SENYAWA ALAM - ebook.library.ums.ac.idebook.library.ums.ac.id/Farmasi/Senyawa_Alam_Metabolit_Sekunder... · Metabolit sekunder adalah senyawa yang disintesis oleh ... Golongan metabolit

ii

SENYAWA ALAM

METABOLIT SEKUNDER

TEORI, KONSEP DAN TEKNIK PEMURNIAN

iii

UU No 19 Tahun 2002 Tentang Hak Cipta Fungsi dan Sifat hak Cipta Pasal 2 1. Hak Cipta merupakan hak eksklusif bagi pencipta atau pemegang Hak

Cipta untuk mengumumkan atau memperbanyak ciptaannya, yang timbul secara otomatis setelah suatu ciptaan dilahirkan tanpa mengurangi pembatasan menurut peraturan perundang-undangan yang berlaku.

Hak Terkait Pasal 49 1. Pelaku memiliki hak eksklusif untuk memberikan izin atau melarang

pihak lain yang tanpa persetujuannya membuat, memperbanyak, atau menyiarkan rekaman suara dan/atau gambar pertunjukannya.

Sanksi Pelanggaran Pasal 72 1. Barangsiapa dengan sengaja dan tanpa hak melakukan perbuatan

sebagaimana dimaksud dalam pasal 2 ayat (1) atau pasal 49 ayat (2) dipidana dengan pidana penjara masing-masing paling singkat 1 (satu) bulan dan/atau denda paling sedikit Rp 1.000.000,00 (satu juta rupiah), atau pidana penjara paling lama 7 (tujuh) tahun dan/atau denda paling banyak Rp 5.000.000.000,00 (lima miliar rupiah).

2. Barangsiapa dengan sengaja menyiarkan, memamerkan, mengedarkan, atau menjual kepada umum suatu ciptaan atau barang hasil pelanggaran Hak Cipta sebagaimana dimaksud dalam ayat (1), dipidana dengan pidana penjara paling lama 5 (lima) tahun dan/atau denda paling banyak Rp 500.000.000,00 (lima ratus juta rupiah)

iv

Azis Saifudin, Ph.D., Apt.

SENYAWA ALAM

METABOLIT SEKUNDER TEORI, KONSEP DAN TEKNIK PEMURNIAN

v

Katalog Dalam Terbitan (KDT)

SAIFUDIN, Azis

Senyawa Alam Metabolit Sekunder Teori, Konsep, dan Teknik Pemurnian/oleh Azis Saifudin.--Ed.1, Cet. 1--Yogyakarta: Deepublish, November 2014.

vii, 113 hlm.; 25 cm ISBN 978-602-280-472-7 1. Senyawa I. Judul

546

Desain cover : Unggul Pebri Hastanto Penata letak : Rizky Selvasari

Jl. Elang 6, No 3, Drono, Sardonoharjo, Ngaglik, Sleman

Jl.Kaliurang Km.9,3 – Yogyakarta 55581 Telp/Faks: (0274) 4533427

Hotline: 0838-2316-8088 Website: www.deepublish.co.id E-mail: [email protected]

PENERBIT DEEPUBLISH (Grup Penerbitan CV BUDI UTAMA)

Anggota IKAPI (076/DIY/2012)

Isi diluar tanggungjawab percetakan

Hak cipta dilindungi undang-undang Dilarang keras menerjemahkan, memfotokopi, atau memperbanyak sebagian atau seluruh isi buku ini

tanpa izin tertulis dari Penerbit.

vi

KATA PENGANTAR

Pembelajaran ilmu bahan obat alam atau farmakognosi di

perguruan tinggi perlu dipikirkan ulang dan redidesain agar lebih

fundamental secara sains, integratif dengan ilmu terkait dan fleksibel

untuk membekali mahasiswa agar bisa berinteraksi dengan

penemuan terbaru dan berpikir lintas bidang/interdisipliner.

Sedangkan pelajaran fitokimia di farmasi yang selama ini terkesan

“berdiri sendiri” perlu dikembalikan ke induk aslinya yakni

farmakognosi. Dan farmakognosi dipertajam dengan kimia bahan

alam (natural product chemistry). Buku ini menggunakan jembatan

aspek kimia organik sebagai dasar dan bingkai pembahasan

farmakognosi. Di dalam buku ini dipaparkan teori dasar metabolit

sekunder, teknik isolasi dengan interface aspek farmakologi.

Beberapa konsiderasi akan inkonsistensi pola yang lazim dijumpai

pada pekerjaan metabolit ini juga dipaparkan, termasuk beberapa

problematika terkait kontroversi metabolit sekunder.

Semoga buku sederhana ini ikut memberikan bekal dan

menambah dasar keilmuan para mahasiswa yang kelak di masa

depan berpartisipasi mengelola kekayaan alam Indonesia. Penulis

berharap buku sederhana ini bermanfaat kepada para peneliti,

mahasiswa tingkat sarjana atau pasca sarjana untuk mendukung riset

bidang senyawa alami, metabolit sekunder. Bagi penulis dan

keluarga semoga menjadi amal kebaikan.

Terima kasih saya ucapkan kepada para guru, senpai dan

kolega yang memberikan bimbingan dan sharing akademik maupun

kehidupan sosial.

Akhirnya terima kasih disampaikan kepada ibu dan bapak

penulis, istri tercinta Anggrek Sekar, wonderful kids Nabilah, Kiki,

dan Ubay yang memberikan inspirasi serta semangat.

Solo, 2014

Penulis

vii

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ................................................................... vi

DAFTAR ISI .............................................................................. vii

BAB I PERAN BAHAN ALAM DALAM PENEMUAN

MOLEKUL OBAT ........................................................... 1

BAB II BIOSINTESIS DAN PENGGOLONGAN

METABOLIT SEKUNDER ............................................. 10

BAB III KELARUTAN METABOLIT SEKUNDER DAN

PEMILIHAN PELARUT .................................................35

BAB IV EKSTRAKSI, FRAKSINASI, DAN PURIFIKASI .................39

BAB V BIOASSAY/UJI BIOAKTIFITAS/UJI

FARMAKOLOGI (BIOASSAY GUIDED

FRACTIONATION) .....................................................69

BAB VI SKALING UP DAN DEREPLIKASI ..................................74

BAB VII EFEK SINERGISME, KOMPLEMENTER, DAN EFEK

PLAUSIBLE ...................................................................76

BAB VIII SENYAWA TARGET BERSIFAT POLAR (SANGAT

LARUT DALAM AIR ATAU METANOL) .......................78

BAB IX PENENTUAN STRUKTUR/ELUSIDASI STRUKTUR .......84

BAB X ELUSIDASI STRUKTUR BEBERAPA SPEKTRA

METABOLIT SEKUNDER ............................................. 91

REFERENSI ............................................................................. 103

GLOSARIUM .......................................................................... 105

INDEKS ................................................................................... 110

BIODATA PENULIS .................................................................. 113

M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 1

BAB I

PERAN BAHAN ALAM DALAM PENEMUAN MOLEKUL OBAT

Target belajar: Pembaca memahami secara fundamental peran bahan

alam sebagai sumber molekul aktif farmakologis. Memahami posisi

farmakognosi dalam rumpun ilmu kefarmasian. Memahami peran

penting kimia organik sebagai jembatan memahami senyawa aktif

dari bahan alam.

Obat berdasarkan besar molekulnya dibagi menjadi dua yakni

mikromolekul dan makromolekul.

Gambar 1.1. Contoh kisah sukses molekul alam. Senyawa-senyawa

tersebut diresepkan di klinik. Molekul-molekul ini

dimurnikan dari tumbuhan dan mikroba tanpa

modifikasi apapun. Statin adalah golongan obat yang

memiliki share market terbesar di dunia.

N

N

O

OCH3

OH

H3CO

N

N

HO

OH

O

O

OCH3

O

NH

O

OO

O

O

O

O

O

HO

OH

OO

H

OH

Daunorubisin

(anti kanker payudara)

Lovastatin /statin

(anti kolesterol)

Artemisinin

(anti malaria)

Vinblastin (anti leukemia) Taxol (anti berbagai kanker)

O OO

O

O

OH

OH

O

OH

H2N

OH

O

O

O

H H

O

H

HO

O

O

O

O

O

H

2 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n

Obat Mikromolekul

Berat molekul obat golongan ini antara 100-1000 Dalton.

Molekul kecil ini kebanyakan diformulasikan dalam bentuk tablet,

kapsul, salep, sirup, serbuk, dan sejenisnya yang sangat mudah

dijumpai di apotek atau toko obat. Mikromolekul diperoleh dengan

cara sintesis total atau parsial dan dengan cara pemurnian dari

tumbuhan, bakteri, jamur.

Obat yang dibuat dari mikromolekul selama proses ekstraksi

dari bahan alam atau sintesisnya memerlukan bantuan pelarut

organik yakni metanol, etanol (alkohol), kloroform, heksana, aseton,

dan etanol dan lain-lain. Lebih dari 90% lebih molekul jenis

ini tidak larut air.

Obat Makromolekul

Kebanyakan obat makromolekul berupa protein dan

polisakarida. Produk ini berbagai vaksin dan produk imunologi.

Berat molekul golongan ini mayoritas lebih dari 1000 Dalton dan

memiliki kelarutan dalam buffer air. Kebanyakan protein merupakan

produk bioteknologi yang dihasilkan dengan rekayasa genetika

dengan bantuan mikrobia. Demikian pula produk obat protein dan

vaksin ini disiapkan dan disimpan dalam buffer.

Makromolekul diperoleh dengan cara ekstraksi serum

binatang, fermentasi bakteri atau jamur. Sifat obat makromolekul

larut dalam air atau buffer.

Baik mikromolekul kebanyakan merupakan produk alam.

Sedangkan makromolekul dihasilkan dari proses fermentasi/

bioteknologi.

Sejak kehidupan manusia pertama Nabi Adam AS hingga detik

ini manusia memanfaatkan bahan alam untuk hidup. Untuk

mendukung kehidupan: kelahiran, pertumbuhan, makan, minum,

pakaian, papan, keindahan, seni, beragama, dan kematian manusia

tidak bisa terlepas dari bahan alam. Kesemua aspek kehidupan

tersebut manusia sangat tergantung dengan zat alami yang dihasilkan

oleh makhluk hidup lain. Dari sisi makhluk produsen, senyawa alami

ada yang digunakan sebagai zat esensial untuk hidup dan ada zat

yang sekedar untuk mendukung kehidupan. Zat esensial untuk hidup


digunakan untuk dasar-dasar kehidupan: tumbuh, berkembang, dan

bereproduksi. Sedangkan zat pendukung kehidupaan digunakan

sebagai zat pertahanan dari gangguan makhluk lain, menarik

(attractant) makhluk lain, dan alelopat untuk mendominasi suatu

kawasan, menetralkan racun, dll.

Senyawa alami secara umum adalah molekul kimia berupa

mineral, metabolit primer, dan metabolit sekunder. Secara famili

besar, metabolit primer dan metabolit sekunder adalah senyawa

organik.

Bahan alam dibedakan menjadi dua berdasarkan fungsi

terhadap makhluk hidup pembuatnya yakni:

1. Metabolit primer

2. Metabolit sekunder

Metabolit sekunder adalah senyawa yang disintesis oleh

makhluk tumbuhan, mikrobia atau hewan melewati proses

biosintesis yang digunakan untuk menunjang kehidupan namun tidak

vital (jika tidak ada tidak mati) sebagaimana gula, asam amino dan

asam lemak. Metabolit ini memiliki aktifitas farmakologi dan biologi.

Di bidang farmasi secara khusus, metabolit sekunder digunakan dan

dipelajari sebagai kandidat obat atau senyawa penuntun (lead

compound) untuk melakukan optimasi agar diperoleh senyawa yang

lebih poten dengan toksisitas minimal (hit).

Metabolit Primer

Memiliki ciri:

Esensial untuk hidup: pertumbuhan normal, perkembangan dan

reproduksi. Berupa enzim fisiologis, menghasilkan energi misalnya

karbohidrat.

Terlibat langsung dalam fungsi fisiologis normal: protein dan

enzim

Terdapat di dalam organisme atau sel.

Dikenal dengan istilah metabolit sentral.

Berat molekul (BM) dari kecil dalam bentuk monomer hingga

sangat besar polimer ( > 1500 Dalton).

Contoh: glukosa, asam organik sederhana, asam lemak,

protein, hormon, enzim adalah metabolit primer.


Metabolit Sekunder

Memiliki ciri:

Tidak terlibat langsung dalam metabolism/kehidupan dasar:

pertumbuhan, perkembangan dan reproduksi.

Tidak esensial, ketiadaan jangka pendek tidak berakibat

kematian. Ketiadaan jangka panjang mengakibatkan

kelemahan dalam pertahanan diri, survival, estetika, menarik

serangga.

Golongan metabolit sekunder distribusi hanya pada spesies

pada filogenetik /familia tertentu.

Seringkali berperan di dalam pertahanan terhadap musuh.

Senyawa organik dengan berat molekul 50-1500 Dalton.

Sehingga disebut mikro molekul.

Penggolongan utama: terpenoid, fenil propanoid, poliketida,

dan alkaloid adalah metabolit sekunder.

Pemanfaatan oleh manusia: untuk obat, parfum, aroma,

bumbu, bahan rekreasi dan relaksasi.

Mikroba dan tumbuhan baik darat maupun laut merupakan

salah satu sumber utama bahan obat. Berbagai obat penting yang

diresepkan di dalam terapi klinik seperti antibiotik, statin, vinkristin,

taksol didapatkan dengan pemurnian dari sumber alami yakni

mikroba dan tetumbuhan. Demikian halnya beberapa jenis-jenis

senyawa yang berpotensi sebagai agen promosi kesehatan seperti

katekin, genistein, flavonoid, stilebenoid, dan lain-lain juga diisolasi

dari bahan alam, baik dari mikroba, tumbuhan, jamur maupun

sarang serangga seperti propolis (sarang lebah) atau pun sarang

semut.


Gambar 1.2. Dari 1355 obat yang digunakan di klinik pada rentang

tahun 1981-2010, hanya 4.4% molekul alami langsung

sebagai obat dan 0.4% ekstrak, namun sekitar 48% obat-

obatan lain diperoleh dengan modifikasi molekul alami,

atau berupa vaksin. (Diadaptasi dari Newman et al, 2012

Journal of Natural Products).

Pada rentang tahun 1981-2010, 4.4% dari 1355 buah obat-

obatan yang beredar berasal dari pemurnian bahan alam dan 0.4%

ekstrak da 43% merupakan senyawa alami yang dimodifikasi

(Newman, Cragg, and Snader, 2012). Terkhusus pada area obat

kanker, 74% obat yang digunakan secara klinik berasal dari ekstraksi

senyawa alami atau modifikasi senyawa alami. Jika digabungkan

dengan senyawa tiruan (mimick), vaksin, ekstrak maka kontribusi

bahan alam dalam penyediaan bahan obat lebih dari 50%. Dengan

demikian tampak sekali peran metabolit sekunder di dalam

penyediaan obat.

Perlu dicatat dengan baik-baik dan ditekankan di sini, bahwa

pemurnian molekul dari bahan alam bukanlah pekerjaan final dan

langsung bisa digunakan obat akan tetapi masih dan perlu langkah

lain. Jadi hanya sekitar 5% senyawa yang dihasilkan ekstraksi

langsung bisa digunakan untuk obat, kebanyakan menemukan

senyawa model untuk disintesis atau dimodifikasi lebih lanjut.

Farmakognosi

Farmakognosi berasal dari kata Yunani Pharmakon (obat) dan

gnosis (pengetahuan), yakni pengetahuan tentang bahan obat. Secara

4.4%

22.1%

0.4%

14.9%

5.9%

52.4%

Molekul alam

Modifikasi molekul alam

Fitofarmaka

Peptida

Vaksin

Sintesis


khusus farmakognosi adalah salah satu rumpun ilmu farmasi yang

mempelajari sumber bahan obat yang berasal dari bahan alami

(tumbuhan, mikroba, sarang, mineral dan hewan). Jadi awal mula

farmakognosi mempelajari bahan mentah obat atau crude drug.

Di waktu lampu (….-1800 M) ketika ilmu kimia organik belum

berkembang farmakognosi berforkus melakukan identifikasi spesies

tanaman, klasifikasi taksonomi, mempelajari morfologi dan

penggunaan bahan-bahan alami untuk pengobatan penyakit.

Tonggak sejarah farmakognosi modern dimulai dengan pemurnian

molekul tunggal dari tanaman.

Gambar 1.2 Morfin senyawa organik pertama dimurnikan oleh Fredrick

Serturner (Merck GmBH) dari kuncup bunga Papver

somniverum. Hingga hari ini masih digunakan di klinik

untuk analgetik umum.

Kelahiran farmakognosi modern (farmakognosi kimiawi)

dimulai dengan pemurnian molekul morfin (analgetik) oleh Friedrich

Sertuner pada tahun 1804 dari kuncup bunga (poppy) Papaver

somniverum dan dikomersialkan oleh pabrik farmasi Jerman, Merck.

Selanjutnya isolasi morfin itu memberikan ide ilmuwan modern lain

untuk melakukan pekerjaan pemurnian molekul-molekul lain dari

bahan alam yang mungkin digunakan untuk obat seperti:

Striknin (pestisida hewan

kecil)

Nikotin (stimulant)

Kuinin (anti malaria kuno) Atropin (relaksan otot polos)

Kafein (stimulant) dan Kokain (stimulan penekan

lapar, halusinogen)


Dengan ribuan spesies hayati tumbuhan tingkat tinggi,

mikroba, jamur, bakteri adalah sumber molekul-molekul penting

untuk kehidupan manusia dan lingkungan. Dengan ditemukan

metode kromatografi dan spektroskopi, farmakognosi memulai

babak baru yakni fokus dengan aspek pemurnian senyawa organik

tunggal. Jadi dalam farmakogos modern, kimiawi organik bukan

sekedar aspek lagi melainkan menjadi paradigma farmakognosi

modern. ScFinder, suatu portal kimia, ratusan ribu senyawa telah

ditemukan hingga kini dan ratusan senyawa baru ditemukan setiap

tahun. Senyawa tersebut diteliti dan dipelajari sebagai kandidat obat.

Jadi di dalam farmasi modern metabolit sekunder merupakan

sumber molekul obat. Pada kimia medisinal, metabolit sekunder

tersebut dipelajari dan diteliti untuk digunakan sebagai kandidat obat

modern. Di tingkat perguruan tinggi dan pasca sarjana metabolit

sekunder dijadikan sebagai obyek pembelajaran secara khusus karena

beberapa pertimbangan:

1. Aspek farmakologi: keanekaragaman struktur kimia metabolit

sekunder yang tinggi mengindikasikan potensi keragaman efek

farmakologinya dan merupakan sumber kandidat senyawa

obat yang tidak terbatas.

2. Stabilitas: molekul kecil memiliki stabilitas lebih tinggi

dibandingkan makromolekul. Makromolekul baik polisakarida

maupun protein rawan terhadap berbagai reaksi perusak.

Misalnya hidrolisis yang menyebabkan struktur pecah.

3. Aspek kimia medisinal dan teknologi pemisahan: senyawa

metabolit sekunder cenderung bersifat semipolar sehingga lebih

mudah berinteraksi atau melewati barrier/jaringan biologis.

Kimia medisinal secara praksis membangun paradigma berpikir

kompromis antara struktur senyawa obat dan aktifitas

farmakologis, pertimbangan polaritas obat terhadap

kemampuan menembus barrier jaringan dan sel. Dalam

prakteknya, aspek teknologi pemisahan juga menjadi unsur

penting kimia medisinal. Senyawa yang bersifat semi polar

lebih mudah dipisahkan dan dimurnikan dengan teknologi

kromatografi yang dikembangkan saat ini (silika, ODS,

sephadex).


4. Aspek farmasetik dan teknologi farmasi: berat molekul yang

kecil memungkinkan takaran dosis yang kecil dan lebih bisa

diterima (acceptable) untuk manusia dan hewan. Berat

molekul kecil lebih fleksibel terkait bentuk sediaan yang akan

diformulasi obat (tablet, kapsul, powder, injeksi), lebih

kompromis dan harmonis dengan pilihan bahan

pengisi/pembantu. Aspek teknologi farmasi: konsekuensi dari

poin 3, bobot molekul yang kecil lebih mudah, efisien dan

ekonomis dalam proses produksi di industri farmasi. Begitu

juga terkait dengan wadah dan pengepak juga lebih

ekonomis.

5. Aspek struktur: struktur senyawa aktif farmakologis seringkali

berstruktur kompleks dengan cukup banyak kiralitas (orientasi

letak gugus dalam 3 dimensi). Metode sintesis seringkali

menghasilkan campuran rasemis dan memiliki tahapan panjang

dilakukan untuk menghasilkan senyawa berstruktur kompleks.

Sehingga ekstraksi dan pemurnian masih merupakan jalan

paling ekonomis dan efisien terkhusus untuk senyawa

berstruktur rumit tersebut.

Pertanyaan

1. Apa keuntungan metabolit sekunder jika digunakan sebagai

bahan baku obat dibandingkan dengan molekul-molekul

besar?

2. Bandingkan sifat metabolit sekunder pula terhadap senyawa-

senyawa yang sangat mudah larut air? dapatkan Anda

memikirkan kelemahannya?


Gambar 1.4 diagram Kedudukan farmakognosi di dalam eksplorasi

material aktif.

Standardisasi dan kontrol

kualitas (kimia analisis)

Ekstrak aktif, gubal,

crude drug Farmakognosi

Farmasetika

Tumbuhan, bakteri, jamur,

dan hewan

Farmakologi

Tablet, serbuk, kaplet, sirup dll

Molekul

Molekul semi

alami

Molekul

Sintesis

Kimia Organik (termasuk

Fitokimia)

Kimia medisinal

Kimia sintesis


BAB II

BIOSINTESIS DAN PENGGOLONGAN METABOLIT

SEKUNDER

Target Pembelajaran: Pembaca ditargetkan mampu membedakan

golongan terpenoid, poliketida, fenil propanoid, alkaloid atau

campuran berdasarkan kerangka kimia yang diberikan. Mampu

menyebutkan jalur biosintesis dan tahapan umum di dalam jalur

biosintesis terpenoid, poliketida dan fenil propanoid. Sedangkan

metode klasik dengan reagen tertentu bersifat dekstruktif sehingga

sudah mulai ditinggalkan. (Untuk pembaca tingkat master

diharapkan mampu memperkirakan golongan metabolit sekunder

berdasarkan clue spektra NMR).

Jika manusia dibekali akal budi dan gerak pindah koordinasi

tubuh, makhluk hidup selain manusia dibekali oleh Allah SWT untuk

menghasilkan senyawa metabolit sebagai “alat” untuk survival

mendukung kehidupan mereka. Misal alkaloid sebagai senyawa

pertahanan dari musuh dan hama, flavonoid senyawa penghias,

senyawa pewarna, terpenoid sebagai atraktan atau penarik, atau

polifenol dalam rangka menetralkan senyawa beracun.

Kenyataannya manusia manusia juga menghasilkan metabolit

kategori alkaloid. Berbagai neurotransmitter adalah alkaloid. Tanpa

alkaloid endogen hidup manusia cacat dan tidak sempurna.

Pembahasan khusus ada di golongan alkaloid.

Sifat-sifat kimiawi metabolit sekunder tersebut umumnya

memiliki berat molekul yang kecil (antara 50-1500 Dalton),

umumnya tidak larut air karena bersifat semi polar, dan struktur

kimianya sangat beragam, jika saling bersenyawa jarang membentuk

molekul besar.

Gambar 2.1 Glukosinolat salah satu senyawa untuk senjata pertahanan

tumbuhan dari serangan virus, bakteri dan jamur.


Selain melakukan biosintesis sekunder, makhluk hidup

melakukan biosintesis primer sebagai proses kimiawi vital untuk

dasar untuk melakukan aktifitas hidup. Biosintesis ini dilakukan untuk

menghasilkan senyawa-senyawa esensial dan dasar reaksi-reaksi

kehidupan misalnya gula (karbohidrat) untuk menghasilkan energi,

asam amino untuk membangun jaringan dan biokatalis, asam lemak

untuk membangun dinding sel dan cadangan energi. Tanpa

metabolit primer ini dasar-dasar hayati tidak ada dan metabolit

sekunder juga tidak bisa diproduksi.

