors ces methodes comme des methodes spec t rophotomet r iques , ce qu'elles ne sont pas : les m~thodes de type ELISA sont et demeurent des << m~thodes radio-immu- nologiques >> sans le rnarqueur radioactif ! Leur principe fondamental de mesure reste un principe immunologique. Oublier cela conduit inevitable- ment un jour & I'erreur.

Probl~mes g6n6raux de nature immunologique ou problbmes de << moyenne cuisine ,,

Un premier pibge serait de penser qu'une metho- de immuno-analytique de dosage d'un marqueur tumoral X mesure effectivement la concentration serique de ce marqueur. En realite, le reactif de capture ou (et) de reconnaissance (anticorps mono- ou polyclonal) se lie & une structure spatia- le definie par I'enchafnement de quelques acides amines ou de quelques residus glucidiques. Cette etroitesse de la cible (epitope) qui devrait garantir la selectivite du composant & doser, peut parfois aboutir & I'effet inverse. On con?oit bien que pourront ainsi 6tre mesurees eri meme temps des families de molecules apparentees au plan phy- siologique ou structural (ciclosporine molecule mare et metabolites, isoferritines...).

La possibilite theorique existe que I'on puisse doser simultanement des composants differents qui porteraient un meme epitope mal choisi. II faut donc bien se souvenir qu'en IA, on dose non le rnarqueur X lui-meme mais une partie structurale- rnent stereosp#cifique et limitee de la molecule X et eventuellement d'autres molecules. Une conse- quence immediate de cela est que I'on ne parle pas forcement du meme ,, objet - Iorsque cet objet est reconnu et mesure par des outils diffe- rents (cf infra). A I'extreme, on pourra parfaite- ment donner un chiffre de concentration pondera- le d'une molecule dont le site actif biologique, different du site immunologique, est alt6re ou detruit (exemple du dosage des phosphatases acides prostatiques par I A - la proteine est quan- tifiee - et par cinetique enzymatique - la fonction est mesuree).

Un phenomene que connaissent depuis long- temps les serologistes est celui produit par la pre- sence d'un grand exces d'antigene ; en IA, ce qu'on designe parfois abusivement par hook effect conduit & observer des valeurs normales ou basses alors que la valeur reelle est trbs 6levee, bien au-del& du dernier point de la gamme d'eta- Ionnage du dosage. Ce piege connu des methodes ,, sandwich >, peut se reveler redou- table avec des serums exceptionnels, car meme la precaution de doser un echantillon sur deux all- quotes, pur et dilue, peut se reveler insuffisante ; cette fa?on de faire se heurte par ailleurs & des

difficultes theoriques et pratiques souvent redhi- bitoires.

Enfin, en IA perdure un << enorme ,, probleme de standardisation [1] qui aboutit & une extraordinai- re et inadmissible heterogeneite des langages, des normes, des definitions et finalement des resultats, non comparables mais destines & 1'etre. Trop souvent, on se heurte & I'absence de prepa- ration internationale de reference, de methode de reference au sens strict du terme, de definition univoque de I'antigene, des reactifs (parmi les- quels il faut certainement compter comme tel, & part entiere, le plastique des tubes, godets, puits...) [3]. Beaucoup de travaux sont en cours dans ce domaine de la standardisation ; des articles nombreux (et & venir) seront utilement consultes sur ce sujet. Pour doser les MT, le bio- Iogiste travaille << sans filet -, ce qui dolt inciter & prendre certaines mesures de bon sens. Ces mesures, appliquees avec un esprit critique per- manent, sont suggerbes plus loin.

L'existence de valeurs elevees des concentra- tions des MT, 1'6tendue des valeurs possibles de certains d'entre eux (BHCG, (zFP, CA 19-9...) qui parcourent plusieurs modules Iogarithmiques, font que I'on dolt diluer certains 6chantillons. Des pibges sont tendus & ce niveau. D'abord, le diluant qui, en se substituant & la plus grande par- tie du serum du malade, va constituer, de fait, un nouvel echantillon. Parfois le diluant du coffret, parfois un serum humain & concentration nulle ou quasi nulle, seront des milieux de dilution accep- tables au prix d'une vigilance particuliere. La courbe de dilution est rarement une belle droite, aussi le suivi du malade s'effectuerait dans les meilleures conditions, toujours au meme coeffi- cient de di lut ion, ce qui n'est bien sQr pas constamment possible.

La courbe d'etalonnage peut egalement tendre ses pibges ; bien que thboriquement cette courbe soit multinomiale, il existe presque toujours des changements de variables et des algorithmes de calcul qui linearisent la fonction << effet-dose ,,. L&, existe une tentation de tracer une droite avec deux points (l'origine et un seul point mesure !) et d'extrapoler si necessaire ; gageons que person- ne ne c~de & pareille tentation.

