Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
EE - EP1664122 B1
Terapeutilised humaniseeritud antikehad CD45 isovormide vastu
TEHNIKAVALDKOND
Antud leiutises käsitletakse orgaanilisi ühendeid, et siduda molekule CD45
antigeeni isovormide vastu, näiteks monokloonsete antikehade vastu, ning nende
ühendite kasutamist. 5
TEHNIKA TASE
Leiutise teostusnäidetes käsitletakse muuhulgas erinevate haiguste ravi, mille
eesmärk on kõrvaldada või inaktiveerida patogeensed leukotsüüdid, ja võimalusel
indutseerida tolerantsus, et inaktiveerida patoloogilised immuunvastused.
Elundi, rakkude ja koe siirdamisele järgnev organismipoolne äratõukereaktsioon ja 10
mitmed autoimmuunhaigused on arvatavalt peaasjalikult tingitud T-raku
vahendatud immuunvastusest, mille käivitavad T-abistajarakud, mis tunnevad ära
spetsiifilised antigeenid, mis seejärel kinni püütakse, töödeldakse ja esitatakse T-
abistajarakkudele antigeeni esitava rakkude (APC), näiteks makrofaagide ja
dendriitrakkude poolt antigeen-MHC kompleksi kujul, s.o T-abistajarakku, kui see 15
tunneb ära spetsiifilised antigeenid, stimuleeritakse tootma tsütokiine, näiteks IL-2,
ja ekspresseerima või üles reguleerima tsütokiini retseptoreid ja muid
aktiveerimise molekule, ning seeläbi prolifereeruma. Mõned neist aktiveeritud T-
abistajarakkudest võivad toimida otse või kaudselt, s.o assisteerides efektori
tsütotoksilisi T-rakke või B-rakke, et hävitada rakke või kudesid, mis 20
ekspresseerivad valitud antigeeni. Pärast immuunvastuste lõppemist võivad teatud
küpsed klooniliselt valitud rakud jääda mälu aitavateks ja mälu tsütotoksilisteks T-
rakkudeks, mis ringlevad kehas ja tunnevad kiiresti ära vastava antigeeni, kui see
peaks taas ilmuma. Kui seda vastust käivitav antigeen on ohutu antigeen, on
tulemuseks allergia, kui antigeen ei ole aga võõrantigeen, vaid oma-antigeen, võib 25
tulemuseks olla autoimmuunhaigus; kui antigeeniks on siirdatud elundist pärinev
antigeen, võib tulemuseks olla transplantaadi äratõukereaktsioon.
Immuunsüsteem on arenenud selliselt, et on võimeline eristama oma ja mitte-oma.
See omadus võimaldab organismil jääda ellu keskkonnas, kus puututakse
EE - EP1664122 B1 2
igapäevaselt kokku patogeenidega. Selline spetsiifilisus mitte-oma suhtes ja
tolerants oma suhtes tekib T-rakkude välja kujunemisel harkelundis positiivse ja
negatiivse valiku protsesside kaudu, mis hõlmab samuti autoreaktiivsete T-
rakkude ära tundmist ja kõrvaldamist. Sellist tolerantsi tüüpi nimetatakse
tsentraalseks tolerantsiks. Ent mõned neist autoreaktiivsetest rakkudest pääsevad 5
sellest selektiivsest mehhanismist ja kujutavad endast potentsiaalset ohtu
autoimmuunhaiguste välja kujunemisel. Et kontrollida autoreaktiivseid T-rakke, mis
on pääsenud perifeeriasse, on immuunsüsteemil perifeersed reguleerivad
mehhanismid, mis kaitsevad organismi autoimmuunsuse eest. Need mehhanismid
on perifeerse tolerantsi aluseks. 10
Rakupinna antigeenid, mille tunnevad ära spetsiifilised monokloonsed antikehad,
on märgitud üldise CD (diferentseerumisklastri) numbriga, mis on määratud
järjestikustes rahvusvahelistes leukotsüüdialastes töötubades, ning käesolevas
kasutatud termin CD45 tähendab rakupinna leukotsüüti tavalist antigeeni CD45;
ning selle antigeeni monokloonne antikeha kannab vastavalt nimetust „anti-CD45“. 15
Antikehad, mis on suunatud leukotsüüdi tavalise antigeeni (LCA) või CD45 vastu,
on anti-lümfotsüüdi globuliini (ALG) põhikomponendiks. CD45 kuulub
transmembraansete türosiinfosfataaside perekonda ja on raku aktiveerimise
seisukohalt nii positiivne kui ka negatiivne reguleerija, sõltuvalt retseptori
vastastoimest. CD45 fosfataasi aktiivsust on tarvis, et aktiveerida Src perekonna 20
kinaasid, mis seostatakse B ja T lümfotsüütide antigeeni retseptoritega
(Trowbridge IS et al, Annu Rev Immunol. 1994; 12:85-116). See on CD45 T-raku
aktiveerimisel hädavajalik signaali 1 suhtes ning CD45-puudulikel rakkudel
ilmnevad tõsised puudused TCR-vahendatud aktiveerimistel.
CD45 antigeen esineb erinevates isovormides, hõlmates transmembraansete 25
glükoproteiinide perekonda. CD45 mitmed isovormid erinevad oma rakuvälise
domääni struktuuri poolest, mis on tingitud kolme varieeruva eksoni alternatiivsest
splaissimisest, mis kodeerivad osa CD45 rakuvälisest piirkonnast (Streuli MF. et
al, J. Exp. Med. 1987; 166: 1548-1566). CD45 erinevatel isovormidel on erinevad
rakuvälised domäänid, aga samad transmembraansed ja tsütoplasma segmendid, 30
millel on kaks homoloogset, äärmiselt konserveerunud fosfataasi domääni, mis
koosnevad ligikaudu 300 jäägist. Erinevaid isovormi kombinatsioone
EE - EP1664122 B1 3
ekspresseeritakse T- ja B-lümfotsüütide alampopulatsioonides (Thomas ML. et al,
Immunol. Today 1988; 9:320-325). Teatud monokloonsed antikehad tunnevad ära
epitoobi, mis on ühine kõigile neile erinevatele isovormidele, samal ajal kui teistel
monokloonsetel antikehadel on piiratud (CD45R) spetsiifilisus, mis sõltub sellest,
millist alternatiivselt splaissitud eksonitest (A, B või C) nad ära tunnevad. Näiteks 5
kannavad monokloonsed antikehad, mis tunnevad ära ekson A saaduse,
märgistust CD45RA, ning need, mis tunnevad ära erinevad ekson B sisaldavad
isovormid, kannavad märgistust CD45RB (Beverley PCL et al, Immunol. Supp.
1988; I:3-5). Antikehad, näiteks UCHL1, mis seostuvad selektiivselt 180 kDa
isovormiga CD45RO (ilma varieeruvate eksoniteta A, B või C), mis näib piirduvat 10
aktiveeritud T-rakkude allrühmaga, mälurakkudega ja kortikaalsete
tümotsüütidega, ja mida ei deleteerita B-rakkudel (Terry LA et al, Immunol. 1988;
64:331-336).
WO 2002/072832 käsitleb monokloonseid antikehi (mAbs), mis on spetsiifilised
epitoobi suhtes nii CD45RB kui ka CD45RO antikehadel, nende kasutamist ravis 15
autoimmuunhaiguste ja transplantaatide äratõukereaktsioonide korral.
Inimese antikeha varieeruv raske domään võib olla N-glükosüülitud (Dunn-Walters
D. et al, Molecular Immunology 2000; 37:107-113). Somaatilise
hüpermutatsiooniga kaasneb valdavalt ühe nukleotiidi asendus varieeruva
piirkonna geenides, et tõsta immuunglobuliini varieeruvust. 20
On teada, et N-glükosilatsioon varieeruvas piirkonnas mõjutab antigeeni sidumist.
Siiski on teada, et aglükosüülitud monokloonsed antikehad kaotavad bioloogilist
funktsiooni säilitades igal glükosüülimisel oma negatiivseid kõrvaltoimeid (Friends
P. et al, Transplantation 1999, 68; 1632-1687)
JOONISTE LOETELU 25
Joonisel fig. 1 on kujutatud, et primaarse MLR inhibeerimine „kandidaat
monokloonse antikeha poolt on doosist sõltuv vahemikus 0,001 kuni 10 µg/ml.
„Kontsentratsioon“ on „kandidaat monokloonse antikeha“ kontsentratsioon.
EE - EP1664122 B1 4
Joonisel fig. 2 on kujutatud ekspressioonivektori HCMV-G1 HuA6-VHQ plasmiidi
plaani, mis hõlmab rasket ahela nukleotiidijärjestusega SEQ ID nr: 12 (3921-4274)
täieliku ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 15.
Joonisel fig. 3 on kujutatud ekspressioonivektori HCMV-G1 HuA6-VHE plasmiidi
plaani, mis hõlmab rasket ahelat, millel on nukleotiidijärjestus SEQ ID nr: 11 5
(3921-4274) täieliku ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 16.
Joonisel fig. 4 on kujutatud ekspressioonivektori HCMV-K HuAb-VL1 humV1
plasmiidi plaani nukleotiidijärjestusega SEQ ID nr: 14 (3964-4284) täieliku
ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 17.
Joonisel fig. 5 on kujutatud ekspressioonivektori HCMV-K HuAb-VL1 humV2 10
plasmiidi plaani nukleotiidijärjestusega SEQ ID nr: 13 (3926-4246) täieliku
ekspressioonivektori nukleotiidjärjestuses SEQ ID nr: 18.
Joonisel fig. 6 on kujutatud ekspressioonivektori LCVL1SP20 plasmiidi plaani,
mille kergel ahelal on nukleotiidijärjestus SEQ ID nr: 33 täieliku
ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 36. 15
Joonisel fig. 7 on kujutatud ekspressioonivektori LCVL2SP20 plasmiidi plaani,
mille kergel ahelal on nukleotiidijärjestus SEQ ID nr: 13 täieliku
ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 39.
Joonisel fig. 8 on kujutatud ekspressioonivektori HCVHEN73D Sp20 plasmiidi
plaani, mille raskel ahelal on nukleotiidijärjestus SEQ ID nr: 34 täieliku 20
ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 37.
Joonisel fig. 9 on kujutatud ekspressioonivektori HCVHQN73D Sp20 plasmiidi
plaani, mille raskel ahelal on nukleotiidijärjestus SEQ ID nr: 35 täieliku
ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 38.
Joonisel fig. 10 on kujutatud ekspressioonivektori HCVHESp20 plasmiidi plaani, 25
mille raskel ahelal on nukleotiidijärjestus SEQ ID nr: 11 täieliku
ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 40.
EE - EP1664122 B1 5
Joonisel fig. 11 on kujutatud ekspressioonivektori HCVHQSp20 plasmiidi plaani,
mille raskel ahelal on nukleotiidijärjestus SEQ ID nr: 12 täieliku
ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 41.
Joonisel fig. 12 on kujutatud VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 ja
VHQ/humV2 ning VHE/humV1 koos VHE-N73D/humV1 suurus-5
eksklusioonkromatograafiat.
Joonisel fig. 13 on kujutatud VHE/humV2, VHE/humV1, VHQ/humV2, VHQ/humV1
ning VHE/humV2 koos VHE-N73D/humV1 katioonvahetuse kromatograafiat.
Joonisel fig. 14 on kujutatud VHE/humV2 ja VHE-N73D/humV1 pöördfaasilist
kromatograafiat. 10
LEIUTISE OLEMUS
Oleme nüüd leidnud humaniseeritud antikeha, millel on sidumise spetsiifilisus nii
CD45RO kui ka CD45 RB suhtes, mis sisaldavad raske ahela varieeruvat
piirkonda SEQ ID nr: 31 või 32 ning kerge ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr:
7 või SEQ ID nr: 8. 15
Teises leiutise teostusnäites käsitletakse humaniseeritud antikeha, millel on
sidumise spetsiifilisus nii CD45RO kui ka CD45RB suhtes ning mis sisaldab:
- raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 31 ja kerge ahela varieeruvat
piirkonda SEQ ID nr: 7,
- raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 31 ja kerge ahela varieeruvat 20
piirkonda SEQ ID nr: 8,
- raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 32 ja kerge ahela varieeruvat
piirkonda SEQ ID nr: 7
- raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 32 ja kerge ahela varieeruvat
piirkonda SEQ ID nr: 8. 25
CD45RB/RO humaniseeritud antikeha võib samuti pärssida põletikulist protsessi,
mis vahendab inimese naha äratõukereaktsiooni. Lisaks on leitud, et CD45RO/RB
humaniseeritud antikeha võib pärssida põletikulist protsessi, mis vahendab
inimese naha transplantaadi äratõukereaktsiooni, suutes nimelt suruda maha
EE - EP1664122 B1 6
sellise põletikulise protsessi, mis vahendab inimese naha transplantaadi
äratõukereaktsiooni in vivo SCID hiirtel, kellele on siirdatud inimnahka ja poogitud
mononukleaarseid splenotsüüte.
Ühtlasi on leitud, et CD45RB/RO humaniseeritud antikeha võib tingida
pikemaajalise inimese saarerakkude transplantaadi elumuse, ennetades 5
transplantaadi infiltratsiooni ja inhibeerides leukotsüüdi vahendatud
äratõukereaktsiooni in vivo.
Leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikehad suudavad spetsiifiliselt siduda
CD45 antigeeni CD45RB ja CD45RO isovorme üksi või kombineerituna teiste
molekulidega. Vastav sidestamise reaktsioon on võimalik standardsetel meetoditel 10
(kvalitatiivne test), kaasa arvatud näiteks igasugused sidumistestid, näiteks
kaudne või otsene immunofluorestsents koos fluorestsents-mikroskoopia või
tsütofluoromeetriline (FACS) analüüs, ensüüm-immuunsorbtsioonmeetod (ELISA)
või radioimmuuntest, kus on võimalik visualiseerida molekuli seostumisega
rakkudega, mis ekspresseerivad teatud CD45 isovormi. Lisaks võib selle molekuli 15
sidumine tingida muutuse rakkude funktsioonis, mis neid isovorme
ekspresseerivad. Näiteks võidakse määrata primaarse või sekundaarse
kombineeritud lümfotsüüdi vastuse (MLR) inhibeerimine, kasutades selleks näiteks
in vitro testi või biotesti, et määrata primaarse või sekundaarse MLR inhibeerimine
CD45RO/RB siduva molekuli kohalolekul või puudumisel, ning tuvastades 20
erinevused primaarse MLR inhibeerimisel.
Samuti on in vitro funktsionaalseid moduleerivaid toimeid võimalik mõõta PBMC
või T-rakkude või CD4+ T-rakkude proliferatsiooni, tsütokiinide tootmise meetodil,
muutustega rakupinna molekulide ekspressioonis, näiteks pärast raku
aktiveerimist MLRis, või pärast stimuleerimist spetsiifilise antigeeniga, näiteks 25
teetanus-toksoidi või muude antigeenidega, või polükloonsete stimulaatoritega,
näiteks fütohemaglutiniiniga (PHA) või anti-CD3 ja anti-CD28 antikehadega või
forboolestritega ja Ca2+ jonofooridega. Neid söötmed valmistatakse sarnaselt
meetodiga, mida on kirjeldatud MLR puhul, välja arvatud, et allogeensete rakkude
asemel kasutatakse stimulaatoritena lahustuvaid antigeene või polükloonseid 30
stimulaatoreid, näiteks neid, mida on nimetatud eelnevas. T-rakkude
EE - EP1664122 B1 7
proliferatsiooni mõõdetakse eelistatavalt, nagu kirjeldatud eelnevas, 3H-tümidiini
abil.
Tsütokiini tootmist mõõdetakse eelistatavalt kihilises ELISA analüüsis, kus
tsütokiine haarav antikeha kaetakse pinnal 96-augulisel plaadil, lisatakse
supernatandid rakukultuuridest, ning inkubeeritakse 1 tund toatemperatuuril. 5
Seejärel lisatakse tuvastav antikeha, mis on spetsiifiline teatud tsütokiini suhtes,
ning teise etapi antikeha, mis on konjugeeritud ensüümiga, näiteks mädarõika
peroksidaas, seejärel vastav substraat, ning plaadi lugejas mõõdetakse siinkohal
vastav absorptsioon. Muutuseid rakupinna molekulides mõõdetakse eelistatavalt
otsese või kaudse immunofluorestsentsiga pärast sihtrakkude määrimist 10
antikehadega, mis on spetsiifilised teatud rakupinna molekuli suhtes. Kasutada
võidakse antikeha, mis on kas otseselt fluorokroomiga või fluorestsentsiliselt teise
etapi antikehaga märgistatud, kusjuures viimane on spetsiifiline esimese antikeha
suhtes, ning rakke analüüsitakse tsütofluorimeetriga.
Leiutise humaniseeritud antikehal on sidumise spetsiifilisus nii CD45RO kui ka 15
CD45RB („CD45RB/RO siduv molekul“) suhtes.
Eelistatavalt seob humaniseeritud antikeha CD45RO isovorme
dissotsiatsioonikonstandi (Kd) <20nM juures, eelistatavalt Kd<15nM või <10nM,
veelgi eelistatumalt Kd<5nM juures. Eelistatavalt seob humaniseeritud antikeha
CD45RB isovorme Kd<50nM juures, eelistatavalt Kd<15nM või <10nM, veelgi 20
eelistatavalt Kd<5nM juures.