Metabolit primer terdiri dari 3 golongan utama yakni

karbohidrat, protein dan lemak. Glukosa esensial untuk

menghasilkan energi, asam amino vital untuk menghasilkan berbagai

hormon dan neuro transmitter, lemak untuk membangun jaringan.

Setiap metabolit primer ini akan bersenyawa membentuk polimer

atau ikatan yang lebih kompleks membentuk jaringan tubuh.

Jaringan otot tersusun dari pensenyawaan kompleks protein, dinding

sel tumbuhan atau cangkang binatang dibentuk dari persenyawaan

antar karbohidrat, jaringan lemak disusun oleh persenyawaan lemak.

Antar metabolit primer ini juga akan saling membentuk

persenyawaan dalam membangun sel-sel dan jaringan kemudian

organ.

Adapun sifat-sifat kimiawi metabolit primer, memiliki berat

molekul kecil mulai dari 80-300 Dalton/amu, larut dalam air (gula

dan asam amino) atau tidak larut air misalnya asam lemak, jika saling

berikatan membentuk senyawa dengan berat molekul sangat besar

(BM >1000-100.000 d). Secara farmakologis, senyawa metabolit

sekunder memiiliki berbagai aktifitas biologis: anti bakteri, anti

infeksi, anti kolesterol, anti kanker, anti diabetes dll.

Pertanyaan: apakah hubungan antara metabolit sekunder dengan

metabolit primer ?

Gambar 2.2 Glukosa, adalah metabolit primer untuk bahan energi

kehidupan dan darinya berbagai metabolit sekunder juga

berasal.


Karena metabolit sekunder berjumlah jutaan di alam dan akan

terus ditemukan ratusan senyawa baru setiap tahun maka tidak

mungkin seseorang bisa menghafalnya, walaupun setiap golongan

struktur. Diperlukan frame work dan metode berpikir yang mampu

mencakup garis besar metabolit sekunder. Untuk itu pemahaman

dasar-dasar biosintesis diperlukan.

Tujuan memahami biosintesis metabolit sekuder:

1. Senyawa di alam berjumlah jutaan dan tidak mungkin dihafal.

Setiap tahun ditemukan ratusan senyawa baru. Bahkan antar

senyawa satu sama lain membentuk senyawa yang lebih

kompleks. Biosintesis digunakan untuk membangun paradigma

berpikir dan meringkas keterhubungan antar senyawa.

2. Keteraturan pola struktur. Dengan memahami kerangka dan

jalur asal biosintesis suatu golongan senyawa bisa digunakan

untuk membantu menentukan struktur kimia. Inti kerangka

senyawa-senyawa metabolit sekunder memiliki keteraturan

pola dan memiliki bentuk yang seragam di dalam keragaman

sehingga penentuan struktur (elusidasi struktur) cukup terbantu

dengan pemahaman kerangka biosintesis.

3. Desain obat modern. Dengan memahami jalur biosintesis dan

mekanisme penyakit dimungkinkan desain obat (sintesis obat

dan QSAR (Quantitative-Structure Activity Relationship) atau

HKSA (Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas)) berdasarkan

pola interaksi penyakit dan target obat yang lebih selektif.

4. Aspek selektifitas. Terkait kondisi patologis (biokimiawi

penyakit), biosintesis terkait dengan berbagai mekanisme

penyakit dan pengobatan. Dengan memahami mekanisme dan

jalur biosintesis pembentukan senyawa penyebab penyakit

maka dimungkinkan memilih target, mengeblok atau

meminimalkan senyawa biologis penyebab penyakit. Misalnya

menurunkan jumlah kolesterol, merusakkan kapsul dari virus,

mengeblok protein penyebab diabetes, meminimalkan

pembentukan NO (nitrit) pada penyakit jantung atau

menyebabkan jejas kerusakan jaringan. Berbagai penyakit

masih menjadi misteri dan kini jalur biosintesis, pathway/ dan

jalur komunikasi sel menjadi topik penting di bidang


kedokteran dan pengobatan karena biosintesis seringkali terkait

dengan pembentukan agen degeneratif di dalam tubuh.

5. Aplikasi bioteknologi untuk produksi. Dengan diketahuinya

jalur biosintesis senyawa tertentu, melalui bioteknologi

kuantitas produk senyawa bermanfaat seperti obat yang

dihasilkan bisa dinaikkan. Jika senyawa kimia hanya bisa

dihasilkan dalam jumlah amat kecil misal taksol atau vinkristin

maka produksinya bisa ditingkatkan melalui potensi rekayasa

genetika atau manipulasi media fermentasi.

Berbagai mekanisme penyakit dan target obat baru ditemukan

dengan biosintesis, misalnya target biosintesis kolesterol, target enzim

pengganggu insulin, target penggangu asetil kolin pada Alzhaemer’s .

Ilmu biosintesis bukanlah ilmu yang mati dan statis namun berbagai

misteri besar kehidupan ada di dalamnya dan akan terus

berkembang dan ditemukan terutama di dunia biologi/kedokteran.

Untuk memahami dasar biosintesis metabolit sekunder maka

terlebih dahulu diperlukan beberapa istilah kunci:

1. Starting material: adalah senyawa sederhana yang biasanya

cukup stabil secara kimiawi dan menjadi bahan baku biosintesis

misalnya asam laktat glukosa, fruktosa, dan senyawa gula lain.

2. Prekursor: adalah senyawa yang terbentuk dari starting

material namun bukan produk akhir, seringkali prekursor ini

ditambahkan dari luar untuk meningkatkan produk. Prekursor

kebanyakan merupakan asam amino.

3. Biokatalis: sebagaimana pengertian katalis pada umumnya

namun katalis di dalam biosintesis secara khusus adalah enzim-

enzim pembantu reaksi.

4. Jalur biosintesis atau pathway: adalah rangkaian tahapan reaksi

perubahan starting material menjadi metabolit.

5. Produk: senyawa terakhir yang dihasilkan, yakni senyawa

senyawa poliketida (C2), terpenoid (C5), senyawa fenil

propanoid (C9) sebagai kerangka utama, senyawa alkaloid,

dan senyawa campuran.

Metabolit sekunder berasal dari biosintesis primer. Umumnya

starting material paling awal adalah senyawa metabolit primer

sederhana dan stabil secara kimia dan fisika, yakni gula.


Penelitian biosintesis di dalam laboratorium:

Media hidup yang digunakan adalah kultur sel tumbuhan, kultur

jamur, kultur bakteri atau tumbuhan utuh.

Gambar 2.3 Alur biosintesis metabolit sekunder. Starting mula-mula

adalah air dan CO2 (fotosintesis) yang menunjukkan bahwa

fotosintesis adalah proses biokimiawi dasar yang mendasari

kehidupan. Dari fakta ini tampak sekali bahwa air adalah

starting material mula-mula semua makhluk hidup.

Dengan demikian berdasarkan jalur biosintesis, metabolit

sekunder digolongkan menjadi:

Glukosa

Asam mevalonat (C5)

Asetil-CoA (C2)

Turunan poliketida

Berbagai asam amino

alifatik

Dioksiselulosa (C5)

Asam

Sikimat

Turunan asetat

Benzoik dan

fenolik (C7)

FOTOSINTESIS

L-fenilalanin,

tirosin, triptofan

(C9)

Eritrose 4-P

H2O +

CO2

O2 +


1. Golongan asetat (C2): poliketida dan asam lemak.

2. Golongan mevalonat dan deoksisilulosa (C5): terpenoid

3. Golongan sikimat: fenil matanoid (C7) dan fenil propanoid

(C9)

4. Golongan alkaloid

5. Golongan campuran: kombinasi antar metabolit sekunder atau

metabolit sekunder dengan metabolit primer.

Golongan senyawa poliketida dan asam lemak (C2)

Gambar 2.4 Tetrasiklin adalah antibiotik dihasilkan oleh biosintesis

asetat. Di tahap akhir mengalami aminasi

Senyawa C2 digolongkan menjadi 2 yakni golongan poliketida

dan turunan asam lemak. Asam asetat adalah building block dan

kerangka dasar golongan ini. Sehingga jumlah karbon golongan

metabolit sekunder ini berjumlah 2 dan kelipatannya (C2 x n).

Senyawa ini sangat luas distribusinya. Mulai dari makhluk jasad renik,

tumbuhan dan vertebrata menghasilkan senyawa golongan ini.

Berbagai golongan antibiotik, asam lemak, bahkan aflatoksin

penyebab hepatitis adalah senyawa-senyawa poliketida. C2 jika

membentuk struktur siklik maka ia menjadi poliketida dan jika

membentuk rantai alifatik panjang maka membentuk kerangka asam

lemak. Dengan demikian C2 berkontribusi membentuk metabolit

primer

Ciri-ciri senyawa poliketida adalah:

- Strukturnya tersusun dari rantai karbon dengan kelipatan 2

sehingga disebut C2, karena berasal dari starting material

asetat: nCH3CO2H -[CH2CO]n-. Adapun jumlah karbon

akhir bisa kehilangan 1 atau kelebihan bisa terjadi.

- Kadang membentuk cincin benzen aromatis


- Jika cincin benzen biasanya mengandung lebih dari satu gugus

hidroksil (-OH) atau alkoksi (-OR) maka gugu-gugus tersebut

akan berposisi meta satu sama lain.

Gambar 2.5 Posisi meta antara dua gugus alkoksi adalah salah

satu ciri khas dari senyawa golongan poliketida.

- Jika membentuk rantai panjang dan berakhiran dengan gugus

karboksilat maka disebut golongan asam lemak.

- Rantai panjang tersebut kadang mengalami siklisasi

Ciri sekunder:

- Semakin panjang rantai karbon maka semakin larut dalam

pelarut non polar, namun semakin banyak gugus hidroksil

maka kelarutan makin tinggi pada pelarut polar seperti

metanol.

Catatan: jumlah karbon di dalam struktur bisa kurang satu atau

kelebihan 1 ditoleransi dan tidak strict rumus C2, C5, C9.

Karena proses di alam oleh reaksi enzimatis.

- Diproduksi oleh hampir semua makhluk hidup, dari makhluk

tingkat rendah bakteri, alga, jamur, tumbuhan dan mamalia

hingga manusia.


Jalur biosintesis poliketida:

Gambar 2.6 Biosintesis golongan asam lemak dari starting material asam

asetat (C2)

Gambar 2.7 Mekanisme biosintesis golongan poliketida (diadaptasi dari

Dewick, 2006)


Identifikasi senyawa poliketida:

Secara kimiawi: dikarenakan beragam strukturnya, maka tidak ada

reagen khusus penciri golongan poliketida. Biasanya identifikasi

didasarkan pada reaksi gugus fungsional kemudian diidentifikasi

perubahan warna yang terjadi atau pergeseran pada panjang

gelombang tertentu. Contohnya jika bergugus fenolik maka potensial

dikopling dengan senyawa pengkelat sehingga larutan lebih gelap.

Sedangkan pencirian fisis dengan menggunakan lampu UV biasanya

akan memberikan pemadaman pada 254 nm dan warna tertentu

pada 366 nm. Jadi tidak terlalu spesifik. Walaupun reagen anilin bisa

mengidentifikasi cincin benzene namun akan bias dengan golongan

fenil propanoid. Untuk identifikasi modern penggunaan reagen

kimiawi destruktif era sekarang sudah dihindari

Untuk golongan asam lemak mudah dicirikan berdasarkan sifat fisis

yang meninggalkan noda semi transparan pada kertas. Di bawah

sinar UV asam lemak tidak memberikan pemadaman flouresensi.

Dengan spektra NMR: jika memiliki proton pada gugus aromatis

maka akan memberikan sinyal geseran kimia sekitar δ 6-8 ppm. Jika

mengadung proton rantai panjang karbon ikatan tunggal (-CH2-)

maka akan memberikan sinyal antara δ 1-2,8 ppm, beberapa

diantaranya overlap. Jika mengandung proton dengan ikatan ganda

maka akan menunjukkan peak sekitar δ 5-6,5 ppm.

Latihan:

Jelaskan mengapa senyawa-senyawa berikut disebut poliketida:


Golongan Senyawa Terpenoid (C5)

Gambar 2.8 Artemisinin adalah obat anti malaria yang diekstraksi dari

jamur Artemisinia annua, merupakan senyawa terpenoid.

Artemisinin menghambat pertumbuhan Plamodium

falciparum.

Terpenoid adalah senyawa yang tersusun dari kerangka

isopren (C5), yakni rantai beranggota lima karbon bercabang

(branching) metil pada karbon nomor 2 atau kelipatannya. Senyawa-

senyawa seskuiterpen (Zingiberaceae), asam ursolat yang terdapat

dalam berbagai tanaman dan bersifat penghambat kanker dan

menurunkan gula darah, asam betulinat yang tekandung dalam

berbagai tatanaman termasuk buah kayu putih yang bersifat

antidiabetes, azadiraktin dari biji mimba (Azadirachta indica) sebagai

pestisida, berbagai macam parfum dan aroma kebanyakan adalah

senyawa-senyawa terpenoid. Karotenoid dalam berbagai tanaman

sebagai pro vitamin A. Skualen suplemen kesehatan, bahkan

kolesterol yang jika kadarnya dalam tubuh berlebihan menyebabkan

penyakit jantung dan stroke adalah merupakan senyawa golongan

terpenoid.

Jalur Biosintesis

Isopentenil piropospat (IPP) atau dimetil alil piropospat

(DMAPP) adalah starting material paling awal dari terpenoid.

Jalur biosintesis terpenoid di mulai dari pembentukan

isopentenil piropospat (IPP) yakni isopren yang mengikat dua

buah pospat kemudian bergabung satu dengan yang lain dari

kepala-ekor membentuk monoterpen, seskuiterpen, diterpen,

triterpen dan seterusnya. Mengapa isoprene dalam reaksi ini

harus mengikat pospat ?.


Terdapat dua jalur biosintesis pembentuk terpenoid: 1 jalur

mevalonat dan 2. deoksiselulosa. Jalur biosintesis

deoksiselulosa adalah jalur biosintesis yang baru ditemukan.

Jalur deoksiselulosa ditandai lazim ada di dalam tumbuhan

atau bakteri, namun jarang terdapat di dalam makhluk

vertebrata termasuk manusia.

Minyak atsiri monoterpen dan seskuiterpen, steroid, kolesterol

merupakan senyawa terpenoid.

Apakah yang bisa Anda ambil pelajaran ?.

Dengan ketiadaaan atau tidak samanya jalur biosintesis

makhluk hidup, memungkinkan intervensi suatu obat cukup

selektif pada makhluk vertebrata.

Mekanisme pembentukan senyawa terpenoid:

Gambar 2.9 Dimetilalil piropospat (DMAPP) dan Isopentenil piropospat

(IPP) adalah starting material terpenoid. Terpenoid tersusun

dari rantai karbon tersebut atau kelipatannya.

Terdapat dua jalur biosintesis pembentuk terpenoid makhluk

hidup ada dua, yakni jalur mevalonat dan deoksiselulosa. Jalur

biosintesis deoksiselulosa adalah jalur biosintesis yang baru

ditemukan. Jalur deoksiselulosa lazim ada di dalam tumbuhan atau

mikroba namun jarang terdapat di dalam makhluk vertebrata

termasuk manusia.

Dengan ketiadaaan atau tidak samanya jalur biosintesis

makhluk hidup, memungkinkan intervensi suatu obat cukup selektif

pada makhluk vertebrata. Apakah yang bisa Anda ambil pelajaran?

Jalur biosintesis terpenoid dimulai dari pembentukan

isopentenil piropospat (IPP) atau dimetilalil piropospat (DMAPP)

yakni isopren yang mengikat dua buah pospat kemudian bergabung

satu dengan yang lain dari kepala-ekor membentuk monoterpen,

seskuiterpen, diterpen, triterpen dan seterusnya. Isoprene adalah unit


pembangun terpenoid bukan merupkan starting material paling awal

dari terpenoid. Mengapa isoprene dalam reaksi ini harus mengikat

pospat? Meskipun DMAPP dan IPP memiliki ikatan ganda namun

electron namun tidak terlalu reaktif untuk bereaksi dengan molekul

sejenis.

Gambar 2.10 Diagram skematik terbentuknya golongan terpenoid

Ciri-ciri senyawa terpenoid adalah:

1. Jumlah rantai atom karbon di dalam kerangka sebanyak 5 atau

kelipatannya. Sehingga disebut senyawa golongan C5.

2. Seringkali bercabang metil (branching –CH3). Karena starting

materialnya memiliki gugus metil maka jelaslah terpenoid yang

dihasilkan mewarisi gugus metil ini.


3. Kadang mengandung gugus metilen (=CH2) terminal atau -

CH2OH. Disebabkan suatu reaksi pada cabang metil pada poin

2 gugus metil tersebut kadang mengalami modifikasi menjadi

gugus metilen terminal atau metil yang mengikat hidroksi.

4. Seringkali membentuk cincin atau rantai siklik yang unik

Ciri sekunder:

5. Semakin panjang rantai karbon (jumlah karbon) kelarutan

makin larut pada pelarut non polar.

6. Jarang memiliki gugus aromatis.

7. Jika memiliki rantai ikatan ganda umumnya berjumlah

terbatas.

Keberadaan senyawa terpenoid berbobot molekul rendah

berlimpah distribusinya pada tumbuhan dan makhluk tingkat rendah

seperti jamur/fungi, bakteri dengan struktur sangat beragam. Pada

makhluk vertebrata dan manusia jenis senyawa terpenoid didominasi

turunan steroid.

Identifikasi Terpenoid

Secara kimia: Karena terpenoid sangat beraneka ragam strukturnya

dan tidak memiliki gugus yang uniform terkait reaktifitas kecuali

ikatan gandanya maka secara kimia terpenoid diidentifikasi dengan

penyemprotan pereaksi vanillin-asam sulfat atau anisaldehida-asam

sulfat yang akan menghasilkan warna-warna ungu, kuning coklat,

hitam pada sinar tampak. Vanillin dan anisaldehida memperpanjang

rantai terkonjugasi dari senyawa target. Atau kadang dilakukan

reaksi oksidasi, yang diperkirakan terlepasnya beberapa hidrogen

meningkatnya jumlah ikatan ganda sehingga terbentuk warna violet

pada cahaya tampak. dengan pereaksi umum serium(IV)sulfat yang

akan menghasilkan warna ungu, biru atau kuning.

Secara fisika: Karena ikatan gandanya terbatas maka identifikasi non

spesifik terpenoid adalah dengan melihat bercak kromatografi lapis

tipis silica gel254 nm di bawah sinar lampu UV 254 akan menghasilkan

bercak warna ungu pemadaman, dengan warna latar lempeng

fluoresensi hijau (lempeng berwarna hijau). Dan di bawah lampu UV

366 mm tidak menghasilkan fuoresensi. Semakin terbatas ikatan


gandanya tentu intensitas akan lemah. Sehingga senyawa-senyawa

triterpen seperti asam ursolat, asam betulinat, kolesterol sulit tampak

dengan identifikasi fisis. Untuk memvisualkan bercak kromatografi

golongan terpenoid rantai panjang memerlukan derivatisasi dengan

penyemprotan vanillin, anisal dehida, serium sulfat kemudian

dipanaskan beberapa detik sehingga akan timbul warna dari kuning

hingga merah tua. Harap dicatat bahwa reaksi kimia seperti ini

terlalu umum.

Gambar 2.11 Vanilin dan anisaldehida, jika dengan bantuan asam sulfat

dan pemanasan 103 0C merupakan penampak bercak

umum untuk senyawa yang tidak nampak pada UV 254

atau 366 terutama turunan terpenoid: minyak atsiri,

senyawa terprenilasi, saponin bahkan steroidal/triterpen.

Secara spektroskopi proton NMR: karena terpenoid memiliki gugus

metil, maka jika dibaca pada spektra NMR akan tampak sinyal

tunggal tinggi pada geseran kimia (chemical shift) antara δ 0.8

sampai sekitar 2 ppm. Atau jika terdapat gugus ekso metilen terminal

(=CH2) maka akan terdapat puncak sinyal tinggi tajam antara 5

sampai 5,6 ppm berupa doublet).

Soal latihan:

a. Sebutkanlah mengapa senyawa-senyawa berikut ini adalah

termasuk terpenoid dan masuk pada golongan tepenoid yang

mana?

O

H

OR

OR

Vanilin/Anisaldehid

Senyawa terpenoid

OH

H

OR

OR

H

Senyawa vanilin terpenoidal

103 0C, 3 menit


b. Sebutkanlah mengapa Mengapa senyawa artemisinin obat

malaria dengan struktur ini termasuk terpenoid dan masuk

golongan terpenoid apa?

Arteminisin obat malaria dari Artemisin:

c. Termasuk golongan terpenoid apakah senyawa dengan

struktur berikut ?

O

O

HO OH

OH

O

6. Steviol

OH

CO2H

4. -kariofilen

3. Iridoid 1. Citral

5. Heyneanol

7. Amrin

2. p-Cimen

H H

HO


Andrografolid dalam herba sambiloto:

Catatan: jumlah karbon di dalam struktur bisa kurang

satu atau kelebihan 1 ditoleransi dan tidak strict

rumus C2, C5, C9. Karena proses di alam oleh reaksi

enzimatis. Asal ciri utama memenuhi dan sesuai golongan

metabolit.

Golongan fenil propanoid (C9) dan fenil metanoid (C7)

Gambar 2.12 Podofilotoksin adalah senyawa anti kanker kulit diisolasi

dari spesies tumbuhan Podophyllum spp. Podofilotoksin

bahan baku obat kanker etopsida (Inzet) yang digunakan

untuk kanker paru, testes, limfoma dll.

Senyawa fenilpropanoid adalah senyawa memiliki kerangka

aromatik fenil (C6) dengan rantai samping propanoid (C3) sehingga

jumlah total karbonnya adalah 9 dan disebut C9 atau fenil

propanoid dan kelipatannya.

Senyawa fenil propanoid terbentuk dari asam sikimat (Gambar

2.3 dan 2.11). Selain fenil propanoid, jalur asam sikimat

dihipotesiskan membentuk building block C7. Berbagai senyawa

golongan lignin, stilben, kumarin memiliki kerangka C9. Asam galat,

O

OH

OCH3

H3CO

O

O H

H

O

O

O

OO

HO

HO


struktur benzoik, berbagai polifenol (bukan jalur tunggal) terbentuk

dari struktur C7.

Golongan Fenil propanoid adalah adalah senyawa yang

memiliki aktifitas farmakologi luas seperti antikanker

(podofilotoksin), filantin berefek sebagai hepatoprotektor dan

stimulan kekebalan dalam tanaman meniran (Phyllanthus niruri),

antiaterosklerosis (stilebenoid, resveratrol), antidiabetes

(sinamaldehide, terkandung dalam kulit kayu manis (Cinnamomum

burmani), eugenol bahan antiseptik gigi diperoleh dari kuncup bunga

cengkeh (Syzygium aromaticum). Berbagai bahan parfum atau aroma

aromaterapi merupakan senyawa fenil propanoid. Jadi minyak atsiri

disusun oleh golongan monoterpen, seskuiterpen, dan

fenilpropanoid.”

Gambar 2.13 Flowchart pembentukan senyawa dengan kerangka C9 dan

C7 atau disebut golongan fenil propanoid dan fenil

metanoid


Ciri-ciri senyawa fenil propanoid dan fenil metanoid:

1. Selalu memiliki kerangka inti fenil dan propanoid sehingga

disebut C9 dan kelipatannya misalnya 2 x C9, 3 x C9 dst. Jika

C7 maka memiliki kerangka benzil dan 1 rantai karbon

samping

2. Pada kerangka aromatik jika memiliki gugus hidroksil (-OH)

atau alkoksi (-OR) biasanya akan berada pada posisi para

terhadap rantai samping propanoidnya.

3. Jika terdapat lebih dari satu alkoksi (-OR) atau hidroksil (-OH)

maka akan berposisi orto.

Keberadaanya berlimpah pada tumbuhan namun terbatas pada

jamur dan belum ditemukan pada manusia atau vertebrata.

Golongan ini melewati starting material asam amino L-tirosin dan L-

fenilalalin yang merupakan asam amino esensial (manusia tidak

memiliki jalur biosintesis ini). Sehingga potensi toksisitas kecil pada

manusia.

Identifikasi senyawa fenil propanoid:

Secara kimia: reaksi umum untuk identifikasi fenil propanoid

tidak ada reagen khusus untuk identifikasi. Sedangkan keberadaan

rantai samping propanoid atau gugus lain tentu tidaklah spesifik.