Probl~mes particuliers b I ' immuno-analyse des marqueurs tumoraux ou probl~mes de << haute cuisine ,,

Lorsque le biologiste communique un resultat eleve de creatininemie au clinicien qui soigne un insuffisant renal, il fournit un signe biologique objectif de la maladie. Lorsque ce meme biologis- te communique le resultat du dosage d'un MT, il serait faux et dangereux de penser qu'il fournit egalement un signe biologique. En dehors des signes pathognomoniques, chacun des signes cli- niques d'une maladie donnee est manifeste par << tant pour cent >, des sujets atteints (sensibilite,

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specificite des signes). L' association de plusieurs signes possede alors une valeur d'orientation dia- gnostique. Les resultats des dosages des MT doi- vent 6tre cons ider#s comme des , s ignes cl i- niques , de la maladie canc6reuse. Comme tels, ils sont presents inconstamment ou peuvent ~tre rendus anormaux par des causes interferentes (phenom~ne du spiking, modification des clai- rances, phenomenes inflammatoires...). Comme tels, ils n 'on t de poss ib i l i te d 'e t re compr is qu'associes aux autres signes cliniques mis en evidence chez un malade ; ils doivent obligatoire- ment 6tre int6gr#s dans I'ensemble de I'observa- t ion de ce malade. II n 'y a pas actuel lement d'autre moyen pour fake de la bonne biologie cli- nique des MT. Si le biologiste consid6re ses resultats deconnect6s du contexte clinique, si le clinicien tire des conclusions de resultats decon- nectes de leurs conditions d'obtention, chacun court le risque d'erreur, de dire et de faire n'impor- te quoi (tableau I).

Mais restons au niveau du laboratoire o6 la Nomenclature reconnaft les MT essentiellement comme des outils de surveillance. Les - radio- immunologistes - avaient, jusqu'& maintenant, I'habitude de travaitler en duplicate, de surveiller I'evolution des performances analytiques & tra- vers t'allure des courbes, ~ le suivi de serums de contr61e.

Ces pratiques de prudence restent de mise avec les techniques non isotopiques largement automatis~es.

On peut legitimement s'interroger sur le ,, dan- ger - pr~sente par des appareils offrant les possi- bilit6s (ou les tentations) de travailler en simple, avec recalcul en un point de courbes memorisees et sans contr61es systematiques. Faisons le pari encore que pour les MT, personne ne se risque b. ceder & une tel le tenta t ion economique. La Nomenc!ature propose le passage en double avec reprise du serum prec6dent (mais tres peu de malades par ten t en vacances avec leur serum !). Cette recommandation meconnaTt les grandes variations que peuvent subir les concen- trations de MT entre deux dosages successifs ; encore une lois, insistons sur la relation obligatoi- re avec la clinique. La proposition alternative de doser le marqueur dans deux series differentes rajoute, & I ' imprecision intras6rie du dosage, I'imprecision interseries. Les diff6rences interme- thodes 6tant completement ignorees, les textes off iciels n ' imposent doric pas de contraintes utiles suffisantes.

Les grandes d i f ferences cons ta tees entre m~thodes ont incite & etudier des correlations ; il ne s'agit pas ici de comparaison avec une metho- de absolue de reference, mais souvent de la com- paraison de resultats obtenus avec le coffret de - CA 421 Durand ,, pour des serums dos6s avec le coffret ,, CA 421 Dubo is , ant6rieurement pre- sent et bien distribue sur le march& Le malheur veut que I'on puisse obtenir une droite dont I 'equat ion au to r i se cer ta ins & dire que

,, Dubois - = 3,87299 - Durand ,. Et d'autres en tirent argument pour interpr6ter des resultats suc- cessifs, d'origines geographiques variables au gre des deplacements du malade.

Naturellement, c'est un pi~ge & 6viter absolu- ment ; la relation obtenue est une relation statis- t ique derivee de ?etude d'un nuage de points experimentaux. Elle n'est pas applicable & un point en particulier (saul & ceux que le hasard a situe sur la droite en question !) et donc, puisque I'on ne fait pas de I'epidemiologie mais du suivi evoluti f de tumeur maligne, une tel le re lat ion d'ensemble est inapplicable a un individu donn~ qui reste un cas unique (fig 1).

La Nomenclature - toujours elle - precise que le compte rendu dolt indiquer les seuils de decision ( la limite des ,, valeurs normales - ) se rapportant & la technique utilisee ; mais pour les MT, ces seuils decisionnels peuvent n'avoir qu'un int6r~t relatif ; on peut d'ailleurs les choisir diff6remment en fonction du but recherche (diagnostic positif, diagnostic d'exclusion...). En pratique, bien plus important que ces seuils est le profil evolutif du marqueur dont, chez un malade en remission, une concentrat ion progressivement croissante se

Tableau I. Sensibilite des signes cliniques et des marqueurs tumoraux.