Samuti käsitletakse leiutises humaniseeritud antikeha, mis seob neid CD45
isovorme, mis
1) sisaldavad CD45 molekuli A ja B epitoope, aga mitte C epitoopi; ja/või
2) sisaldavad CD45 molekuli B epitoopi, aga mitte C epitoopi; ja/või 25
3) ei sisalda CD45 molekuli A, B ega C epitoopi.
Samuti käsitletakse eelistatud teostusnäites ka sellist leiutise molekuli, mis ei seo
CD45 isovorme, milleks on
1) CD45 molekuli kõik A, B ja C epitoobid; ja/või
EE - EP1664122 B1 8
2) CD45 molekuli B ja C epitoobid, aga mitte A epitoop.
Täiendavates eelistatud teostusnäidetes suudab leiutise siduv molekul järgnevat:
1) tunneb ära mälu ja in vivo alloaktiveeritud T-rakud; ja/või
2) seob oma sihtmärgi inimese T-rakkudel, näiteks PEER rakkudel; kus nimetatud
sidumine toimub eelistatavalt Kd<15 nM juures, veelgi eelistatavamalt Kd<10 nM 5
ja kõige eelistatavamalt Kd<5 nM juures; ja/või
3) inhibeerib in vitro alloreaktiivset T-raku funktsiooni, eelistatavalt ligikaudse IC50
väärtuse juures, mis on väiksem kui 100 nM, eelistatavalt väiksem kui 50 nM või
30 nM, veelgi eelistatumalt on ligikaudne IC50 10 või 5 nM, veelgi eelistatumalt 0,5
nM või 10
isegi 0,1 nM; ja/või
4) indutseerib rakusurma apoptoosi kaudu inimese T-lümfotsüütides; ja/või
5) indutseerib alloantigeeni spetsiifilist T-raku tolerantsi in vitro; ja/või
6) ennetab letaalset ksenogeneetilist transplantaat-peremehe-vastu (GvHD)
haigust, mis on indutseeritud SCID hiirtes, süstides neile inimese PBMC, mida 15
manustatakse efektiivses koguses; ja/või
7) seob T-lümfotsüüte, monotsüüte, tüvirakke, loomulikke tapjarakke ja/või
granulotsüüte, aga mitte vereliistakuid ega B-lümfotsüüte; ja/või
8) toetav T-rakkude eristumist iseloomuliku T-regulatoorraku (Treg) fenotüübiga;
ja/või 20
9) indutseerib T-regulatoorrakke, mis suudavad pärssida looduslikku T-raku
aktivatsiooni; ja/või
10) pärsib põletikulist protsessi, mis vahendab inimese naha transplantaadi
äratõukereaktsiooni, pärssides nimelt põletikulist protsessi, mis vahendab inimese
naha transplantaadi äratõukereaktsiooni in vivo SCID hiirtel, kellele on siirdatud 25
inimese nahka ja poogitud mononukleaarseid splenotsüüte; ja/või
11) pikendab inimese saarerakkude transplantaadi elumust hu-PBL-NOD/SCID
hiirte mudelis.
Täiendavas eelistatud teostusnäites seob leiutise humaniseeritud antikeha sama
epitoopi kui mononukleaarne antikeha „A6", nagu kirjeldanud Aversa et al., 30
Cellular Immunology 158, 314-328 (1994).
EE - EP1664122 B1 9
Eelnevalt kirjeldatud sidumisomaduste ja bioloogiliste aktiivsuste tõttu on leiutise
humaniseeritud antikeha eriti kasulik meditsiinis, ravis ja/või profülaktikas.
Haigusteks, mille puhul leiutise humaniseeritud antikeha on eriti kasulik, on
muuhulgas autoimmuunhaigused, transplantaadi äratõukereaktsioon, dermatiit,
põletikuline soolehaigus ja/või allergiad, nagu on kirjeldatud alljärgnevas. 5
Humaniseeritud antikehad võidakse näiteks derivatiseerida antikehadest, mis
saadakse B-rakkude või hübridoomide või nende fragmentide abil, nt F(ab’)2 ja
Fab fragmendid, samuti üksiku ahela või üksiku domääni antikehad. Üksiku ahela
antikeha koosneb raskete ja kergete ahelate varieeruvatest piirkondadest, mis on
kovalentselt seotud peptiidi siduva linkeriga, koosnedes tavaliselt 10 kuni 30 10
aminohappest, eelistatavalt 15 kuni 25 aminohappest. Seega ei hõlma selline
struktuur raskete ja kergete ahelate konstantset osa, ning arvatakse, et väikese
peptiidi speisser peaks olema vähem antigeenne kui terve konstantne osa.
Humaniseeritud antikeha all mõistetakse antikeha, milles hüpervarieeruvad
piirkonnad (CDRid) on mitte-inimese (nt hiire) päritolu, ehkki kogu või sisuliselt 15
kogu muu osa, s.o konstantsed piirkonnad ja varieeruvate piirkondade äärmiselt
konserveerunud osad, on inimpäritolu. Humaniseeritud antikeha võib aga säilitada
mõned hiire järjestuse aminohapped varieeruvate piirkondade osades, mis
külgnevad hüpervarieeruvate piirkondadega.
Hüpervarieeruvad piirkonnad, s.o CDRid vastavalt antud leiutisele, võivad olla 20
seotud raamistiku piirkondadega, näiteks inimpäritolu kergete ja raskete ahelate
konstantsete osadega. Sobivaid raamistiku piirkondi on kirjeldatud näiteks:
„Sequences of proteins of immunological interest", Kabat, E.A. et al, US
Department of Health and Human services, Public Health Service, National
Institute of Health. Eelistatavalt võib inimese raske ahela konstante osa olla IgG1 25
tüüpi, kaasa arvatud alltüübid, eelistatavalt võib inimese kerge ahela konstantne
osa olla k või l tüüpi, veelgi eelistatumalt k tüüpi. Eelistatavalt hõlmab nimetatud
raske ahel mitte enam kui üht glükosüülimise saiti, kõige eelistatumalt on
glükosüülimise saidiks N-glükosüülimise sait ning kõige eelistatumalt paikneb üks
glükosüülimise sait raske ahela konstantses osas. Kõige eelistatumalt ei sisaldu 30
varieeruvas piirkonnas ühtegi glükosüülimise saiti ning eelistatavalt ei sisaldu
glükosüülimise saiti ka raamistiku piirkonnas.
EE - EP1664122 B1 10
Teises aspektis käsitletakse antud leiutises humaniseeritud antikeha, mis hõlmab
- polüpeptiidi SEQ ID nr: 31 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 7 (näiteks
VHEN73D/humV2),
- polüpeptiidi SEQ ID nr: 31 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 8 (näiteks
VHEN73D/humV1), 5
- polüpeptiidi SEQ ID nr: 32 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 7 (näiteks
VHQN73D/humV2), või
- polüpeptiidi SEQ ID nr: 32 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 8 (näiteks
VHQN73D/humV1).
„Polüpeptiid“, kui käesolevas pole täpsustatud teisiti, tähendab peptiidi või valku, 10
mis sisaldab aminohappeid, mis on üksteisega ühendatud peptiidsidemetega,
mille aminohappe järjestus algab kaugeimas N-otsas lõpeb kaugeimas C-otsas.
Leiutise polüpeptiid on monokloonne antikeha. Eelistatavalt on see
humaniseeritud (CDR-siirdatud) monokloonne antikeha. Humaniseeritud (CDR-
siirdatud) monokloonne antikeha võib, aga ei pruugi, hõlmata täiendavaid 15
mutatsioone, mis on viidud sisse aktseptori antikeha raamistikku (FR)
järjestustesse. Eelistatavalt sisaldab humaniseeritud antikeha vaid üht
glükosüülimise saiti. Kõige eelistatumalt on nimetatud üheks glükosüülimise
saidiks N-glükosüülimise sait. Kõige eelistatumalt ei sisaldu varieeruvas piirkonnas
ühtegi glükosüülimise saiti ning veelgi eelistatumalt ei sisaldu raske ahela 20
varieeruvas piirkonnas ühtegi glükosüülimise saiti, kõige eelistatumalt ei sisaldu
raamistiku piirkondades (FRid) ühtegi glükosüülimise saiti.
Termin „kovalentne modifikatsioon“ hõlmab leiutise polüpeptiidi modifikatsioone, nt
spetsiifilise järjestuse või selle fragmendi modifikatsioone orgaaniliste valkude või
mitte-valguliste derivatiseerivate ainetega, fusioone heteroloogilistes polüpeptiidi 25
järjestuses ja post-translatsioonilisi modifikatsioone. Kovalentselt modifitseeritud
polüpeptiididel, nt spetsiifilise järjestuse omadel, on endiselt võime siduda
CD45RO ja CD45RB rist-sidestades. Kovalentsed modifikatsioonid viiakse
traditsiooniliselt sisse, reageerides vastavad aminohappe jäägid orgaanilise
derivatiseeriva ainega, mis suudab reageerida valitud saitide või terminali 30
jääkidega, või rakendades post-translatsiooniliste modifikatsioonide mehhanisme,
mis funktsioneerivad valitud rekombinantsetes peremeesrakkudes. Reatud post-
EE - EP1664122 B1 11
translatsioonilised modifikatsioonid on tingitud rekombinantsete peremeesrakkude
toimest ekspresseeritud polüpeptiidile. Glutaminüüli ja asparaginüüli jäägid on
sageli post-translatsionaalselt deamideeritud vastavateks glutamüüli ja aspartüüli
jääkideks. Samuti võidakse neid jääke deamineerida kergelt happelistel
tingimustel. Teisteks post-translatsioonilisteks modifikatsioonideks on muuhulgas 5
proliini ja lüsiini hüdroksüülimine, serüüli, türosiini või treonüüli jääkide hüdroksüüli
rühmade fosforüülimine, lüsiini, arginiini ja histidiini külgahelate α-amino rühmade
metüülimine, vaat nt T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties,
W. H. Freeman & Co., San Francisco, lk 79-86 (1983). Kovalentseteks
modifikatsioonideks on näiteks fusioonproteiinid, mis sisaldavad leiutise 10
polüpeptiidi, näiteks spetsiifilise järjestusega, ja nende aminohappelise järjestuse
variante, näiteks immunoadhesiinid ja N-otsa fusioonid heteroloogilistes
signaaljärjestuses.
„Aminohapped“ tähendab kõiki looduses esinevaid L-α-aminohappeid, näiteks D-
aminohapped. Aminohapped on identifitseeritud kas hästi teada ühetäheliste või 15
kolmetäheliste märgistustega.
Termin „aminohappelise järjestuse variant“ tähistab molekule, mis erinevad oma
aminohappelise järjestuse poolest teistest leiutise polüpeptiididest, nt spetsiifilise
järjestuse poolest. Leiutise polüpeptiidi aminohappelise järjestuse variantidel,
näiteks spetsiifilise järjestusega variantidel, on siiski võime siduda CD45RO ja 20
CD45RB. Asenduslikud variandid on need, mille polüpeptiidist on vähemalt üks
aminohappe jääk eemaldatud ja selle asemele sisestatud teine aminohape, nt
spetsiifilise järjestusega aminohape. Need asendused võivad olla üksikud, kus
vaid üks aminohape on molekulis asendatud, või mitmed, kus kaks või mitu
aminohapet on samas molekulis välja vahetatud. Sisendatavad variandid on 25
sellised, milles on üks või mitu aminohapet sisestatud vahetult aminohappega
külgnevalt teatud asendisse leiutise polüpeptiidis, näiteks spetsiifilises järjestuses.
Aminohappega külgnemine tähendab liitmist kas aminohappe α-karboksü või α-
amino funktsionaalse rühma kaudu. Kustutustega variandid on need, kus leiutise
polüpeptiidis, näiteks spetsiifilise järjestusega peptiidis, on üks või mitu 30
aminohapet eemaldatud. Tavaliselt on kustutustega variantidel üks või kaks
aminohapet eemaldatud molekuli teatud piirkonnast.
EE - EP1664122 B1 12
Antud leiutises käsitletakse ka isoleeritud polünukleotiide, mis kodeerivad leiutise
humaniseeritud antikeha.
Polünukleotiidid hõlmavad polünukleotiide, mis kodeerivad polüpeptiidi SEQ ID nr:
31 või SEQ ID nr: 32 ja/või eelistatavalt polüpeptiidi SEQ ID nr: 7 või SEQ ID nr: 8;
kodeerides näiteks 5
- polüpeptiidi SEQ ID nr: 31 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 7,
- polüpeptiidi SEQ ID nr: 31 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 8,
- polüpeptiidi SEQ ID nr: 32 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 7 või
- polüpeptiidi SEQ ID nr: 32 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 8.
„Polünukleotiid“, kui käesolevas pole märgitud teisiti, tähendab polüribonukleotiidi 10
või polüdeoksüribonukleotiidi, mis võib olla modifitseerimata RNA või DNA või
modifitseeritud RNA või DNA, kaasa arvatud muuhulgas ühe- või kaheahelaline
RNA ja RNA, mis on ühe- ja kaheahelaliste piirkondade segu.
CD45RO/RB humaniseeritud antikeha, mis on kimäärne või humaniseeritud
antikeha, on võimalik toota rekombinantsetel DNA meetoditel. Seega võidakse 15
konstrueerida üks või mitu DNA molekuli, mis kodeerivad CD45RO/RB, asetada
sobivatesse kontrolljärjestustesse ja sisestada sobivasse peremeesorganismi, et
neid ekspresseerida sobiva vektori abil.
Samuti käsitletakse antud leiutises polünukleotiidi, mis kodeerib leiutise
CD45RO/RB humaniseeritud antikeha üht, rasket ja/või kerget ahelat; ja leiutise 20
polünukleotiidi kasutamist, et toota leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikeha
rekombinantsetel tehnikatel.
CD45RO/RB siduv molekul võidakse saada vastavalt, nt analoogselt, meetodiga,
mis on konventsionaalne, rakendades käesolevas toodud informatsiooni, nt teavet
hüpervarieeruvate või varieeruvate piirkondade aminohappe järjestustest ja neid 25
piirkondi kodeerivatest polünukleotiidi järjestustest. Meetodit varieeruva domääni
geeni konstrueerimiseks on kirjeldatud nt EP 239 400 ning selle võib lühidalt kokku
võtta järgmiselt: Geeni, mis kodeerib mis tahes spetsiifilisusega monokloonse
antikeha varieeruvat piirkonda, on võimalik kloonida. Määratakse DNA segmendid,
mis kodeerivad raamistiku ja hüpervarieeruvaid piirkondi, ning eemaldatakse DNA 30
EE - EP1664122 B1 13
segmendid, mis kodeerivad hüpervarieeruvaid piirkondi. Kaheahelalised
sünteetilised CDR kassetid valmistatakse DNA sünteesis vastavalt CDR ja CDR’
järjestustele, nagu käesolevas täpsustatud. Neil kassettidel on kleepuvad otsad, et
neid oleks võimalik ligeerida inimpäritolu soovitud raamistiku ühendustes.
Polünukleotiide, mis kodeeriva üheahelalisi antikehi, võidakse valmistatakse 5
vastavalt, näiteks analoogselt, konventsionaalsetele meetoditele. Nii valmistatud
leiutise polünukleotiid võidakse sisestada vastavasse ekspressioonivektorisse.
Sobivaid rakuliine on võimalik leida vastavalt, näiteks analoogselt,
konventsionaalsetele meetoditele. Ekspressioonivektorid, mis sisaldavad näiteks
sobivaid promootoreid ja geene, mis kodeerivad raske ja kerge ahela konstantseid 10
osi, on teada, näiteks kaubanduslikult saadavad. Sobivad peremeesorganismid on
teada või leitavad vastavalt, näiteks analoogselt, konventsionaalsetele
meetoditele, ning hõlmavad rakukultuuri või transgeenseid loomi.
Samuti käsitletakse antud leiutises ekspressioonivektorit, mis sisaldab leiutise
polünukleotiide, kus vektor suudab toota humaniseeritud antikeha, kui nimetatud 15
vektor paikneb vastavas peremeesrakus.
Teises leiutise aspektis käsitletakse isoleeritud peremeesrakku, mis sisaldab
ekspressioonivektorit, mis suudab toota humaniseeritud antikeha. Oleme samuti
leidnud, et leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikeha inhibeerib
autoimmuunvastuseid doosist sõltuval moel, nagu määratud in vitro MLR. Need 20
tulemused näitavad, et rakud, mis on alloaktiveeritud leiutise CD45RO/RB
humaniseeritud antikeha kohalolekul, on puudulikud oma vastustes alloantigeeni
suhtes. See kinnitab täheldust, et leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikeha
võib toimida otse efektori alloreaktiivsetele T-rakkudele ja moduleerida nende
funktsiooni. Lisaks uuriti primaarsest MLR tuletatud T-rakkude funktsionaalseid 25
omadusi veel restimuleerimise katsetes sekundaarses MLR, kasutades spetsiifilisi
stimuleerivaid rakke või kolmanda poole stimulaatoreid, et hinnata täheldatud
funktsionaalsete toimete spetsiifilisust. Oleme leidnud, et rakkudel, mis on
derivatiseeritud primaarsetest MLRidest, kus sisaldub leiutise CD45RO/RB
humaniseeritud antikeha, oli pärsitud võimet vastata järgnevalt optimaalsele 30
stimuleerimisele spetsiifilise stimulaatorrakkudega, ehkki sekundaarsetele
kultuuridele ei lisatud ühtegi antikeha. Järgneva inhibeerimise spetsiifilisust
EE - EP1664122 B1 14
demonstreeriti leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikehaga töödeldud rakkude
võimega vastata normaalselt stimulaatorrakkudele mitte-seotud kolmanda poole
doonoritelt. Restimuleerimise katsed, kasutades T-rakke, mis on derivatiseeritud
primaarsetest MLR kultuuridest, näitavad seega, et rakud, mis eelnevalt
alloaktiveeritakse leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikehaga, on 5
hüporeageerivad, s.o tolerantsed esialgse alloantigeeni suhtes. Täiendavaid
bioloogilisi aktiivsusi on kirjeldatud näidetes 7 ja 9 kuni 13.