Tergantung dari berbagai gugus fungsional yang terikat. Jika

mengandung gugus hidroksil maka reagensia pengkopling semacam

FeCl2 yang berakibat warna larutan menjadi gelap.

Secara fisika: Senyawa ini biasanya jika dilihat di bawah sinar

UV 254 nm lempeng KLT silica gel254 akan mengalami pemadaman

fluoresensi (quenching). Khusus untuk golongan kumarin akan

memberikan flouresensi biru terang, sedangkan pada larutan

berflouresensi hijau. Adapun berbagai reagensia penciri gugus kimia

tentu tidak spesifik untuk mencirikan golongan fenilpropanoid.

Secara spektroskopi NMR. Tanda kurung di awal dan diakhir

alinea dibuang.: karena dipastikan memiliki kerangka aromatik,

biasanya proton pada aromatik akan memiliki geseran kimia antara δ

6 sampai 7 ppm. Pola pemecahannya mengikuti sistem ABX misalnya

dd (doublet of doublet) atau double dengan coupling constant kecil

antara 1-3 Hz yang menunjukkan coupling meta. Diukur pada


karbon NMR maka akan terdapat sinyal karbon sebanyak enam

buah pada geseran kimia di atas δ 100 ppm. Sedangkan rantai

samping tergantung gugus yang diikat, jika membuat proton fenil

maka akan memberikan sinyal pada geseran kimia antara δ 4,5- 6

ppm, jika berupa proton alifatik maka akan berada di antara δ 1-2

ppm, jika terikat pada karbon yang mengikat oksigen maka akan

berada di antara δ 3-4 ppm.

Tugas: Identifikasilah termasuk golongan senyawa apa golongan

berikut ini!

Golongan alkaloid

Gambar 2.14 “Piculah Adrenalin mu! Adrenalin adalah salah satu

alkaloid yang diproduksi oleh makhluk vertebrata dari

asam amino tirosin. Adrenalin berfungsi mediator pada sel

saraf terkait rasa simpati dan kewaspadaan. Jadi tidaklah

betul alkaloid hanya terdapat pada tumbuhan melainkan

hampir semua kingdom termasuk manusia.


Definisi alkaloid klasik menyatakan

bahwa semua senyawa metabolit sekunder

yang mengandung unsur nitrogen di dalam

kerangkanya. Alkaloid diklasifikasi-kan

berdasarkan asam amino prekursornya

dan di dalam kerangkanya masih memiliki

atom nitrogen.

Adapun senyawa dengan kerangka asetat, terpenoid, shikimat

yang mengalami aminasi (pemasukan atom N) bukanlah alkaloid

secara definisi khusus.

Senyawa alkaloid memiliki peran yang sangat besar di dalam

bidang kedokteran. Senyawa yang pertama kali diisolasi secara murni

adalah morfin. Berbagai obat penting terutama obat syaraf adalah

alkaloid. Berbagai doping, bahan obat narkotik, kopi dikonsumsi

sehari-hari oleh manusia mengandung alkaloid yakni kafein, coklat

adalah alkaloid teobromin.

Namun secara dominan alkaloid adalah senyawa metabolit

sekunder yang berasal dari prekursor asam amino. Sehingga untuk

mempelajari alkaloid bisa ditelusuri berdasarkan building block atau

kerangka asam amino asalnya.

Golongan utama alkaloid:

alkaloid turunan ornitin

alkaloid turunan lisin

alkaloid turunan asam nikotinat

alkaloid turunan tirosin

alkaloid triptopan dan asam antranilat

alkaloid turunan histidin

alkaloid karena reaksi aminasi

Keberadaan dan fungsi alkaloid:

Keragaman struktur alkaloid sangat tinggi. Alkaloid berpotensi

sebagai sumber obat yang berlimpah dan berefek farmakologis

beragam. Sifat fisiko-kimia yang bersifat semipolar dan mampu

berinteraksi dengan membran sel. Kontribusi atom N di dalam

struktur memberikan efektifitas interaksi kimiawi dengan reseptor.

N C

O

OH

H

H

H

R


Secara farmakologis bersifat bioaktif lemah hingga kuat. Alkaloid

yang bersifat lemah bermanfaat sebagai zat rekresional, misalnya

kafein dalam teh dan kopi. Alkaloid yang berefek kuat bersifat

blocker atau stimulant berbagai reseptor atau protein fungsional.

Alkaloid yang sangat poten bersifat racun misalnya beberapa

alkaloid dari katak.

Obat-obatan seringkali dibuat dengan memodifikasi alkaloid

endogen. Terdistribusi luas dari tumbuhan, jamur, bakteri hingga

mamalia. Neurotransmitter kebanyakan merupakan alkaloid:

adrenalin, atropin, asetilkolin,glutamat, adenosin, dll.

Soal latihan:

identifikasilah mengapa senyawa-senyawa berikut merupakan

alkaloid !

Senyawa Golongan Campuran

Senyawa-senyawa fenil propanoid (C9), C7, terpenoid (C5),

poliketida (C2), alkaloid serta metabolit primer (umumnya

monosakarida) di alam bisa saling bereaksi dan berikatan sehingga

membentuk kerakaragaman baru baik struktur maupun aktifitas

farmakologi.

Jadi Jenis kombinasi bisa:

- Dua golongan metabolit sekunder.

- Tiga golongan metabolit sekunder.

O

HO

HO

H

NMe

HN

NMeH

NH

OH

HO

HO

Kodein (obat batuk kering) Nikotin (stimulant)

Dopamin (neurotransmitter

emosi dan memori)

Salbutamol (anti asma sintetis)


- Semua golongan dengan metabolit primer (terutama

monosakarida glukosa, rhamnosa, fruktosa)

- Semua metabolit sekunder juga bisa melakukan reaksi

halogenasi, sulfurasi, dan aminasi.

Soal latihan: (Harap dipahami bahwa jumlah karbon kurang satu

atau kelebihan satu dari rumus umum bisa terjadi)

1. Senyawa kavibetol merupakan senyawa marker pada daun

sirih (Piper bettle). Merupakan senyawa golongan apakah

kavibetol?

2. Senyawa flavonoid adalah senyawa yang distribusinya sangat

luas pada berbagai familia dan spesies tanaman. Tersusun dari

kerangka apakah senyawa flavonoid?

3. Tetrahidrokanabinoid (THC) adalah senyawa aktif dalam

tanaman ganja (Cannabis sativa). Senyawa ini berpotensi untuk

mengobati multiple sclerosis. Tersusun dari kerangka apa saja

golongan tersebut?

4. Dounorubisin disari dari jamur Streptomyces peucetius

digunakan untuk mengobati kanker leukemia limfosit dan


myeloid akut. Termasuk golongan apakah senyawa taxol dan

dounorubisin?

5. Kurkumin adalah bumbu dapur yang berkhasiat untuk

mencegah keganasan (malignansi) kanker. Termasuk golongan

apakah kurkumin?

6. Lunamarin adalah senyawa yang terdapat pada daun maitan

atau sanrego (Lunasia amara Blanco). Termasuk senyawa

apakah senyawa lunamarin dan tersusun dari building block

apa saja?

7. Jeruk purut atau Citrus hystrix kaya dengan kumarin salah

satunya ada eupecindatin. Termasuk building block apakah

senyawa tersebut?

8. Saponin terdistribusi pada bererapa spesies. Digoksin

merupakan saponin. Lerak untuk mencuci kain batik tulis juga


merupakan saponin. Tersusun dari kerangka apa sajakah

senyawa saponin dengan struktur di bawah ini?

9. Kapsisin adalah senyawa yang terkandung di dalam buah cabai

(Capsicum sp), selain bermanfaat untuk memberikan rasa

pedas pada sambal, kapsisin berefek sebagai pengurang nyeri

(analgetik). Merupakan senyawa apakah dan tersusun dari

kerangka apa senyawa kapsisin tersebut?

Penggolongan metode lain:

Sebagian ilmuwan lain mengklasifikasikan metabolit sekunder

berdasarkan keluasan distribusinya dan kelimpahannya di alam.

Penggolongan ini biasanya memiliki tujuan pragmatis namun tidak

terlalu spesifik untuk melakukan kuantifikasi dan digunakan untuk

melakukan estimasi kasar golongan senyawa yang kemungkinan

bertanggung jawab secara farmakologis. Golongan senyawa itu

adalah:

1. Gol. Fenolik

2. Gol. Flavonoid

3. Gol. Saponin

4. Gol. Minyak atsiri

5. Gol. Tannin

6. Gol. Alkaloid (terbatas pada beberapa genus)

7. Gol. Steroid


Namun dengan kemajuan kimia organik selama 30 tahun ini,

pembagian golongan umum ini sudah tidak terlalu relevan. Seorang

peneliti akan cukup mudah menelusuri pustaka terakit golongan

metabolit sekunder yang dikandung oleh suatu tanaman dan

menegasikan golongan yang tidak perlu dianalisis. Jika ditelusuri

ketujuh metabolit sekunder tersebut sudah tercakup dari kerangka

molekul C2, C5, C7, C9, alkaloid, atau kombinasi.

Pertanyaan:

1. Termasuk golongan metabolit sekunder apakah senyawa

fenolik, flavonoid, dan golongan tannin?. Bagaimana

hubungan kekerabatan mereka?

2. Bagaimana hubungan kekerabatan antara saponin dengan

senyawa steroid?

3. Sebutkan komponen metabolit sekunder yang menyusun

golongan minyak atsiri?

4. Jelaskan kedudukan ketujuh golongan tersebut di dalam

khazanah metabolit sekunder?


BAB III

KELARUTAN METABOLIT SEKUNDER DAN

PEMILIHAN PELARUT

Target Pembelajaran: Pembaca diharapkan mampu memahami sifat

dasar metabolit sekunder dan memberikan overview pelarut yang

sesuai di dalam upaya ekstraksi.

Penggolongan metabolit sekunder berdasarkan kepolaran

secara tegas tidaklah tepat. Penggolongan metabolit sekunder

berdasarkan polaritas sangatlah kaku sehingga tidak mutlak bisa

diterapkan. Sifat polaritas antar golongan metabolit sekunder

kebanyakan tidaklah berbeda secara dramatis. Untuk mengisolasi

dan memurnikan metabolit sekunder harus dipahami sifat dasar

molekul metabolit sekunder. Mayoritas metabolit sekunder bersifat

semi polar sehingga larut dalam pelarut organik. Metanol dan

asetonitril adalah pelarut organik paling polar. Heksana, benzana,

dan petroleum eter bersifat non polar. Hanya sebagian saja dari

metabolit sekunder bersifat polar dan larut dalam metanol atau air.

Kebanyakan metabolit yang larut metanol adalah senyawa glikosida

yang mengikat satu atau lebih molekul gula heksosa/pentosa.

Adapun kebanyakan golongan terpenoid bersifat non polar sehingga

larut ke dalam pelarut non polar dan semi polar. Namun untuk

monoterpen dan seskuiterpen masih mampu larut dalam metanol.

Metode kromatografi baik fase normal atau terbalik yang saat

ini diterapkan dan berkembang kebanyakan kompatibel dengan

senyawa semi polar. Sehingga senyawa yang sangat polar atau non

polar tidak kompatibel dengan metode pemisahan kromatografi.

Begitu juga metabolit primer polisakarida, lemak, dan protein

tunggal dari bahan alam tidaklah tepat menggunakan metode

kromatografi konvensional. Demikian juga senyawa yang larut air

dan sangat larut metanol atau yang sangat non polar sangat sulit

memurnikan dan mengkarakterisasinya.


Untuk melakukan pemisahan awal senyawa alami dari matriks

nabati/hewani melibatkan pemisahan kasar dilanjutkan dengan

pemisahan halus. Pemisahan kasar melibatkan salah satu metode:

- ekstraksi

- fraksinasi partisi cair-cair

- atau fraksinasi cair-padat

Sedangkan pemisahan halus melibatkan salah satu:

- kromatografi kolom fase normal

- kromatografi kolom fase terbalik

- Kromatografi eksklusi/permeasi

Jenis dan kegunaan pelarut

Berbagai pelarut lazim digunakan pada berbagai pekerjaan

ekstraksi, fraksinasi, fase gerak kromatografi.

Tabel. Pelarut yang lazim dan penggunaannya

Solven Konstanta

dielektrik (ε)

Penggunaan

Hekana 2,02 Untuk mengekstraksi lemak. Untuk

partisi paling awal terhadap larutan air

atau heksana. Heksana tidak bercampur

dengan metanol. Dengan rasio besar ke

kecil (0-10 %) dicampur etil asetat

digunakan untuk fase gerak KLT dan

kolom silika untuk memisahkan

senyawa semi polar-non polar.

CCl4 2,24 Racun. Tidak pernah dipakai untuk

ekstraksi atau pemisahan.

Benzana 2,28 Karsinogenik !!. Digunakan untuk

pemisahan isomer-isomer yang memiliki

cincin benzen, untuk tahap pemurnian.

Lakukan di lemari asam/fumehood.

Toluen 2,38 Fase gerak KLT dicampur dengan

metanol kadar rendah. Analisis KLT

senyawa bercincin benzana.

Trietil amina 2.43 Bersifat basa lemah. Dicampur (1-5 %)

dalam kloroform-metanol atau heksana-

etil asetat untuk menganalisis KLT

beberapa alkaloid.


Solven Konstanta

dielektrik (ε)

Penggunaan

Kloroform 4,81 Untuk partisi terhadap air. Dicampur

metanol kadar rendah (5-20 %) untuk

fase gerak KLT fase normal. Selalu larut

dengan metanol berapa pun kadarnya.

Cukup toksik. Direkomendasikan

diganti dengan diklorometan untuk

kromatografi kolom adapun KLT tidak

masalah. Dalam bentuk terdeutronasi

pelarut yang bersih untuk kebanyakan

senyawa semi polar-non polar.

Eter (dimetil

eter)

5,0 Toksik dan anestetik. Jika terpaksa

digunakan dengan rasio 1-4 terhadap

heksana digunakan sebagai fase gerak

untuk pemurnian dan pemisahan

dengan KLT. Dilakukan di lemari asam.

Etil asetat 6,02 Untuk partisi cair-cair dengan air.

Dilakukan setelah heksana. Dicampur

dengan heksana (0-100%) untuk fase

gerak kromatografi kolom. Dicampur

dengan kloroform atau diklorometana

untuk kromatografi kolom senyawa-

senyawa non polar. Dilakukan sebelum

campuran heksana-etil asetat.

Asam asetat 6,15 Sedikit mengasamkan fase gerak pada

KLT pemisahan halus

Diklorometana 8,93 Untuk partisi cair-cair menggantikan

kloroform. Dicampur metanol kadar

rendah (5-20 %) untuk fase gerak KLT

fase normal.

n-butanol 17,8 Untuk partisi terhadap air setelah etil

asetat. Kadang dicampur sedikit asam

asetat atau asam lemah lain dan

dijenuhkan dengan air untuk analisis

KLT glikosida. Ditutup rapat. Bau

mengganggu pernapasan.

n-propanol 20,1 partisi cair-cair dengan air jika perlu

lebih halus ketika fraksi air setelah

dipartisi dengan n-butanol

Aseton 20,7 Ekstraksi senyawa semi polar. Kadang

dicoba dengan sedikit metanol untuk

KLT. Dalam bentuk terdeutronasi

sebagai pelarut semi polar NMR.

Etanol 25,3 Untuk ekstraksi awal simplisia baik

sendiri atau dicampur dengan air kadar


Solven Konstanta

dielektrik (ε)

Penggunaan

< 30%.

Metanol 33 Pelarut utama untuk ekstraksi simplisia.

Campuran dengan aseton atau

asetonitril untuk fase gerak fase terbalik.

Rasio sangat kecil terhadap klorofom

atau diklorometana untuk fase gerak

KLT fase normal.

Asetonitril 36,6 Dalam bentuk campuran dengan air

untuk fase gerak KLT fase terbalik dan

HPLC

DMSO 47,2 Pelarut untuk bioassay. Dalam bentuk

terdeutronasi sebagai pelarut NMR

Air 80 Pengekstraksi polar, membuat infusa,

membuat dekokta. Dalam bentuk

terdeutron sebagai pelarut NMR

Gambar 3.1 Diagram alur proses ekstraksi hingga diperoleh senyawa

aktif. Pengujian efek farmakologi harus dilakukan setiap

tahap. Sampel yang aktif yang diteruskan. Itulah inti dari

bioassay guided gractionation.


BAB IV

EKSTRAKSI, FRAKSINASI, DAN PURIFIKASI

Target Pembelajaran: Pembaca mampu memahami alur pemurnian

mulai dari proses ekstraksi, fraksinasi, dan purifikasi. Mampu memilih

fase diam dan fase gerak dalam setiap tahap serta menentukan bobot

minimal yang harus dimiliki pada setiap proses.

Ekstraksi

Metode ekstraksi paling sederhana dan menjadi pilihan adalah

maserasi (perendaman). Yakni merendam material di dalam pelarut.

Maserasi (merendam dalam pelarut) adalah metode ekstraksi pilihan

pada tahap pendahuluan ataupun ekstraksi perbanyakan. Selain

karena simple juga tidak banyak gangguan fisis.

Adapun metode dasar yang lain seperti perkolasi, Shoxleat, gas

superkritikal, counter current chromatography, microwave dll

digunakan menyari bahan yang targetnya sudah jelas.

Tahapan ekstraksi melewati dua mekanisme dasar yakni:

Disolusi : proses terendamnya senyawa target oleh solven.

Difusi : proses terbawanya senyawa-senyawa oleh solven keluar

sel atau matriks alami.

Agar solven bisa menjangkau tempat senyawa di dalam sel

atau ruang antar sel maka penyerbukan harus dilakukan. Serbuk yang

terlalu halus menyebabkan larutan keruh atau terbentuk dispersi

yang mengganggu kedua proses itu. Pembatas proses difusi adalah

gradien difusi yang mendekati ~1. Artinya kadar senyawa di dalam

pelarut dan di dalam material alami sama. Biasanya setelah 1 malam

diganti pelarut baru.

Pada pekerjaan skrining seringkali hanya dibutuhkan 1-10 gram

serbuk bahan untuk diekstraksi. Barulah jika setelah bioassay

diketahui sampel yang paling poten maka yang diperbanyak.

Bioassay secara in vitro modern hanya membutuhkan bobot ekstrak

sekitar 1 mg. Untuk mempercepat ekstraksi seringkali dikombinasi

dengan sonikasi 1 jam, menaikkan suhu 30-400C. Tidak perlu dalam

jumlah besar.


Polarisasi dan Depolarisasi

Konsep interaksi kimiawi pada ekstraksi, fraksinasi kasar, dan

sub fraksinasi berdasarkan derajat polaritas pelarut-pelarut. Di sisi

lain harus dimengerti bahwa tidaklah tepat mengandalkan konsep

kelarutan “like dissolves like” belaka. Seseorang harus memiliki

pemahaman yang cukup dengan prinsip ikatan kimia dan batas

kelarutan. Tidaklah benar bahwa senyawa polar hanya larut di

dalam pelarut polar atau sebaliknya. Pada batas tertentu sekelompok

metabolit sekunder dapat mengalami polarisasi atau depolarisasi

pada suatu kuantitas pelarut berlebih sehingga terjadi peristiwa “like

dissolves unlike”. Contohnya etanol dalam jumlah besar mampu

melarutkan glikosida (polarisasi). Heksana yang bersifat non polar

dalam jumlah besar juga mampu menarik polifenol karena fenomena

depolarisasi. Untuk itulah pekerjaan pengawalemakan (defatting)

bukanlah pekerjaan yang dianjurkan karena menyebabkan cukup

banyak metabolit terlarut hilang. Contohnya senyawa xanton

(ksanton) kadar akan berkurang dari ekstrak jika heksana digunakan

untuk pengawalemakan ekstrak kulit manggis.

Interaksi Kimiawi

Konsep yang harus dikuasai adalah pada fase pemisahan halus

adalah interaksi antara fase diam, pelarut, dan analit. Pada fase diam

normal interaksi kimiawi yang paling penting adalah ikatan hidrogen

antara tiga komponen.

Untuk menghasilkan senyawa aktif secara farmakologis

diperlukan kerja yang sistematik dengan melakukan pendekatan

bioaktifitas. Untuk itu diperlukan target biologis yang sesuai sebagai

representai penyakit tertentu. Demikian pula pemilihan bahan hayati

dilakukan secara random (acak) dengan jumlah jenis sampel (spesies)

banyak. Semakin banyak spesies yang diuji semakin besar peluang

untuk memperoleh bahan aktif yakni jumlah spesiesnya Untuk

pemilihan sampel secara random, sampel tidak harus pernah

dilaporkan untuk penyakit yang ingin diteliti. Di industri, sampel

random ini dilakukan secara HTS (high throughput screening), yakni

penapisan dengan uji farmakologis secara cepat dengan jumlah stok

sampel sangat kecil (<0,5 mg). Pendekatan ini juga berdasarkan


penggunaan tradisional untuk penyakit yang sesuai

(etnofarmakologi) dari pengamatan empiris, data empiris dari

record, daftar obat tradisional atau dari publikasi, dan laporan

ilmiah. Bahkan bisa dari buku resep tradisional atau pustaka lokal

yang bisa dipertanggung jawabkan artinya tidak hanya 1-2 buku

resep saja.

Untuk isolasi skala proyek penelitian uji aktifitas in vitro lebih

sesuai karena akan menyesuaian jumlah fraksi yang dihasilkan.

Namun demikian harus selalu dipikirkan penyesuaian bobot sampel

yang tersedia jika ingin dilakukan uji secara in vivo / in vitro.

Dengan setiap langkah ekstraksi, fraksinasi, dan purifikasi

semua material selalu dipantau dengan pengujian aktifitas

farmakologis. Paradigma kerja ini disebut bioassay-guided

fractionation. Pendekatan ini menjadi standard dalam penemuan

obat baik dari bahan alam maupun sintesis.

Secara kuantitas ada tiga macam metabolit sekunder yakni

yang ditemukan sebagai senyawa utama (major compound),

senyawa minor (minor compound), dan senyawa kelumit (trace

compound)*.

Adapun perinciannya adalah sebagai berikut:

- Senyawa utama jika ditemukan dalam prosentasi lebih besar

dari 0,01 % dari berat simplisia(>100 mg/kg simplisia.

- Senyawa minor jika ditemukan dalam prosentase kurang dari

0,01-0,0001 % (75-20** mg/kg simplisia)

- Senyawa kelumit jika ditemukan dalam prosentasi kurang dari

0,0001 % (5-0,5 mg/kg simplisia)

* Berdasarkan limit of identification dengan NMR 400 MHz.

** Angka-angka ANTARA tidak eksak karena mempertimbangkan

kehilangan selama proses ekstraksi.

Pentingnya Dokumentasi

Pemastian spesies atau disebut otentikasi dengan

mengkonsultasikan kepada taksonomis jika merupakan spesies yang

bukan merupakan domain umum. Namun jika sudah jelas dan

merupakan public domain misalnya pohon jati (Tectona grandis),


bawang merah (Alium cepa), melinjo (Gnetum gnemon) tentu

mudah menentukan spesiesnya. Voucher atau contoh bagian

tanaman atau tanaman utuh (herba) wajib disimpan untuk

dokumentasi jika sewaktu-waktu untuk konfirmasi atau penelusuran

kembali demikian deskripsi tempat pengambilan sampel. Teknologi

dokumentasi elektronik pribadi juga bisa digunakan, misalnya

menyimpan dalam bentuk fotonya. Tanpa dokumentasi dan

otentikasi yang baik bisa menimbulkan keraguan hasil atau kesulitan

untuk memperoleh hasil yang sama.

Bahan Simplisia (Crude Drug)

Untuk mendapatkan ekstrak yang poten dilakukan berdasarkan:

1. Pendekatan data empiris: mengamati bahan yang secara

empiris memberikan efek positif pada penderita penyakit

tertentu.

2. Sampling random: sampel diseleksi dari berpuluh-puluh

(hingga ratusan) bahan hayati. Skrining haruslah dilakukan

sehemat dan seefisien mungkin. Era sekarang bioassay

didasarkan pada target molekul in vitro atau kultur sel yang

membutuhkan jumlah bahan uji sangat sedikit. Cukup

disediakan 1-10 gram bahan mentah. Semuanya dimaserasi

hingga didapatkan 1-10 mg ekstrak. Kemudian diuji pada dosis

tunggal misalnya mengacu 25 µg/mL (replikasi atau triplikasi).

