Artabgrenzung bei Wasserfroschen 127

Literature

LAMBERT, J.; GERY, J., 1967: Poissons du Bassin de 1'Ivindo. Part 111. Le Genre Aphyosemion.

SCHEEL, J. J., 1968 a: Rivulins of the Old World. T.F.H. Publ. USA. - 1968 b: A new species of Aphyosemion (Cyprinodontidae, Pisces) from Fernando Poo.

Rev. 2001. Bot. Afr. 78. - 1972: Rivuline Studies (in press).

Author's address: J. J. SCHEEL, Danmarks Akvarium, Charlottenlund, Denmark

Rev. Biol. Gabonica 3 (4).

I . Zoologisches Institut der Universitat Wien Vorstand: Univ.-Prof. Dr. Friedrich Schaller

Serologische und morphologische Untersuchungen zur Frage der Artabgrenzung bei Wasserfroschen aus der

Umgebung von Mainz (Rhein-Main-Gebiet)

Von HEINZ G. TUNNER

Mit 4 Abbildungen

Eingegangen am 15. Dezember 1971

Einleitung

Im Anschlui3 an eine vergleichende elektrophoretische Untersuchung der Serumeiweifle einheimischer Wasserfrosche ist die Frage aufgetaucht, ob die im Rhein-Main-Gebiet vorkommenden Griinfrosche alle zu einer Art zu zahlen sind oder nicht.

Nach MERTENS (1949) ist der Wasserfrosch (Rana esculenta) im Rhein-Main-Gebiet iiberall anzutreffen und . . . in seinen auderen Erscheinungen recht veranderlich." Hier erwahnt MERTENS auch, da8 der Wasserfrosch in diesem Gebiet nimt selten in der Form auftritt, ,, . . ,die von den alteren Herpetologen als besondere Unterart (lessonae) aufgefadt worden ist". In der Folge wird aber dieser Form der systematische Wert einer Unterart n i h t zuerkannt. Nach den in den letzten Jahren durmgefuhrten Kreuzungsexperimenten, den morphologisden und karyologischen Untersuchungen, sowie der Analyse der Serumeiweide (BERGER 1967, 1968, 1970; GUNTHER 1969, 1970; TUNNER 1970) spricht alles dafur, dad innerhalb der Wasserfrosche im europaischen Raum 3 Arten zu unterscheiden sind: Rana ridibunda Pallas, Rana lessonae Carnerano und Rana esculenta LinnC. (Auf die Hybridnatur von Rana esculenta, die sich aus den oben zitierten Arbeiten von BERGER, GUNTHER und TUNNER ergeben hat, sol1 in der vor- liegenden Untersuchung nicht eingegangen werden.)

Z. zool. Sysr. Evolut.-forsh. 10 (1972) 127-132 @ 1972 Verlag Paul Parey, Hamburg und Berlin

128 H . G . Tunner

Material, Fundorte und Methode

Irn Spatsornmer 1970 war Gelegenheit, in der Umgebung von Mainz aus 10 verschiedenen Fundorten insgesamt 74 Wasserfrosche zu samrneln und diese auf ihr Serurneiweihuster und die rnorphologischen Merkmale hin zu untersuchen.

Irn folgenden werden die einzelnen Fundorte, die Anzahl der darin gesarnrnelten In- dividuen, sowie die sich durch die Untersuchung ergebende Artbestimrnung der Frosche an- gegeben: 1.) An 4 Stellen des Naturschutzgebietes Kiihkopf: a) Reichertsinsel: 2 R. lessonae (9, $), 14.R. esculenta (1299, 2 $ $ , b) Seitenarm des nordlichen Altrheins, der den kleinen Kiihkopf einschliefit: 1 R. lessonae (b) , 7 R. esculenta ( 5 9 9 , 2 8 $), c ) Kronkesinsel: 7 R. lessonae ( 7 9 9 ) , 1 R. esculenta (Y), d) Neurhein, etwas nordlich vorn Park latz Neurheinfahre: 2 R. esculenta ( 2 9 9 ; 2. Gustavsburg (Kana1 z.Altrhein): 2 R.esculenta (!,$); 3.) Nonnenau. 4 R. lessonae ( 2 9 4 , 2$9), 3 R . esculenta ($2, 2 8 8); 4.) Bauschheim: 6 ridibunda (699); 9 R. esculenta ( 5 9 9 , 4 $ 8 ) ; 5.) Ginsheim (Altrhein): 8 R. esculenta (899); 6.) Gensingen (Kiesgruben): 1 R. ridibunda (d), 6 R. esculenta (399, 3 $ 8); 7.) Niederhausen (Dorf- weiher): 1 R. esculenta (8).