Samuti oleme leidnud, et proliferatsiooni rakkudes, mida on eelnevalt töödeldud
leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikehaga, on võimalik päästa eksogeense
IL-2. See näitab, et alloreaktiivsete T-rakkude töötlemine leiutise CD45RO/RB 10
humaniseeritud antikehaga indutseerib tolerantsuse seisundi. Nimelt olid langenud
proliferatiivsed vastused, mida täheldati leiutise CD45RO/RB humaniseeritud
antikehaga töödeldud rakkudes, tingitud T-raku funktsiooni halvenemisest, ning
need rakud suutsid reageerida eksogeensele IL-2, osutades sellele, et need rakud
on anergilises, tõeliselt mittereageerivas olekus. Selle vastuse spetsiifilisust näidati 15
rakkude suutlikkusega, mida töödeldi leiutise CD45RO/RB humaniseeritud
antikehaga, vohada normaalselt mitte-seotud doonori rakkudes kontrolliga
töödeldud rakkude tasemeni.
Lisaks näitavad katsed, et leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikeha
seostumine CD45RO ja CD45RB võib inhibeerida perifeerse vere 20
mononukleaarsete rakkude (PBMC) mälu vastuseid, millised rakud pärinevad
spetsiifilise recall-antigeeniga immuniseeritud doonoritelt. Leiutise CD45RO/RB
humaniseeritud antikeha seostumine CD45RO ja CD45RB on seega samuti
efektiivne mälu vastuste inhibeerimisel lahustuva antigeeni osas. Leiutise
CD45RO/RB humaniseeritud antikeha võimet inhibeerida meenutus-(recall)-25
vastuseid teetanuse suhtes PBMC rakkudes, mis pärinevad immuniseeritud
doonoritelt, näitavad, et leiutise CD45RO/RB siduv molekul suudab sihtida ja
moduleerida mälu T-rakkude aktiveerimist. Need andmed näitavad muuhulgas, et
leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikeha suudab lisaks alloreaktiivsete ja
aktiveeritud T-rakkudele ära tundmisele moduleerida ka nende funktsiooni, mille 30
tulemusena indutseeritakse T-raku anergia. See omadus võib osutuda oluliseks
kujunevate immuunvastuste ravis, mis on tekkinud vastuseks autoantigeenidele ja
EE - EP1664122 B1 15
allergeenidele ning võimalikult ka alloantigeenidele, nagu seda on täheldatud
autoimmuunhaiguste, allergia ja krooniliste äratõukereaktsioonide ning muudegi
haiguste, näiteks psoriaasi, põletikulise soolehaiguse puhul, kus mälu vastused
etendavad rolli haigusseisundi hoidmisel. See on arvatavalt oluliseks aspektiks
haigussituatsioonis, näiteks autoimmuunhaiguse korral, kus mälu vastused 5
autoantigeenide suhtes mängivad olulist rolli haiguse alal hoidmisel.
Oleme samuti leidnud, et leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikeha võib
moduleerida T-rakud proliferatiivseid vastuseid kombineeritud lümfotsüüdi
vastuses (MLR) in vivo, s.o leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikehal on
avastatud vastavad inhibeerivad omadused in vivo testimisel, näiteks letaalse 10
ksenogeneetilise transplantaat-peremehe-vastu (GvHD) haiguse ennetamine või
põletikuliste protsesside maha surumine, mis vahendavad inimese naha
transplantaadi äratõukereaktsiooni SCID hiirte mudelites, või inimese
saarerakkude transplantaadi elumuse pikendamine hu-PBL-NOD/SCID hiire
mudelis. 15
Leiutise CD5RO/RB humaniseeritud antikehal võivad seega olla
immunosupressiivsed ja tolerogeensed omadused ning see võib olla kasulik
tolerantsi in vivo ja ex vivo indutseerimiseks alloantigeenide, autoantigeenide,
allergeenide ja bakteriaalse floora antigeenide suhtes, nt võib leiutise CD45RO/RB
humaniseeritud antikeha olla kasulik, et ravida ja ennetada haigusi, sealhulgas 20
autoimmuunhaigusi, näiteks muuhulgas reumatoidartriiti, psoriaatilist artriiti,
autoimmuunset türeoidiiti, Gravesi tõbe, I ja II tüübi diabeeti, polüskleroosi, Crohni
tõbe (CD), haavandilist koliiti (UC), süsteemset erütematoosset luupust, Sjögreni
sündroomi, sklerodermiat, autoimmuunset gastriiti, glomerulonefriiti, transplantaadi
äratõukereaktsiooni, näiteks muuhulgas elundi ja koe transplantaadi 25
äratõukereaktsiooni, näiteks, et ravida transplantaadiga patsienti südant, kopsu, nii
südant kui kopsu, maksa, neeru, kõhunääret, nahka või sarvkesta, samuti
transplantaat-peremehe-vastu (GvHD) haigust, näiteks pärast luuüdi siirdamist
ja/või pankrease saarerakkude transplantaadi äratõukereaktsiooni ja/psoriaasi,
dermatiiti, näiteks atoopilist ja kontaktdermatiiti, kaasa arvatud allergilist 30
kontaktdermatiiti, põletikulist soolehaigust ja/või allergiaid, kaasa arvatud allergilist
astmat.
EE - EP1664122 B1 16
Samuti käsitletakse käesoleva teostusnäidetes leiutise CD45RO/RB
humaniseeritud antikeha kasutamist ravimina.
Samuti käsitletakse käesolevas leiutise humaniseeritud antikeha kasutamist, et
ravida ja/või ennetada autoimmuunhaigusi; transplantaadi äratõukereaktsiooni,
psoriaasi, dermatiiti, põletikulist soolehaigust ja/või allergiaid. 5
Samuti käsitletakse käesolevas leiutise humaniseeritud antikeha kasutamist, et
ravida ja/või ennetada transplantaat-peremehe-vastu (GvHD) haigust.
Samuti käsitletakse antud leiutises humaniseeritud antikeha kasutamist, et
valmistada ravimeid ravimaks pankrease saarerakkude transplantaadi
äratõukereaktsiooni. 10
Samuti käsitletakse käesolevas meetodit haiguse ravimiseks ja/või ennetamiseks,
millisteks haigusteks on muuhulgas autoimmuunhaigused, transplantaadi
äratõukereaktsioon, psoriaas, dermatiit, põletikuline soolehaigus ja/või allergiad,
mis hõlmavad sellist ravi ja/või profülaktikat vajavale patsiendile efektiivses
koguses leiutise GD45RO/RB humaniseeritud antikeha manustamist, näiteks 15
leiutise ravimkoostise kujul.
Ühes leiutise teostusnäites käsitletakse meetodit haiguse ravimiseks ja/või
ennetamiseks, milliseks haiguseks on saarerakkude transplantaadi
äratõukereaktsioon, mis hõlmab vastavat ravi ja/või profülaktikat vajavale
patsiendile efektiivses koguses leiutise humaniseeritud antikeha manustamist. 20
Eelistatud teostusnäidetes rakendatakse nimetatud CD45RO/RB humaniseeritud
antikeha ravimite tootmiseks või ravi- ja/või profülaktiliseks meetodiks selliste
haiguste jaoks nagu autoimmuunhaigused, transplantaadi äratõukereaktsioon,
psoriaas, dermatiit, põletikuline soolehaigus ja/või allergiad, hõlmates polüpeptiidi
SEQ ID nr: 31 või SEO ID nr: 32 ja/või polüpeptiidi SEQ ID nr: 7 või SEQ ID nr: 8. 25
Eelistatavalt hõlmab CD45RO/RB humaniseeritud antikeha polüpeptiidi SEQ ID nr:
31 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 8.
CD45RO/RB humaniseeritud antikeha „efektiivne kogus“ on kogus, mis on piisav,
et saada kasulikud või soovitud tulemused, kaasa arvatud kliinilised tulemused,
EE - EP1664122 B1 17
leevendades näiteks üht või mitut sümptomit, mis on tingitud
autoimmuunhaigusest,
transplantaadi äratõukereaktsioonist, psoriaasist, dermatiidist, põletikulisest
soolehaigusest ja/või allergiast, tõstes vastava patsiendi elukvaliteeti, vähendades
teist ravimite doosi, mis on vajalikud, et ravida selliseid haigusi, parandades teise 5
ravimi toimet, viivitades haiguse progressiooni ja/või pikendades patsientide
elumust, kas otse või kaudselt.
Efektiivset kogust võidakse manustada ühe- või mitmekordselt ning võimalusel ka
kombineerituna teise ravimi, ühendi või ravimkoostisega. Seega võib „efektiivset
kogust“ mõista ühe või mitme raviaine manustamise kontekstis, ning üksikut ainet 10
võidakse manustada efektiivses koguses, kombineerituna ühe või mitme teise
raviainega, et saada soovitud tulemused.
Samuti käsitletakse leiutise teostusnäidetes leiutise CD45RO/RB humaniseeritud
antikeha manustamist üksiku toimeainena või kombineerituna teiste ravimitega
immuunmoduleerivates režiimides või teiste põletikuvastaste ainetega, näiteks et 15
ravida või ennetada haigusi, mis on seotud näiteks autoimmuunhaigustega,
transplantaadi äratõukereaktsiooniga, psoriaasiga, dermatiidiga, põletikulise
soolehaigusega ja/või allergiatega. Näiteks võidakse leiutise CD45RO/RB
humaniseeritud antikeha kasutada kombineerituna kaltsineuriini inhibiitoriga,
näiteks tsüklosporiin A, tsüklosporiin G, FK-506, ABT-281, ASM 981; mTOR 20
inhibiitoriga, näiteks rapamütsiiniga, 40-O-(2-hüdroksü)etüül-rapamütsiiniga,
CCI779, ABT578, AP23573, AP23464, AP23675, AP23841, TAFA-93, biolimus-7
või bioimus-9; kortikosteroidiga; tsüklofosfamiidiga; asatiopriiniga;
metotreksaadiga; S1P retseptori agonistiga, näiteks FTY 720 või vastava
analoogiga; leflunomiidiga või selle analoogidega; misoribiiniga; 25
mükofenoolhappega; mükofenolaat-mofetiiliga; 15-deoksüspergualiiniga või selle
analoogidega; immuunsupressiivsete monokloonsete antikehadega, näiteks
monokloonsete antikehadega leukotsüüdi retseptorite suhtes, näiteks MHC, CD2,
CDS, CD4, CD11a/CD18. CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137,
ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB või nende ligandite, nt CD154 suhtes; muude 30
immuunmoduleerivate ühenditega, näiteks rekombinantse siduva molekuliga,
millel on vähemalt üks CTLA4 või selle mutandi rakuvälise domääni osa, näiteks
EE - EP1664122 B1 18
vähemalt CTLA4 või selle mutandi rakuväline osa, mis on seotud mitte-CTLA4
valgu järjestusega, näiteks CTLA4lg (märgistatud nt ATCC 68629) või selle
mutandiga, nt LEA29Y, või muude adhesioonimolekuli inhibiitoritega, näiteks
monokloonse antikehaga või madala molekulmassiga inhibiitoritega, kaasa
arvatud LFA-1 antagonistidega, selektiini antagonistidega ja VLA-4 5
antagonistidega.
Leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikeha võidakse manustada üksi või
kombineerituna teise ravimi, ühendi või ravimkoostisega mis tahes
konventsionaalsel moel, kaasa arvatud süstimine või järk-järguline infusioon.
Selline manustamine võib olla näiteks suukaudne, intravenoosne, 10
intraperitoneaalne, intramuskulaarne, intrakavitaalne, nahaalune, paikne või
transdermaalne. „Koos manustamise“ all mõeldakse leiutise koostiste
komponentide manustamist kombineerituna või sisulisel samal ajal, kas samas
tugiaines või eraldi tugiainetes selliselt, et mõlemad ühendid satuvad
gastrointestinaaltrakti samaaegselt. Eelistavalt manustatakse neid ühendeid 15
fikseeritud kombinatsioonina.
Samuti käsitletakse antud leiutises ravimkoostist, mis sisaldab leiutise
CD45RO/RB humaniseeritud antikeha kombineerituna vähemalt ühe
farmatseutiliselt vastuvõetava tugiaine või lahjendusvedelikuga.
Käesolevas kontekstis tähendab termin „farmatseutiliselt vastuvõetav tugiaine või 20
lahjendusvedelik“ üht või mitut sobivat tahket või vedelat täiteainet,
lahjendusvedeliku või kapseldamise abiainet, mis sobivad manustamiseks
imetajatele, kaasa arvatud inimestele. Termin „tugiaine“ märgib orgaanilist või
anorgaanilist koostisosa, mis on looduslik või sünteetiline, mis kombineeritakse
toimeainega, et soodustada selle manustamist/toimimist. 25
Termin „farmatseutiliselt vastuvõetav“ tähendab mitte-toksilist materjali, mis ei
mõjuta toimeainete bioloogilise aktiivsuse efektiivsust. Sellised koostised võivad
sageli sisaldava farmatseutiliselt vastuvõetavas kontsentratsiooni sooli,
puhveraineid, säilitusaineid, sobivaid tugiaineid, täiendavaid immuunpotentsiga
ainega, näiteks adjuvante ja tsütokiine, ning valikuliselt muid raviaineid, näiteks 30
kemoterapeutilisi aineid.
EE - EP1664122 B1 19
Meditsiiniliseks kasutuseks peavad soolad olema farmatseutiliselt vastuvõetavad,
ent farmatseutiliselt mittevastuvõetavaid sooli võidakse samuti kasutada, et
valmistada farmatseutiliselt vastuvõetavaid sooli, ning ei kuuluvad selliste
vaheainetena samuti antud leiutise rakendusraamistikku.
Ravimkoostised võivad sisaldada ka sobivaid puhveraineid, kaasa arvatud 5
äädikhappe soola; boorhape soola ja fosforhape soola. Leiutise ravimkoostised
võivad samuti valikuliselt sisaldada sobivaid säilitusaineid, näiteks
bensalkooniumkloriidi, klorobutanooli, parabeene ja timerosaali.
Polüpeptiidi või nimetatud polüpeptiidi kodeeriva nukleiinhappe doosid subjektile
manustamiseks valitakse vastavalt erinevatele parameetritele, arvestades 10
muuhulgas manustamisviisi ja patsiendi üldist tervislikku seisundit. Teisteks
faktoriteks on muuhulgas soovitud raviperiood. Juhul, kui subjekti vastus on
esialgselt rakendatavate dooside järel ebapiisav, võidakse rakendada kõrgemaid
doose (või sisuliselt kõrgemaid doose lokaliseerituma manustamisviisi kaudu)
sellises ulatuses, mis on patsiendi tolerantsi tasemetega lubatud. 15
Leiutise ravimkoostised võivad olla ühikdoosi kujul ning need võidakse valmistada
farmaatsiatööstuses teada ja levinud meetodeid kasutades. Kõik rakendatavad
meetodid hõlmavad etappi, kus toimeaine kombineeritakse tugiainega, mis
koosneb ühest või mitmest lisaainest. Üldiselt valmistatakse need koostised
ühtlaselt, viies toimeaine kokkupuutesse vedela tugiainega, peenestatud 20
kuivainega, või vajadusel mõlemaga, et anda ravimkoostisele vorm.
Suukaudseks manustamiseks sobivad ravimkoostised võivad esineda diskreetsete
üksustena, näiteks kapslitena, tablettidena, pastillidena, mis sisaldavad eelnevalt
määratud koguses toimeainet. Teisteks koostiseks on muuhulgas suspensioonid
vesilahustes või veevabades lahustis, näiteks siirupites, eliksiirides või 25
emulsioonides.
Parenteraalseks manustamiseks mõeldud ravimkoostised sisaldavad tavaliselt
steriilset polüpeptiidi või seda polüpeptiidi kodeeriva nukleiinhappe vesilahust või
veevaba lahust, mis on eelistatavalt patsiendi verega isotooniline. See koostis
võidakse valmistada vastavalt teada meetoditele, kasutades dispergeerivaid või 30
EE - EP1664122 B1 20
märgavaid aineid ja suspendeerivaid aineid. Steriilne süstekoostis võib samuti olla
steriilne süstelahus või -suspensioon mitte-toksilises parenteraalselt
vastuvõetavas lahjendusvedelikus või lahustis, näiteks lahusena 1,3-butaandioolis.
Vastuvõetavateks tugiaineteks ja lahustiteks on vesi, Ringeri lahus ja isotooniline
naatriumkloriidi lahus. Lisaks võidakse konventsionaalselt lahustava või 5
suspendeeriva keskkonnana rakendada steriilseid, tahkeid rasvu rakendada. Sel
eesmärgil võidakse rakendada mis tahes tahket rasva, kaasa arvatud sünteetilisi
mono- või diglütseriide. Lisaks võidakse rasvhappeid, näiteks oleiinhapet,
kasutada süstelahuste valmistamisel. Tugiaine koostiseid, mis sobivad
suukaudseks, nahaaluseks, intravenoosseks, intramuskulaarseks jne 10
manustamiseks, on kirjeldatud: Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack
Publishing Co., Easton, PA.