Sampel yang menunjukkan efek poten lalu ditentukan ED50

atau IC50-nya. Setelah diperoleh ekstrak paling poten maka

simplisia ekstrak yang paling poten tersebut diperbanyak

setidaknya 1 kg.

Saran: Untuk mahasiswa tingkat skripsi sebaiknya bekerja dalam

rangka untuk membuktikan data empiris atau dari 10 sampel

random. Untuk tesis sekitar 25 sampel agar lebih mungkin untuk

mendapatkan bahan poten. Adapun untuk tingkat desertasi

seharusnya menghasilkan karya yang sangat berbobot temuan baru

baik senyawa baru atau senyawa sangat poten untuk itu tingkat

disertasi diperlukan jumlah sampel yang jauh lebih banyak.


Ekstraksi dan Uji Farmakologi Pendahuluan

Untuk melakukan isolasi dan pemurnian metabolit sekunder

terlebih dahulu perlu diketahui apakah suatu ekstrak memiliki

aktifitas biologis yang menjanjikan. Untuk itu perlu dilakukan

farmakologis pendahuluan. Hal itu tidak terlepas dari model

penyakit yang diteliti atau dijadikan sasaran pengobatan. Sebagai

ketentuan umum ekstrak dikatakan memiliki aktifitas farmakologi

yang menjanjikan jika memiliki kemampuan hambat atau dosis

efektif lebih dari 75% populasi pada kadar 25 μg/mL terhadap

aktifitas molekul (enzim/protein) penyebab penyebab penyakit, sel

kanker, bakteri atau jamur dengan Semakin kecil dosis efektif maka

semakin poten dan promising. Biasanya jika dosis efektif terlalu besar

maka tidak dilanjutkan. Beberapa peneliti melakukan eksepsi tetap

melakukan pemurnian pada spesies-spesies yang belum diketahui

kandungan metabolit sekundernya.

Gambar 4.1 Maserasi dilakukan 10 bagian pelarut: 1 bagian simplisia.

Misal 1 kg bahan dalam 10 L metanol.

Pada era sekarang, pada dasarnya isolasi senyawa dari bahan

alam tidaklah sulit terlebih jika targetnya adalah major compound

(senyawa utama). Akan tetapi untuk melakukan isolasi terlebih

dahulu perlu dipahami sifat-sifat bahan secara umum. Biasanya

bahan yang berasal dari ekstrak daun adalah paling sulit untuk


mendapatkan senyawa dikarenakan matriks nabati dan kompleksnya

jaringan. Material yang berupa ekstrak dari biji atau rimpang-

rimpangan tentu lebih sederhana dan jauh lebih mudah untuk

mendapatkan senyawa. Demikian bahan dari kayu memiliki jaringan

dan kerumitan kandungan metabolit yang lebih sederhana

dibandingkan organ daun. Sehingga beberapa peneliti ada yang

secara pragmatis menghindari penggunaan daun.

Berikut ini adalah sifat-sifat bahan secara umum:

(Adapun pertimbangan utama pemilihan harus didasarkan

pada sejauh mana potensi sampel terhadap target).

Organ Keuntungan Kerugian

Daun Biasanya organ daun memiliki

ketersediaan material yang

tinggi.

Keragaman golongan meta-

bolit sekunder di dalam daun

bermacam-macam mulai dari

yang non polar seperti

steroid,triterpene. Semipolar

seperti flavonoid hingga se-

nyawa polar seperti polifenol

dan glikosida atau terpenoid

terhidroksilasi.

Kompleksitas jaringan dan

matriks nabati paling kom-

pleks dan kandungan kimia

sangat beragam sehingga

mempersulit pemisahan.

Kandungan asam lemak

tinggi sehingga paling sulit

dalam preparasi.

Defatting dengan pelarut

heksan atau petroleum eter

bisa dilakukan namun perlu

diwaspadai kehilangan se-

nyawa yg larut pada solven

tersebut (depolarisasi).

Cukup sulit mendapatkan

isolat metabolit sekunder

dalam jumlah banyak dan

beragam.

Jika isolasi metabolit se-

kunder maka harus berhati-

hati adanya positif palsu

yang disebabkan oleh asam

lemak.

Buah Matriks nabati dan jaringan

sel tidak terlalu kompleks.

Target metabolit semi polar

mudah lebih mudah di-

pisahkan.

Pembuatan simplisia ribet

karena harus diiris dirajang

dan butuh waktu penge-

ringan lebih lama.

Kandungan metabolit se-

kunder lebih rendah. Butuh

bobot simplisia banyak.



Kebanyakan berisi metabolit

primer (karbohidrat) bersi-

fat polar larut metanol atau

air. Kromatografi fase

normal atau terbalik tidak

terlalu kompatibel dan bisa

diaplikasikan.

Keberadaan asam lemak

kadang mengakibatkan po-

sitif palsu pada beberapa uji

farmakologi yang bertarget

protein/enzim

Kayu Jaringan lebih sederhana dari

daun

Mudah mendapatkan senya-

wa semipolar seperti senyawa

golongan fenil propanoid dan

modifikasinya yaknia lignan

dan juga terpenoid kompleks.

Tergantung spesies dan

familinya jaringan kayu

mengandung alkaloid.

Biasanya adsorben untuk

pemisahan dengan kolom

silika dengan sistem solven

kombinasi antara heksana

dengan etil asetat.

Kulit buah Jaringan lebih sederhana dari

daun.


wa semi polar seperti xanton,

polifenol dan terpenoid

Biji Jaringan termasuk paling

sederhana

Meskipun jaringan biji sering

mengandung karbohidrat dan

asam lemak. Dengan peng-

ekstraksi etanol atau etil

asetat atau diklorometana

(CH2Cl2) karbohidrat akan

minimal.


wa golongan terpenoid,

lignan



Bunga Mudah mendapatkan senya-

wa golongan pilifenol,

flavonoid dan modifikasinya

Negatif palsu, hati-hati

dengan senyawa berwarna

yang menggangu uji

bioassay dengan metode

kolorimetri

Rimpang Matriks tidak kompleks

dengan karbohidrat rendah


wa golongan fenil propanoid,

terpenoid seperti seskuiterpen

atau diterpen dan polifenol

glikosida

Propolis,

sarang

serangga,

bekatul,

dan

metabolit

binatang

Matriks dan residu nabati

tidak kompleks

Kandungan kimia bervariasi

tergantung geografi. Konse-

kuensinya bisa berbeda

potensi aktifitas farma-

kologisnya.

dll

Ekstraksi

Ekstrak/sari adalah material hasil penarikan oleh pelarut air

atau pelarut organik dari bahan kering (dikeringkan). Hasil penyarian

tersebut kemudian pelarutnya dihilangkan dengan cara penguapan

dengan alat evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental jika

pelarutnya pelarut organik. Jika pelarutnya air, pada tahap akhir

dilakukan penghilangan total dengan cara liofilisasi menggunakan

alat freeze dryer. Hasil liofilisasi akan berupa serbuk. Akan tetapi

teknologi liofilisasi di Indonesia tergolong komersial dan sangat

mahal serta terbatas dimiliki institusi ilmiah di Indonesia. Untuk itu,

cara lain bisa ditempuh dengan pengentalan dengan waterbath

dengan temperature kurang dari 60 0C.

Metanol, etanol 70 %, dan etanol 96% adalah pelarut pilihan

utama untuk mengekstraksi metabolit sekunder yang belum diketahui

strukturnya dan untuk tujuan skrining. Ketiga pelarut ini memiliki

extracting power (daya ekstraksi) yang luas sehingga semua

metabolit sekunder tersari dalam tiga kali maserasi. Jika tujuannya

mengisolasi dan memurnikan senyawa target sudah jelas bisa

menggunakan pelarut organik lain (butanol, etil asetat, kloroform,


aseton, atau heksana) yang memiliki sifat ekstraksi terbaik (melalui

trial and error dan dipantau dengan plat KLT atau HPLC atau

densitometer dengan detektor UV/Vis). Tujuan pemurnian tertarget

tersebut dinamakan dereplikasi.

Biasanya ekstraksi dilakukan dengan maserasi atau perendaman

bahan dengan pelarut terpilih karena maserasi merupakan cara

ekstraksi yang paling mudah dengan rendemen ekstraksi tinggi.

Seringkali maserasi dikombinasi dengan digesti dan refluk selama 1-2

jam dengan suhu 40-60 0C untuk untuk meningkatkan efisiensi

penyarian. Biasanya ekstraksi dilakukan 2-3 kali atau sampai material

tidak mengandung senyawa terlarut lagi (dicek dengan KLT dan

lampu UV 254/366 nm). Jika penggunaan tradisional, masyarakat

secara turun temurun menggunakan bahan dengan cara direbus atau

dekok maka pelarut yang digunakan adalah air dengan cara merebus

atau mendekoktasi. Namun jika uji pendahuluan dilakukan secara

skrining pada berbagai material maka ekstraksi menggunakan pelarut

metanol atau etanol 70 % atau etanol 96 % (dalam air). Bobot

simplisia yang digunakan untuk skrining farmakologis sebanyak 10-

100 gram. Berdasarkan penelitian, ketiga jenis solven itu memiliki

ekstraktabiliti terbaik. Hampir semua metabolit sekunder akan

terlarut sempurna oleh ketiga solven tersebut dengan maserasi tiga

kali. Metode ekstraksi lain seperti perkolasi, perkolasi

berkesinambungan, gas superkritis dll bukanlah metode terpilih

untuk ekstraksi pendahuluan. Metode-metode ekstraksi tersebut

lebih tepat menjadi topik pembahasan untuk aplikasi industri atau

perbanyakan rendeman atau scaling up.

Adapun pelarut organik etil asetat, butanol,

diklorometan/kloroform, dan heksana lazim digunakan untuk tahap

fraksinasi dengan metode partisi cair-cair atau enap tuang (padat-

cair). Penggunaan langsung salah satu jenis pelarut organik itu juga

tidak bisa disalahkan asal cukupnya pertimbangan pustaka.

Jika skrining telah dilakukan dan menunjukkan salah satu

sampel aktifitas poten maka dilakukan pekerjaan isolasi. Untuk

tujuan isolasi direkomendasikan bobot bahan simplisia awal

sebaiknya minimal 1 kg agar peluang mendapatkan senyawa aktif

farmakologis secara secara kualitatif maupun kuantitatif lebih tinggi.


Seringkali (hampir selalu) tahap fraksinasi belum mendapatkan

senyawa tunggal. Fraksinasi tahap II biasanya dilakukan dengan cara

kromatografi kolom. Kromatografi kolom pilihan utama adalah fase

normal. Kemudian jika masih belum mencapai target dilakukan

fraksinasi tahap ke III dengan fase terbalik. Kromatografi permeasi

dengan fase diam polisakarida sering dilakukan setelah fraksinasi

tahap II.

Fraksinasi Kasar

Fraksinasi dengan Partisi

Ekstrak (metanol, etanol 70%, atau etanol 96%) yang

diperoleh masih kasar dan sangat kompeks isinya. Untuk itu perlu

dilakukan fraksinasi cair-cair atau partisi.

Lazimnya untuk ekstrak metanol atau etanol 70% dilarutkan

ke dalam air hingga tepat larut. Kemudian dipartisi bertingkat mulai

dari:

1. Butanol

2. Etilasetat

3. Kloroform/diklorometana

4. Heksan

Sebaiknya heksana digunakan terakhir untuk mencegah

pengambilan metabolit sekunder yang kurang selektif.

Untuk semua pelarut organik akan berada fase atas kecuali

kloroform akan berada di bawah air.

Masing-masing fraksi kental harus diperoleh setidaknya 10 gram agar

bisa dilakukan tahap fraksinasi lanjut. Selain itu semua fraksi partisi

tersebut juga harus segera diuji kembali aktifitasnya.

Catatan: Gunakan corong pisah yang berbentuk buah pear/lebih

bulat untuk mempartisi dua pelarut yang tetapan dieliktrikumnya

sangat berbeda (polaritasnya sangat beda misal air dengan heksana).

Corong pisah yang berbentuk lebih memanjang digunakan untuk dua

pelarut yang polaritasnya berdekatan misalnya air dengan butanol


Gambar 4.2 Diagram partisi cair-cair. Ekstrak kering dari metanol atau

etanol berair dilarutkan terlebih dahulu dalam air. Heksana,

kloroform, etil asetat, dan butanol adalah yang digunakan

untuk mempartisi. Selain kloroform pelarut organik selalu

di lapisan atas air.

Setelah mendapatkan ekstrak kental atau ekstrak kering maka

dilakukan pemisahan kasar dari ekstrak berdasarkan tingkat

polaritasnya yakni mulai dari non polar, semi polar dan polar.

Fraksinasi biasanya dilakukan untuk ekstrak pola: air, metanol atau

etanol 70%.

Fraksinasi ekstrak air bisa dilakukan dengan cara partisi atau

pelarutan pada solven organik. Jika fraksinasi dilakukan secara

partisi, ekstrak air dilarutkan kembali dengan air pada volume tepat

larut kemudian dilakukan partisi secara berturutan dengan butanol,

etil asetat, diklorometana atau heksana jika perlu. Partisi

menggunakan alat corong pisah (separatory funnel). Jika fraksinasi

dilakukan dengan cara pelarutan maka ekstrak air dilarutkan secara

berturutan dengan metanol, etilasetat dan diklorometan atau

heksana. Pelarutan cukup dilakukan dengan menggunakan alat

berbahan gelas, bahan yang larut dipisahkan dan prosedur diulangi

2-3 kali. Semua fraksi yang dihasilan dipantau potensinya dengan uji

farmakologi.


Kasus yang sama bisa dilakukan untuk ekstrak metanol dan

ekstrak etanol 70%. Partisi untuk ekstrak metanol sebaiknya

ditambahkan air 1-2% untuk meningkatkan efektifitas pemisahan.

Jika ekstraksi dilakukan secara langsung dengan menggunakan

kloroform atau diklorometana atau heksana biasanya tidak

dilakukan fraksinasi karena pelarut-pelarut ini biasa digunakan untuk

mengekstraksi kayu dan kulit buah. Pada sampel tersebut lemak

pengganggu atau sakarida tidak terlalu banyak. Sehingga setelah

kering bisa langsung dilakukan kromatografi kolom. Meskipun

metanol seringkali juga digunakan untuk mengekstraksi bahan-bahan

tersebut.

Mengapa fraksinasi pada ekstrak air penggunaan pelarut

diklorometan atau heksana jika perlu saja?.

Tidak semua fraksi yang diperoleh harus dilanjutkan untuk

purifikasi. Hanya fraksi yang prospektif saja yakni memiliki aktifitas

farmakologi cukup tinggi saja yang dilanjutkan. Misal jika kita telah

memperoleh berbagai fraksi metanol, fraksi etil asetat, fraksi

diklorometan, fraksi heksana dan residu, untuk itu wajib dipantau

aktifitas biologisnya. Untuk itu, uji farmakologi wajib dilakukan

untuk memandu/memilih bahan mana yang layak untuk dilanjutkan.

Selain itu juga harus memperhatikan bobot fraksi kering yang ada.

Pengentalan/Pengeringan:

Pada dasarnya pengeringan dilakukan setelah tiap tahap

ekstraksi, fraksinasi, dan pemurnian. Ada beberapa metode

pengeringan:

1. Diuapkan di atas water bath (penguapan): Baik sistem terbuka

maupun tertutup. Sistem tertutup mencegah solven meracuni

ke mana-mana

2. Diuapkan dengan rotaroy evaporator: Digunakan untuk semua

pelarut organik. Tidak cocok untuk bahan berair. Air

membutuhkan waktu penguapan yang sangat lama. Saat ini

beredar multirotaroty evaporator. Lebih efisien karena enam

sampel dikeringkan bersamaan.

3. Liofilisasi (freeze dryer): Digunakan untuk bahan yang berair

tidak untuk pelarut organik.


4. Dialiri dengan gas N2: Untuk bahan yang termolabil, harga

mahal, jumlah rendemen kecil.

Pada tahap ekstraksi, fraksinasi, atau sub fraksinasi dengan

kromatografi kolom akan dihasilkan sekitar 50 botol dengan volume

sekitar 100 ml fraksi, kemudian dipekatkan dengan cara evaporasi.

Pekerjaan pada tahap ini sangat ribet karena jumlah sampel yang

sangat banyak. Untuk mempermudah pekerjaan beberapa peneliti

membiarkan sampel-sampel di dalam fume hood (lemari asam)

sampai beberapa hari, ada yang mengeringkan dengan suatu

rotatory evaporator berhari-hari. Alat terbaru untuk meringkas

pekerjaan adalah dengan multi evaporator misal buatan Buchi yang

mampu mengeringkan 6 botol sekaligus dengan volume masing-

masing 100 mL.

Untuk fraksi yang mengandung air (karena fase gerak

menggunakan kombinasi air) merupakan masalah tersendiri karena

cukup lama. Jika tidak tersedia multivaporator yang kuat,

pemekatan bisa dilakukan dengan rotatory evaporator dengan suhu

water bath 500C, dengan volume pengisian labu 1/3 bagian untuk

mencegah terjadinya buih yang mudah tersedot ke atas. Beberapa

peneliti menambahkan propanol pada labu untuk mempercepat

penguapan.

Perlu dihindari penguapan pelarut organik dengan waterbath

yang tidak tertutup materialnya untuk menghindari toksisitas. Anda

bisa melakukan modifikasi alat waterbath agar cairan pelarut tidak

menguap bebas.

Sebisa mungkin pengentalan material dengan cara penguapan

menggunakan suhu serendah mungkin. Air adalah solven yang paling

sulit dihilangkan. Penggunaan suhu yang terlalu tinggi beresiko

degradasi konsitutuen di dalamnya. Direkomendasikan suhu

pengentalan di bawah 600

C. Penggunaan freeze dryer hanya

ditujukkan untuk material berair. Tidak direkomendasikan untuk

material yang mengandung pelarut organik. Gas N2 digunakan

dengan cara dialirkan pada material yang mengandung pelarut

organik. Cara ini hanya efisien untuk jumlah bahan yang tidak stabil

panas. Pengeringan dengan cara liofilisasi dan pengaliran N2 akan

menghasilkan material dalam bentuk serbuk.


Gambar 4.3 Rotaroy single evapotor (a), multivaporator (b) buatan

Buchi (Jerman)

Mayoritas sediaan jamu dan obat tradisional digunakan

dengan cara perebusan. Dengan demikian senyawa-senyawa aktif di

dalamnya adalah senyawa larut air. Biasanya setelah ekstrak air

dipekatkan atau dikeringkan dengan liofilisasi dilarutkan kembali ke

dalam pelarut semi polar etil asetat. Purifikasi dilakukan dari fraksi

larut pelarut semipolar tersebut. Jadi secara praktis sampel yang

diekstraksi dengan pelarut organik lebih untuk pemurnian. Para

peneliti hingga sekarang menyadari bahwa memurnikan senyawa

larut air atau sangat larut metanol membutuhkan teknologi baru.

Dasar-dasar kromatografi untuk pemisahan

Di dalam isolasi senyawa, kromatografi sangat penting dan

fundamental untuk identifikasi, deteksi pemisahan, deteksi optimasi

fase gerak, deteksi kemurnian, dll. Jadi kromatografi adalah metode

dasar. Ada dua tipe kromatografi berdasarkan pengepakan fase

diam. Yakni kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kolom.

Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah fundamental untuk

“mendapatkan visi” terkait metode pemisahan yang akan kita pilih.

KLT cenderung bersifat analitis, hanya pekerjaan tertentu untuk

isolasi (preparatif). KLT akan memvisualkan senyawa-senyawa yang

terkandung di dalam bahan sehingga bisa diketahui sifat-sifatnya

terutama polaritas. Sistem yang dipilih fase diam dan fase gerak

sebisa mungkin memberikan jumlah bercak sebanyak mungkin. Fase

diam seringkali disebut dengan penjerap atau adsorben.

Kromatografi kolom adalah alat utama untuk pemisahan.

Jenis kromatografi melibatkan interaksi:


a. kromatografi adsorbsi: Pemisahan berdasarkan interaksi kimia

antara fase diam normal atau terbalik baik dengan lapis tipis

maupun kolom (fase normal dan terbalik).

b. kromatografi ekslusi: Pemisahan berdasarkan ukuran partikel

senyawa terhadap fase diameter pori antar fase diam (ekslusi),

hampir dikatakan tidak terjadi interaksi kimia antara fase diam

dengan analit. Fase diam umumnya terbuat dari polisakarida

misal selulosa (Sephadex LH)

Untuk orientasi dan pendahuluan, dimensi plat penjerap cukup

2x5 cm. Untuk melakukan KLT kita perlu memahami aspek:

1. Fase diam tipe normal: Fase diam/penjerap yang banyak

diandalkan digunakan adalah silika. Interaksi dasar yang terjadi

adalah ikatan hidrogen. Untuk fase diam silika maka fase gerak

harus dipilih antara kombinasi: 1 metanol-kloroform atau 2.

heksana-etilasetat. Jika digunakan metanol-kloroform maka

jumlah metanol antara 0-20% dalam kloroform. Jumlah

metanol > 30% membawa senyawa sangat polar dan sulit

diprofilkan dengan KLT fase normal. (kloroform memang agak

toksik sehingga bisa diganti dengan diklorometana karena sifat

polaritasnya hampir sama). Jika kombinasi metanol-kloroform

tidak bisa memberikan pemisahan yang baik atau jumlah

bercak tidak banyak maka fase gerak diganti dengan kombinasi

heksana-etilasetat. Heksana biasanya dibutuhkan dalam rasio

yang rendah, 95-50%. Disarankan rasio heksan dari kadar

tinggi ke rendah (etil asetatnya tinggi) tetap di coba misal

heksana berkadar antara 10-30%.

Tahap ini dilakukan untuk memilih pemisahan kasar dengan

kolom kromatografi kolom biasanya silika.

Catatan: Para ilmuwan telah sepakat secara umum memiliki

model fase gerak utama untuk profiling metabolit sekunder

yakni kombinasi antara kloroform-metanol atau heksana-etil

asetat. Kedua formula itu menjadi mainstream. Kedua fase

gerak ini juga diterapkan untuk fase gerak kromatografi kolom

fase normal.

2. Fase diam terbalik (RP = reversed phase). Kebanyak fase diam

yang digunakana dalah okta desil silika (ODS). Interaksi dasar


yang terjadi antara fase diam dengan sampel adalah gaya

London dan van der Waals. Pada fase diam tipe ini dibutuhkan

fase gerak yang bersifat polar antara lain kombinasi air-

metanol, air-metanol-acetonitril, air-metanol-aseton dll.

Semakin tinggi jumlah air maka semakin lama rambatan fase

gerak. Maksimal rasio airnya adalah 50%. Jumlah air yang

terlalu tinggi akan mengelupas lapisan fase diam. Untuk

orientasi awal biasanya dibutuhkan solven-solven tersebut

dengan rasion 1:1 atau 1:1:1.

3. Pemisahan alkaloid: membutuhkan fase diam silika dengan fase

gerak dengan orientasi seperti poin 1 akan tetapi perlu

ditambahkan basa lemah: misalnya CHCl3 - metanol –

ammonia (atau basa lemah lain)= 7: 3 : 0.1.

Kromatografi Kolom dan Subfraksinasi

Untuk memilih kapan menggunakan fase diam tipe terbalik

atau tipe normal maka KLT baik dengan fase diam normal atau

terbalik harus dilakukan terlebih dahulu. Jika KLT tipe silika mampu

memberikan pemisahan terbanyak maka kolom silika digunakan.

Akan tetapi jika fase diam terbalik memberikan pemisahan maksimal

maka fase terbaliklah yang digunakan.

Fraksinasi adalah upaya pemisahan yang dilakukan setelah

mendapatkan fraksi aktif atau ekstrak aktif. Untuk fraksinasi

dilakukan dengan cara kromatografi kolom dengan adsorben/fase

diam/penjerap berupa silika atau fase terbalik C-18. Yang

dimaksudkan C-18 di sini adalah oktil dekana yang terikat dengan

silika. Adsorben dengan silika disebut fase normal sedangkan

adsorben C-18 bersifat terbalik (reversed phase/RP) seringkali disebut

ODS (okta desil silika). Perlu dicatat disini bahwa ODS adalah bahan

yang mahal sehingga untuk menggunakan perlu hati-hati.