Die Gewinnung des Serums erfolgte wieder durch direktes Anstechen des Ventrikels und anschlieflendes Zentrifugieren des gewonnenen Blutes (vergl. TUNNER 1970). Hier ist zu er- wahnen, dai3 bei Froschen, die langere Zeit ohne Nahrung in Gefangenschaft gehalten werden, die Blutmenge gegeniiber frischgefangenen Tieren von gleicher Kopf-Rurnpf-Lange geringer ist. Ein darauf zuriickzufiihrender Unterschied in Zahl oder Lage der Proteinfraktionen auf den Pherogramrnen ist nicht nachweisbar. Die relative Konzentration der Eiweinfraktionen diirfte sich aber bei langerer Gefangenschaft verandern.

Die Serumeiweige wurden auf einern 15gigen Trenngel, bei Verwendung eines 2,5%igen Sarnmelgels in einer Vertikal-Elektrophorese-Kammer getrennt. Eine ausfiihrliche Beshreibung dieser Methode sowie der Gel- bzw. Pufferzusammensetzung liegt von EBERMANN und BODEN- SEHER (1968) vor.

Die Serumproteine

Die Analyse der Serumproteine zahlreicher vorwiegend in ostlichen Gebieten (Donau bei Wien, Neusiedlersee, westliche CSSR, Jugoslawien, Westanatolien) gelegenen Wasserfroschpopulationen hat gezeigt, dai3 jede der 3 Rana-Arten ein durchaus charak- teristisches SerumeiweiBmuster aufweist. Diese typischen EiweiBbilder sind mit S-Typ (= Serum-Typ) 1 fur R. lessonae, mit S-Typ 2 fur R. ridibunda und mit S-Typ 3 oder S-Typ 4 fur R. esculenta bezeichnet worden.

5 homologe Proteine dienten als Grundlage bei der Erstellung dieser 4 S-Typen, wobei die auffallendsten Unterschiede in den Pherogrammen der 3 Grunfrosch-Arten im Albumin aufscheinen; R. ridibwnda und R. lessonae besitzen nur eine Albuminfrak- tion, R. esculenta hingegen immer eine Doppelfraktion, deren Phasen entweder eng beisammen liegen oder scharf voneinander getrennt erscheinen. Demnach treten bei R. esculenta 2 verschiedene S-Typen auf, die durch die unterschiedliche Lage der beiden Albumine gekennzeichnet sind. Die beiden eng beisammenliegenden Albuminphasen charakterisieren den S-Typ 3 (Albumin A14, die deutlich getrennten Fraktionen den S-Typ 4 (Albumin &3), (TUNNER 1970).

Die unter den vollkommen gleichen Bedingungen (auf Polyacrylamid in einer verti- kalen Elektrophorese-Apparatur bei gleicher Gel- bzw. Pufferzusammensetzung) ge- trennten Serumproteine der Frosche aus dem Rhein-Main-Gebiet stimmen nun im Albumin und in den anderen homologen Proteinen weitgehend mit den Serumbildern der Frosche aus den schon bearbeiteten ostlichen Fundorten iiberein. Auch die charak- teristische Albuminverdopplung findet sich bei den rhein-mainischen Froschen aus-

1 Herrn CHRISTOPH KRAPP danke ich sehr herzlich fur die aktive Mithilfe beim Fang der Frosche.

Artabgrenzung bei Wasserfroschen 129

nahmslos bei den nach den morphologischen Merkmalen als R. esculenta erkannten In- dividuen (Abb. 2, Ale). Allerdings konnte kein esculenta-Individuum gefunden wer- den, bei dem die beiden Albuminphasen in der oben erwahnten scharf getrennten Form (Ala) auftreten. In den ostlichen Populationen sind die beiden S-Typen von R. esculen- ta ungefahr gleich haufig verteilt und das Auftreten der einen oder anderen Albumin- verdopplung ist in keiner Weise am Phanotyp der Frosche erkennbar. (Wie es uber- haupt zur Entstehung der beiden Albuminphasen kommt, die mit Sicherheit auf die Hybridnatur von R. esculenta zuruckzufuhren ist, und wie moglicherweise das