Leiutise ravimkoostis võib sisaldada ka täiendavaid toimeaineid, näiteks muid
immuunmoduleerivaid antikehi, näiteks muuhulgas anti-ICOS, anti-CD154, anti-
CD134L või rekombinantseid valke, näiteks muuhulgas rCTLA-4 (CD152), rOX40 15
(CD134), või põletikuvastaseid aineid või immuunmoduleerivaid ühendeid, näiteks
tsüklosporiin A, FTY720, RAD, rapamütsiini, FK506, 15-deoksüspergualiini,
steroide; nagu eelnevas kirjeldatud. Selline ravimkoostis võib sisalda leiutise
CD45RO/RB humaniseeritud antikeha ja immuunmoduleerivaid ravimeid ja/või
põletikuvastaseid aineid eraldi doseerimisvormides, eelistatavalt ühikdoosi 20
vormides, mis sobivad sisaldavate ühendite manustamiseks sünergiliselt
efektiivsetes koguses, millises komplektis sisalduvad ka kasutusjuhised valikuliselt
koos vahenditega, mis hõlbustavad nende manustamist, nt siltide või joonistega.
Leiutise koostisi võidakse manustada vaba kombinatsioonina või fikseeritud
kombinatsioonina. Ühendite absoluutdoosid varieeruvad vastavalt mitmesugustele 25
teguritele, näiteks patsiendi andmed, manustamisviis, soovitud kestus, toimeaine
vabastamise kiirus ning ravitava haigusseisundi olemus ja tõsidus.
Haigusteks, mis on võimalik ravida leiutise CD45RO/RB humaniseeritud
antikehaga üksi või kombineerituna teiste ravimitega, on muuhulgas
autoimmuunhaigused, kaasa arvatud reumatoidartriit, psoriaatiline artriit, 30
autoimmuunne türeoidiit, Gravesi tõbi, I ja II tüübi diabeet, polüskleroos, Crohni
tõbi (CD), haavandiline koliit (UC), süsteemne erütematoosne luupus, Sjögreni
EE - EP1664122 B1 21
sündroom, sklerodermia, autoimmuunne gastriit ja glomerulonefriit; transplantaadi
äratõukereaktsioon, kaasa arvatud elundi ja koe transplantaadi
äratõukereaktsioon, näiteks patsiendi südame, kopsu, nii südame kui kopsude,
neeru, pankrease, naha või sarvkesta ravimiseks transplantaatidega,
ksenogeneetilist transplantaat-peremehe-vastu (GvHD) haigus, näiteks pärast 5
luuüdi siirdamist, ja/või pankrease saarerakkude transplantaadi
äratõukereaktsioon; psoriaas; dermatiit, näiteks atoopiline ja kontaktdermatiit,
kaasa arvatud allergiline kontaktdermatiit; põletikuline soolehaigus ja/või allergiad,
kaasa arvatud allergiline astma.
NÄITED 10
Antud leiutise olemus saab selgemaks järgmiste võrdlusnäidete valguses. Neid
näiteks ei tuleks aga tõlgendada leiutise rakendusvaldkonda piiravatena.
Järgnevates näideteks on kõik temperatuurid toodud Celsiuse kraadides.
„Kandidaat monokloonne antikeha“ või „kimäärne antikeha“ on leiutise
CD45RO/RB siduv molekul, mis sisaldab kerget ahelat SEQ ID nr: 3 ja rasket 15
ahelat SEQ ID nr: 4.
„Humaniseeritud antikeha“ on leiutise CD45RO/RB siduv molekul, mis sisaldab
polüpeptiidi SEQ ID nr: 8 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 9 (VHE/humV1, VHE/VL1 või
VHE/VLh), polüpeptiidi SEQ ID nr: 8 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 10 (VHQ/humV1,
VHQ/VL1 või VHQ/VLh); polüpeptiidi SEQ ID nr: 7 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 9 20
(VHE/humV2, VHE/VL2 või VHE/VLm); polüpeptiidi SEQ ID nr: 7 ja polüpeptiidi
SEQ ID nr: 10 (VHQ/humV2, VHQ/VL2 või VHQ/VLm); polüpeptiidi SEQ ID nr: 8 ja
polüpeptiidi SEQ ID nr: 31 (VHEN73D/humV1, VHEN73D/VL1 või VHEN73D/VLh);
polüpeptiidi SEQ ID nr: 8 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 32 (VHQN73D/humV1,
VHQN73D/VL1 või VHQN73D/VLh); polüpeptiidi SEQ ID nr: 7 ja polüpeptiidi SEQ 25
ID nr: 31 (VHEN73D/humV2, VHEN73D/VL2 või VHEN73D/VLm); või polüpeptiidi
SEQ ID nr: 7 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 32 (VHQN73D/humV2, VHQN73D/VL2 või
VHEN73D/VLm).
Kasutatud on järgmisi lühendeid:
APC antigeeni esitav rakk 30
EE - EP1664122 B1 22
CEX katioonvahetuse kromatograafia
c.p.m. lugemeid minutis
dhfr dihüdrofolaat-reduktaas
EDTA etüleendinitrilo tetra-äädikhape
ELISA ensüüm-immuunsorbtsioonmeetod 5
ESI-Q-TOF elektropihustuse ionisatsioon - tetrapool - lennuaeg
FACS fluorestsents-aktiveeritud läbivoolutsütomeeter
Fc kristalliseeritav fragment
F(ab’)2 antigeeni siduv fragment; bivalentne
FITC fluorestseiinisotiotsüanaat 10
FBS veiselooteseerum
GVHD transplantaat-peremehe-vastu haigus
HCMV inimese tsütomegaloviiruse promootor
HPLC kõrgrõhuvedelikkromatograafia
IFN-� interferoon-gamma 15
IgE immunoglobuliin isotüüp E
IgG immunoglobuliin isotüüp G
IL-2 interleukiin-2
IU rahvusvahelised ühikud
MALDI-TOF maatriks-assisteeritud-laser-desorptsioon-ionisatsioon - lennuaeg 20
MLR kombineeritud lümfotsüüdi reaktsioon
MLC kombineeritud lümfotsüüdi kultuur
MP1 maatriks valk 1 hemophilus influenza bakterist
MTX metotreksaat
PBS fosfaat-puhverdatud saliin 25
PBL perifeerse vere leukotsüüdid
PBMC perifeerse vere mononukleaarsed rakud
PCR polümeraasi ahelreaktsioon
RP pöördfaasiline kromatograafia
SEC suurus-eksklusioonkromatograafia 30
SCID tõsine kombineeritud immuunpuudulikkus
Treg T-regulaatorrakud
xGVHD kseno-transplantaat-peremehe-vastu haigus
EE - EP1664122 B1 23
Näide 1: Primaarse kombineeritud lümfotsüüdi vastus (MLR)
Rakud
Vereproovid võetakse tervetelt inimdoonoritelt. Perifeerse vere mononukleaarsed
rakud (PBMC) isoleeritakse tsentrifuugides Ficoll-Hypaque’il (Pharmacia LKB)
kogu perifeerse vere leukotsüütidest, leukofereesiga või teada veretüübiga raku 5
katetega, aga mitte tundmata HLA tüübiga. Teatud MLR katsetes kasutatakse
PBMC otse stimulaatorrakkudena pärast kiiritamist 40 Gy juures. Teistes katsetes
depleteeritakse T-rakud PBMCdest, kasutades CD2 või CD3 Dynabeads (Dynal,
Oslo, Norra). Pärlid ja saasterakud eemaldatakse magnetvälja rakendades.
PBMCdest depleteeritud T-rakke kasutatakse stimulaatorrakkudena pärast 10
kiiritamist.
PBMC, CD3+ T-rakke või CD4+ T-rakke kasutatakse vastaja-rakkudena MLR.
Erinevate doonorite rakkudest valmistatakse stimulaatorrakud. CD3+ T-rakud
puhastatakse negatiivse selektsiooni teel, kasutades anti-CD16 mAb (Zymed, CA),
kitse anti-hiire IgG Dynabeads, anti-CD14 Dynabeads, CD19 Dynabeads. Lisaks 15
kasutatakse anti-CD8 Dynabeads CD4+ T-rakkude puhastamiseks. Saadud rakke
analüüsitakse FACScan või FACSCalibur (Becton Dickinson & Co., CA) ning
saadud rakkude puhtuseks oli >75%. Rakud suspendeeritakse RPMI1640
söötmes, millele on lisatud 10% kuumus-inaktiveeritud FBS, penitsilliini,
streptomütsiini ja L-glutamiini. 20
Reagendid
Saadakse ka kimäärne anti-CD45R0/RB monokloonne antikeha „kandidaat
monokloonne antikeha“ ja isotüübiga sobituv kontroll kimäärne antikeha. Hiire
(inimese) kontroll IgG1 antikeha, mis on spetsiifiline KLH (keyhole limpet
hemotsüaniin), või rekombinantne inimese IL-10 soetatakse BD Pharmingen (San 25
Diego, CA). Anti-inimese CD154 monokloonne antikeha 5c8 on selline, nagu
kirjeldanud Lederman et al 1992.
Primaarse kombineeritud lümfotsüüdi vastus (MLR)
EE - EP1664122 B1 24
1 x 105 PBMC alikvoodid või 5 X 104 CD3+ või CD4+ rakud segatakse kokku 1 x
105 kiiritatud PBMCdega või 5 x 104 T-rakkudega depleteeritud kiiritatud (50 Gy)
PBMCdega, 96-auguliste söötmeplaatide igas augus (Costar, Cambridge, MA)
nimetatud monokloonne antikeha kohalolekul või antikeha puudumisel. Teatud
katsetes lisatakse kitse anti-hiire lg F(ab’)2 fragment või kitse anti-inimese lg, mis 5
on spetsiifiline Fc osa suhtes (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA),
koguses 10 µg/ml kandidaat monokloonsele antikehale, et tagada CD45
sihtmolekulide optimaalne in vitro ristsidestamine. Kombineeritud rakke
kasvatatakse 4 või 5 päeva temperatuuril 37 °C 5% CO2 atmosfääris ning
proliferatsioon määratakse, pulseerides rakke 3H-tümidiinidga viimased 16-20 10
tundi.
Teised katsed on sarnased eelnevalt kirjeldatuga, ent järgmiste eranditega: 1)
kasutatavaks söötmeks on EX-VIVO (Bio-Whittaker), mis sisaldab 10% FBS ja 1%
inimese plasmat; 2) anti-hiire kogu IgG (5 µg/ml) kasutatakse sekundaarse
ristsidestamise etapina; 3) stimulaatorrakkude kiirutuseks on 60 Gy. 15
Primaarne MLR teostatakse „kandidaat monokloonse antikeha“ või kontrollina
kasutatava kimäärse IgG1 (10 µg/ml) kohalolekul teise reagendina, kitse anti-
inimese lg F(ab’)2 fragment, mis on spetsiifiline Fc osa (10 µg/ml) suhtes.
Protsentuaalne inhibeerimine „kandidaat monokloonse antikeha“ poolt arvutatakse
võrdluses raku proliferatsiooniga kontroll IgG1 kohalolekul. Tulemused on toodud 20
alljärgnevas tabelis:
Tabel 1
Primaarse MLR inhibeerimine 10 µg/ml leiutise kandidaat monokloonse antikeha
poolt
Responder Stimulaator (kiir. PBMC) Inhibeerimise %
#211 CD4 #219 CD3 63,51
#220 CD4 #219 CD3 depl. 63,07
#227 CD4 #220 CD3 depl. 65,96
#229 CD4 #219 CD3 depl. 50,76
Keskmine ± standardhälve 60,83±6,83*
* Oluliselt erinev kontrollväärtusest (P<0,001)
EE - EP1664122 B1 25
Leiutise kandidaat monokloonne antikeha inhibeerib primaarset MLR, nagu selgub
tabelist 1. Keskmiseks inhibeerivaks toimeks on 60,83 ± 6,83% neljalt erinevalt
doonorilt derivatiseeritud CD4+ T-rakkudega ning see oli statistiliselt oluline.
Primaarse MLR inhibeerimine „kandidaat monokloonse antikehaga“ on näidatult
„kandidaat monokloonse antikeha“ doosist sõltuv vahemikus 0,001 kuni 10 µg/ml, 5
nagu kujutatud joonisel fig. 1.
Primaarse MLR „kandidaat monokloonse antikehaga“ inhibeerimise IC50
määratakse kolme MLR katsete tulemustest, kasutades ühe doonori PBMC
responder-rakke. Seega segatakse responder CD4+ T-rakud doonorilt #229 ja
#219 ja kiiritatud PBMC rakud, mis on depleteeritud T-rakkudest ja mida 10
kasutatakse stimulaatoritena, „kandidaat monokloonse antikeha“ või kontroll
kimäärse antikeha kohalolekul kitse anti-inimese Ig 10 µg/ml F(ab’)2 fragmendiga.
Katseid korratakse 3 korda ning proliferatsiooni protsent „monokloonse antikeha“
kohalolekul arvutatakse võrdluses T-raku proliferatsiooniga kontroll-antikeha
kohalolekul. IC50 väärtus määratakse, kasutades Origin (V. 6.0®) seadet. Rakulise 15
aktiivsuse IC50 väärtuseks leiti 0,87 ± 0,35 nM (0,13 ± 0,052 µg/ml).
Näide 2: Sekundaarne MLR
Et hinnata, kas „kandidaat monokloonne antikeha“ indutseerib CD4+ T-rakkude
mitte-reaktiivsust teatud alloantigeenide suhtes, teostatakse sekundaarne MLR
antikehadeta pärast primaarset MLC. CD4+ T-rakke kasvatatakse kiiritatud 20
allogeensete stimulaatorrakkudega (T-rakud - depleteeritud PBMC) nimetatud
antikeha kohalolekul 96-augulistel söötmeplaatidel 10 päeva (primaarne MLC).
Seejärel rakud kogutakse, kihitatakse Ficoll-Hypaque gradiendiga, et eemaldada
surnud rakud, pestakse kaks korda RPMI, ja restimuleeritakse sama
stimulaatoriga, kolmanda poole stimulaatorrakkudega või IL-2 (50 U/ml). Rakke 25
kasvatatakse 3 päeva ja proliferatsiooni vastus määratakse, pulseerides rakke 3H-
tümidiiniga viimased 16-20 tundi söötmes.
Nimelt kasvatatakse CD4+ T-rakke kiiritatud allogeensete stimulaatorrakkudega
(T-rakud-depleteeritud PBMC rakud, mis on võetud teistelt doonoritelt) 10 µg/ml
„kandidaat monokloonse antikeha“, kontroll IgG1 kimäärse Ab ja kitse anti-inimese 30
EE - EP1664122 B1 26
Ig F(ab’)2 fragmendi kohalolekul. Primaarne MLR proliferatsioon määratakse
viiendal päeval. Sekundaarseks MLR kasvatatakse resonder- ja stimulaatorrakke
10 päeva „kandidaat monokloonse antikeha“ kohalolekul, seejärel rakud
korjatakse, pestakse kaks korda RPMI1640 ning restimuleeritakse konkreetse
stimulaatoriga, kolmanda poole stimulaatoritega või IL-2 (50 U/ml) antikehadeta. 5
Rakkude proliferatsioon määratakse kolmandal päeval. Saadud tulemused on
toodud tabelis 1:
Tabel 2
Resonder CD4+ T-rakud doonor # Sekundaarse MLR inhibeerimise %
#211 49,90*
#220 59,33*
#227 58,68*
* Oluliselt erinev kontrollväärtusest (p=<0,001 määratud t-testis, SigmaStat
V.2.03). # p=<0,046
Selleks, et testida, kas halvenenud proliferatsioon on tingitud mitte-reaktiivsusest,
mis on kujunenud „kandidaat monokloonse antikehaga“ töötlemise tagajärjel, 10
kasvatatakse rakke, mis on derivatiseeritud primaarsest MLR, IL-2 (50 U/ml)
kohalolekul. IL-2 lisamisel pääsetakse T-rakkude proliferatiivsed vastused, mida oli
töödeldud „kandidaat monokloonse antikehaga“ primaarses MLR tasemetel, mis
on sarnased neile, mida on täheldatud IgG1 kontrollantikeha kohalolekul. Need
andmed näitavad, et halvenenud sekundaarne vastus T-rakkudes, mida on 15
töödeldud „kandidaat monokloonse antikehaga“, on tingitud T-resonder-rakkude
funktsionaalsest muutusest, muutudes mitte-reaktiivseteks teatud
stimulaatorrakkude suhtes.
Protsentuaalne inhibitsioon arvutatakse vastavalt järgmisele valemile:
. 20
Statistiline analüüs teostatakse SigmaStat (Vers. 2.03) kasutades.
EE - EP1664122 B1 27
Andmeid analüüsitakse kahetises ANOVA, millele järgneb Dunnetti meetod. Kõigis
testmeetodites loetakse tõenäosusi <0,05 oluliseks. Teatud katsetes kasutatakse
t-testi (SigmaStat V.2.03).