Bagaimanakah polaritas fase normal silika dan C-18 ini?. Bilamana

memilih silika atau ODS sebagai fase diam?

Agar potensi mendapatkan senyawa target lebih tinggi, untuk

melakukan kromatografi kolom ini sebaiknya minimal bobot bahan

adalah 5-10 g. Kemudian bahan tersebut dibuat serbuk dengan


mencampurkan dengan silika atau ODS. Untuk membuat serbuk

yang baik ekstrak dilarutkan dengan aseton karena mudah menguap

lalu dicampurkan fase diam. Jika bobot > 8 gram dicampur dengan

fase diam dan serbukkan dengan rotaroty evaporator. Kemudian

dan dikepak pada pre kolom.

Kromatografi kolom: digunakan untuk memisahkan/fraksinasi

ekstrak kasar maupun halus. Untuk pemisahan kasar, fase diam

umumnya terbuat dari serbuk silika yang dikepak/dimasukkan ke

dalam kolom dalam bentuk larutan dalam pelarut organik atau

serbuk kering. Sedangkan pemisahan halus biasanya melibatkan fase

diam non polar misal okta desil silika atau polikasakarida misal

Sephadex.

Ukuran Partikel:

Khusus untuk kromatografi kolom silika, Ukuran partikel silika

yang digunakan untuk tahap fraksinasi adalah:

• 40-63 µm (230-400 Mesh). Luas penggunaan dan lazim

digunakan

• 63-200 µm (70-230 Mesh) untuk kolom yang mengandalkan

gravitasi.

• Ukuran lebih kecil dari 40 µm digunakan untuk KLT

Sub Fraksinasi dengan Kromatografi

Pekerjaan pemurnian dan pemisahan molekul kecil di bidang

kimia farmasi, pemurnian hasil sintesis organik, ekstraksi campuran

sampel, pemurnian senyawa alami diawali dengan kromatografi

kolom silika menggunakan metode kromatografi kolom sebagai

“golden standard”.

Gambar 4.4 Struktur partikel silika dan gugus fungsional yang dimiliki.

Siloksan dan silanol adalah gugus penting dalam interaksi

adsorbsi.

Catatan: Isolasi senyawa yang sudah diketahui /known compound.


Banyak sekali senyawa major compound yang sudah diketahui

strukturnya. Untuk mendapatkan senyawa yang sudah dikenal

terlebih merupakan major compound dengan cepat bisa dilakukan

dengan melakukan KLT ekstrak, mengacu angka Rf dengan senyawa

standard. Kemudian mengerok dan melarutkan kembali senyawa

dengan solven yang sesuai.]

Interaksi pada Kromatografi Fase Normal (Normal Phase)

Fase diam silika adalah pilihan utama dan paling banyak

digunakan. Silika cukup kompatibel dengan kebanyakan metabolit

sekunder. Fase diam silika (Gambar) kaya dengan gugus silanol dan

siloksan. Hidroksil yang terikat silika disebut silanol sedangkan

oksigen yang terikat oleh dua atom silika disebut siloksan. Kedua

jenis gugus ini bersifat polar dan atom oksigen padanya berifat

proton aseptor.

Interaksi pada Kromatografi Fase Terbalik (Reversed Phase)

Fase diam okta dekanil (C-18) adalah pilihan utama pada

pemisahan halus. Fase ini lazim dilakukan setelah kromatografi fase

normal. Walaupun juga tergantung dari profil KLT yang paling

banyak memberikan bercak pemisahan. Interaksi yang terjadi antara

adsorben dengan analit adalah interaksi hidrofobik terutama gaya

van der Waals atau ikatan London. Pada keadaan normal adsorben

memiliki simetris. Keberadaan fase gerak yang umumnya bersifat

polar (biasanya campuran metanol, asetonitril, air) menyebabkan

terjadinya induksi muatan lemah pada permukaan fase diam terbalik.

Senyawa yang bersifaat lebih polar lebih larut terbawa fase gerak

sedangkan senyawa yang bersifat kurang polar akan

berinteraksi/terjerab lebih lama dengan fase diam sehingga dengan

gaya London tersebut sehingga memiliki waktu tinggal (retention

time) lebih panjang.


Gambar 4.5 Modifikasi adsorben silanol (polar) dengan cara reaksi

ksilaasi mengikat rantai karbon panjang (C-18) yang

berakibat adsorben mula-mula fase normal/polar berakibat

bersifat non polar. Interaksi induksi muatan lemah gaya

London atau van der Walls dominan atau gaya London

terjadi

Gambar 4.6 Permukaan fase diam normal dan terbalik. Pada fase diam

normal terdapat berbagai gugus polar yang bisa

menyumbangkan lone pair elektron untuk ikatan

hidrogren. Pada fase diam terbalik rantai karbon panjang

menyumbang interaksi van der Waals. Harap dipahami

perbedaannya.


Setelah beberapa tahap pemisahan belum tentu setiap tahapan

langsung menghasilkan senyawa murni. Beberapa tahapan harus

dilalui. Demikian juga jika suatu laboratorium telah dilengkapi

dengan HPLC preparatif. Meskipun pemisahan lebih selektif

pemisahan harus dilakukan beberapa tahap. Tahap terakhir setelah

melewati fraksinasi kasar dan fraksinasi halus, pada tahap akhir jika

belum murni dan tunggal maka dilakukan kromatografi preparatif.

Yakni pemisahan pada sejumlah sampel dengan bobot yang cukup

dengan metode KLT fase normal atau terbalik atau dengan HPLC.

Pemantauan hasil fraksinasi:

Secara klasik, fraksi pekat hasil pemisahan dengan kolom

tersebut dipantau profilnya dengan menggunakan KLT. Agar

ekonomis, untuk pemantauan dengan KLT ini digunakan dimensi

plate 5 x 8 cm dengan jarak penotolan 0.4 cm sehingga diperlukan

kapiler untuk menotolkan dengan diameter sekecil mungkin. Akan

tetapi perlu diingat bahwa tidak semua fraksi akan terpisah dengan

penjerap silika. Sehingga perlu juga dipikirkan untuk penggunaan

adsorben non polar (C-18). Hasil tampungan yang memiliki pola

kromatogram yang sama dijadikan satu dan dipekatkan kemudian

ditimbang. Seringkali pada tahap akhir kromatografi kolom pelarut

yang digunakan adalah pelarut yang paling polar yakni metanol.

Pelarut ini akan mengandung komponen-komponen yang sangat

polar. Walaupun kadang poten namun cukup sulit untuk

dimurnikan.

Pada tahap fraksinasi ini akan diperoleh fraksi dengan bobot

bervariasi antara 0.1 gram sampai 4 gram. Biasanya padah tahap ini

jarang diperoleh fraksi yang mengandung senyawa tunggal.

Demikian juga kita harus tetap memperhatikan aspek farmakologis

yakni fraksi mana yang aktif secara farmakologis.

Catatan:

Perlu disadari bahwa pada tahap proses pemisahan kasar dengan tipe

kolom terbuka, VLC (vacuum liquid chromatography) dan MPLC

(medium pressured liquid chromatography) sangat jarang langsung

menghasilkan senyawa tunggal (senyawa murni) sehingga perlu


dilakukan pemurnian lebih lanjut. Akan tetapi hal ini juga tergantung

dari kompleksitas ekstrak awalnya. Misalnya jika bahan kita dari

ekstrak heksana dari spesies Garcinia spp maka cukup mudah

memperoleh senyawa tunggul atau beberapa rimpang Zingiberaceae.

Terdapat beberapa tipe kolom kromatografi:

Rasio bobot antara sample dan ekstrak dengan fase diam umumnya

adalah antara 30-100 kali bobot ekstrak (n x [30 100]).

Kolom tradisional atau open column. Tipe ini adalah tipe yipe klasik

dengan menggunakan kolom terbuka/open column. Interaksi

pemisahan terjadi karena adsorbsi dan gravitasi. Rasio antara ekstrak

dengan adsorben biasanya 1-5%. Solven dimasukkaan ke kolom

dengan cara dituang melewati bibir kolom agar tidak merusak eluasi

atau aliran fase. Tipe ini tidak bisa untuk adsorben fase terbalik mis.

ODS karena hampir tidak bergerak. Jika bahan yang dipisahkan tidak

terlalu banyak sebaiknya langsung diselesaikan karena pendiaman 1

malam dengan kolom kecil berakibat sampel dalam kolom

cenderung bercampur kembali.

Kolom dengan vakum. Untuk mempercepat proses dibantu dengan

pompa vakum yang menekan aliran solven sehingga interaksi/retensi

dengan adsorben senyawa-senyawa lebih cepat. Agar efisiensi

pemisahan lebih baik kolom tipe ini sambung dengan pipa yang

menghubungkan pre kolom yang berisi serbuk ekstrak. Sistem ini

kadang disebut VLC (vacuum liquid chromatography). Jika preparasi

dan optimasi baik, jumlah penggunaan fase diam lebih sedikit dan

ekstrak yang dipisahkan bisa lebih banyak. Panjang pre kolom (7x4

cm) bisa digunakan untuk 10 gram bahan yang dicampur silika,

sedangkan ukuran kolom (15x4 cm). Dikarenakan peralatan ini

biasanya home made dan diassembling sendiri maka perlu dilakukan

optimasi dan trial terutama sekali untuk mendapatkan tekanan

pompa dari diesel dan aliran solven yang terbaik. Solven dimasukkan

ke dalam kolom secara manual tergantung bentuk kolom. Untuk

melakukan assembling, hati-hati dalam memilih gelas untuk kolom

untuk menghindari pecah karena tekanan).


Kromatografi cair bertekanan medium: Medium Pressured Liquid

Chromatography (MPLC). Peralatan ini hampir sama dengan tipe

VLC di atas akan tetapi disempurnakan dengan regulator tekanan

dan dilengkapi dengan regulator pengatur rasio fase gerak. Rasio

bahan yang ingin dipisah menyesuaikan ukuran kolom. Bahan

ditempatkan pada pre kolom yang disambung pada kolom.

Pemisahan dengan alat ini jauh lebih efisien dan dengan kapasitas

bisa maksimal. Terdapat beberapa supplier Buchi Jerman dan

Yamazen dari Jepang. Seringkali MPLC dilengkapi detektor UV.

HPLC preparative (p-High Performance Liquid Chromatography).

Beberapa peneliti menggunakan HPLC untuk melakukan pencarian

senyawa target dengan lebih cepat, efisien dan lebih aman secara

kesehatan. Solven organik yang digunakan di dalam pemisahan

sering kali terbawa udara di dalam ruangan sehingga sedikit banyak

akan terhirup oleh peneliti. Untuk itu, HPLC preparatif dipilih untuk

pertimbangan aspek kesehatan yang lebih baik. Dengan sistem ini

jumlah bahan yang digunkan cukup dalam bobot mg saja. HPLC

preparatif secara prinsip sama dengan HPLC secara umum akan

tetapi ukuran kolom lebih besar dengan kapasitas pompa lebih besar.

Kemudian senyawa yang dihasilkan akan diperoleh dalam level

mikro gram dan cukup terbaca dengan 150 kali scanning dengan

NMR 800 MHz. Sistem ini dimudahkan dengan detekor UV atau

FID.

Acuan antara rasio dimensi kolom versus bobot sampel

Dimensi kolom Bobot sampel Volume elusi fase gerak

Kolorm tradisional/open

column

1-5 % dari berat

silika

VLC/MPLC (fase normal)

3 x volume adsorben

4 x 7 cm 1-5 g

4 x 15 cm 5-10 g

4 x 30 cm 15-20 g

VLC/MPLC (fase terbalik)

2 x 15 cm 0,25 g 3 x volume adsorben

3 X 15 cm 0.5-1 g

4 x 15 cm 2 g

HPLC preparatif 50 -300 mg


Pengepakan adsorben:

Homogenitas dan kompaknya susunan fase gerak di dalam kolom

akan menentukan efektifitas pemisahan. Demikian juga panjang

kolom juga akan menentukan efektifitas pemisahan. Ada dua cara

pengepakan penjerap:

1. Pengepakan kering: serbuk adsorben dimasukkan ke dalam

kolom yang ujungnya sudah disumbat dengan kapas atau

glasswool. Cara ini hanya sesuai

2. pengepakan secara basah: fase diam dilarutkan dengan solven

paling awal kemudian dituang ke dalam kolom. Untuk selulosa

karbohidrat sebaiknya direndam terlebih dahulu semalam agar

cukup mengembang.

Gambar 4.7 Penyiapan kolom dan penampungan fraksi. Pada tahap

kolom kasar volume tiap fraksi adalah 100 mL. Setelah

pemisahan halus termasuk kromatografi ekslusi sekitar 50

mL. Metode ini adalah metode paling klasik namun masih

digunakan hingga hari ini.

Teknik elusi fase gerak:

Fase gerak dipilih berdasarkan orientasi atau uji pendahuluan.

Misalnya salah satu dari kombinasi antara kloroform-metanol,

diklorometane-metanol, heksana-etil asetat, heksana-aseton, jika

penjerap kolomnya silika, asetonitril-air, asetonitril-metanol-air,

metanol-air jika penjerapnya non polar.


Meski demikian hendaknya tidak memilih fase gerak isokratik

yakni fase gerak dengan rasio tetap. Sistem isokratik tidak bisa

digunakan untuk pemisahan ekstrak kasar atau sub fraksi.

Elusi fase gerak harus menggunakan sistem gradien yakni

dimulai dari pelarut non polar terlebih dahulu kemudian bertingkat

pada kombinasi yang paling polar jika penjerapnya silika. Sebaliknya

jika fase diamnya non polar dimulai dengan kombinasi yang paling

polar terlebih dahulu misalnya metanol-air (1:2). Contoh: untuk

kombinasi CHCl3-metanol atau CH2Cl2-metanol biasanya dimulai

dengan 100% CHCl3/CH2Cl2, kemudian 98%, 96%, 94%, 96%

sampai kadar 70%. bisa juga lebih rendah lagi misalnya 50% atau

20%. Untuk penjerap tipe terbalik eluent terakhir dipilih MeOH-

asetronitril dengan perbandingan 1:1 atau jika perlu dengan rasio 1:4.

Demikian juga untuk kombinasi yang lain. Terkait volume fase gerak,

setiap kombinasi dibuat dengan volume 3 x volume kolom, dan

minimal 2 x volume kolum.

Untuk setiap penampungan tetesan dikumpulkan sekitar 100

mL, biasanya jika dari fraksi kasar maka jumlah akhir sekitar 50-70

botol, dan 50 mL jika dari fraksi halus biasanya berjumlah antara 25-

40 buah botol.

Permasalahan dalam elusi:

1. Cracking: Pada kromatografi kolom klasik, seringkali setelah

beberapa waktu elusi dilakukan, susunan fase diam terlihat

pecah dan berpori (cracking): hal ini terjadi karena masuknya

udara ke dalam sistem atau elusi fase gerak tidak kontinyu

(kekeringan karena teledor). Walaupun cracking terjadi proses

kromatografi kolom tetap dilanjutkan sampai akhir.

2. Adsorben masih berwarna: Seringkali walau dieluasi dengan

solven terakhir yang paling polar, fase gerak masih berwarna

dan terkesan masih mengandung senyawa. Silika seringkali

menjerap senyawa polifenol atau ODS seringkali mengikat kuat

senyawa yang sangat tidak polar. Untuk itu tidak ada cara lain

membiarkan.


Gambar 4.8 Untuk mempercepat pemisahan bisa dikombinasi dengan

tekanan (A). Namun perlu hati-hati jika kaca tidak tahan

tekanan!. Peralatan modern MPLC (medium pressured

Liquid Chromatography) telah diaplikasikan selama 20

tahun (B). Produk terbaru dari Buchi (Jerman) kolom

terbuat dari plastik. Kolom tersedia berbagai ukuran. Sangat

efisien dan aman. Selain itu terdapat produk Yamazen

(Jepang).

Purifikasi

Tahap purifikasi ini dilakukan setelah dihasilkan beberapa sub

fraksi dengan bobot antara 0.1-4 g pada tahap sub fraksinasi dengan

kromatografi kolom. Berikut ini adalah beberapa metode dasar

untuk pemurnian:

Kromatografi preparatif

Jika hanya memiliki sub fraksi dengan bobot 100-300 mg

sebaiknya langsung dimurnikan dengan KLT preparative. Sedangkan

kapasitas maksimal per plat KLT adalah 10-25 mg untuk fase terbalik.

10-50 mg untuk fase normal.

Purifikasi dengan KLT

Fraksi yang kurang dari 0.6 gram dipisahkan/dimurnikan

kandungan senyawanya dengan KLT preparatif, tetapi harus

diperhatikan aspek berikut:


- Untuk KLT preparatif dengan penjerap silika dengan ketebalan

0.5 mm kapasitas maksimal sampel adalah 50 mg, sedangkan

KLT RP kapasitas maksimal sampel adalah 25 mg. Biasanya

250 mg akan dibutuhkan 5 buah plate KLT.

- Jika lebih dari 0.8 gram biasanya dipurifikasi/pisahkan kembali

dengan kromatografi kolom dengan dimensi yang lebih kecil,

namun juga tergantung jumlah bercak yang ada, jika ternyata

sudah cukup sederhana cukup dengan KLT preparatif.

Purifikasi dengan kromatografi kolom kembali:

Jika fraksi aktif yang dihasilkan berbobot lebih dari 1 gram dan

berdasarkan profil KLT-nya masih kompleks sebaiknya dilakukan

kromatografi kolom kembali baik normal atau fase terbalik

tergantung dari profiling kLT yang dilakukan.

Purifikasi dengan kromatografi eksklusi:

Sephadex 20-LH (GE) merupakan fase diam emas (golden

standard) untuk kromatografi tipe ekslusi pemisahan/pemurnian/

memekatkan molekul kecil. Sephadex ini sangat menguntungkan

untuk isolasi polifenol misalnya berbagai flavonoid dari daun

sembung (Blumea balsamifera) (Nessa et al., 2004; Saifudin et al,

2102). Sephadex merupakan modifikasi selulosa. Material tersedia di

pasaran dengan packing 50, 100, dan 500 g. Sephadex berharga

sangat mahal sehingga harus sangat

hati-hati menggunakan. Hindarkan

pH ekstrim, ekstrak yang terlalu

kasar, dan ekstrak yang masih

terlalu kompleks.

Rasio antara sampel dengan

serbuk Sephadex adalah maksimal

4% (4 gram ekstrak, 100 gram

serbuk).

Penyiapan: Kolom Sephadex

sama saja dengan jenis kolom lain

yakni terbuat dari kaca. Sedangkan

dimensinya memperhatikan asas

Gambar 4.9 Struktur

Sephadex LH-20


kromatografi. Sejumlah gram ser-buk yang akan digunakan direndam

dalam pelarut yang digunakan sebagai fase ferak minimal 4 jam.

Lalu dituang ke dalam kolom yang bagian dalam bawahnya

sudah ditutup (jangan terlalu ketat) dengan kapas atau glass wool.

Pelarut harus selalu tersisa pada bagian atas kolom (tidak boleh

kehabisan pelarut!). Sisakan ujung atas 5-10 cm tidak terisi. Lalu

dibiarkan 2 jam sebelum memasukkan ekstrak. Alirkan kran di

bawah hingga pelarut berda tersisa tepat di permukaan. Ekstrak

dimasukkan dalam bentuk cairan (larutkan ekstrak tepat larut)

dengan pipet. Lalu alirkan perlahan sehingga ekstrak tepat masuk 1

mm di bawah permukaan atas. Tambahkan berlahan beberapa mL

fase gerak hingga 5-10 ruangan terisi. Penampungan tetesan setiap 50

mL. 200-300 mL tetesan pertama biasanya belum mengandung

analit.

Untuk pemurnian dengan Sephadex tetesan fraksi dikumpulkan

dengan volume kurang dari 50 mL. Kemudian dipekatkan dan

divisualkan kembali itu dengan KLT.

Purifikasi dengan HPLC Preparatif

Jika tersedia HPLC preparatif, pemurnian akan lebih cepat

dilakukan. HPLC tipe ini memilik dimensi dan kekuatan pompa yang

besar. Pemisahan dan pemurnian lebih efisien dibanding cara

manual.

Setiap pemurnian dipisahkan berdasarkan HPLC analisis

pendahuluan dan ditampung berdasarkan puncak-puncak serapan

pada layar monitor.

Pada tahap pemurnian sebaiknya senyawa yang dihasilkan

minimal 3 mg untuk mempermudah analisis kualitatif terkait batas

analisis dengan NMR serta ketersediaan sampel untuk uji

farmakologis.

Pada tahap ini harus difahami bahwa jumlah sampel seringkali

memiliki keterbatasan pada tahap pemurnian dikarenakan senyawa

aktif diproduksi oleh makhluk hidup dalam kadar rendah. Sehingga

pekerjaan isolasi bahan alam sering tidak tepat disebut dengan isolasi

obat akan tetapi disebut isolasi senyawa penuntun (lead finding).


Problem yang Sering Terjadi

Isolasi polifenol dan flavonoid: untuk pemisahan kasar sebisa

mungkin bobot ekstrak minimal 15 gram jika menggunakan kolom

silika. Untuk pemisahan halus sebaiknya tidak menggunakan KLT

preparatif silika. Karena silika akan menjerab dengan kuat senyawa

tipe polifenol.

Pemisahan glikosida: Jika menggunakan KLT preparatif bisa

ditempuh dengan fase gerak kloroform-metanol-air= 7: 3: 0.5.

Sistem fase gerak ini biasa digunakan juga untuk memisahkan tanin.

Rekristalisasi

Adalah upaya pemurnian dengan solven yang sedikit larut,

penurunan suhu pelarut, atau penguapan pelarut. Rekristalisasi

ditempuh jika hasil isolasi senyawa target lebih dari 50 mg. Jika

terlalu rendah beresiko senyawa target hilang. Kombinasi klorofom-

MeOH, heksana-klorofom, heksana-etilasetat, aseton-klorofom

seringkali dipilih untuk melakukan rekristalisasi. Rekristalisasi

dilakukan beberapa kali. Dengan cara menambahkan solven tepat

larut kemudian didinginkan pada suhu 4oC. Seringkali proses

rekristalisasi jarang dilakukan sebab rendeman senyawa target

ditemukan dalam jumlah yang kecil.

Uji Kemurnian

Meskipun pada pemantauan dengan KLT telah menunjukkan

bercak tunggal atau analisis HPLC menunjukkan puncak tunggal yang

simetris belum kita telah diperoleh senyawa murni. Uji purity atau

kemurnian adalah upaya untuk menunjukkan senyawa terisolasi

sudah tunggal atau belum. Kemurnian sangat penting untuk

meminimalkan gangguan pada uji farmakologis. Seringkali impurities

atau senyawa pencemar ikut memberikan aktifitas farmakologis.

Berikut ini adalah beberapa metode uji pemurnian:

1. Uji kemurnian dengan KLT kembali dengan berbagai fase gerak

dan adsorben yang berbeda. Metode ini adalah cara yang

paling klasik dan murah. Fase diam sebaiknya tidak hanya

tunggal atau satu tipe. Untuk golongan glikosida sebaiknya


setelah dicek dengan plat silika kemudian dicek dengan fase

diam selulosa.

2. Uji kemurnian berdasarkan HPLC. HPLC sistem terbalik adalah

metode paling baik untuk mengecek kemurnian. Metode ini

untuk menunjukkan indikator kemurnian melihat berupa

puncak tunggal, tajam dan simetrisnya puncak dan keberadaan

impurities yang masih ada bersama senyawa target. Detektor

HPLC kebanyakan menggunakan UV dan sebagian kecil

menggunakan RI (refraktif index) untuk senyawa target yang

miskin/tidak memiliki kromofor. Untuk memastikan dilakukan

analisis berdasarkan sistem gradient fase gerak atau flow rate

fase gerak.

3. Uji kemurnian berdasarkan 1H NMR. Jika suatu lab memiliki

mesin NMR maka uji kemurnian 1 dan 2 di atas tidak perlu

dilakukan. Metode ini paling cepat dan otentik. Senyawa

dikeringkan dan langsung dimasukkan pada pelarut

terdeuteronasi (tidak mengandung proton) kemudian langsung

dibaca dengan mesin. Senyawa target dan kadar pencemar

akan langsung terlihat.