\

0 A12 +

-6

7 c12 - 0 - €

t 1 2 3 1 2 3

Serum-Typ Serum-Typ

Abb. 1 (links). Fotografiscfic Darstellung der 3 SerumeiweiStypen: S-Typ 1, Rana lessonae; S-Typ 2, Rana ridibwnda; S-Typ 3 Rana esculenta - Abb. 2 (rechts). Grafiscfie Darstellung nach Abb. 1, mit den homologen EiweiSfraktionen A, B, C, D und E, sowie der Fraktion a

Fehlen eines der beiden Verdopplungstypen zu erklaren ist, wird sehr wahrscheinlich die in Arbeit befindliche Analyse der Albumine experimentell erzielter Bastarde zwi- schen den 3 Grunfrosch-Arten zeigen.) Die Albumine von R. ridibunda und R. lessonae sind auch bei den Rhein-Main-Froschen einfach und zeigen im Pherogramm geringe Lageunterschiede; das Albumin von R. lessonae liegt der Anode am nachsten. Aui3er- dem ist der S-Typ 1 gegeniiber den anderen Serumbildern durch ein starker konzen- triertes Band (Abb. 1, u ) gekennzeichnet.

Nach den Ergebnissen der Autoren FLINTH, HEMMER und JAEGER (1968) sollen R. ridibunda und R. esculenta jdentische Proteinfraktionen" besitzen. Diese Befunde stimmen mit dem hier vorliegenden Untersuchungsergebnis nicht iiberein, und es erhebt sich zunachst die Frage nach Brauchbarkeit und Aussagekraft der von den verschie- denen Autoren verwendeten elektrophoretischen Trennverfahren.

Allgemein anerkannt ist, dai3 der elektrophoretische Trenneffekt auf dem synthe- tischen Polyacrylamid bei Anwendung eines diskontinuierlichen Trennsystems besser ist als auf Papier, Starke oder Zelluloseazetat. PAULOV und KMETOVA (1964) trennten beispielsweise die Seren von R. esculenta und R. ridibunda papierelektrophoretisch nur in 4 eng beisammenliegende Fraktionen. Mit der Cellogel-Elektrophorese haben FLINTH, HEMMER und JAEGER (1968) bei den gleichen Arten 9 Fraktionen nachweisen konnen. Auf Polyacrylamid lassen sich die Grunfrosch-Seren in bis zu 25 Fraktionen zerlegen.

130 H . G. Tunner

Die Cellogel-Elektrophorese hat offensichtlich einen zu geringen Trenneffekt, um die Unterschiede in den Seren der 3 nahverwandten Arten deutlich zu machen. Vor allem die sicher geringen Struktur- bzw. Ladeunterschiede der beiden Albuminphasen im S-Typ 3 (Ale) durften auf Polyacrylamid no& am besten sichtbar zu machen sein. Es erscheint demnach fraglich, ob die Papier- oder Cellogel-Elektrophorese zur Auf- klarung dieses systernatischen Problems, das sich um das Artniveau bewegt, iiberhaupt geeignet ist.

Die Vertikal-Elektrophorese auf Polyacrylamid als Tragermaterial diirfte wegen des hohen Trenneffekts und der direkten Vergleichbarkeit der einzelnen Eiweifle zur Zeit die brauchbarste Methode sein, systematische Probleme an nahverwandten Arten zu studieren.

Die morphologischen Merkmale ' 7-10 Tage nach dem Fang wurden an den mit Ather betaubten Tieren folgende Werte ermittelt: 1. Kopf-Rumpf-Lange, KRL, (gemessen von der Schnauzenspitze bis zum Ende des 0 s coccygis). 2. Tibialange, TL, (die rechte Tibia). 3. Lange des Fersenhockers, HL, (Callus internus).