Näide 3: In vivo elumuse uuringud SCID hiirtel
hu-PBL pookimine SCID hiirtele 5
Inimese perifeerse vere mononukleaarseid rakke (PBMC) süstitakse
intraperitoneaalselt SCID hiirtele C.B 17/GbmsTac-Prkdcscid Lystbg mice
(Taconic, Germantown, NY) koguses, mis on piisav, et indutseerida letaalset
ksenogeneetilist transplantaat-peremehe-vastu (GvHD) haigust >90% hiirtel 4
nädalat pärast rakkude ülekannet. Selliselt töödeldud SCID hiired kannavad 10
seejärel nimetust hu-PBL-SCID hiired.
SCID hiirtetöötlemine hu-PBL monokloonse antikehaga
Hu-PBL-SCID hiiri töödeldakse „kandidaat monokloonse antikehaga“ või hiire või
kimäärse isotüübiga sobivate monokloonse antikeha kontrollidega päeval 0,
vahetult pärast PBMC süstimist, 3. ja 7. päeval ning nädalaste intervallidega 15
seejärel. Monokloonseid antikehi siirdatakse nahaaluselt 100 µl PBS
lõppkontsentratsioonis 5 mg kehakaalu kg kohta. Selline ravi lõpetatakse, kui kõik
kontrollhiired on surnud.
Ravitulemuste hindamine
Põhiliseks kriteeriumiks „kandidaat monokloonse antikeha“ efektiivsuse hindamisel 20
on selles uuringus hu-PBLSCID hiirte elumus. Saadud tulemuste olulisust
hinnatakse elumuse analüüsi statistilisel meetodil, kasutades Log-rank testi
(Manteli meetod) Systat v9.01 tarkvara abil. Elumuse analüüsi meetodiks on mitte-
parameetriline test, mis ei võta arvesse mitte üksnes konkreetset veel elavat hiirt,
vaid ka seda, kas see hiir ohverdati põhjustel, mis ei puutu ravisse/haigusesse, 25
näiteks nõue teostada selle elundite/rakkude in vitro analüüs. Maksa, kopsu, neeru
ja põrna biopsiad võetakse surnud hiirtelt täiendavaks hindamiseks. Lisaks
kaalutakse hu-PBL-SCID hiiri katse alguses (enne rakkude ülekannet) ja selle
jooksul (iga kahe päeva tagant), et hinnata otseselt nende tervislikku seisundit.
EE - EP1664122 B1 28
Lineaarse regressiooni jooned saadakse, kasutades kehakaalu versus PBMC
ülekandele järgnevate päevade väärtuseid iga hiire kohta, seejärel võrreldakse
vastavaid kaldeid (kontroll versus anti-CD45 töödeldud hiired), rakendades mitte-
parameetrilist Mann-Whitney testi.
Tulemused 5
Kõigil hu-PBL-SCID hiirtel, keda oli töödeldud hiire monokloonse antikeha
kontrollidega, olid infiltreerunud leukotsüüdid kopsus, maksas ja põrnas ning nad
surid (4/4) ca 2 kuni 3 nädala jooksul pärast rakkude siirdamist. Surm on xGvHD
tõenäoliseks tagajärjeks. Kontroll monokloonse antikehaga töödeldud hiired
kaotasid ka massis lineaarselt, ca 10% ja enam kui 3 nädalaga. 10
Kõik hu-PBL-SCID hiired, keda oli töödeldud „kandidaat monokloonse antikehaga“
jäid ellu (4/4) nähtava haiguse märgita enam kui 4 nädala vältel, ehkki „kandidaat
monokloonse antikehaga“ töötlemine peatati 3 nädala möödudes. „Kandidaat
monokloonse antikehaga“ töödeldud hiired võtsid kaalus juurde lineaarselt kuni ca
5% 4 nädalaga. 15
Näide 4: Leiutise antikehade ekspressioon
Humaniseeritud antikeha ekspresseerimine, milleks on SEQ ID nr:_7, SEQ ID
nr:_8, SEQ ID nr: 9, SEQ ID nr: 10, SEQ ID nr:_31 või SEQ ID nr: 32
Konstrueeritakse ekspressioonivektorid vastavalt plasmiidi plaanidele, mida on
kujutatud joonistel fig. 2 kuni 11, mis hõlmavad vastavaid nukleotiide, mis 20
kodeerivad humaniseeritud kerge ahela varieeruva piirkonna humV1
aminohappelist järjestust (SEQ ID nr: 8; joonised fig. 4 ja 6), humaniseeritud kerge
ahela varieeruva piirkonna humV2 aminohappelist järjestust (SEQ ID nr: 7;
joonised fig. 5 ja 7), humaniseeritud raske ahela varieeruva piirkonna VHE
aminohappelist järjestust (SEQ ID nr: 9; joonis fig. 3 ja 10) või humaniseeritud 25
raske ahela varieeruva piirkonna VHQ aminohappelist järjestust (SEQ ID nr: 10;
joonised fig. 2 ja 11), humaniseeritud raske ahela varieeruva piirkonna VHE-N73D
aminohappelist järjestust (SEQ ID nr: 31; joonis fig. 8) või humaniseeritud raske
ahela varieeruva piirkonna VHQ-N73D aminohappelist järjestust (SEQ ID nr: 32;
joonis fig. 9). Neil ekspressioonivektoritel on DNA (nukleotiidi) järjestused SEQ ID 30
EE - EP1664122 B1 29
nr: 15 ja SEQ ID nr: 41 (VHQ), SEQ ID nr: 16 ja SEQ ID nr: 40 (VHE), SEQ ID nr:
17 ja SEQ ID nr: 36 (humV1), SEQ ID nr: 18 ja SEQ ID nr: 39 (humV2) või SEQ ID
nr: 37 (VHEN73D) ja SEQ ID nr: 38 (VHQ-N73D).
Humaniseeritud antikeha raske ja kerge ahela ekspressioonivektorite
konstrueerimine ekspressiooniks COS rakkudes 5
Inimese kappa kerge ahela ekspressioonivektorid versioonideks VLh ja VLm
Et konstrueerida lõplik ekspressioonivektor kodeerimaks täielikku inimese kappa
isotüübiga humaniseeritud kerget ahelat, eemaldatakse DNA fragmendid, mis
kodeerivad täieliku kerge ahela varieeruvaid piirkondi (VLh ja VLm), VLh ja VLm
versioonidest, mis sisaldab PCR-Script kloonimisvektoreid (Stratagene) (VLm 10
piirkond), kasutades HindIII ja BgIII. Geel-puhastatud fragmendid subkloonitakse
C21-HCMV kappa ekspressioonivektori, mis loodi humaniseeritud anti-IgE
antikeha konstrueerimisel, TESC-21 HindIII ja BamHI saitideks (Kolbinger et al
1993) ja mis saadakse M. Bendig’ilt (MRC Collaborative Centre, London, UK)
(Maeda et al. 1991). Ligeerimise saadused puhastatakse fenool/kloroformi 15
ekstraheerimisel ja elektroporeeritakse elektrokoporatsioon-kompetentne
Epicurian Coli® XL1-Blue värviga (kategoorianumber #200228, Stratagene).
Pärast plaatimist LB/amp agari plaatidel üle öö temperatuuril 37 °C, korjatakse
kõik 12 kolooniat, et valmistada plasmiidne DNA 3 ml kultuurist, kasutades
BioRobot 9600 (Qiagen). Nii saadakse kerge ahela ekspressioonivektorid 20
humaniseeritud antikeha vastavateks versioonideks VLh ja VLm, nagu toodud ka
joonistel.
Inimese gamma-1 raske ahela ekspressioonivektorid VHQ
Et konstrueerida VHQ ekspressioonivektor, võidakse etapipõhine lähenemine.
Esmalt koondatakse VHQ täielik varieeruv piirkond PCR abil vastavalt 25
metoodikale, mida on kirjeldanud Kolbinger et al 1993 (Protein Eng. 1993 Nov;
6(8):971-80) ja subkloonitakse C21-HCMV-gamma-1 ekspressiooniks, millest C21
sisend oli eemaldatud, kasutades samu ensüüme. PCRScript klooni HindIII/BamHI
fragment, mis sisaldas täielikku varieeruvat piirkonda, subkloonitakse seejärel
ekspressioonivektoriks C21-HCMV-gamma-1, mis on lõhustatud samade 30
EE - EP1664122 B1 30
ensüümidega. Nii saadakse lõplik ekspressioonivektor humaniseeritud antikeha
versiooniks VHQ.
Inimese gamma-1 raske ahela ekspressioonivektorid VHE
Lõplik VHE ekspressioonivektor, mis kodeerib inimese gamma-1 isotüübi täielikku
humaniseeritud rasket ahelat, ligeerides otse Hindlll ja BamHI piiratud PCR 5
fragmendi, mis kodeerib varieeruva piirkonna C21-HCMV gamma-1
ekspressioonivektori HindIII ja BamHI saitideks, milline ekspressioonivektor
saadakse humaniseeritud anti-IgE antikeha TESC-21konstrueeriisel (Kolbinger et
al. 1993) ja mis saadi samuti M. Bendig’ilt (MRC Collaborative Centre, London,
UK) (Maeda et al. 1991). 10
Transientne ekspressioon COS rakkudes
Järgnevat transfektsiooni protokoll kohandatakse adhesiooni COS rakkudele
sobivaks 150 mm rakukultuuri anumates, kasutades SuperFect™ transfektsiooni
reagenti (kat. nr 301305, Qiagen). Neli erinevat eelnevalt kirjeldatud
ekspressioonivektorit kasutatakse rakkude transientseks transfektsiooniks. 15
Humaniseeritud antikeha ekspresseerimiseks transfekteeritakse mõlemad kaks
klooni, mis sisaldavad raske ahela sisendeid (vastavalt VHE või VHQ), rakkudesse
mõlema kahe klooniga, mis kodeerivad kergeid ahelaid (vastavalt humV1 või
humV2), saades kokku 4 erinevat raskete ja kergete ahela ekspressioonivektorite
kombinatsiooni (VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 ja VHQ/humV2). Enne 20
transfektsiooni lineariseeritakse plasmiidid restriktsiooni endonukleaasiga Pvul,
mis lõhustub piirkonnas, mis kodeerib resistentsuse geeni ampitsilliini suhtes.
Transfektsioonile eelneval päeval külvatakse 4 x 106 COS rakke 30 ml värskes
söötmes 150 mm rakukultuuri anumatesse. Külvamine sellel rakutihedusel annab
üldiselt 80% laatumise 24 tunni järel. Transfekteerimise päeval lahjendatakse nelja 25
erinevat lineariseeritud raske ja kerge ahela DNA ekspressioonivektorit (iga maht
15 µg) kogumahus 900 µl värske söötmega, mis ei sisalda seerumit ega
antibiootikume. 180 µl SuperFect transfektsiooni reagent segatakse seejärel
põhjalikult kokku DNA lahusega. DNA segu inkubeeritakse 10 minutit
toatemperatuuril, et saada kompleksne moodustis. Kui see keerukas 30
moodustumise aset leiab, eemaldatakse COS rakukultuurist kasvusööde ning
EE - EP1664122 B1 31
rakke pestakse üks kord fosfaat-puhverdatud saliiniga. 9 ml värsket söödet (mis
sisaldab 10% FBS ja antibiootikume) lisatakse igale reaktsioonitorule, mis sisaldab
transfektsiooni komplekse, ja on segatakse korralikult. Lõplik koostis viiakse
vahetult igasse 4 kultuuri, et need transfekteerida ja õrnalt segada. Rakukultuure
inkubeeritakse seejärel DNA kompleksidega 3 tundi temperatuuril 37 °C ja 5% 5
CO2 atmosfääris. Pärast inkubeerimist eemaldatakse sööde, mis sisaldab
transfektsiooni komplekse, ning asendatakse 30 värske söötmega. 48 tundi pärast
transfekteerimist kogutati söötme supernatandid.
Söötme supernatantide kontsentreerimine
ELISA ja FACS analüüsi tarvis kogutakse söötme supernatandid COS rakkudest, 10
mida on transfekteeritud raske ja kerge ahela plasmiididega, ning
kontsentreeritakse järgnevalt. 10 ml iga supernatanti lisatakse Centriprep YM-50
tsentrifuugi filterseadmetesse (kat. nr 4310, Millipore) vastavalt tootja juhistele.
Neid spetsiaalseid filtreid tsentrifuugitakse 10 minutit pööretel 3000 p/min
toatemperatuuril. Seejärel korratakse tsentrifuugimise etapp taas ülejäänud 20 ml 15
supernatandiga, kasutades üksnes 5 minutit tsentrifuugimist ja jälgides
kontsentreerumise protsessi. Kogutakse vahesaadusena tekkinud 500 µl
kontsentreeritud supernantanti, viiakse uutesse Microcon Centrifugal
filterseadmetesse (kat. nr 42412, Microcon) ning kontsentreeritakse seejärel
vastavalt tootja juhistele. Kontsentreeritud supernatante tsentrifuugitakse neli 20
korda 24 minutit pööretel 3000 p/min toatemperatuuril, üks kord 10 minutit 6000
p/min ja seejärel kolm korda 5 minutit, jälgides alati kontsentreerumise protsessi.
Lõplikuks kontsentreeritud söötme mahuks saadakse 100-120 µl vastavalt 250
kuni 300-kordsele originaalse söötme kontsentratsioonile ning seda säilitakse
temperatuuril 4 °C kasutamiseni. Võrdluse ja kontrollina kontsentreeritakse sööde, 25
mis saadakse transfekteerimata rakkudest, sarnaselt, kasutades sama
tsentrifuugimise protokolli, mida on kirjeldatud ülal.
Stabiilsete Sp2/0 müeloomi transfektanti genereerimine, mis eritavad
humaniseeritud anti-CD45RO/RB antikehi
Hiire müeloomi rakuliini Sp2/0 (ATCC, CRL-1581) elektroporeeritakse eelnevalt 30
kirjeldatud CHO ekspressioonivektoritega, mis kodeerivad CD45RO/RB rasket
EE - EP1664122 B1 32
(VHE või VHQ) ja kerget (humV1 või humV2) ahelat, mis seob humaniseeritud
antikehi. Transfektsiooniks kasutatakse nelja erineva raskete ja kerget ahelate
ekspressioonivektorite kombinatsiooni (VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 ja
VHQ/humV2) vastavalt järgnevalt protokollile: 20 µg iga plasmiidi
superkeerdudega DNAd segatakse elektroporatsiooni küvetti (0,4 cm vahemik) 8 x 5
106 elusate Sp2/0 rakkudega, mis on suspendeeritud DMEM/10% FCS söötmes.
Elektroporatsiooni seadistusteks on 1500 V, 25 PF, kasutades BioRad
GenePulser seadet. Elektroporatsiooni järel kasvatakse rakke 20 tundi söötmes
(DMEM, millele on lisatud 10% FCS penitsilliini, streptomütsiini ja L-glutamiini).
Teisel päeval lisatakse selektsiooni ravim G418 (kat. nr 10131-019, Gibco) 10
lõppkontsentratsioonis 1 mg toimeainele ning rakud jaotatakse 96-augulisele
plaadile, 200 µl igasse auku ligikaudu 105 rakku augu kohta. 10 kuni 15 päeva
hiljem jaotatakse G418 ellujäänud kloonid G418 sisaldavas söötmes.
Humaniseeritud monokloonsete antikehade eritamist nendest transfektantidest
hinnatakse ELISA analüüsis, kasutades katva antikehana kitse anti-inimese 15
IgG/Fcg (kat. nr 109-005-098, Jackson Labs) ja peroksidaasiga sidestatud inimese
kappa kerge ahela vastu (kat. nr A-7164, Sigma). Transfektandid, mis osutusid
selles testis positiivseteks, valitakse produktiivsuse võrdluseks augu kohta
igapäevaselt, kasutades taas ELISA (vaata alljärgnevat). Iga transfektandi parim
kloon valitakse vahetuks subkloonimiseks piiratud lahjendamisega, kasutades 20
külvitihedust 1 rakk augu kohta. G418 ellujäävate subkloonide produktiivsus
määratakse taas vastavalt eelnevalt kirjeldatud meetodile. Subkloonid viiakse
G418 sisaldavasse söötmesse, kuni kultuuri mahuks saadakse 150 ml, millises
etapis jätkatakse kasvatamist ilma G418 kolbides, mis on mõeldud toitma
rullpudeleid. 25
Pärast esimest transfektsiooni ja valimist kasvavad transfektandid välja 96-
augulistelt plaatidelt tihedusel 20,8% VHE/humV1 suhtes, 11,5 % VHQ/humV1
suhtes, 18,8% VHE/humV2 ja 7,3 % VHQ/humV2 suhtes. Pärast kaht
subkloonimist on kaheks parimaks tootjaks kloonid 1.33.25 (3,87 pg/auk/päev) ja
1.33.26 (3,43 pg/auk/päev) VHE/humV1 ja 12.1.4 (1,19 pg/auk/päev) ja 12.1.20 30
(1,05 pg/auk/päev) VHQ/humV1 osas. Stabiilsed Sp2/0 transfektandid
VHE/humV1 ja VHQ/humV1 suhtes jagatakse seejärel antikeha tootmiseks ja
puhastamiseks.