Analisis Kemometrik

Berbagai analisis kimiawi modern yang dilakukan untuk

menentukan sifat umum kimiawi terutama struktur. Analisis kimiawi

klasik yang bersifat merusak seperti penentuan gugus fungsional

dengan reaksi kimia menggunakan reagen harus dihindari. Metode

modern yang standard adalah sifat kimia pada HPLC, keberadaan

gugus fungsional pada IR (Infra Red) spektrometri, keberadaan

ikatan penyerab energi cahaya pada UV spektrometri.

Elusidasi struktur atau penentuan struktur (lihat bab elusidasi

struktur)

Untuk menghasilkan suatu senyawa aktif dan prospektif untuk diteliti

lebih lanjut, sifat farmakologi, interaksi molekuler, sifat

farmakokinetika dan upaya optimasi aktifitas dengan modifikasi

sintesis/semi sintesis, maka struktur senyawa target harus diketahui.

Untuk itu dilakukan penentuan struktur atau elusidasi struktur.


Penentuan struktur ada 2 cara:

1. Dengan metode spektroskopi: Langkah pertama sekali yang

dilakukan adalah analisis NMR (nuclear magnetic resonance),

IR, MS, UV, rotasi aktif. Adapun spektroskopi IR, MS dilakukan

pada tahap yang paling akhir. Penentuan UV atau rotasi aktif

dilakukan jika perlu, bilamana diperlukan spectra UV dan

rotasi aktif?

2. Dengan metode kristalografi: Difraksi sinar X bisa diterapkan

untuk memberikan gambaran molekul target tanpa merusak

atau mengkontaminasi kemurniannya.


BAB V

BIOASSAY/UJI BIOAKTIFITAS/UJI FARMAKOLOGI

(BIOASSAY GUIDED FRACTIONATION)

Untuk memperoleh senyawa aktif, uji farmakologi/bioaktifitas

dilakukan saat: 1 setelah ekstraksi, 2. Setelah fraksinasi, dan 3. setelah

memperoleh senyawa murni. Uji aktifitas yang obyektif bukan

dilakukan diakhir setelah memperoleh senyawa murni karena akan

berakibat kehilangan komponen aktif sesungguhnya.

Uji farmakologi harus mengandung unsur blanko, standard,

control positif dan jika diperlukan suatu control positif. Adapun

berdasarkan tingkatannya in vitro, in vivo dan uji klinik.

Untuk memantau keberadaan suatu senyawa poten di dalam

suatu ekstrak, uji farmakologi dilakukan untuk memandu dari tingkat

ekstrak, fraksi, sub fraksi hingga senyawa-senyawa murni akhir.

Dikarenakan efisiensi dan juga muncul kesadaran animal right

maka dikembangkan uji in vitro. Uji in vitro adalah metode skrining

untuk sebelum dilakukan uji in vivo. Jika suatu senyawa dinyatakan

aktif senyawa in vivo dan secara statistik lebih baik atau setidaknya

sama dengan control positif maka disebut dengan senyawa potent.

Uji in vitro dengan target protein dikembangkan dan lebih disukai

karena efisien secara waktu dan material. Uji in vivo dengan hewan

uji tetap dibutuhkan dengan komite etik yang dibuat pada suatu

universitas atau institusi berwenang sebagai acuan.

Tipe uji in vitro in situ in vivo

Target protein/enzim, sel

kultur, bakteri,

jamur,

in situ (potongan

jaringan tertentu),

atau organ

terisolasi

Hewan uji

Sampel

minimal

1 mg 100- mg-1 g 10 - 100 g

DOSIS AKTIF:

ED50 atau IC50

1-20 µg/mL

( kurang dari 10

µM, atau minimal

sama dengan

kontrol positif

20-50 μg/mL

(atau minimal

sama dengan

kontrol positif)

10-50 mg/kg

BB


Tipe uji in vitro in situ in vivo

Signal

transduksi

Western blot hasil up regulasi protein pada jalur

patologi tertentu atau signal pathway tertentu

Kontrol positif Senyawa poten yang dilaporkan oleh peneliti lain atau

senyawa yang telah terbukti secara klinis

Beberapa konsep dasar yang harus dimengerti untuk

melakukan uji farmakologi, bahwa ada target kelompok populasi

yang dijadikan target perlakuan oleh ekstrak, sub fraksi atau senyawa

murni, ada kelompok populasi yang tidak dikenai perlakuan, ada

kelompok populasi yang tidak dikenai perlakuan oleh suatu obat

sudah dikenal (marketed drug) dengan aktifitas farmakologi yang

kita pilih misal anti bakteri TBC, penurun gula darah, anti kanker,

anti plasmodium dll. Untuk itu harus dimengerti beberapa variable

atau unsur-unsur eksperimen.

Desain dasar eksperimen uji farmakologi meliputi:

Subjek/objek uji : Sekelompok populasi yang mendapatkan

perlakuan sampel ekstrak/fraksi/senyawa

isolat. Perlakuan sampel pada subjek/objek uji

ini harus merupakan dosis bertingkat (seri

dosis). Jika hanya satu dosis saja maka kita

tidak bisa menentukan dosis efektif. Demikian

pula jika hanya satu dosis maka kita tidak bisa

menentukan tipe aktifitas itu berupa aktifitas

yang bergantung pada dosis (dose-dependent

activity) atau aktifitas yang tidak tergantung

dosis (all or none activity) yang sering terjadi

pada senyawa saponin atau penghambat

enzim. Untuk menentukan seri dosis lihat topik

variable bebas di bawah.

Kontrol positif : Sekelompok populasi yang mendapatkan

perlakuan obat yang sudah dikenal memiliki

aktifitas farmakologi tertentu. Populasi harus

memiliki tanggapan (out come) positif yang

sangat tinggi.

Blangko : Sekelompok populasi uji yang mendapatkan

perlakuan penuh 100% aktifitas uji.


Kontrol negatif : Sekelompok populasi yang tidak mendapatkan

treatment sampel uji akan tetapi semua kondisi

sama. Kelompok ini setelah eksperimen harus

memberikan nilai netral.

Kelompok koreksi : Kadang diperlukan kelompok uji yang hanya

mendapatkan perlakuan cairan pembawa saja

(vehicle) misalnya air, buffer, atau pelarut saja

(mis DMSO) dikarenakan bahan-bahan ini

turut mempengaruhi level hasil. Nilai koreksi

ini dikurangi blangko untuk memberikan nilai

basis.

Uji farmakologi dipengaruhi oleh faktor-faktor langsung atau

tidak langsung terhadap subjek uji, untuk itu kita harus memahami

dan memperhatikan variable-variabel dalam eksperimen, yang

meliputi:

Variabel bebas: Yakni perlakuan yang kita pilih langsung terhadap

objek uji misalnya seri kadar/dosis sampel uji (ekstrak/fraksi/senyawa

isolat) yang kita pilih misalnya 1, 2, 4, dan 8 µg/ml (in vitro), 20, 50,

100, 250 mg/BB (per berat badan) (uji in vivo dan uji klinik). Untuk

menentukan range variable bebas itu, kita sendiri harus melakukan

uji pendahuluan dosis yang bisa memberikan aktifitas positif atau

dosis acuan. Untuk membuat acuan dosis yang efektif harus mengacu

hasil pada kontrol posisif.

Variabel terkontrol: yakni kondisi-kondisi eksternal dan

mempengaruhi kondisi internal uji. Variable terkontrol yang kita

pilih akan menentukan nilai uji. Untuk itu harus ditentukan

temperatur ruangan, lama inkubasi, kelembaban, keberadaan

cahaya. Variabel terkontrol cukup mengacu ke pada protocol atau

penelitian-penelian yang sama yang sudah terpublikasi.

Variabel tergantung: Ringkasnya adalah hasil yang konsisten dengan

variable bebas yang dipilih. Yakni kondisi yang terjadi akibat

perlakuan (treatment) yang dilakukan terhadap subjek uji misalnya

warna larutan uji yang berubah kepekatan karena terhambatnya

enzim atau matinya sel target (uji in vitro). Variabel tergantung ini

harus fit in order artinya cocok dengan desain penelitian awal


misalnya tingkat tanggapan biologis seiring dengan level dosis yang

dipilih.

Di dalam melakukan uji farmakologi seringkali terjadi suatu

penyimpangan atau kesalahan, yakni:

Kesalahan sistematis (systematic error): Kesalahan sistematik bisa

dipengaruhi oleh variable terkontrol atau tindakan si peneliti

misalnya karena pipet sudah tidak standard, tidak terkalibrasi,

masuknya suatu cemaran, rusaknya enzim uji. Kesalahan sistematis

sangat mudah diidentifikasi karena hasil yang sangat drastis, misalnya

nilai antara hasil kelompok perlakuan, blangko, control negative dan

control positif sama.

Kesalahan acak (random error): Terjadi karena tindakan atau kondisi

yang tidak bisa dihindarkan misalnya variabilitas tindakan karena

pemipetan, pengenceran dan bisa jadi penimbangan. Kesalahan acak

bisa terdeteksi dengan statistik sederhana misalnya antar replikasi

nilai standar deviasi yang sangat besar.

Untuk menjustifikasi suatu sampel poten atau tidak prospektif

maka mengacu pada hasil berikut:

ekstrak: nilai dosis acuan sebaiknya < 10x kontrol positif.

Artinya aktifitas farmakologi yang ditimbulkan ekstrak 10 x

dari aktifitas kontrol positif.

fraksi/sub fraksi: nilai dosis acuan sebaiknya < 5 X nilai kontrol

positif

senyawa murni (isolat): nilai dosis acuan ≤ 1 X nilai kontrol

positif

Beberapa sampel ekstrak menunjukkan efek yang sama dengan

kontrol posisif. Di sisi lain fraksi atau senyawa murni memperlihatkan

efek yang lebih rendah dari ekstrak utuhnya.


Gambar 5.1 Grafik uji farmakologis harus menunjukkan efek yang

depend (tergantung) dosis. Meski demikian efek tidak akan

pernah 0 atau 100 %. Pada dasarnya bentuk grafik selalu

sigmoid. Software paling simple untuk oleh data adalah

program Excel dan acceptable karena data factual. Akurasi

bisa didapatkan dari angka probit namun tidak harus asal

trend grafik logis. Grafik ideal akan diperoleh dengan

software uji farmakologi komersial.

0

25

50

75

100

0,00 1,00 2,00%

Efe

k

Dosis


BAB VI

SKALING UP DAN DEREPLIKASI

Dereplikasi

Tatkala peneliti telah mengetahui material target atau senyawa

target atau ketika membutuhkan jumlah yang lebih banyak untuk uji

farmakologi misalnya maka ia harus memperbanyak senyawa target

dalam tempo cepat. Jika kita memahami sifat fisiko kimia (misalnya

Rt) dan berbagai metode pemurnian maka metode yang baru

ditempuh tidak perlu dilakukan lagi jika terlalu panjang. Untuk

permulaan, penggunaan metode partisi sangatlah menguntungkan.

Metode memperbanyak senyawa target dalam tempo cepat disebut

dereplikasi.

Skaling up

Untuk menemukan senyawa yang poten tidaklah mudah.

Pencarian senyawa aktif bukanlah proses yang murah dan ekonomis.

Setelah ribuan senyawa ditemukan, tidak semua akan menjadi obat.

Seringkali senyawa yang bersifat poten ditemukan dalam konsentrasi

rendah atau sangat rendah misalnya taxol dan vinkristin. Seringkali

pula senyawa poten tersebut ditemukan sebagai struktur baru. Jika

senyawa juga ditemukan pada spesies lain dalam konsentrasi tinggi

tentu tidaklah masalah. Untuk itu harus dipikirkan proses dan

metode yang mampu memperbanyak senyawa target secara

maksimal dan efisien. Skaling up adalah proses perbanyakan senyawa

target terutama untuk tujuan ekonomi. Proses skaling up bisa

dilakukan dengan cara:

- Perbaikan ekstraksi

- Sintetis total atau semi sintesis

Perbaikan ekstraksi dilakukan agar lebih efisiensi dan efektif

yakni diperoleh senyawa target dalam jumlah banyak dengan waktu

yang lebih singkat. Sebagaimana diketahui banyak senyawa alami

memiliki struktur yang rumit dan memiliki atom karbon kiral yang

banyak. Sintesis juga memerlukan beberapa step yang tidak mudah


serta by product atau ruwahan yang tidak diharapkan atau tidak

poten. Proses ekstraksi dilakukan bila sintesis total sulit dilakukan.

Untuk produksi metabolit sekunder dalam jumlah yang banyak

lewat ekstraksi kecermatan menggunakan partisi cair-cair sangat

menentukan. Perbaikan proses ekstraksi bisa ditempuh dengan jalan:

1. Perbaikan cara pengeringan. Beberapa sampel yang

dikeringkan dengan mesin justeru memberikan kadar

kandungan senyawa yang rendah dibandingkan dengan

pengeringan di bawah sinar matahari. Contohnya turunan

kumarin pada sampel herbal Angelica dahurica (Jurnal CIna)

2. Pemilihan pelarut organik yang lebih tinggi daya ekstraksinya.

Jika metanol atau etanol memiliki keterbatasan bisa langsung

mencoba pelarut lain pada waktu ekstraksi sehingga

yield/rendemennnya lebih tinggi.

3. Pemilihan metode ekstraksi yang lebih tepat. Maserasi memang

merupakan metode utama pada tahap ekstraksi kasar karena

simpel dan jumlah bahan sangat fleksibel.

4. Pelibatan aspek fisis: digesti, panas, gelombang microwave.

Faktor-faktor fisis tersebut membantu disolusi dan difusi

senyawa target dari bahan ke larutan.

5. Melibatkan penggunaan arus listrik lemah pada counter current

kromatografi.

6. Pemilihan pelarut untuk partisi yang lebih selektif.

7. Manipulasi pH untuk mendapatkan selektifitas tinggi.

8. Penggunaan adsorben non konvensional: turunan

karbohindrat: siklodekstrin, berbagai sephadex, amilum dst.

Gambar 6.1 Struktur siklodekstrin


BAB VII

EFEK SINERGISME, KOMPLEMENTER, DAN EFEK PLAUSIBLE

Apapun yang dilakukan manusia pasti ada kelemahan dan nilai

negatif. Istilah isolasi mengacu pada sistem reduksionisme dan

simplifikasi sistem biologi. Pemurnian bertujuan untuk simplifikasi

dari berbagai matriks nabati yang dianggap menggangu. Seringkali

tahap ekstrak kasar menunjukkan efek yang sangat poten hampir

sama atau lebih poten dengan kontrol positif. Kini para ilmuwan

farmakognosi menyadari bahwa seringkali fraksinasi, pemurnian dan

hasil senyawa murni justeru memiliki efek yang lebih lemah

dibandingkan dengan efek ekstrak utuh, crude drug, rebusan dan

fraksi sejenisnya. Bahkan seringkali pula bahan semi murni memiliki

hilang efeknya. Namun pada tahap fraksinasi lanjut efeknya turun

atau sama dengan fase ekstrak tentu ini agak mengecewakan.

Material yang lebih murni namun memiliki berefek turun

mengindikasikan keberadaan salah satu peristiwa:

Sinergisme: keradaan salah satu atau beberapa senyawa

menyebabkan penguatan efek kuat dan dramatis, yang jika

beraksi tunggal tidak berefek atau sangat lemah. Pemisahan

menyebabkan efek kecil atau tidak berefek. Senyawa-senyawa

bisa bersifat ajuvan menaikkan absorbsi, menaikkan transport

ke dalam sel terhadap molekul prinsip, atau mencegah efluks

pengeluaran dari sel.

Plausible effect: efek aditif beberapa senyawa pada target

molekuler tunggal. Efek yang diberikan adalah hasil

sumasi/penjumlahan total efek semua komponene. Dan

memiliki efek lebih poten dibandingkan efek sendiri-sendiri.

Komplementer: beberapa senyawa memiliki target molekuler

berbeda namun berazas patologis sama.

Jika salah satu peristiwa ini terjadi maka ekstrak kasar atau

fraksi kasar tetap bisa dikembangkan menjadi bahan obat dengan

menggunakan penanda satu atau beberapa molekul aktif tertentu

sebagai penanda aktif (active marker) atau kimiawi (analytical


marker). Standardisasi untuk menjamin keamanan dan mutu ekstrak

merupakan salah satu topik penting di dalam farmasi pada tingkat

produksi dan aplikasi kedokteran herbal.

Namun demikian molekul alami tetap menjadi salah satu

model untuk pengembangan dan penemuan obat. Dengan

ditemukannya senyawa murni yang kurang aktif maka perlu

modifikasi semi sintesis atau modifikasi farmasetik. Dengan demikian

senyawa murni hanyalah salah satu dari target dan dasar keilmuan

farmasi yang butuh pengembangan dan bantuan disiplin ilmu lain

misalnya kimia medisinal, kimia sintesis, docking komputer, termasuk

ilmu klasik yakni analisis kuantitatif dan standardisasi kimiawi.


BAB VIII

SENYAWA TARGET BERSIFAT POLAR

(SANGAT LARUT DALAM AIR ATAU METANOL)

Target belajar:

Pembaca mampu memahami bahwa metabolit sekunder bukanlah

bahan yang selalu aktif. Seringkali ampas (metabolit primer)

terutama karbohidrat adalah bahan yang lebih poten farmakologis.

Pembaca mampu memahami kelemahan proses ekstraksi dan

kromatografi main stream.

Pada tahap proses fraksinasi terakhir, fraksi yang sangat polar

kebanyakan disebut ampas. Fraksi polar tersebut selalu ditinggal dari

proses isolasi karena keterbatasan metode. Jadi pada kenyatannya

selalu fraksi semi polarlah (etil asetat, butanol, kloroform) yang

menjadi obyek pemurnian untuk mendapatkan metabolit sekunder.

Di sisi lain senyawa yang sangat polar (misal polisakarida) atau non

polar (asam lemak dan derivatnya) cenderung di tinggalkan,

Fenomena di atas linear apa yang terjadi pada mayoritas

masyarakat ilmiah dan kelompok akademik serta masyarakat industri

farmasi herbal mempercayai bahwa untuk meningkatkan jaminan

mutu obat herbal harus diproduksi dalam bentuk ekstrak.

Kebanyakan ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut etanol

kadar tinggi. Pelarut etanol digunakan atas pertimbangan

kemampuannya yang excellent melarutkan mayoritas molekul aktif.

Walau konsorsium obat herbal di dunia juga memperkenankan

beberapa pelarut organik lain seperti metanol, aseton atau etil asetat.

Namun etanol merupakan pelarut organik yang direkomendasikan

untuk mengekstraksi obat herbal sebelum diproduksi dalam bentuk

farmasetis modern.

Trend di atas tentu sangat paradoks dengan apa yang terjadi

pada obat herbal. Obat herbal secara faktual dan historis, beratus

tahun dan turun temurun digunakan dengan cara direbus dengan air.

Masyarakat primitif dan tradisional tidak mengenal pelarut organik

untuk mempersiapkan bahan obat untuk pengobatan tradisional.


Mungkin Kontroversial Mewujudkan Jamu Selain Ekstrak Air?

Masyarakat Industri dan peneliti di kebanyakan universitas

menggunakan pelarut organik karena pertimbangan pragmatis yakni

kemudahan penguapan dan penghilangan dari ekstrak dari pada

menggunakan pelarut air. Di laboratorium penguapan air dari

ekstrak membutuhkan waktu yang cukup lama serta peralatan

mahal. Penguapan bahan berair membutuhkan freeze dryer yang

berharga mahal dengan kapasitas terbatas.

Demikian pula untuk kondisi saat ini persyaratan CPOTB (cara

pembuatan obat tradisional yang baik) lebih mengakomodasi bahan

baku yang diekstraksi dan dipersiapkan dengan pelarut organik. Di

sisi lain sertifikat CPTOB merupakan persyaratan suatu produk layak

registrasi di Badan POM dan edar di masyarakat Indonesia.

Kontroversi Penelitian Obat Herbal

Kebanyakan penelitian obat herbal di perguruan tinggi dan

laboratorium menjadikan bahan-bahan yang diekstrak dengan

pelarut-pelarut organik sebagai obyek kajian utama. Tren dan tradisi

tersebut tidak hanya terjadi di Indonesia namun di dunia. Ada

beberapa alasan yang menjadikan kecenderungan tersebut terjadi:

Pertama, molekul dan senyawa alami yang menjadi target adalah

mikro molekul yang bersifat semi polar. Senyawa semi

polar mudah terekstraksi dengan pelarut-pelarut organic,

etanol, metanol, aseton, etil asetat dll.

Kedua, kebanyakan peneliti masih bersikap “menghindari

kesulitan”. Hal ini terjadi karena metode kromatografi

mainstream saat ini dan utama yang digunakan dan

menjadi metode rujukan adalah metode yang

kompatibel dengan senyawa semi polar. Fenomena

ini klop dengan poin pertama. Metode kromatografi fase

diam fase normal dan terbalik utama yang

berkembang saat ini mengakomodasi dan difokuskan

untuk senyawa metabolit sekunder. Pada kenyataannya

jamu rebusan kebanyakan dipersiapkan dengan merebus

dengan air.


Ketiga, kebanyakan ilmuwan memiliki interes yang tinggi pada

mikromolekul (metabolit sekunder) karena relatif mudah

dimurnikan dan ditentukan strukturnya.

Dengan demikian tentu cukup kontroversial jika ingin

merepresentasikan obat tradisional dengan cara mengekstraksi

tanaman obat dengan menggunakan pelarut organik dan tidak

representatif menggambarkan obat tradisional yang notabene

digodog.

Rebusan Secara Ilmiah Ternyata Aktif

Secara tidak sadar, periode tahun 2002-2012 ilmuwan di

Institute of Natural Medicine Universitas Toyama Jepang, di

dalamnya beberapa ilmuwan Indonesia termasuk Dr. Tepy Usia

(BPOM) dan Dr. Subehan (Unhas), membuktikan bahwa beberapa

bahan jamu yang disiapkan dengan rebusan air memiliki efek bioaktif

lebih tinggi dari bahan yang disiapkan dengan ekstraksi pelarut

organik (Saifudin dkk, 2012). Analisis yang lebih jauh menggunakan

spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance) menunjukkan

bahwa material jamu yang direbus dengan air tersebut mengandung

polisakarida dalam kadar tinggi dan dominan. Menariknya bukan

terpenoid, fenil propanoid, flavonoid, polifenol atau metabolit

sekunder terlarut dalam air yang lazimnya menjadi interes penelitian

dan riset. Walaupun perebusan dengan air panas masih

memungkinkan mengambil metabolit sekunder terekstraksi namun

tentu dalam kadar sangat minor.

Kandungan Utama Material Polar

Karbohidrat dan polisakarida adalah kandungan utama dari

ekstrak air atau ekstrak polar lain termasuk ekstrak metanol.

Hal itu tercermin pada salah satu contoh yang penulis sajikan

sampel kayu manis (Cinnamomum burmanii), meskipun dikenal

sebagai bumbu dapur namun memiliki efek anti diabetes tipe II yang

poten. Ekstrak air komponen jamu ini mengandung polisakarida

(Gambar) sebagai komponen utama. Sedangkan menurut studi

fitokimia lebih lanjut pada ekstrak pelarut organik (metanol) kaya

akan fenil propanoid dan polifenol terutama sinamal dehida


(Subehan dkk, 2002). Walaupun kedua ekstrak berefek terkait anti

diabetes (Saifudin dkk, 2012). Dengan demikian metabolit primer

(polisakarida dan karbohidrat) juga penting untuk memberikan efek

farmakologis.

Pemisahan Senyawa Polar

Polisakarida dalam topik pengobatan modern memiliki peran

penting. Beberapa vaksin merupakan turunan polisakarida.

Sebagaimana diungkapkan di depan bahwa sistem pemisahan

mainstream utama saat ini hanya bisa memisahkan senyawa yang

bersifat semi polar. Sistem pemisahan mainstream yang dimaksud

adalah fase diam silika dan ODS. Di sisi lain secara realitas pada

praktek bioassay-guided fractionation sering kali dijumpai fraksi yang

bersifat polar (MeOH atau air) lebih poten dari pada fraksi semi

polar. Tentu material dan senyawa yang larut dalam air sangat sulit

(hampir tidak bisa) dipisahkan dengan adsorben di atas. Untuk

diketahui bahwa senyawa yang bersifat sangat polar akan berada

dasar tempat penotolan KLT setelah dielusi pada fase normal dan

terbawa fase gerak pada fase terbalik. Kebalikannya adalah lemak.