Sensibilit# des signes cliniques au cours d'une infection Afipia fells Fievre 32% C~phalee 14% Ad6nopathies 49% Asth~nie 30% Spl6nom~galie 11% Exantheme 4%

Sensibilit6 des marqueurs tumoraux dans le cancer du sein m6tastase

MCA > 11U/ml 52% CA 15-3 > 30U/ml 55% ACE > 10mcg/I -29%

Y "DUBOIS"

x

__.~X "DURAND"

Fig 1. La relation traduite par le graphe Y=f(X) est une relation statistique entre deux ensembles de donn6es ; elle n'autorise en aucun cas le calcul individuel de la valeur Yi d'un point Xj. En mati~re de r~sultat de dosage d'un MT, on ne parle pas !

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demasque Iors de dosages comparatifs succes- sifs ; la signification p#jorative d'un tel profil est claire m6me si, individuellement, chacune des valeurs du profil est situee en dessous du seuil de normafit&

]k I'inverse de ce que nous avons dit plus haut et dans le cadre restreint particulier du diagnostic precoce d'une recidive survenant chez un malade en r~mission, le MT qui etait positif au moment du diagnost ic initial possede une valeur pr6dict ive positive pratiquement 6gale & 100%. Son int~r~t principal est alors d'etre un signal d'alarme appa- raissant parfois plusieurs mois avant que la cli- nique ou (et) I'imagerie ne confirme I'information biologique. La force et la faiblesse du MT est de pouvoir ~tre & ce moment un element d'informa- tion totalement isole ; le biologiste dolt 6tre suffi- samment sQr de sa techn ique analyt ique pour convaincre que le m~me outil biologique imparfait est alors un outil fiable de diagnostic biologique de la r~cidive. II ne faut passe laisser prendre au piege d'une plausible expl icat ion interf6rente et quels que soient les choix th6rapeutiques faits, il faut garder comme hypo these premiere que I ' a u g m e n t a t i o n iso lee du m a r q u e u r s ign i f ie , jusqu '& preuve du contraire, la r6cid ive ou la reprise ~volut ive de la maladie. Raccourci r les interval les entre dosages est cer ta inement un moyen de faire rapidement apparaftre la v6ritable nature de 1'61~vation constatee.

Repetons encore : un resultat de dosage de MT doit s'interpr6ter au sein de I'observation clinique du malade ; le suivi n'est aujourd'hui possible qu'effectu~ toujours dans les m6mes conditions (methodes, laboratoire...).

solut ions ais6es ne sont pas entrevues & court terme. Cependant, elle est un moyen de mettre au service des malades de meilleurs outils - les MT - permettant une aide au diagnostic, au bilan d'extension, au contr61e de I'efficacit6 de la thera- peutique, & la detection precoce de recidive de la maladie cancereuse. L'apparente facilite de r6ali- sation des dosages des MT par les automates ne doit pas faire oubl ier la grande complexi te des interactions moleculaires mises en oeuvre dans la cupule de r~action ; la vigilance du biologiste doit toujours rester grande. II est important pour les malades de pouvoir beneficier de ces techniques soph is t iquees par tout et pas seu lement dans quelques rares sites privilegies. Mais, fait inhabi- tuel, il nous semble que I'ouverture s'est faite trop t6 t ou t rop v i te et que le march6 y est mal pr6par6 ; si les tentatives actuelles, visant & redui- re la dispersion interm6thodes, n'aboutissent pas, il est & craindre que le desappointement, I' incom- pr6hension, la desaffection des cl iniciens - voir I'irritation des autorites de tutelle - n'entraTnent un jour I 'abandon de certains de ces outils, impar- fairs mais indispensable, et uti les Iorsqu'on les manipule en connaissant leurs limites [2].

Terminons par un regret qui const i tue un der- nier piege pour le malade canc6reux (malade qui fr~quemment suit, compare et interprete les varia- t ions quantitatives de ses r6sultats) : les MT sont trop souvent des messagers de mauvaises nou- velles. Si I'~levation progressive d'un MT a une signification malheureusement claire, la persistan- ce d'une valeur normale n' implique pas obligatoi- rement qu 'au plan c l in ique la s i tuat ion 6volue favorablement.

Conclusion

Ces quelques reflexions sont tres loin de consti- tuer une revue exhaustive des pi~ges de I' immu- n o - a n a l y s e des m a r q u e u r s t u m o r a u x . Bien d'autres difficultes sont rencontrees qui necessi- teraient d'6tendre nos r6flexions : pr6sence dans le s6rum de facteurs ant ig lobul in iques, d 'ant i - corps interferents, effets dits de matrice... L'IA est une technique qui pose certes de tr~s nombreux et diff ici les problemes dont, pour certains, des

R~f~rences

1 Masseyeff R (1 992) Standardisat ion des Immunodosages. Spectra Biol 92, 4, 41-50

2 Miyai K, Price CP (1992) Problems for improving performances in Immunoassay. JIFCC 4, 4, 154- 163.

3 Ternynck Th (1988) #tudes des reactions non sp~ci- fiques observees darts la pratique des dosages immuno-enzymatiques. ISB 14, 5, 413.