EE - EP1664122 B1 33
Antikehad puhastatakse stabiilselt transfekteeritud SP2/0 müeloomi rakuliinide
supernatantidest, mis sisaldavad 10% FCS, kasutades afiinsus-kromatograafiat,
mis rakendab immobliseeritud anti-inimese IgGFc maatriksit, ja suurus-
eksklusioonkromatograafiat. Vajadusel eemaldatakse endotoksiin, kasutades
Acticlean Etox kolonni (Sterogene Bioseparations). 5
Humaniseeritud antikeha raske ja kerge ahela ekspressioonivektorit
konstrueerimine ekspressiooniks Sp2/0 rakkudes
Inimese kappa kerge ahela ekspressioonivektorid versioonideks VLh ja VLm:
humV1 (= VL1) või humV2 (= VL2) cDNA amplifitseeritakse PCR CHO
ekspressiooni-plasmiidist SEQ ID nr: 17 või SEQ ID nr: 18, kasutades praimereid 10
HuCD45LC-Mlu (5’-AAAACGCGTTGTGACATTCTGCTGACCCAGTCT-3’; SEQ ID
nr: 42) ja HuCD45LC-Hind (5’-AAAAAAGCTTGGTCCCCTGGCCGAACGTGAA-3’;
SEQ ID nr: 43). Iga 321 bp PCR fragment seeditakse MluI ja HindIII ning
ligeeritakse otse kerge ahela ekspressioonivektorisse chA6HCk.dhfr, mis
seeditakse samade ensüümidega. Saadud plasmiidid nimetatakse LCVL1Sp20 15
(SEQ ID nr: 36; joonis fig. 6) ja LCVL2Sp20 (SEQ ID nr: 39; joonis fig. 7).
LCVL1Sp20 kasutatakse seejärel ekspresseerimiseks humaniseeritud antikeha
VHE/humV1, VHQ/humV1 või VHE-N73D/humV1 Sp2/0 rakkudes; LCVL2Sp20
võidakse seejärel kasutada ekspressiooniks humaniseeritud antikeha
VHE/humV2, VHQ/humV2 või VHE-N73D/humV2 Sp2/0 rakkudes. 20
Inimese gamma-1 raske ahela ekspressioonivektorid VHQ ja VHE versioonideks
Kaks humaniseeritud VH cDNA piirkonda amplifitseeritakse PCR
rekombinantsetest plasmiididest HCMV-G1 HuA6-VHE (SEQ ID nr: 16; joonis fig.
3) ja HCMV-G1 HuA6-VHQ (SEQ ID nr: 15 joonis fig. 2), kasutades PCR
praimereid HuCD45HCEup (5’-CAGGCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCA-3’; 25
SEQ ID nr: 44) või HuCD45HCQup (5’-
CAGGCACAGGTGCAGCTGGTGGAGTCA-3’; SEQ ID nr: 45) ja HuCD45HClo (5’
-AAATCCTTCTAGAACTCACCTGAGGAGAC-3’; SEQ ID nr: 46). PCR
fragmentide’ 3’-otsad seeditakse BstEII. Iga PCR fragment kloonitakse seejärel
raske ahel kasseti vektorisse HCcassREAL, mis on lõigatud BstEII ja jämeda otsa 30
EE - EP1664122 B1 34
lõikajaga HincII. Saadud plasmiidid on vahesaadusteks lõplike ekspressiooni
konstruktide saamisel ning need kannavad vastavalt nimetusi HCcassHVESP20 ja
HCcassHVQSP20. Selle subkloonimise tulemusel muutub ka liiderjärjestus, mis
on seotud mõlema VH piirkonnaga esialgsetes vektorites. Kui vana liiderjärjestuse
aminohappeliseks järjestuseks on MDWTWRVFCLLAVVAPGAHS (SEQ ID nr: 5
47), asendatakse see subkloonimisel MAWVWTLPFLMAAAQSVQA vastu (SEQ
ID nr: 48).
Vahesaadused HCcassVHESP20 või HCcassVHQSP20 seeditakse Scal ja
seejärel seeditakse vastavad plasmiidid BamHI ja EcoRI. 2.9 kb fragmendid, mis
sisaldavad Ig raske ahela promootorit ja VH piirkonda, puhastatakse ja ligeeritakse 10
raske ahela ekspressiooni konstrukti BamHI- ja EcoRI-seeditud 8,7 kb
fragmendiga. Saadud plasmiidid kannavad nimetust HCVHESp20 (SEQ ID nr: 40;
joonis fig. 10) ja HCVHQSp20 (SEQ ID nr: 41; 11); ning neid kasutatakse
ekspressiooniks humaniseeritud antikeha VHE/humV1 VHQ/humV1 Sp2/0
rakkudes. 15
Inimese gamma-1 raske ahela ekspressioonivektor VHEN73D versiooniks
Ekspressioonivektoreid HCVHESp20 (SEQ ID nr: 40; joonis fig. 10) ja
HCVHQSp20 (SEQ ID nr: 41; joonis fig. 11) kasutatakse mallidena saidipõhises
mutageneesis, et saada N73D mutatsioon, (asparagiini muutmine aspartaadiks
humaniseeritud antikeha raske ahela aminohappe asendis 73). See mutatsioon 20
eemaldab arvatava N-glükosüülimise saidi. Mutagenees viiakse läbi QuikChange®
Multi-Site Directed mutageneesi komplektiga (Stratagene), kasutades praimerina
CD45H-N73D (5’-fosfo GCCACACTAACTGCAGACAAATCCATCAGCACAGC-3’;
SEQ ID nr: 49) vastavalt tootja juhistele. Kinnitatakse saadud konstruktide
HCVHEN73DSp20 ja HCVHQN73DSp20 järjestus ning see märgistatakse 25
vastavalt SEQ nr: 37 ja SEQ nr: 38, joonised fig. 8 ja fig. 9. HCVHEN73DSp20
(SEQ nr: 37) kasutatakse koos kerge ahela ekspressiooni konstruktiga LCVL1
SP20 (SEQ nr: 36), et ekspresseerida humaniseeritud antikeha VHE-
N73D/humV1 Sp2/0 rakke.
Stabiilsete Sp2/0 müeloomi transfektantide saamine, mis eriavad humaniseeritud 30
anti-CD45RO/RB antikeha VHE-N73D/humV1
EE - EP1664122 B1 35
Hiire müeloomi rakuliin Sp2/0 Ag14.10 elektroporeeritakse vektoritega, mis
kodeerivad humaniseeritud antikeha VHEN73D/humV1 rasket
(HCVHEN73DSp20; SEQ ID nr: 37) ja kerget (LCVL1SP20; SEQ ID nr: 36) ahelat.
Transfekteerimiseks kasutatakse rakke, mille elujõulisus on eksponentsiaalsel
kasvufaasis kõrgem kui 95%. Rakke pestakse kaks korda külma TF puhvriga (272 5
mM sahharoos, 1 mM MgCl2, 7 mM fosfaadi puhver pH 7,4) ning rakkude
kontsentratsiooniks reguleeritakse 2 x 107 rakku ml kohta TF puhvris. 0,8 ml
rakususpensiooni segatakse 15 µg iga raske ja kerge ahela plasmiidi konstruktiga
ning asetatakse 10 minutiks jääle. Viis transfektsiooni teostatakse
elektroporatsioonis, kasutades Biorad Gene Pulser (280V ja 25 PF). Pärast 10
elektroporatsiooni asetatakse rakud 15 minutiks jääle, misjärel viiakse need 50 ml
külma söötmesse (RPMI-põhine sööde ilma FCS) ja inkubeeritakse 2 päeva
temperatuuril 37 °C ja 5% CO2 atmosfääris.
Transfektantide valimiseks kasvatatakse rakke 1,1 mg/ml G418 kohalolekul
(Geneticin, Gibco lot 3069464) ligikaudu 2 kuni 3 nädalat. dhfr (dihüdrofolaat 15
reduktaas) amplifikatsiooni marker, mis paikneb kerge ahela konstruktil, võimaldab
amplifitseerida dhfr geeni, samuti transgeeni, foolhappe analoogi metotreksaadiga
(MTX). Geeni amplifitseerimiseks kasvatatakse G418 resistentseid rakke 200 nM
MTX kohalolekul 2-3 nädalat, misjärel tõuseb MTX kontsentratsioon täiendavalt
tasemel 1 µM, saades amplifitseeritud heterogeense rakukogumi. Antikeha 20
kontsentratsioon määratakse analüütilise proteiin-A HPLC. Parimad tootvad
kogumid valitakse kloonimiseks piiratud lahjendustega, kasutades külvitihedust 0,3
raku augu kohta, et isoleerida kõrge tootlikkusega kloonid.
Näide 5: Rekombinantsete inimese IgG ekspressiooni määramine ELISAs
VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 ja VHQ/humV2 iseloomustamine 25
Et määrata rekombinantse inimese antikeha IgG kontsentratsioonid, mis
ekspresseeritakse söötme supernatantides, on töötatud välja kihiline ELISA
protokoll, mida on optimeeritud inimese IgG standardina kasutades.
Lamedapõhjalistele 96 auguga mikrotiitri plaatidele (kat. nr 4-39454, Nunc
Immunoplate Maxisorp) lisatakse üle öö temperatuuril 4 °C 100 µl kitse anti-30
inimese IgG (terve molekul, kat. nr I1011, SIGMA) lõppkontsentratsioonil 0,5 µg/ml
EE - EP1664122 B1 36
fosfaat-puhverdatud saliinis. Auke pestakse 3 korda pesupuhvriga (PBS, mis
sisaldas 0,05% Tween 20) ja blokeeritakse poolteist tundi temperatuuril 37 °C
blokeerimispuhvriga (0,5% BSA PBSis). Pärast 3 pesemistsüklit valmistatakse
antikeha proovid ja standardne inimese IgG (kat. nr 14506, SIGMA), 1,5-kordset
seerialahjendust blokeerimispuhvris. 100 µl lahjendatud proove või standardit 5
viiakse kahekordselt kaetud plaadile ning inkubeeritakse 1 tund toatemperatuuril.
Inkubeerimise järgselt pestakse plaate kolm korda pesupuhvriga, inkubeeritakse
seejärel 1 tund 100 µl mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud kitse anti-inimese
IgG kappa kerge ahelaga (kat. nr A-7164, SIGMA), mida on lahjendatud 1/4000
blokeerimispuhvris. Kontrollrakud saavad 100 µl blokeerimispuhvrit või 10
kontsentreeritud tavalist söödet. Pärast segu teostatakse seotud peroksidaasi
kolorimeetriline kvantifitseerimine proovis ja standardaukudes, kasutades TMB
Peroksidaas EIA substraadi komplekti (kat. nr 172-1067, Bio-Rad) vastavalt tootja
juhistele. Peroksidaasi mikstuurile lisatakse koguses 100 µl augu kohta ja
inkubeeritakse 30 minutit toatemperatuuril pimedas. Kolorimeetriline reaktsioon 15
peatatakse 100 µl 1 M väävelhappe lisamisega ning absorptsioon igas augus
loetakse 450 nm juures, kasutades ELISA plaadi lugejat (Model 3350-UV,
BioRad).
Korrelatsioonikoefitsiendiga 0,998 IgG standardkõvera jaoks määratakse
järgnevad kontsentratsioonid nelja erineva söötme kontsentraatide osas (ca 250-20
300kordselt kontsentreeritud), mis on saadud transfekteeritud COS rakkudest:
VHE/humV1 supernatant = 8,26 µg/ml
VHE/humV2 supernatant = 6,27 µg/ml
VHQ/humV1 supernatant = 5,3 µg/ml
VHQ/humV2 supernatant = 5,56 µg/ml 25
Suurus-eksklusioonkromatograafia (SEC)
Afiinsus-puhastatud antikehi VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 ja
VHQ/humV2 analüüsitakse suurus-eksklusioonkromatograafias (SEC) TSKgel
Super SW3000SWXL, et määrata valgusisaldus, väikeste agregaatide protsent
(oligomeersed antikehad), samuti võimalikud kõrval- ja lagunemissaadused. 30
Kromatogrammid näitavad VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 ja
EE - EP1664122 B1 37
VHQ/humV2 suhtes, et peamine piik on lõhenenud ja et eraldumine on nähtavam
kogumite puhul raske ahelaga E (joonis fig. 12). Saadud tulemused näitavad, et on
vähemalt kaks molekuli retentsiooniajaga, mis on tüüpiline IgG antikehale, mis
sisaldub igas proovis.
SDS-PAGE redutseerivatel tingimustel 5
Humaniseeritud CD45RO/RB siduvate molekulide VHE/humV1, VHE/humV2,
VHQ/humV1 ja VHQ/humV2 analüüs SDS-PAGE redutseerivatel tingimustel
(gradient geel, 4 kuni 20% Tris-Glycine gel, Novex) näitab ootamatu täiendava riba
kohalolu, mis migreerub veidi riba kohal, vastates raske ahela ribale igas proovis.
Massierinevus hinnatakse olevat vahemikus 2 kuni 4 kDa. Western Blot analüüs 10
näitab, et ülemise riba tunnevad ära anti-inimese (H + L) antikehad, lubades
oletada, et täiendav riba on raske ahela variant.
Katioonvahetus-kromatograafia (CEX)
Laengu heterogeensust hinnatakse katioonvahetus-kromatograafias (CEX),
kasutades PolyCatA kolonni (PolyLC Inc). Ehkki kimäärne monokloonne antikeha 15
sisuliselt laengu heterogeensust ei sisalda, välja arvatud C-otsa lüsiini variandid,
on kõik humaniseeritud CD45RO/RB siduvad molekulid, s.o VHE/humV1,
VHE/humV2, VHQ/humV1 ja VHQ/humV2 oma laengult väga heterogeensed.
Laengu heterogeensuse tavaliseks põhjuseks antikehades on Lys
kohalolu/puudumine antikeha raske ahela C-otsas, mille tulemuseks on kolm piiki 20
CEXis. Nähtavate piikide kõrge arv igal kromatogrammil (>10; joonis fig. 13)
näitab, et vähemalt üks täiendab modifikatsioon sisaldub kõigis neljas
CD45RO/RB siduvas molekulis.
SDS-PAGE
Et hinnata molekulaarseid erinevusi kahe antikeha liigi vahel, mis sisalduvad valgu 25
kogumites VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 ja VHQ/humV2, valitakse
VHE/humV2 täiendavaks analüüsiks. VHE/humV2 kaks SEC piiki kogutakse pool-
ettevalmistaval moel ja analüüsitakse uuesti SECis, et kinnitada nende puhtus.
SECiga kogutud fraktsioone (fraktsioon 1 ja fraktsioon 2) analüüsitakse seejärel
EE - EP1664122 B1 38
SDS-PAGE redutseerimise tingimustel. Ootamatu lisariba proportsioon ligikaudu
49 kDa juures on kahe fraktsiooni vahel erinev. Fraktsioon 2 seda täiendavat
kõrgemat riba praktiliselt ei sisalda.
ESI-Q-TOF massispektromeetria
SEC fraktsioone F1, F2 ja VHE/humV2 valgukogumit analüüsitakse seejärel ESI-5
Q-TOF massispektromeetrias. Valgukogumi ja fraktsiooni 2 spektrogrammides
täheldatakse samu signaalide gruppe. Esimene signaalide grupp on ligikaudu 148
000 Da valgukogumis ja fraktsioonis 2, aga seda ei tuvastatud fraktsioonis 1.
Fraktsioonis 1 tuvastatakse teine signaalide grupp (ligikaudu 150 300 Da) lisaks
signaalide grupile ligikaudu 152 500 Da. Teist signaalide gruppi ligikaudsel 10
tasemel 150 320 Da ei tuleks korreleeruda tavaliselt täheldatud antikeha
vormidega. Need avastused näitavad, et SECi kaks piiki ja kaks ülemist riba
redutseeritud SDS-PAGEs vastavad kõik oodatud valgu variantidele.
Pöördfaasiline kromatograafia
Et saada massispektromeetrias vähem keerukam muster, analüüsitakse antikeha 15
ahelaid täiendavalt eraldi. Fraktsioonid redutseeritakse ja alküülitakse. Et kinnitada
reaktsioonide täielikkust order analüüsitakse redutseeritud ja alküülitud proove
pöördfaasilises (RP) kromatograafias (SORBAX, Poroshell 300SB-C8). Pärast
redutseerimist ja alküülimist on piigi kuju peaaegu sama kui vaid redutseerimise
järel. Täheldatakse nihet retentsiooniajas. Sarnased mustrid saadakse SEC 20
fraktsiooni 1 ja fraktsiooni 2 redutseeritud ja alküülitud proovide kohta.
VHE/humV2 valgukogumi proovi, SEC fraktsiooni 1 ja SEC fraktsiooni 2
(redutseeritud ja alküülitud) analüüsitakse ESI-Q-TOF massispektromeetrias. Mitu
massi piiki on võimalik määrata oodatud antikeha vormidele. Samad põhilised
piigid leiduvad kõigis kolmes proovis (valgukogum, F1 ja F2), aga nende 25
intensiivsused fraktsioonis 2 on väga madalad (joonis fig. 14).
Raske ahela variantide süsivesikute analüüs
Redutseeritud ja alküülitud antikeha süstitakse pöördfaasilise (RP) kromatograafia
kolonni ning kogutakse need kaks piiki, mis vastavad raske ahela variantidele.
Seejärel määratakse nende RP-fraktsioneeritud antikehade oligosahhariidi 30
EE - EP1664122 B1 39
profiilid. Eeldatavate G0 ja G1 oligosahhariidide jääkide seas, mis leiduvad kõigis
proovides, tuvastatakse mitugi teist piiki fraktsiooni 1 kromatogrammis (nende
piikide jäljed on samuti tuvastatavad fraktsiooni 1 ja valgukogumi
kromatogrammides).