Walaupun solven diganti tetap saja terjadi demikian.

Untuk memisahkan ekstrak air (diperoleh dengan cara maserasi

digesti dengan air panas 1-2 jam) dilakukan prosedur:

- Filtrasi dengan kapas untuk menghilangkan material tak larut

air.

- Dialisis

- Kromatografi resin: ion exchange

Gambar 8.1 Spektra 1H NMR ekstrak air

kayu manis (Cinnamomum burmanii)

yang menunjukkan keberadaan

polisakarida (geseran kimia δ 3 – 4,5

ppm) yang bertanggung jawab

memberikan efek farmakologis.


- Filtrasi Gel Sepharose

- Sephadex LH-20

- Elektroforesis

Penentuan Struktur Polisakarida

Untuk polisakarida, bobot minimal yang diperlukan adalah 20

mg untuk NMR. Karena geseran kimia atom hidrogen akan

menumpuk pada area 3-4 ppm. Demikian pula geseran kimia karbon

akan berada pada daerah 70-90 ppm.Untuk menentukan struktur

golongan polisakarida NMR tidak bisa terlalu diandalkan.

Penentuan struktur polisakarida strukturnya lebih

mengutamakan dengan alat GC-MS dengan membandingkan

standard monosakarida-monosakarida.

Adapun penentuan penentuan kemurnian dan kadarnya

menggunakan HPLC dengan detektor RI (Refraktive Index).

Dengan demikian, secara umum pemurnian polisakarida

memerlukan treatmen khusus dan lebih rumit karena melibatkan

berbagai kromatografi eksklusi dengan berbagai fase diam

polisakarida.

Karena pemurnian terkendala dengan kompleksitas matriks

nabati, polisakarida saat ini cenderung dihasilkan dari ekstraksi hasil

fermentasi bakteri atau sintesis.

Fair dalam Fokus Penelitian Jamu

Walaupun mayoritas interes penelitian tanaman obat dan jamu

adalah melakukan ekstraksi, fraksinasi dan purifikasi senyawa

metabolit sekunder, akan lebih fair jika perguruan tinggi dan para

peneliti tidak menghindari ekstrak air. Secara real kendala peralatan

yang tidak kompatibel dengan material larut air memang tidak bisa

dihindari. Sambil menunggu terobosan sains dan teknologi metode

ekstraksi, saat ini ranah penelitian yang bisa dijangkau adalah aspek

khasiat dan toksisitas ekstrak air.

Jadi, encouragement dan kampanye meminum jamu rebusan

dan melestarikan jamu gendong, dorong, bonceng serta pembuat

jamu rebusan yang merupakan profesi yang mulai terpinggirkan dan


punah juga perlu dilakukan. Agar khazanah jamu rebusan tidak

hilang dari pustaka empiris pengobatan !

Lebih jauh lagi, jamu rebusan tetap memiliki masa depan dan

tetap memiliki khasiat baik ilmiah maupun empiris. Jamu tidak

representatif jika digambarkan dengan metabolit sekunder semata-

mata. Jamu tidak selalu harus diekstraksi. Obat tradisional tidak

selalu tepat jika harus diisolasi dan ingin diketahui zat yang

bertanggung jawab secara farmakologis. Mungkin biarlah

kebanyakan jamu ada dalam bentuk rebusan air karena:

Pertama, kenyataannya metode kromatografi dan metode

karakterisasi yang ada saat ini “hanya” kompatibel dengan

metabolit sekunder.

Kedua, karakterisasi dan metode elusidasi struktur termasuk NMR

dan kebanyakan spektroskopi yang ada saat ini “hanya

mampu” mengkarakterisasi mikromolekul.

Ketiga, sinergisme dan plausible effect seringkali teramati dan

terjadi pada obat tradisional untuk memberikan efek.


BAB IX

PENENTUAN STRUKTUR/ELUSIDASI STRUKTUR

Untuk menentukan struktur suatu molekul organik cara

standard dan yang merupakan golden method adalah menggunakan

spektroskopi NMR (nuclear magnetic resonance). Metode NMR

memberikan informasi jumlah proton dan karbon, lingkungan

kimiawi proton dan karbon. Dengan metode NMR ini akan

diperoleh data-data yang sangat informatif. Hampir dikatakan

bahwa NMR merupakan tulang punggung elusidasi struktur.

Pemahaman struktur senyawa kimia berbasiskan jalur biosintesis

(lihat Bab awal) sangat membantu menentukan struktur. Membaca

referensi tentang hubungan kekerabatan dan kandungan metabolit

sekunder material yang diteliti juga sangat membantu. Jika sudah

biasa, informasi dari 1H NMR dan

13C NMR sudah cukup untuk

menentukan apakah suatu senyawa merupakan senyawa baru (novel

compound) atau senyawa yang sudah diketahui (known compound).

Dengan melihat chemical shift (δ ppm) dan pemecahan puncak

(splitting patterns) dari NMR proton dan karbon kemudian

membandingkan dengan spektra dari paper di suatu jurnal seringkali

sudah cukup untuk men-justifikasi novelty suatu senyawa. Kedua

jenis spektra NMR merupakan sidik jari suatu molekul yang sangat

otentik. Jadi tidak perlu buru-buru diambil 2D NMR jika suatu

senyawa memiliki spektra NMR proton dan karbon sama dengan

artikel terpublikasi di suatu referensi.

NMR juga tidak bersifat dekstruktif sehingga bahan uji bisa di-

recovery. Seringkali senyawa baru (new compound) atau rendemen

hasil sintesis memilki kadar yang kecil. Metode analisis yang bersifat

un desktruktif salah satunya NMR paling diandalkan. Adapun

spektrofotometri IR (infra merah), UV (ultraviolet), MS (mass

spektrometri), dan kristalografi dilakukan setelah dipastikan bahwa

senyawa yang ditemukan adalah senyawa baru atau suatu

permintaan khusus (supervisor, editor jurnal, dll) untuk menentukan.

Seringkali senyawa organik memiliki steriosenter atau karbon

asimetris, yakni karbon yang mengikat 4 macam substituent yang

berbeda tentu ke-4 subsituent akan memiliki letak dalam ruang atau


spasial sendiri-sendiri atau 3 dimensi. Dengan demikian dari NMR

akan diperoleh informasi, 1. struktur datar (planar structure), 2.

Struktur dalam ruang tiga dimensi. Metode NMR bisa digunakan

untuk menentukan kiralitas adalah NOE (Nuclear Overhausser Effec),

NOESY, dan ROESY.

Untuk memperoleh spektra 13C NMR diperlukan waktu yang

lebih lama karena di alam raya abundance 13C hanya 1 % dari

12C.

Adapun 1H memiliki kelimpahan mayoritas dibanding

2H atau

3H

yakni 99%. Bobot minimal agar diperoleh spektra 1H NMR yang

adalah 1 mg. Namun untuk efisiensi dan kecepatan memperoleh

data, maka bobot yang diperlukan setidaknya 5 mg. Untuk

memperoleh data proton 1H NMR biasanya cukup waktu kurang

dari 5 menit. Sedangkan untuk memperoleh data karbon 13C NMR

diperlukan waktu lebih panjang, biasanya untuk bobot 10 mg

memerlukan waktu 1-3 jam.

Bobot minimal yang diperlukan untuk elusidasi struktur dengan

NMR sebaiknya tidak kurang dari 3 mg agar efisien. Meskipun bobot

0.6-1 mg masih tetap bisa menghasilkan spektrak yang cukup jelas

pada mesin NMR 400 MHz. Elusidasi struktur bukanlah pekerjaan

yang sulit, hanya masalah kebiasaan dan ketekunan. Sering bekerja

dengan sampel selama 6 bulan akan diperoleh intuisi dan mindset

suatu spektra.

Berdasarkan urutan bekerja, metode NMR ada 2 macam yakni:

1. satu dimensi (1D)

2. dua dimensi (2D)

1D NMR terdiri dari 1H NMR dan

13C NMR masing-masing

untuk menentukan jumlah proton dan karbon serta basis lingkungan

kimiawinya.

2D NMR digunakan untuk menentukan secara detail

lingkungan antara proton dan karbon dan atom lain. Untuk

menentukan struktu kimia tidak harus semua metode itu ditempuh.

Untuk senyawa yang sudah diketahui (known compound) cukup

hanya 1D NMR dengan cara membandingkan data 1H dan

13C NMR

dengan senyawa yang sama dan telah terpublikasi di pustaka

(terutama berbagai jurnal di internet). Mesin NMR dengan produsen

berbeda seringkali memberikan hasil data yang sedikit berbeda angka


desimal atau bahkan 1-2 point namun hal ini masih merupakan data

yang sama. Hanya senyawa baru (novel compound) saja yang

membutuhkan semua data 2D secara detail. Biasanya di dalam

pekerjaan isolasi pada suatu spesies ditemukan 1-5 senyawa baru,

jadi tidak selalu harus mengambil data semua, terlebih lagi jika

memang tujuannya

Referensi Kemotaksonomi

Pemahaman dasar-dasar biosintesis metabolit sekunder secara

baik akan sangat membantu melakukan interpretasi data

spektroskopi NMR. Demikian pula untuk mempermudah dan

membantu menganalisis data NMR. Membaca publikasi ilmiah

(jurnal) yang membahas kandungan kimia suatu spesies, laporan

tentang konstituen kimiawi suatu genus seringkali ditempuh oleh

para peneliti bidang farmakognosi. Demikian juga melakukan cross

referensi tentang data-data NMR-nya.

Spektra 1H NMR memberikan data:

δ, chemical shift (geseran kimia) antara 0–15 dengan satuan

ppm dari standard internal. Geseran kimia antara

Jenis atom tetangga karbon pengikat H. Pada prinsipnya jika

karbon mengikat atom elektronegatif maka posisi geseran

kimia pada angka yang lebih besar:

CH3 (1,5-0.5 ppm), CH2 (1-2 ppm)

CH2= (4,5-5 ppm), CH3-C= (1,2-1,9 ppm)

-CH-O (3-4,5 ppm)

-CH benzil (7-8 ppm) dst

Rasio relatif jumlah atom H. Semakin tinggi puncak

menandakan jumlah hidrogen semakin banyak. Noise atau

puncak gangguan memiliki intensitas sangat pendek pada dasar

spektra. Adapun puncak standard diambil yang memiliki

intensitas terendah. Biasanya rasio merupakan kelipatan 1

(1:2:3, dalam suatu molekul tangan karbon hanya mengikat

maksimal 3 atom hidrogen).


Splitting pattern 1: bentuk pemecahan spektra,

menginformasikan berapa jumlah proton pada karbon

tetangga.

Splitting pattern 2: dua hidrogen yang terikat pada satu karbon

(disebut proton germinal) kadang memiliki sifat magnetik yang

sama

Spektra 13C NMR memberikan data:

Jumlah karbon dalam suatu senyawa.

Posisi atom karbon. Posisi dinyatakan sebagai geseran kimia δc

(0-200 ppm)

Karbon SP3 terletak antara 1-20 ppm, karbon yang mengikat

atom O (68-90 ppm), karbon metilen -CH2- (30-45 ppm), -

CH-(45-52 ppm), C=O (170-180ppm), C=C (100-130 ppm),

C-benzil (140-160 ppm).

Spektra NOE (Nuclear overhauser effect):

Adalah spektra yang menunjukkan interaksi 2 atom hidrogen

dalam ruang (3 dimensi). NOE disebut juga dengan analisis

kedekatan hidrogen dalam ruang (bukan ikatan kimiawi seperti

COSY).

Peranan pelarut

Secara umum pelarut yang handal untuk pengukuran NMR ada

dua, yakni kloroform dan metanol terdeutronasi. Kloroform handal

digunakan untuk senyawa yang cenderung semi polar. Ia memiliki

spektra yang bersih. Metanol melarutkan sampel yang cenderung

polar (kaya gugus hidroksi). Namun metanol cenderung melarutkan

berbagai impuritis. Spektra cenderung kotor. Seringkali pula metanol

juga mampu melarutkan senyawa yang larut dalam kloroform. Air

terdeutronasi (D2O) digunakan untuk senyawa yang sangat polar

misalnya glikosida bergula banyak atau golongan karbohidrat.

Seringkali aseton, piridin, dan DMSO terdeutronasi digunakan

untuk melarutkan senyawa semi polar. Mengganti pelarut seringkali

dilakukan dan perlu dilakukan untuk memunculkan puncak hidrogen

yang tersembunyi. DMSO sebaiknya digunakan jika tidak ada pelarut


yang tidak bisa melarutkan. DMSO sulit diuapkan. Jika isolat

kadarnya kecil menyulitkan recovery. Pemunculan dan spektra yang

berbeda dari berbagai pelarut juga bermanfaat untuk

mengkarakterisasi berbagai isomer. Seringkali spektra proton saling

tersebunyi atau overlap. Bisa muncul dengan penggantian pelarut.

Spektra 2D NMR memberikan informasi:

HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence):

Spektra ini adalah pengimpitan horizontal vs vertical antara

signal 1H NMR vs

13C NMR. HMQC memberikan informasi

jumlah hidrogen yang terikat oleh suatu karbon.

COSY (Correlated Spectroscopy): Spektra adalah pengimpitan

horizontal vs vertical spektra 1H NMR. COSY memberikan

informasi jumlah hidrogen berjarak 1 karbon atau pada proton

yang sama.

HMBC (Heteronuclear Magnetic Bond Correlation): Spektra ini

adalah pengimpitan horizontal vs vertical antara signal 1H

NMR vs 13C NMR. HMBC memberikan informasi posisi suatu

atom hidrogen terhadap 2-3 atom karbon.

Ketiga 2D NMR metode di atas adalah cara umum adapun

HSQC, TOCSY dll mudah dimengerti setelah memahami HMQC,

COSY, dan HMBC.

ROESY (rotating-frame nuclear Overhauser effect correlation

spectroscopy) dan NOESY (Nuclear Overhauser effect

spectroscopy) untuk mengetahui korelasi hidrogen dengan

hidrogen karena berdekatan di ruangan 3 dimensi. Dua

metode ini digunakan untuk menentukan kiralitas. Akan tetapi

NOE lebih akurat sebab di dalam ROESY dan NOESY signal

juga terkandung COSY signal.

Data NMR diambil pertama kali disamping sangat informatif,

pekerjaan NMR tidak bersifat dekstruktif sehingga tidak merusak

isolat sehingga bisa di-recovery lagi. Namun jika isolat diperoleh

dengan konsentrasi tinggi misalnya lebih dari 50 mg maka semua

pengambilan spektra bisa diambil secara simultan. Setelah diperoleh

spektra NMR pekerjaan selanjutnya mengukur berat molekul dengan

spektroskopi massa.


MS: Massa Spektroskopi

Prinsip dasar dari metode ini adalah membuat suatu molekul

netral menjadi bermuatan sehingga bisa dideteksi. Secara prinsip

dasar asam atau basa lemah dijadikan sebagai sumber ion bersama

pelarut. Informasi yang diperoleh adalah berat ion, yakni massa

molekul isolate ditambah atau dikurangi sumber ion. Biasanya

disajikan dalam [M+H]+ atau [M-OH]

- atau dalam bentuk radikal

[M●]

+ , dst. Jadi berat molekul sesungguhnya diperkirakan berkurang

satu, bertambah satu, atau angka yang mendekati. Adakalanya

ionisasi melalui penambahan berat molekul air. Untuk itu

kecermatan dalam mengesitimasi dan pengalaman sangat diperlukan.

Adapun, bobot isolat yang dibutuhkan untuk spektroskopi massa ini

sangat kecil. Lebih disukai sekitar 0,5 mg/mL.

Tujuan utama metode ini adalah untuk mengetahui berat

molekul. Ada beberapa metode dasar cara ionisasi spektroskopi yang

yakni APCI (atmospheric pressure chemical ionization), ESI (electro

spray spectroscopy), atau FAB (Fast atomic bombardment). APCI

digunakan untuk senyawa yang cenderung polar, ESI digunakan

senyawa yang kurang polar atau non polar, FAB digunakan untuk

molekul kecil namun memberikan fragmentasi tidak terkendali

namun informatif terhadap elemen penyusun molekul (analisis

elemental). Lebih jauh spektroskopi akan memberikan informasi pola

fragmentasi. Pola fragmentasi sangat penting untuk melihat

perbedaan senyawa-senyawa yang memiliki berat molekul sama.

Dengan pola fragmentasilah meraka akan bisa dibedakan. Seringkali

beberapa senyawa memiliki spektra NMR yang sama namun pada

hakekatnya mereka adalah stereoisomer. Selain besar angka rotasi

aktif, pola fragmentasi juga memberikan informasi perbedaan antar

stereoisomer. Peralatan modern “hyphenated instrument” yakni

mengintegrasikan kromatografi cair dengan massa spektroskopi (LC-

MS) lebih memberikan informasi lebih baik. Jika metode LC-MS

digunakan biasanya senyawa dilarutkan di dalam metanol. Adapun

metode MS tunggal bisa menggunakan beberapa matriks seperti

gliserol sebagai media untuk isolat.


IR: Infra Red spektroscopy memberikan informasi gugus-gugus

fungsional yang dimiliki oleh suatu senyawa. Pada era sekarang

spektra IR bisa dianggap sebagai data sekunder dan bukan utama.

Metode ini dilakukan setelah diperoleh NMR dan MS. Spektra IR

akan memberikan informasi gugus fungsional. Maka media vehicle

untuk pengukuran metode ini adalah senyawa yang tidak memiliki

gugus fungsional. Kloroform atau diklorometana adalah pelarut

pilihan utama untuk pengukuran spektra IR. Jika tidak larut ke dalam

kedua jenis solven maka diserbukkan bersama KBr (kalium bromida).

Untuk menginterpretasikan kita cukup membandingkan dengan

berbagai tabel pada buku-buku standard misalnya yang ditulis

Silverstein (1998) atau Pavia dan Kriz (2004). Puncak-puncak yang

diberikan ibarat sidik jari dank has untuk gugus fungsional maka

cenderung mudah ditebak.

Pertanyaan:

Mengapa KBr digunakan sebagai matriks dalam pengukuran

IR?.

Mengapa metanol atau etanol yang merupakan pelarut

universal tidak direkomendasikan sebagai pelarut IR?.

UV-VIS: Ultra violet-Visible. Spektra ini digunakan untuk

mengidentifikasi berapa panjang velombang maksimal (λ max) suatu

isolat. Untuk era sekarang spektra ini juga merupakan data sekunder

dan tidak terlalu informatif. Secara kasar suatu senyawa tidak akant

terlihat pada cahaya tampak maka ia akan memiliki λ max > 400

nm. Senyawa yang tidak tampak pada cahaya visible maka akan

memiliki lambda maksimum antara 240-380 nm. Namun jika pada

area ultra violet atau visible suatu senyawa tidak tampak maka

kemungkinan tidak memiliki kromofor sebagaiman polisakarida.

Informasi tersebut sangat berguna di dalam menentukan

instrumentasi yang tepat untuk melakukan analisis kuantitaf.

Senyawa yang mampu mengabsorbsi panjang gelombang UV/VIS

maka detektor PAD bisa digunakan. Di sisi lain senyawa yang tidak

memiliki tanggapan sebagai mana turunan polisakarida maka

detekor RI (refractive index) bisa digunakan.


BAB X

ELUSIDASI STRUKTUR BEBERAPA SPEKTRA METABOLIT

SEKUNDER

Target Belajar: Pada tahap permulaan mahasiswa memerlukan

spektra 1 dan 2 dimensi yang lengkap (1H NMR,

13C NMR, COSY,

HMQC, HMBC) untuk menentukan struktur planar atau struktur 2

dimensi suatu senyawa. Jika sudah terbiasa dan telah memahami

kerangka jalur biosintesis secara baik maka seringkali cukup 1H dan

13C NMR dengan HMBC sudah bahkan cukup data 1 dimensi saja

bisa digunakan untuk membantu menentukan struktur. Karena

kebanyakan metabolit sekunder sudah diketahui sehingga cukup

membandingkan dengan data terpublikasi. Jika data sama maka

merupakan senyawa yang sama. Untuk membuat laporan seorang

peneliti harus memberikan data lengkap baik 1 dan 2 dimensi NMR.

Sedangkan data untuk dipublikasi di jurnal internasional bereputasi

baik, jika memfokuskan aspek kimia, biasanya data 1H dan

13C NMR

saja yang disajikan. Hanya senyawa baru saja yang perlu lengkap

diskripsinya termasuk 2 dimensi NMR.

Di dalam mata kuliah spektroskopi atau elusidasi struktur

seringkali memberikan urutan spektrak MS, UV-VIS, IR, rotasi optis,

baru data NMR. Di dalam praktek data NMR lah yang pertama

diambil dan difokuskan baru kemudian data MS pada tahap terakhir.

Sedangkan data-data lainnya hanya sekedar data konfirmasi

tambahan. Dengan demikian data NMR merupkan data primer dan

golden standard.

Senyawa tidak melulu memiliki struktur planar (2 dimensi).

Cukup banyak senyawa yang memiliki karbon kiral. Konsekuensinya

senyawa jenis ini memiliki struktur dalam ruang atau memiliki

struktur 3 dimensi (3D). Setelah memahami cara menentukan

struktur planar kemampuan mahasiswa harus meningkat yakni

mampu menentukan struktur 3 dimensi dengan bantuan model

struktur kimia dan spetra NOE, NOESY, atau ROESY. Proses itu


TM

TM

disebut dengan penentuan stereokimia relatif. Untuk menentukan

struktur mutlak digunakan CD cotton (tidak dibicarakan di sini).

Senyawa 1

1H NMR menunjukkan cukup banyak proton yang terletak

pada posisi kurang dari 2 ppm. Hanya terdapat proton singlet pada

posisi 6 ppm yang terisolir. Harap mengabaikan puncak tinggi

namun lebar pada 4,8 ppm (atau pada suatu spektra lain) karena ia

adalah solven atau impuritis (tidak selalu pendek). Abaikan juga

spektra pada 0 ppm karena ia adalah standard TMS (Tetra Metil

Silan). Pada 13C NMR menunjukkan 11 buah sinyal karbon. Harap

mengabaikan puncak tebal dan tinggi pada 50 ppm karena ia adalah

puncak solven CD3OD. Pada spektra tersebut terlihat 6 buah sinyal

karbon pada posisi lebih dari 100-205 ppm. Mereka adalah karbon

aromatis. Terdapat 4 karbon alifatik 15-40 ppm dan 80 karbon metil

olefin.

Pada HMQC mengkonfirmasi semua posisi hidrogen tersebut

terutama metil 1,8 ppm yang berkorespondensi pada 80 ppm. Pada

DEPT mengkonfirmasi bahwa mayoritas proton/hidrogen terikat

oleh karbon alifatik yang merupakan CH2. Sedangkan karbon

terendah mengikat 3 buah hidrogen. Sekaligus membuktikan bahwa

karbon yang sangat pendek jumlah protonnya bisa banyak.

Sedangkan pada karbon 6 ppm terkonfirmasi ia terikat pada satu

karbon aromatis.

Untuk mengkonfirmasi di mana rantai alifatik mengikat cincin

benzen bisa dilihat dari HMBC. Pada spektra tersebut proton

1H NMR

13C NMR


terisolasi 6 ppm tersebut berkorelasi dengan karbon karbonil dan

proton terhidroksilasi. Posisi diperjelas dengan korelasi antara

proton triplet dengan karbon karbonil tersebut. Selain itu korelasi

tersebut juga mengkonfirmasi bahwa ujung CH2-CH2 merupakan

karboksilat. Terlihat dari korelasi proton metilen dengan karbon 208

ppm. Gugus metil berposisi meta terhadap proton terisolasi

dikonfirmasi dengan korelasi dengan dua sinyal karbon aromatis.

Spektra MS mengkonfirmasi berat molekul senyawa tersebut tepat

sesuai dengan simulasi struktur NMR. Sehingga struktur senyawa

tersebut seperti pada gambar.

HMQC DEPT

HMBC

Konfirmasi Spektra MS [HR-ESI-MS: 253,0718]

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 m/z0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Inten.(x1,000,000)

253.0718

Gambar struktur senyawa

berdasarkan data NMR 1 dan 2

dimensi. Garis tebal menunjukkan

COSY. Anak panah menunjukkan

HMBC.


Senyawa 2

Spektra 1H NMR menunjukkan keberadaan 4 buah metil (-

CH3). Dua diantaranya pada 1,6 ppm overlap dengan puncak tinggi.