Die fur die jeweilige Art charakteristischen Regressionsgeraden der beiden Merk- malspaare KRL - TL und TL - H L wurden nach KREYSZIG (1970) berechnet und sind in Fig. 1 und Fig. 2 dargestellt. Die Lage der Ausgleichsgeraden im Streudiagramm fur

Abb. 3. Verlauf der Regressionsgeraden fur das Merkmalspaar Kopf-Rumpf-Lange (Abszisse) / Tibialange (Ordinate). Rana esculenta, + Rana ridibunda und 0 Rana lessonae

das Merkmalspaar KRL-TL laflt zunachst vermuten, dai3 sich auch im Rhein-Main- Gebiet die 3 Ram-Arten nach den angegebenen morphologischen Merkmalen unter- scheiden; das rnuflte bedeuten, dai3 die 3 Anstiege gleich (d. h. bei der Abtestung nicht signifikant), jedoch die Nullpunktabstande verschieden sind (d. h. bei der Abtestung signifikant). Die varianzanalytische Abtestung (nach MATHER 195 1) der 3 Anstiege gemeinsam, sowie der 3 Nullpunktabstande gemeinsam fur das Merkmalspaar KRL - TL ergibt bei einem kritischen Wert von 2,01 im Sinne der Annahme ein nichtsignifi- kantes Ergebnis fur die Anstiege, sowie ein signifikantes fur die Nullpunktabstande.

* W. und J. BREINBAUER danke ich fur die Hilfe bei den statistischen Berechnungen.

Artabgrenzung bei Wasserfroschen 131

Bei der analogen Auswertung von HL - TL (Fig. 2) ergibt sich bei einem kritischen Wert von 2,68 (das entspricht einer Irrturnswahrscheinlichkeit a von 1 %) fur die An- stiege ebenfalls ein nichtsignifikantes, bzw. fur die Nullpunktabstande ein signifikantes Ergebnis.

Zusatzlich ist bei der morphologischen Bestirnmung der Frosche auch die Form des Fersenhockers und die Farbung beriicksichtigt worden. Die Hochwolbung des Meta- tarsaltuberkels, die besonders fur R. lessonae typisch ist, in einer Mai3zahl auszu- drucken, war nicht moglich, da bei R. esculenta der Hocker oft stark asymrnetrisch ist (vergl. d a m BERGER). Was die Farbung betrifft, so erscheinen bei R. lessonae die beiden

Abb. 4. Verlauf der Regressionsgeraden fur das Merkmalspaar Fersenhockerlange (Abszisse) / Tibialange (Ordinate). Rana esculenta, + Rana ridibunda und 0 Rana lessonae

dorsalen Driisenleisten haufig in sehr schonern Goldgelb und heben sich deutlich von der griinen oder seltener braunen Grundfarbung ab. Bei R. ridibunda fie1 auf, dai3 die Innenseiten der Oberschenkel, auf denen sich die dunkle Marmorierung abzeichnet, eine leicht gelbliche Grundfarbung zeigen. In der Regel sol1 diese Farbung - allerdings extremer ausgebildet - nur bei R. esculenta und R. lessonae auftreten. GUNTHER (1968) schreibt, dai3 ,, . . . an Stelle der gelben Farbe. . . bei Rana ridibunda eine grunliche oder grauweiae, selten gelbliche Farbung zu bemerken (ist) . . . In Populationen der Umgebung von Wien finden sich auch gelegentlich ridibunda-Exemplare, deren Ober- schenkelfarbung leicht an die der beiden anderen Arten erinnert.

Zusammenfassung

Mit der vorliegenden Untersuchung ist die Frage nach der Artzugehorigkeit von Grunfroschen aus der Umgebung von Mainz (Rhein-Main-Gebiet) gepruft worden.

D a m wurden die Seren von 74 Wasserfroschen polyacrylamidgelektrophoretisch getrennt. Nach dem SerumeiweiBmuster unterscheiden sich auch in diesem Raum Rana ridibunda, Rana lessonae und Rana esculenta.

Zur Prufung der Artabgrenzung nach den morphologischen Merkmalen wurden fur die Merkmalspaare Kopf-Rumpf-Lange/Tibialange, sowie Tibialange/Fersenhockerlange die Re- gressionsgeraden der ridibunda-, lessonae- und esculenta-Individuen errechnet und die Anstiege sowie Nullpunktabstande varianzanalytisch abgetestet. Dabei ergaben sich fur den Verlauf der 3 Geraden aus Kopf-Rumpf-Lange/Tibialange und TibialangelFersenhockerlange signifikante Unterschiede.