Koos võetuna osutavad need tulemused, et suuremad antikeha liigid sisaldavad 5
täiendavat glükosülatsiooni, mida SP2/0 ekspresseeritud monokloonsete
antikehade puhul tavaliselt ei kohta tingituna massi erinevusest. Et suur, keerukas
glükosülatsioon, mis tuvastatakse süsivesinike analüüsis ja massispektromeetrias,
on väga ebatõenäoline konserveerunud saidi puhul antikeha konstantses
piirkonnas, otsitakse muid võimalike saite humaniseeritud antikehade 10
aminohappelises järjestuses. Potentsiaalne sait (N73) N-glükosüülimiseks (N-X-S)
identifitseeritakse kahe raske ahela variandi varieeruvas domäänis.
Ettevalmistav fraktsioneerimine CEXis
Täiendavad analüüsid teostatakse materjaliga, mis on puhastatud VHE/humV1
kogumist. Et vähendada materjali heterogeensust, eemaldatakse C-otsa lüsiin 15
karboksüpeptidaas-B töödeldes. VHE/humV1 antikeha fraktsioneeritakse
ettevalmistavad katioonvahetus-kromatograafias, kasutades SP sefaroosi
(Pharmacia). Kolonn tasakaalustatakse 25 mM naatriumfosfaadi puhvriga, pH 6,0
(= puhver A) ja seotud valku elueeritakse 250 mM NaCl puhvris A (= puhver B;
gradient 0-65% B-st). Fraktsioonide puhtust analüüsitakse CEX abil. Kogutud 20
fraktsioonid süstitakse taas SEC kolonni, et leida võimalik korrelatsioon kahe
tehnika abil saadud tulemuste vahel. See kromatogramm näitab, et esimene
piikide rühm, mis saadi CEX tehnikas, korreleerub eelpiigiga antikeha SEC
analüüsis, ning et piikide teine rühm, mis saadi CEX tehnikas, ühtib esimese
piigiga valgukogumi SEC analüüsis (või fraktsiooni 1 analüüsis), ning et viimane 25
piik CEX tehnikas elueerib viimase piigina SEC tehnikas (või fraktsiooniga 2).
Järeldusena võib märkida, et eelkirjeldatud tulemused (SEC fraktsioonide 1 ja 2
oligosahhariidide profiil, CEX muster, mis saadi pärast de-karboksüülimist, SEC
muster, mis saadi CEX tehnikas, massispektromeetrias kogutud fraktsioonide
kohta) osutavad tugevalt komplekssete oligosahhariididega antikeha liikide 30
kohalolule, põhjustades a) massi heterogeensust, tingides topeltpiigi SEC tehnikas
EE - EP1664122 B1 40
ja b) täheldatud kahekordse raske ahela riba redutseeritud SDS-PAGE laengu
heterogeensuses, mille tulemusel saadakse CEX muster.
CEX fraktsioonide analüütiline iseloomustamine
Et suuremad antikeha liigid elueerivad CEX tehnikas varem, osutades sellele, et
nad on vähem positiivselt laetud, mõõdetakse siaalhappe kohalolu (komplekse 5
glükosülatsiooni komponent ja negatiivselt laenguga) erinevates fraktsioonides,
mis on saadud ettevalmistavas CEX. Siaalhape sisaldub erinevatel tasemetel
kõigis 4 proovis. Leitud siaalhape on kõige tõenäolisemalt N-glükolüül-
neuramiinhappe kujul (vastavalt lühemalt retentsiooniajale N-
atsetüülneuramiinhappe standardiga võrreldes). Siaalhappe väga madal kohalolu 10
ühes CEX fraktsioonis erinevalt selle rohkusest teises CEX fraktsioonis vihjab
tugevalt asjaolule, et negatiivselt laetud suhkru komponent etendab osa
massi/laenu heterogeensuses. CEX fraktsioone analüüsitakse ESI-Q-TOF
massispektromeetrias.
SDS-PAGE 15
Samu fraktsioone analüüsitakse SDS-PAGE tehnikas redutseerivatel tingimustel.
Võib järeldada, et ülemine raske ahela riba vastab antikeha osale, millel on
kompleksne oligosahhariidi profiil, mis sisaldab siaalhapet. Madalama raske ahela
riba vastab eeldatud antikehale, millele on konventsionaalne oligosahhariidi profiil.
Papaiiniga seeditud CEX fraktsioonide eraldamine Mono-S kolonnis 20
Et kinnitada potentsiaalse glükosüülimise saidi kasutust raske ahela varieeruvas
domäänis, töödeldakse ligikaudu 1 mg iga CEX fraktsiooni papaiiniga, et eraldada
antikeha Fab ja Fc osa. Ettevalmistav kromatograafia teostatakse Mono-S
kolonnis. Kogutud allfraktsioonid süstitakse uuesti RP kolonni, et identifitseerida
selle sisu Fab ja/või Fc domäänide osas. Kogutud allfraktsioone analüüsitakse 25
ESIQ-TOF massispektromeetrias. Saadud tulemused näitavad, et a)
konserveerunud glükosüülimise saiti raske ahela Fc osas hõivavad biantennilised
oligosahhariidi vormid ühegi (G0), ühe (G1) või kahe otsa (G2) galaktoosi
üksustega; b) ning et vastupidi, ebaregulaarne glükosüülimise sait (N73) kannab
kompleksseid oligosahhariide, mis sisaldavad N-glükolüül neuramiinhapet. 30
EE - EP1664122 B1 41
Järelduseks võib nentida, et asparagiini jääk N73 raske ahela varieeruvas
piirkonnas on osaliselt N-glükosüülitud. Need suhkru liigid tingivad massi
heterogeensust, samuti laengu heterogeensust, mis on tuvastatavad SDSPAGE,
suurus-eksklusioonkromatograafia ja katioonvahetus-kromatograafia abil.
VHE-N73D/humV1 iseloomustamine 5
Et kõrvaldada humaniseeritud VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 ja
VHQ/humV2 antikehade heterogeensus, asendatakse asparagiini jääk raske ahela
varieeruva piirkonna asendis N73 asparagiinhappe jäägiga (vt näide 4). VHE-
N73D/humV1 analüüsitakse seejärel edasi:
Suurus-eksklusioonkromatograafia analüüs (SEC) 10
SEC teostatakse vastavalt ülalkirjeldatule. SEC analüüsis täheldatakse selget
erinevust VHE/humV1 ja VHE-N73D /humV1 vahel. Erinevalt topeltpiigist, mis
saadi VHE/humV1 puhul, saadakse VHE-N73D/humV1 puhul vaid üks piik (joonis
fig. 12). Ligikaudu 0,2% agregaatidest kvantifitseeritakse SEC tehnikas.
SDS-PAGE redutseerivatel tingimustel 15
VHE/humV2 ja VHE-N73D/humV1 analüüsitakse edasi SDS-PAGE tehnikas
redutseerivatel tingimustel, nagu eelnevalt kirjeldatud. VHE-N73D/humV1 puhul on
nähtav vaid üks riba eeldatavas raske ahela (HC) asendis (ligikaudu 50 kDa). HC-
riba, mida täheldatakse VHE-N73D/humV1 puhul, vastab VHE/humV2 topelt-
madalamale ribale. Kerge ahela asend on kõigi analüüsitud valkude puhul sama. 20
Katioonvahetus-kromatograafia (CEX)
Katioonvahetus-kromatograafia (CEX) teostatakse, nagu eelnevas kirjeldatud.
CEX analüüsis saadud tulemused näitavad, et VHE-N73D/humV1 laenu
heterogeensust vähendatakse C-otsa lüsiini variantides (kolm piiki), võrreldes
VHE/humV2 laengu kõrge heterogeensusega (>10; joonis fig. 13) MALDI TOF 25
analüüsis (massispektromeetria)
EE - EP1664122 B1 42
Raske ja kerge ahela MALDI TOF analüüsis (massispektromeetria) tuvastatud
mass on kooskõlas eeldatava massiga, mis on järeldatud VHE-N73D/humV1
aminohappelisest järjestusest.
Pöördfaasiline kromatograafia (RP)
Pärast redutseerimist DDT tehnikas analüüsitakse kaht humaniseeritud antikeha 5
VHE/humV2 ja VHE-N73D/humV1 pöördfaasilises kromatograafias (RP).
Tingituna osaliselt glükosüülimisest aspargiinil N73, täheldatakse „raskeid ahelaid“
VHE/humV2 (topeltpiik ligikaudu 18,5 min) puhul piikide seas, mis vastavad
kergele ahelale (ligikaudu 17,3 min). VHE-N73D/humV1 puhul täheldatakse raskel
ahelal üksnes üht piiki (joonis fig. 14). 10
Näide 6: FACS võrdlusanalüüs (sidumisafiinsus)
Inimese T-rakuliin PEER valitakse sihtrakuks FACS analüüsiks, sest see
ekspresseeris oma rakupinnal CD45 antigeeni. Et analüüsida humaniseeritud
antikeha supernatantide sidumisafiinsust, teostatakse võrdluskatsed, kasutades
FITC-märgistatud kimäärset antikeha võrdlusena ja võrreldes puhastatud hiire 15
antikeha ja kimäärse antikeha inhibitsiooniga. PEER rakukultuure tsentrifuugitakse
10 sekundit pööretel 3000 p/min ning sööde eemaldatakse. Rakud
resuspendeeritakse FACS puhvris (PBS, mis sisaldab 1% FBS ja 0,1 %
naatriumasiidi) ja külvatakse 96-augulisele ümarapõhjalisele mikrotiitri plaadile
rakutihedusel 1x105 rakku augu kohta. Plaati tsentrifuugitakse ja supernatant 20
eemaldatakse. Blokeerimise uuringuteks lisatakse esimesse auku esmalt 25 µl
kontsentreeritud transfekteerimata söödet või isotüüpi, mis sobitub
kontrollantikehaga (negatiivsed kontrollid), märgistamata hiire antikeha või
kimäärset antikeha (positiivsed kontrollid), samuti kontsentreeritud supernatanti,
mis sisaldab erinevates tekstis märgitud kogustes humaniseeritud antikeha 25
(proovid). Pärast 1 tundi inkubeerimist temperatuuril 4 °C pestakse PEER rakke
200 µl FACS puhvriga tsentrifuugides. Rakke inkubeeritakse seejärel 1 tund
temperatuuril 4 °C kimäärse antikehaga, mis on konjugeeritud FITC 25 µl FACS
puhvris lõppkontsentratsioonis 20 µg/ml. Rakke pestakse ja resuspendeeritakse
300 µl FACS puhvris, mis sisaldab 2 µg/ml propiidiumjodiidi, mis võimaldab juhtida 30
EE - EP1664122 B1 43
elujõulisi rakke. Rakukoostisi analüüsitakse voolutsütomeetris (FACSCalibur,
Becton Dickinson).
FACS analüüsid näitavad doosist sõltuvat fluorokroom-märgistatud kimäärse
antikeha blokeerimist kontsentreeritud humaniseeritud antikeha kultuuri
supernatantidega. Doosist sõltuvat kimäärset antikeha sidumise blokeerimist ei 5
täheldata sobiva isotüübiga kontrollantikeha korral, mis tõendab asjaolu, et
erinevate humaniseeritud antikeha kombinatsioonide blokeeriv toime on epitoobi-
spetsiifiline ja et epitoobi-spetsiifilisus säilib pärast humaniseerimise protsessi.
Lahjendamata supernatanti eelnevalt nimetatud SP2/0 transfektantidest või
kimäärset antikehast (positiivsed kontrollid) või sobiva isotüübiga 10
kontrollantikehast (negatiivsed kontrollid) inkubeeritakse tasemel 2 µg/ml söötmes
1,5 x 105 PEER rakkudega 100 µl 30 minutit temperatuuril 4 °C. Seejärel lisatakse
100 µl PBS, mis sisaldab FITC-märgistatud kimäärset antikeha, igale proovile ning
inkubeerimine temperatuuril 4 °C jätkub veel 30 minutit. Pärast pesemist
resuspendeeritakse rakud FACS-PBS, mis sisaldab 1 µg/ml 7-amino-aktinomütsiin 15
D, ja analüüsitakse voolutsütomeetrias, kasutades Becton Dickinson FACSCalibur
seadet ja CellQuest Pro tarkvara. Sulgemine („gating“) teostatakse elusrakkudel,
s.o 7-amino-aktinomütsiin D – negatiivsed sündmused.
FACS analüüsid näitavad, et märgistamata humaniseeritud CD45RB/RO siduvad
molekulid, nt VHE/humV1 ja VHQ/humV1, aga mitte sobiva isotüübiga 20
kontrollantikeha, konkureerivad FITC-märgistatud kimäärse antikehaga, et siduda
inimese CD45-positiivset T-rakuliini PEER.
VHE-N 73D/humV1 spetsiifilisus
Et hinnata, kas humaniseeritud CD45R0/RB siduva molekuli VHE/humV1
modifitseerimine, s.o asparagiini vahetus aspartaadi vastu CD45RO/RB siduva 25
molekuli raske ahela aminohappe asendis 73, modifitseeris reaktiivsust
samatüvelise epitoobiga, analüüsitakse VHE-N73D/humV1 reaktiivsust CD45-
ekspresseeriva inimese T-rakuliini PEER sidumise võrdluskatses.
PEER rakke inkubeeritakse VHE-N73D/humV1, selle kimäärse eellasega või
mitte-siduva isotüübi IgG1 kontrollantikehaga. Sidumata antikeha pestakse välja ja 30
EE - EP1664122 B1 44
rakke inkubeeritakse fluorestseiinisotiotsüanaat-(FITC)-märgistatud kimäärse anti-
CD45R0/RB monokloonse antikehaga või FITC-märgistatud isotüübi IgG1
kontrollantikehaga. Pärast pesemist teostatakse rakkudega voolutsütomeetria
analüüs, et määrata FITC-märgistatud antikeha kogus, mis on seotud
eelinkubeeritud PEER rakuga: PEER rakukultuure tsentrifuugitakse 10 minutit 400 5
korda standardse raskusjõuga (g) ja sööde eemaldatakse. Rakud
resuspendeeritakse FACS puhvris (PBS, mis sisaldab 1 mahu% FBS, 0,1
mass/mahu% EDTA ja 0,1 mass/mahu% naatriumasiidi) ja külvatakse 96-
augulistele V-põhjaga mikrotiiri plaatidele tihedusel 1 x 105 rakku augu kohta.
Plaati tsentrifuugitakse ja supernatant eemaldatakse. Iga rakkude proovi 10
inkubeeritakse 30 minutit temperatuuril 4 °C 50 µl FACS puhvris, mis sisaldab 20
µg/ml kimäärset anti-CD45R0/RB monokloonset antikeha, VHE-N73D/humV1 või
IgG1 kontrollantikeha. Järgmiseks pestakse PEER rakke kaks korda 150 µl FACS
puhvriga tsentrifuugides. Rakke inkubeeritakse seejärel 30 minutit temperatuuril 4
°C 50 µl FACS puhvris, mis sisaldab 20 µg/ml FITC-konjugeeritud kimäärset 15
monokloonset antikeha või FITC-konjugeeritud 3G5 kontrollantikeha. Lõpuks
pestakse rakke ja resuspendeeritakse 200 µl FACS puhvris, mis sisaldab 7-amino
aktinomütsiin D (7-AAD) tasemel 1 µg/ml, mis võimaldab identifitseerida
elujõulised rakud analüüsi käigus. Rakukoostisi analüüsitakse FACSCalibur
voolutsütomeetriga (Becton Dickinson). 20
Täheldatakse, et märgistamata VHE-N73D/humV1 ja märgistamata kimäärne anti-
CD45R0/RB monokloone antikeha, aga mitte IgG1 kontrollantikeha, takistavad
FITC-märgistatud kimäärset anti-CD45R0/RB monokloonset antikeha sidumast
CD45-ekspresseerivat PEER rakke, nagu määratud langenud fluorestsentsi
signaaliga. Järeldusena leiti, et VHE/humV1 antikeha modifitseerimine VHE-25
N73D/humV1 antikehaks ei muuda humaniseeritud anti-CD45R0/RB siduva
molekuli epitoobi-spetsiifilisust.
VHE-N73D/humV1 antikeha afiinsuse inimese või cynomolgus ahvi CD45 suhtes
Et määrata VHE-N73D/humV1 antikeha afiinsust selle epitoobi suhtes, võidakse
kvantifitseerida VHE-N73D/humV1 reaktiivsus inimese CD45-ekspresseeriva T-30
rakuliiniga PEER või cynomolgus ahvi CD45-ekspresseeriva T-rakuliiniga HSC-F
EE - EP1664122 B1 45
sidumise võrdluskatses, mis on sarnane meetodiga, mida on kirjeldanud Daley et
al., 1995; J. Mol. Biol. 253:243.
Lühidalt kasutatakse PEER või HSC-F rakkude määrimise intensiivsust FITC-
märgistatud antikehaga erinevates kontsentratsioonides märgistamata
konkureeriva antikeha kohalolekul, et arvutada märgistamata antikehade 5
afiinsused. Täpsemalt mõõdetakse esimeses etapis FITC-märgistatud hiirest
derivatiseeritud anti-inimese CD45RB/RO antikeha A6 (mA6) kontsentratsioon ja
fluorokroomi märgistuse stöhhiomeetria. Järgmiseks määratakse sihtmolekuli
CD45 kontsentratsioon PEER või HSC-F rakuliini pinnal eelnevalt nimetatud FITC-
konjugeeritud mA6 yes (hiirest derivatiseeritud anti-inimese CD45) antikeha abiga, 10
kasutades teada molekulaarse märgistusastmega fluorestsentseid pärleid.