Puncak pada 2,4 dan 2,8 ppm adalah metil olefinik. Yakni metil

yang terikat pada karbon ikatan ganda (C=C). Sedangkan 1,6 ppm

(tinggi) pada 75 ppm. Anda tahu bahwa senyawa yang kaya dengan

gugus metil adalah golongan terpenoid. Harap mengabaikan puncak-

puncak yang pendek karena ia adalah impurities atau kontaminan.

Pada spektra 13C NMR menunjukkan keberadaan 15 jumlah

karbon yang mayoritas terletak di daerah kurang dari 70 ppm.

Harap mengabaikan puncak karbon yang sangat tinggi pada C NMR

karena ia adalah solven CDCl3. Anda tahu pula bahwa 15 adalah

kelipatan dari 5 (isopren). Hanya terdapat 9 karbon pada daerah

ikatan ganda. 4 diantaranya overlap terlihat 2 puncak tinggi (bernilai

masing-masing 2 karbon). Pada spektra COSY menunjukkan bahwa

dua puncak triplet proton pada geseran kimia 2,6-2,8 ppm masing-

masing bernilai 3 proton saling berdekatan. Dua buah puncak

doublet pada 6,8 dan 7,2 ppm saling berdekatan. Dengan demikian

senyawa tersebut adalah seskuiterpen yang kaya dengan ikatan

ganda. Selain itu tidak ada metilen, yakni karbon tersier terlihat tidak

adanya signal karbon antara 44-60 ppm. Jadi bisa disimpulkan

bahwa senyawa tersebut adalah sekuiterpen tipe guaian. Yakni

seskuiterpen yang bercincin tunggal yang tersusun 10 karbon.

Untuk menentukan kedudukan keempat metil tersebut harus

dilakukan HMBC. Terlihat cross peak metil 1,6 ppm sangat jelas

terlihat pada dua signal karbon pendek 70 ppm dan 156 ppm.

Sedangkan metil pada 2,4 ppm terletak berdekatan posisi karbon

olefin dan karbon karbonil 180 ppm. Sedangkan metil pada 2,2

711

1H NMR

13C NMR


terletak berdekatan dengan dua buah karbon vinilik. Sehingga

disimpulkan struktur sebagaimana pada gambar, yakni suatu

seskuiterpen guaian.

Konfirmasi Spektra MS [HR-ESI-MS: 249.1481]

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 m/z0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

Inten.(x100,000)

249.1481

231.1310

COSY HMQC

HMBC

Gambar struktur senyawa

berdasarkan data NMR 1 dan 2

dimensi. Garis tebal menunjukkan

COSY. Anak panah menunjukkan

HMBC.


Senyawa 3

Penentuan Stereokimia Relatif

Untuk menentukan struktur 2D (dua dimensi) atau disebut

dengan struktur planar tidaklah terlalu sulit. Seringkali Anda akan

menjumpai struktur yang memiliki 3D di dalam ruangan. Mengapa ?.

Anda telah mengenal istilah karbon kiral. Yakni karbon yang

mengikat empat gugus fungsional yang berbeda. Maka ia akan

memiliki struktur 3 dimensi. Ada dua cara penentuan struktur yakni

secara relatif atau secara mutlak. Secara relatif seringkali cukup

menggunakan model struktur kimia dibantu dengan data NOE

spektra, NOESY, dan ROESY. Data dari NOE lebih disukai karena

tidak ada unsur COSY. Jadi jika memiliki data NOESY atau ROESY

perlu diklarifikasi dengan data COSY.

Untuk menentukan stereokimia, struktur dua dimensi harus

final dan selesai terlebih dahulu. Contohnya di bawah ini.

Termasuk senyawa golongan apakah ini?

Dari kedua spektra 1H yang kaya dengan metil kemudian

berdasar 13C NMR tampak senyawa memiliki 15 buah karbon yang

berlokasi <60 ppm. Berdasarkan fakta itu Anda tidak kesulitan

menyimpulkan bahwa senyawa tersebut adalah suatu seskuiterpen.

Berdasarkan analisa COSY,

HMQC, dan HMBC maka struktur senyawa tersebut adalah

seperti pada gambar X. Namun struktur 2 dimensi tersebut tidaklah

cukup. Ada 3 karbon kiral.

13C NMR 1

H NMR


Anda harus menentukan orientasi atau arah gugus-gugus

fungsional yang terikat. Untuk menentukan orientasi hidrogen maka

dilakukan pengukuran NOE. Salah satu hidrogen pada karbon 1,2,

dan 3 di radiasi. Jika terdapat proton yang signalnya naik maka

menunjukkan kedekatan. Sebaliknya, jika justeru sinyal lemah

menunjukkan arah yang berlawanan.

COSY HMQC 1H NMR

Gambar struktur senyawa ber-

dasarkan data 1 dan 2

D NMR

HMBC


Senyawa 4

1H NMR spektra di atas menunjukkan keberadaan 6 hidrogen

pada geseran lebih dari 6 ppm. Daerah tersebut adalah daerah

proton aromatis. Geseran kimia memperlihatkan sistem ABX. Yakni

terjadinya kopling konstan pada posisi meta dan para. Pada daerah

4-5 ppm adalah area proton yang terikat pada karbinil (karbon yang

teroksigenasi). Sedangkan dua puncak tinggi pada 3,8 dan 3,9 ppm

adalah gugus metil metoksi (-OCH3). COSY spektra mengkonfirmasi

kedekatan proton pada 3,8 dan 3,9 ppm (doublet). COSY juga

mengkonfirmasi sistem ABX tersebut bahwa dua proton 6,2 dan 6,4

ppm berdekatan karena berposisi meta dan saling mengkopling

lemah 4 Hz. Tiga proton pada 6,9; 7,2; dan 7,4 ppm berdekatan

dengan posisi orto, meta, dan para.

Pada spektra 13C NMR spektra menunjukkan keberadaan 17

buah puncak sinyal karbon. Puncak tebal dan tinggi pada 75 ppm

harap diabaikan ia adalah solven CDCl3. Kebanyakan puncak berada

> 100 ppm sebanyak 15 buah. Jadi ada dua kemungkinan yakni

terpenoid atau flavonoid. Kedua kelompok senyawa tersebut

memiliki jumlah karbon yang sama. Secara mudahnya senyawa

Gambar struktur senyawa berdasarkan data

NOE proton1 menunjukkan respon setelah

proton 2 diiradiasi namun tidak untuk

proton 3 (metil). Konfirmasi dengan iradiasi

proton 3 menunjukkan tiadanya respon

kenaikan sinyal pada proton 2. Data

tersebut menginformasikan bahwa 1 dan 2

memiliki orientasi yang sama. Namun 3

berlawanan.


tersebut adalah flavonoid. Flavonoid memiliki 12 buah karbon

aromatis dan 3 jembatan propanoid.

HMBC mengkonfirmasi posisi metoksi 3,7 ppm berada pada

cincin A, berposisi meta terhadap hidroksi. Sedangkan metoksi 3,9

berposisi orto terhadap rantai propanoid pada cincin B. Struktur

senyawa tsb disimpulkan seperti pada gambar.

(mirisitrin)

Spektra H NMR memiliki 5 proton di daerah 5,3-7 ppm.

Puncak tinggi pada 7 ppm menunjukkan dua buah proton overlap. 3

proton lain menunjukkan splitting sistem ABX. Daerah tersebut


adalah daerah aromatis /benzen. Adapun puncak broaden dan tinggi

pada 4,9 ppm adalah kontaminan solven. Puncak sinyal hidrogen

antara 3,2-4,2 ppm menununjukkan puncak karbinil (karbon yang

teroksigenasi). Secara ringkas daerah tersebut adalah daerah gula.

Keberadaan puncak metil 1 ppm mengkonfirmasi metil gula. Adapun

dua puncak tinggi masing-masing pada daerah 2 dan 3 ppm

merupakan kontaminan solven metanol dan aseton.

Spektra C NMR menunjukkan keberadaan 20 karbon. 15

karbon berada di daerah vinilik dan 5 karbon berada di daerah

karbon teroksigenasi. Dari spektra tersebut karbon tersebut

menunjukkan gula tipe glukosa. Sedangkan 15 karbon sangat jelas

merupakan kerangka flavonoid. Tanpa menggunakan spektra 2D

(COSY, HMQC, HMBC) senyawa tersebut bisa disimulasi

strukturnya. Ia merupakan glikosida. Anda jangan terlalu

menggantungkan spektra lengkap. Para peneliti biasanya dengan

data H dan C NMR sudah bisa menentukan strukturnya kemudian

mengkonfirmasi dengan data 1D NMR senyawa terpublikasi. Khusus

untuk flavonoid, kerangkanya tidak terlalu rumit sehingga mudah

ditebak. Kemudian jika betul-betul senyawa baru saja dan tidak

sesuai dengan satu pun publikasi data 2 D diperlukan untuk diukur.

Senyawa 5

Cocokkanlah data 1 dan 2 D NMR berikut ini terhadap struktur yang

diberikan.


Senyawa 6

Cocokkanlah data-data 1 dan 2 D NMR berikut ini terhadap struktur

yang diberikan !



REFERENSI

Dewick, M, Natural Products Biosynthetic, Humana Press, London.

Newman, D. J., & Cragg, G. M. (2007). Natural Products as Sources

of New Drugs over the Last 25 Years⊥. Journal of natural

products, 70(3), 461-477.

Newman, D. J., Cragg, G. M., & Snader, K. M. (2000). The influence

of natural products upon drug discovery. Natural product

reports, 17(3), 215-234.

Newman, D. J., Cragg, G. M., & Snader, K. M. (2003). Natural

products as sources of new drugs over the period 1981-2002.

Journal of natural products,66(7), 1022-1037.

Pavia, D., Lampman, G., Kriz, G., & Vyvyan, J. (2008). Introduction

to spectroscopy. Cengage Learning.

Saifudin A, Kadota S, Tezuka Y. Protein tyrosine phosphatase 1B

inhibitory activity of Indonesian herbal medicines and

constituents of Cinnamomum burmannii and Zingiber

aromaticum. J Nat Med. 2013 Apr;67(2):264-70

Saifudin A, Tanaka K, Kadota S, Tezuka Y Protein tyrosine

phosphatase 1B (PTP1B)-inhibiting constituents from the

leaves of Syzygium polyanthum. Planta Med. 2012

Aug;78(12):1378-81.

Saifudin A, Tanaka K, Kadota S, Tezuka Y. Sesquiterpenes from the

rhizomes of Curcuma heyneana. J Nat Prod. 2013 Feb

22;76(2):2

Silverstein, R., & Webster, F. (2006). Spectrometric identification of

organic compounds. John Wiley & Sons.

Subehan S, Kadota S, Tezuka Y. In vitro mechanism-based

inactivation of cytochrome P450 3A4 by a new constituent

of Cinnamomum burmani. Planta Medica. 2008

Oct;74(12):1474-80.


Usia T, Iwata H, Hiratsuka A, Watabe T, Kadota S, Tezuka Y.

CYP3A4 and CYP2D6 inhibitory activities of Indonesian medi

cinal plants. Phytomedicine. 2006 Jan;13(1-2):67-73.


GLOSARIUM

Adsorben : Sinonim penjerab atau fase diam. Bersifat polar

atau non polar tergantung jenis bahan.

Alkaloid : Metabolit sekunder yang merupakan turunan asam

amino. Di dalam kerangkanya memiliki atom N.

Asam sikimat : starting material golongan fenil propanoid (C9)

Asam : starting material golongan terpenoid (C5)

mevalonat khususnya non tumbuhan.

Asetil-Coa : Starting material golongan (C2) baik poliketida

atau asam asam lemak.

Bioassay : Proses pemurnian senyawa dari bahan dengan

guided pantauan atau panduan aktifitas biologis. Untuk

fractionation bidang penemuan obat berdasar kuatnya efek

farmakologis.

Branching : Suatu percabangan metil. Suatu ciri khas dari

methyl golongan terpenoid.

Building block : skeleton, kerangka utama suatu molekul yang

didasarkan oleh rantai karbon yang tidak terputus

oleh atom lain. Jadi atom karbon (C) adalah

kerangka utama.

DMAP : dimethyl alil pyrophosphate. Starting material

kedua golongan terpenoid..

Deoksisilulosa : Starting material dan jalur biosintesis dari golongan

Dioksisilulosa terpenoid khusunya dari tumbuhan.

ED50 : effective dose 50. Adalah dosis yang memberikan

respon pada 50 populasi subyek uji.

Ekstraksi : Proses pengambilan senyawa dengan pelarut

terpilih. Untuk metabolit sekunder dengan pelarut

organik. Direkomendasikan jumlah bahan mentah

tidak kurang dari 1 kg.


Fenil : Adalah senyawa berkerangka cincin benzil (C6)dan

propanoid rantai samping propanoid (3).

Fraksinasi : pemecahan ekstrak menjadi sub ekstrak

berdasarkan derajat polaritas

Hit : Senyawa yang diuji pada tahap in vitro.

Hit expansion : pembuatan analog senyawa hit melewati sintesis.

HPLC : HPLC yang bertujuan untuk pemurnian. Dilakukan

preparatif setelah fraksinasi halus. Lebih ramah terhadap

kesehatan. Bentuk kolom lebih besar (cm) dari

HPLC konvensional dan kekuatan pompa lebih

besar.

Hyphenated : Sistem analisis yang secara bertahap dilakukan. Dua

Method atau tiga alat disambung menjadi satu. Biasanya

(instrument) sistem kromatografi terlebih dahulu yang pertama

setelah itu spektroskopi massa atau NMR.

IC50 : Inhibitory concentration 50. Adalah konsentrasi

sampel uji yang memberikan hambatan pada 50

subyek uji.

IPP : iso pentenyl pyrophosphate. Starting material

golongan terpenoid.

Kontrol positif : material yang digunakan sebagai referensi

pembanding. Senyawa yang sudah mafhum dan

diketahui memiliki efek tinggi. Bisa senyawa yang

digunakan di klinik atau senyawa penuntun.

Kromatografi : Adsorben atau fase diamnya bersifat inert.

eksklusi Selektifitas bahan yang dianalisis berdasarkan

ukuran partikel.

KLT preparatif : Kromatografi lapis tipis yang bertujuan untuk

pemurnian. Dilakukan setelah fraksinasi halus.

Kapasitas maksimal tiap plate adalah 50 mg untuk

fase normal, 25 mg untuk fase terbalik.


Lead : Senyawa yang menunjukkan efek dan paling

optimum dari beberapa senyawa hasil skrining.

Lead : Senyawa yang menunjukkan paling poten

optimization dioptimasi dengan metode semi sintesis dan

sejenisnya. Agar efeknya maksimal dan efek

samping minimal.

Maserasi : proses ekstraksi dengan cara perendaman. Metode

pilihan untuk metabolit sekunder.

Metabolit : protein, karbohidrat, lemak

primer

Metabolit : Mikromolekul yang digunakan untuk mendukung

sekunder kehidupan.

NMR : Nuclear Magnetic Resonance

1D NMR : Nuclear Magnetic Resonance yang diukur secara

satu dimensi. 1H NMR,

13C NMR, dan NOE adalah

1 D NMR

1H NMR : Hidrogen Nuclear Magnetic Resonance. Metode

pengukuran resonansi inti hidrogen 1. Memberikan

informasi hidrogen-hidrogen di dalam molekul.

13C NMR : Carbon Nuclear Magnetic Resonance. Metode

pengukuran resonansi inti karbon 13. Memberikan

posisi karbon-karbon di dalam molekul.

Splitting : Bentuk pecahan puncak pada spektra H NMR. Bisa

disebabkan hidrogen germinal (dalam karbon yang

sama) atau visinal (bertetangga).

2D NMR : adalah NMR yang diukur secara dua dimensi.

Diukur berdasarkan data H dan C NMR. COSY,

HMQC, dan HMBC adalah 2D NMR

COSY : Correlated spectroscopy. Pengukuran untuk

memberikan data interaksi splitting antara dua

hidrogen yang berjarak 2 karbon (bertetangga).


HMQC : Heteronuclear Multiple Quantum Coherence:

Memberikan data ikatan antara hidrogen dengan

karbon.

HMBC : Heteronuclear Magnetic Bond Correlation. Untuk

menentukan korelasi suatu atom hidrogen

terhadap atom karbon yang berjarak 2 dan 3 dari

karbon pengikatnya.

ABX system : Sistem interaksi antar hidrogen melewati ikatan

aromatis atau karbon ikatan ganda. Splitting

puncak memberikan angka coupling constant (J)

yang besarnya berbanding lurus dengan dekatnya

jarak. Orto kopling memberikan angka 8-10 Hz,

meta kopling memberikan angka 3-4 Hz, dan para

kopling memberikan nilai 1-1,8 Hz.

AMX system : interaksi antar hidrogen di dalam NMR melewati

ikatan. Terjadi interaksi antara proton germinal

karena nilai magnetis yang berbeda. Akibatnya

proton di dalam satu ikatan saling berinteraksi.

NOE : Nuclear Overhausser Effect. Interaksi antara

hidrogen di dalam ruangan (space). Jika salah satu

diiradiasi gugus hidrogen yang berdekatan akan

memberikan respon kenaikan intensitas puncak.

Normal : Sistem kromatografi yang bersistem fase diam polar

(normal phase) namun fase non polar hingga semi polar.

ODS : octa desil silika. Adsorben non polar. Fase terbalik.

Partisi : Pemisahan bahan berdasarkan polaritas yang

berbeda menggunakan media carian yang tidak

bercampur. Ekstrak dilarutkan ke pelarut polar

terlebih dulu terutama air. Butanol, etil asetat,

kloroform, dan heksana.

Poliketida : Adalah golongan senyawa yang berkerangka

turunan asam asetat (C2).


Poten : Pernyataan bahwa suatu sampel memiliki aktifitas

yang tinggi. Sebanding atau lebih tinggi dari

kontrol positif

QSAR : Qualitative Structure-Activity Relationship. Efek

yang diprediksi berdasarkan struktur kimiawi/gugus

fungsional. HKSA: Hubungan Kuantitatif antara

Struktur dan Aktifitas.

Sephadex : Fase diam terbuat dari polisakarida dengan prinsip

pemisahan ekslusi. Sephadex LH-20 adalah pilihan

utama.

Spektroskopi : Spektroskopi yang digunakan untuk menentukan

Mass berat molekul dan elemen-elemen penyusun suatu

senyawa.

Terbalik : Sistem kromatografi yang berfase diam non polar

(reversed phase) namun fase gerak polar.

Terpenoid : Senyawa yang memiliki kerangkan karbon C5

dengan gugus samping metil (CH3).

TMS : Tetra metil silan. Standard pengukuran spektra

NMR. Bernilai 0 ppm.


INDEKS

A

Adrenalin, 28

Alkaloid, 29, 30, 33, 105

Artemisinin, 19

Aseton, 37

Asetonitril, 38

Atropin, 6

B

Bioassay, vii, 39, 105

Biokatalis, 13

Biosintesis, vii, 11, 12, 17, 19

Branching, 105

Building block, 105

Butanol, 48, 108

C

Chemical shift, 23, 84, 86

Cinnamomum burmanii, 80

COSY, 87, 88, 91, 94, 96, 98,

100, 107

Crude drug, 6, 9, 42, 72

D

Dalton, 2, 3, 4, 10, 11

Daun, 44

Dereplikasi, vii, 74

Digoksin, 32

Diklorometana, 37

DMAPP, 19, 20

DMSO, 38, 71, 87

E

Ekstraksi, vii, 37, 39, 43, 46, 105

Elusidasi, vii, 67, 85

Esensial, 3

Etanol, 37

Etil asetat, 37

F

Farmakognosi, 5

Farmakologi, vii, 43

Fase terbalik, 108

Fenil propanoid, 26

Fenolik, 33

Flavonoid, 33, 99

Fraksinasi, vii, 48, 49, 54, 55,

106

Friedrich Sertuner, 6

G

Geseran kimia, 86, 98

Glukosa, 11

Glukosinolat, 10

Gnetum gnemon, 42

H

Heksan, 48

Hit, 106

HKSA, 12, 109

HMBC, 88, 91, 92, 93, 94, 96,

99, 100, 107, 108

HMQC, 88, 91, 92, 93, 96, 100,

107, 108


HTS, 40

Hyphenated, 106

I

Infra merah, 84

IPP, 19, 20, 106

Isopren, 19, 20, 21, 94

K

Kapsisin, 33

Kloroform, 37, 48, 87, 90

Kokain, 6

Kromatografi, 36, 44, 48, 52,

54, 55, 56, 60, 63, 81, 106

Kurkumin, 32

L

Lead, 107

Liofilisasi, 46, 50, 51, 52

Lovastatin, 1

M

Makromolekul, 2, 7

Metabolit primer, 3, 11

Metabolit sekunder, 3, 13, 105

Mikromolekul, 2, 107

Minyak atsiri, 20, 33

Morfin, 6

MPLC, 58, 60, 63

N

Neurotransmitter, 30

Nikotin, 6

NOE, 85, 87, 88, 91, 96, 97,

107, 108

NOESY, 85, 88, 91, 96

O

ODS (Okta Desil Silika), 54

Ornitin, 29

Orto, 108

P

Para, 52, 53, 100

Partisi, 48, 49, 50, 108

Pengentalan, 50

Pengeringan, 50, 51

Polar, vii, 80, 81

Poliketida, 108

Prekursor, 13

Produk, 2, 13, 63

Propolis, 46

Q

QSAR, 12, 109

R

Rasemis, 8

Refraktive index, 82

Replikasi, 42, 72

Resveratrol, 26

S

Saponin, 32, 33

Sephadex, 53, 55, 64, 65, 82,

109

Silan, 92

Skualen, 19

Starting material, 13, 105, 106


Statin, 1

Steroid, 33

Struktur, vii, 12, 55, 75, 82, 85,

99, 109

Syzygium, 26, 103

T

Taksol, 4, 13

Tanin, 66

Terpenoid, 19, 20, 22, 109

Tetra metil silan, 109

Tetrahidrokanabinoid, 31

U

Ursolat, 19, 23

V

Vanilin, 23

Vinblastin, 1

X

Xantor, 40, 45


BIODATA PENULIS

Azis Saifudin, PhD, Apt. Lahir pada 12 Januari 1978 di Karanganyar

wilayah karesidenan Surakarta Jawa Tengah. Ia memperoleh sarjana

farmasi dan apoteker dari UGM tahun 2001 dan 2002. Tahun 2006

ia mampir Universitas Leiden Belanda belajar program master

dengan beasiswa pemerintah Belanda (Stuned). Pada tahun 2013 ia

mendapatkan gelar PhD dari Institute of Natural Medicine

Universitas Toyama, Jepang dengan predikat wisuda honorable

mention. Ia menempuh S3 melalui beasiswa pemerintah RI pada era

presiden SBY. Sejak mahasiswa S1 ia telah terinspirasi untuk

mempelajari senyawa alam yang merupakan induk dari obat

modern. Sehingga sejak S1 hingga S3 ia membuat tesis dan desertasi

terkait dengan metabolit sekunder (farmakognosi). Dari bahan-

bahan jamu, ia sudah memurnikan lebih dari 70 senyawa dan

termasuk 16 senyawa baru. Karya monumentalnya adalah ia

menemukan senyawa marker penghambat protein tirosine 1B

fosfatase (PTP1B) dari tanaman asli Indonesia daun salam

(Szyzygium polyanthum) yang telah dipublikasikan di jurnal

internasional Planta Medica. Selain itu ia telah menerbitkan beberapa

karyanya di jurnal internasional Jurnal of Natural Products, Natural

Products Communication, dan Journal of Natural Medicines. Ia

memiliki interes pada farmakognosi pengembangan metode analisis

untuk kontrol kualitas bahan baku jamu, ekstraksi, fraksinasi, dan

purifikasi dengan sistem kromatografi fase terbalik-normal,

kromatografi eksklusi, operasi NMR (nuclear magnetic resonance),

serta pengembangan bioassay in vitro terutama berbasis kultur sel

dan enzim. Buku ini adalah buku kedua yang ia tulis. Buku

sebelumnya berjudul,”Standardisasi Bahan Obat Alam”.


Documents

SENYAWA ALAM - ebook.library.ums.ac.idebook.library.ums.ac.id/Farmasi/Senyawa_Alam_Metabolit_Sekunder... · Metabolit sekunder adalah senyawa yang disintesis oleh ... Golongan metabolit