Summary Serological and morphological data on species determination of green frogs

of the Mainz area (Rhein-Main) The objective of the present analysis was to clarify the question of species of green frogs origining from the area of Mainz (Rhein-Main).

132 H. G. Tunner

For this purpose, the sera of 74 green frogs were separated by means of polyacrylamid- gelelectrophoresis. Here, too, the serum protein patterns show differences between Rana ridibunda, Rana lessonae and Rana esculenta.

In order to determine a species by means of morphological charateristics, the regression of ridibunda- lessonae- escualenta-individuals was computed for the characteristic pairs such as body lengthhibia length and tibia lengthllength of the internal metatarsal tubercle and both the inclination of the lines plus the intercept on the axes were countertested by an analysis of variance. Thus, significant differences were shown between the courses of the three lines of body length/tibia length and tibia length/length of the internal metatarsal tubercle.

RCsumC Contribution ci la question des limites d’isphces chez les grenouilles vertes des environs Mainz

(rhgion Rhein-Main) par une Ctude serologique et morphologique Ce travail presente une analyse du probleme de I’appartenance d’ispece des grenouilles vertes region Mainz (Rhein-Main) et environs.

Les Proteines siriques de 74 grenouilles vertes furent CtudiCs par I’ilectrophorhse en gel de polyacrylamide. D’apris les spectres du proteine sCrique on peut, la aussi, faire une distinction entre: Rana ridibunda, Rana lessonae et Rana esculenta.

D’aprhs les paires de marques distinctives longueur tfte-tronc / longueur du tibia, ainsi que longueur du tibia / longueur du callus internus, on entreprlt une determination morphologique et on put calculer les droites de regression; les pentes et les distances des droites du point zero du repere furent CtudiCs par une analyse des variations. Ainsi, on put remarquer des differences marquantes du point de vue statistique pour le parcours de la droite longueur tfte-tronc/ longueur du tibia et longueur tibia / longueur du callus internus.

Literatur

BERGER, L., 1967: Embryonal and larval development of F1 generation of green frogs of

- 1968: Morphology of the F1 generation of various crosses within Rana esculenta-complex.

- 1970: Some characteristics of the crosses within Rana esculenta complex in postlarval

EBERMANN, R.; BODENSEHER, H., 1968: Bestimmung der Transferrintypen bei Rindern durch

FLINDT, R.; HEMMER, H.; JAEGER, R., 1968 : Das SerumeiweiRbild mitteleuropaischer Anuren.

GUNTHER, R., 1968 : Morphologische und okologische Untersuchungen von Rana esculenta L.

- 1969: Paarungsrufe und reproduktive Isolationsmechanismen bei europaischen Anuren der

- 1970: Der Karyotyp von Rana ridibunda PALL. und das Vorkommen von Triploidie bei

KREYSZIG, E., 1970: Statistische Methoden und ihre Anwendung. Vandenhoedc & Ruprecht,

MATHER, K., 1951 : Statistical Analysis in Biology. London. MERTENS, R., 1947: Die Lurche und Kriechtiere des Rhein-Main-Gebietes. Frankfurt. PAULOV, S.; KMETOVA, S., 1964: Notes on identification of the serum protein spectrum in frogs

TUNNER, H. G., 1970: Das SerumeiweiBbild einheimischer Wasserfrosche und der Hybrid-

different combinations. Acta 2001. Cracov, 12, 123-160.

Acta 2001. Cracov, 13, 301-327.

development. Ann. 2001. Warszawa, 27, 374-416.

vertikale Polyacrylamid-Elektrophorese. Experientia, 24, 523-524.

2001. Jb. Physiol., 74, 155-163.

und Rana ridibunda PALL. 2001. Jb. Syst., 95, 229-264.

Gattung Rana (Amphibia). Forma et functio, 1, 263-284.

Rana esculenta L. (Anura, Amphibia). Biol. Zbl. 89, 327-342.

Gottingen.

(Family Ranidae). Folia Biologica Praha, 10, 155-156.

charakter von Rana esculenta. Verh. Dtsch. 2001. Ges., 352-358.

Anschrift des Verfassers: Dr. HEINZ G. TUNNER, I. Zoologisches Institut der Universitat Wien, lOlO-Wien, Dr.-Karl-Lueger-Ring 1