Rakuliste CD45 retseptorite kontsentratsiooni ja selle teada FITC-konjugeeritud
ligandiga määratakse FITC-konjugeeritud mA6 afiinsus rakuliste CD45 retseptorite
suhtes FACS-põhises tasakaalu tiitrimise meetodis. Lõpuks määratakse
märgistamata antikeha VHE-N73D/humV1 afiinsus konkureerivate 15
määrimisreaktsioonide põhjal FITC-konjugeeritud mA6ga PEER või HSC-F
rakkudel, mõõtes FITC fluorestsentsi kasvu VHE-N73D/humV1
kogukontsentratsiooni funktsioonina. Kui kuupvõrrandit, mis on sidumise tasakaalu
algebraliselt eksplitsiitseks kirjelduseks kahe ühe retseptori sidumise osas
konkureeriva ligandi mikstuuris, rakendatakse programmis Origin 7.5, kasutatakse 20
selle tarkvara programmi, et arvutada VHE-N73D/humV1 dissotsiatsioonikonstandi
(Kd) väärtus korduvate kõverale paigutamise analüüsides.
Ühes katses arvutati VHE-N73D/humV1 dissotsiatsioonikonstandiks inimese
PEER rakulise sihtmärgi suhtes 2,44 ± 0,07 nM - cynomolgus HSC-F rakuliini
suhtes aga 1,67 ± 0,00 nM, eeldades divalentse antikeha seostumist CD45RO/RB 25
sihtmolekulidega.
Näide 7: CD45RB/RO siduvate molekulide bioloogilised aktiivsused
Selles uuringus vaatlesime, kas CD45RB/RO siduv kimäärne antikeha, kui see
sisaldub polükloonselt aktiveeritud primaarsetes inimese T-rakkude kultuurides, (i)
toetab T-rakkude eristumist neile omase Treg fenotüübiga, (ii) takistab või 30
EE - EP1664122 B1 46
soodustab apoptoosi pärast T-rakkude aktiveerimist, ja (iii) mõjutab alamhulga-
spetsiifiliste antigeenide ja retseptorite ekspressiooni pärast restimulatsiooni.
CD45RB/RO siduv kimäärne antikeha parendab rakusurma polükloonselt aktiveeritud T-rakkudes
Primaarsed T-rakud (CD4+ ja CD8+ T-rakkude alamhulkade segu) aktiveeriti anti-5
CD3 ning anti-CD28 monokloonse antikehaga (iga 200 ng/ml) CD45RB/RO siduva
kimäärse antikeha kohalolekul või puudumisel (=kontroll). Antikeha liiased
eemaldatakse pesuga teisel päeval. 7-amino-aktinomütsiin D (7-AAD) DNA-
määriva värvina võetakse üles apoptootiliste ja nekrootiliste rakkudega, et mõõta
aktivatsiooni järgset rakusurma. Saadud tulemused näitavad, et T-rakkude 10
aktiveerimine CD45RB/RO siduva kimäärse antikeha kohalolekul suurendas 7-
AAD positiivsete rakkude fraktsioone kahekordselt teisel päeval pärast
aktiveerimist. Seitsmendal päeval oli 7-AAD positiivsete rakkude osakaal taas
sarnane nii CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga töödeldud kultuurides kui ka
kontrollkultuurides. 15
CD45RB/RO siduva kimäärne antikeha, aga mitte monokloone kontrollantikeha, mida on töödeldud T-rakkudega, näitavad T-regulaatorraku (Treg) fenotüüpi
CD25 suurenenud ekspressioon ja negatiivne reguleeriv valk CTLA-4 (CD152) on
Treg rakkude markeriteks. Primaarsete ja sekundaarsete T-raku vastuste 20
funktsionaalne supressioon CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga võib olla
tingitud Treg rakkude induktsioonist. Selle uurimiseks aktiveeritakse T-rakud anti-
CD3 + CD28 monokloonsete antikehadega ja neid kasvatakse CD45RB/RO
siduva kimäärse antikeha või anti-LPS monokloonse kontrollantikeha kohalolekul.
CTLA-4 ja CD25 ekspressiooni ajaline kulg näitab olulisis erinevusi kontrollide ja 25
CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga töödeldud T-rakkude vahel esimesel ja
kolmandal päeval pärast sekundaarset stimuleerimist, näidates Treg fenotüüpi.
Rakusisest CTLA-4 ekspressiooni säilitatakse CD45RB/RO siduva kimäärse antikeha kohalolekul
EE - EP1664122 B1 47
On täheldatud, et rakusiseselt võib leiduda olulises koguses CTLA-4. Seega
analüüsiti paralleelselt CTLA-4 pinna värvimiseks CTLA-4 rakusisest
ekspressiooni. Mõõdukad erinevused T-raku kultuuride vahel esinesid neljandal
päeval pärast stimuleerimist. Pärast pikemaajalist kasvatamist aga püsisid kõrged
rakusisesed CTLA-4 tasemed üksnes CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga 5
töödeldud T-rakkudes, mitte aga kontroll-T-rakkudes.
CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga töödeldud T-rakud muutuvad topeltpositiivseks CD4 ja CD8 suhtes
Pärast stimuleerimist indutseerivad ja üles-reguleerivad T-rakud mitmete
pinnaretseptorite, näiteks CD25, CD152 (CTLA-4), CD154 (CD40-Ligand) ja teiste 10
selliste ekspressiooni. Samas arvatakse, et CD4 või CD8 ekspressiooni tase jääb
suhteliseks konstantseks. Vaatlesime reprodutseeritavalt nii CD4 kui ka CD8
antigeenide olulist kasvu CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga töödeldud T-
rakkudel, aga mitte kontrollantikehaga töödeldud T-rakkudel pärast aktiveerimist.
CD4/CD8 topeltpositiivse T-raku populatsiooni esinemine näib olevat tingitud CD4 15
ülesreguleerimisest CD8+ alamhulgas ja CD8 ülesreguleerimisest CD4+
alamhulgas. See on vastuolus topeltpositiivsete T-rakkude madala protsendiga
kontrollkultuurides.
Kõrge IL-2 retseptori aIfa-ahela, aga väga madal beeta-ahela ekspressioon CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga töödeldud T-rakkudega 20
Treg on teadaolevalt püsivalt positiivsed CD25 suhtes, IL-2 retseptori alfa-ahela
suhtes. Trimeerse IL-2 retseptori muude allüksuste reguleerimine Treg rakkudel on
tundmata. Hiljuti võrdleseime IL-2 retseptori, näiteks CD122 beeta-ahela
ekspressiooni T-rakkudel, mida on aktiveeritud ja propageeritud CD45RB/RO
siduva kimäärse antikeha kohalolekul või puudumisel. Need tulemused näitavad, 25
et CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga töödeldud T-rakkudel on ligikaudu
kümnekordselt madalam CD122 ekspressioon, võrreldes T-rakkudega
kontrollkultuurides. See erinevus võib näidata, et Treg rakud eeldavad vohamiseks
IL-2-st erinevaid faktoreid.
Näide 8: Leiutise järjestused (leiutise CDR järjestused on alla joonitud) 30
EE - EP1664122 B1 48
SEQ ID nr: 1 Kimäärse kerge ahela aminohappelise järjestuse osa
SEQ ID nr: 2 Kimäärse raske ahela aminohappelise järjestuse osa 5
SEQ ID nr: 3 Kimäärse kerge ahela aminohappeline järjestus
SEQ ID nr: 4 10
Kimäärse raske ahela aminohappeline järjestus
SEQ ID nr: 5 Polüpeptiidi SEQ ID nr: 1 kodeeriv nukleotiidjärjestus
15 SEQ ID nr: 6
EE - EP1664122 B1 49
Polüpeptiidi SEQ ID nr:2 kodeeriv nukleotiidjärjestus
SEQ ID nr: 7 Humaniseeritud kerge ahela humV2 (humV2 = VLm) aminohappelise järjestuse osa 5
SEQ ID nr: 8 Humaniseeritud kerge ahela humV1 (humV1 = VLh) aminohappelise järjestuse osa
10 SEQ ID nr: 9 Humaniseeritud raske ahela VHE aminohappelise järjestuse osa
SEQ ID nr: 10 Humaniseeritud raske ahela VHQ aminohappelise järjestuse osa 15
SEQ ID nr: 11 Aminohappelist järjestust SEQ ID nr: 9 kodeeriv nukleotiidjärjestus
EE - EP1664122 B1 50
SEQ ID nr: 12 Aminohappelist järjestus SEQ ID nr: 10 kodeeriv nukleotiidjärjestus
SEQ ID nr: 13 5
Aminohappelist järjestust SEQ ID nr: 7 kodeeriv nukleotiidjärjestus
SEQ ID nr: 14 Aminohappelist järjestust SEQ ID nr: 8 kodeeriv nukleotiidjärjestus
10
SEQ ID nr: 15
EE - EP1664122 B1 51
Ekspressioonivektori HCMV-G1 HuA6-VHQ (humaniseeritud raske ahela ekspressioonivektori täielik DNA järjestus, mis hõlmab SEQ ID nr: 12 (VHQ) 3921-4274) nukleotiidjärjestus
EE - EP1664122 B1 52
EE - EP1664122 B1 53
EE - EP1664122 B1 54
EE - EP1664122 B1 55
EE - EP1664122 B1 56
SEQ ID nr: 16 Ekspressioonivektori HCMV-G1 HuA6-VHE (humaniseeritud raske ahela ekspressioonivektori täielik DNA järjestus, mis hõlmab SEQ ID nr: 11 (VHE) 3921-4274) nukleotiidjärjestus 5
EE - EP1664122 B1 57
EE - EP1664122 B1 58
EE - EP1664122 B1 59
EE - EP1664122 B1 60
EE - EP1664122 B1 61
SEQ ID nr: 17 Ekspressioonivektori HCMV-K HuAb-VL1 hum V1 (humaniseeritud raske ahela ekspressioonivektori täielik DNA järjestus, mis hõlmab SEQ ID nr: 14 (humV1=VLh) 3964-4284) nukleotiidjärjestus 5
EE - EP1664122 B1 62
EE - EP1664122 B1 63
EE - EP1664122 B1 64
EE - EP1664122 B1 65
EE - EP1664122 B1 66
EE - EP1664122 B1 67
SEQ ID nr: 18 Ekspressioonivektori HCMV-K HuAb-VL1 hum V2 (humaniseeritud kerge ahela ekspressioonivektori täielik DNA järjestus, mis hõlmab SEQ ID nr: 13 (humV2=VLm) 3926-4246) nukleotiidjärjestus 5
EE - EP1664122 B1 68
EE - EP1664122 B1 69
EE - EP1664122 B1 70
EE - EP1664122 B1 71
EE - EP1664122 B1 72
EE - EP1664122 B1 73
SEQ ID nr: 31: Humaniseeritud raske ahela VHE-N73D aminohappelise järjestuse osa
SEQ ID nr: 32: 5
Humaniseeritud raske ahela VHQ-N73D aminohappelise järjestuse osa
SEQ ID nr: 33: Aminohappelist järjestust SEQ ID nr: 8 kodeeriv nukleotiidjärjestus
EE - EP1664122 B1 74
SEQ ID nr: 34: Aminohappelist järjestust SEQ ID nr: 31 kodeeriv nukleotiidjärjestus
SEQ ID nr: 35 5
Aminohappelist järjestust SEQ ID nr: 32 kodeeriv nukleotiidjärjestus
SEQ ID nr 36 Ekspressioonivektori LCVL1Sp20 nukleotiidjärjestus
10
EE - EP1664122 B1 75
EE - EP1664122 B1 76
EE - EP1664122 B1 77
EE - EP1664122 B1 78
EE - EP1664122 B1 79
SEQ ID nr: 37 Ekspressioonivektori HCVHEN73DSp20 nukleotiidjärjestus
EE - EP1664122 B1 80
EE - EP1664122 B1 81
EE - EP1664122 B1 82
EE - EP1664122 B1 83
EE - EP1664122 B1 84
EE - EP1664122 B1 85
SEQ ID nr: 38 Ekspressioonivektori HCVHQN73DSp20 nukleotiidjärjestus
EE - EP1664122 B1 86
EE - EP1664122 B1 87
EE - EP1664122 B1 88
EE - EP1664122 B1 89
EE - EP1664122 B1 90
SEQ ID nr: 39 Ekspressioonivektori LCVL2Sp20 nukleotiidjärjestus
EE - EP1664122 B1 91
EE - EP1664122 B1 92
EE - EP1664122 B1 93
EE - EP1664122 B1 94
SEQ ID nr: 40 Ekspressioonivektori HCVHESp20 nukleotiidjärjestus
EE - EP1664122 B1 95
EE - EP1664122 B1 96
EE - EP1664122 B1 97
EE - EP1664122 B1 98
EE - EP1664122 B1 99
EE - EP1664122 B1 100
SEQ ID nr: 41 Ekspressioonivektori HCVHQSp20 nukleotiidjärjestus
EE - EP1664122 B1 101
EE - EP1664122 B1 102
EE - EP1664122 B1 103
EE - EP1664122 B1 104
EE - EP1664122 B1 105
EE - EP1664122 B1 106
Näide 9: CD45RO/RB siduvate humaniseeritud antikehade in vitro efektiivsus
VHE/humV1 ja VHQ/humV1
Et määrata CD45R0/RB siduvate humaniseeritud antikehade VHE/humV1 ja
VHQ/humV1 efektiivsus võrdluses kimäärse antikehaga, analüüsitakse nende 5
võimet indutseerida apoptoosi inimese T-rakkudes ja ka nende võimet inhibeerida
inimese T-rakkude proliferatsiooni.
Rakud ja reagendid
Perifeerse vere mononukleaarsed rakud (PBMC) isoleeritakse teada veregrupiga,
aga tundmatu HLA tüübiga tervete inimdoonorite leukofereesi proovidest 10
tsentrifuugides Ficoll-Hypaque seadmes (Pharmacia LKB). PBMC, mida
kasutatakse stimulaatoritega, depleteeritakse esmalt T- ja NK-rakkudega,
kasutades CD3-kattega ferromagnetilisi pärleid (Miltenyi). Pärlid ja saastavad
rakud eemaldatakse magnetväljas. T-raku depleteeritud PBMC rakke kasutatakse
stimulaatorrakkudena pärast kiiritamist (50 Gy). CD4+ T-rakke kasutatakse 15
responder-rakkudena MLR tehnikas ja isoleeritakse PBMC rakkudest CD4 T-raku
negatiivse selektsiooni komplektis (Miltenyi).
EE - EP1664122 B1 107
Saadud rakke analüüsitakse FACScan või FACSCalibur (Becton Dickinson & Co.,
CA) ja nende puhtuseks on >75%. Rakud suspendeeritakse RPMI1640 söötmes,
millele on lisatud 10% kuumus-inaktiveeritud FCS, penitsilliini, streptomütsiini ja L-
glutamiini.
Apoptoosi testid 5
Kolme terve vabatahtliku inimdoonori PBMC rakke kasvatatakse söötmes
(RPMI1640+10%FCS) üle öö (<16h) CD45R0/RB siduva kimäärse monokloonse
antikeha, humaniseeritud antikehade (VHE/humV1 ja VHQ/humV1) või anti-LPS
monokloonse kontrollantikeha kohalolekul. Kui nii on märgitud, kaasatakse rist-
sidestamise reagent, kitse anti-inimese IgG F(ab’)2-fragment (kat. nr 109-006-098, 10
JacksonLab) µg/ml kontsentratsioonis, mis on kaks korda nii kõrge kui proovi anti-
CD45 antikehade kontsentratsioon. Kõigis antikeha reagente sisaldavates
aukudes hoitakse PBS kontsentratsiooni konstantsena kõigi proovide lõikes,
nimelt 20 mahu% proovide puhul, millel puudub rist-sidestaja, või 40 mahu% rist-
sidestajaga proovide puhul. Varasemad katsed näitavad, et PBS kogus ei mõjuta 15
tulemusi.
Pärast kogu öö kasvatamist antikehade kohalolekul teostatakse proovidega
voolutsütomeetria analüüsid ja neid määratakse apoptoosi markeriga AnnexinV-
FITC (Cat.No. 556419, BD/Pharmingen) ja T-raku markeriga CD2-PE (kat. nr
556609, BD/Pharmingen). Proove töödeldakse Becton Dickinson FACSCalibur 20
seadmes ja saadud andmeid analüüsitakse CellQuest Pro tarkvara kasutades.
Saadud andmete põhjal saadud kõverad koostatakse tarkvaras Origin v7.0300
Koostamiseks kasutatav valem on järgmine:
(„sigmoid-logistiline“)
A1: lõppväärtus (sobitamise seanssideks seadistustega „jagatud“ ja „voolavad“) 25
A2: algväärtus (sobitamise seanssideks seadistustega „jagatud“ ja „voolavad“)
p: võimsus
Xo: ED50; IC50 (vt alljärgnevat).
EE - EP1664122 B1 108
Rist-sidestaja puudumisel on VHE/humV1 kõige efektiivsem ED50 väärtusega 148
± 71 nM, sellele järgneb VHQ/humV1 väärtusega 377 ± 219 nM. CD45R0/RB
siduv kimäärne antikeha on vähem efektiivsem ED50 väärtusega 2440 ±1205 nM.
Rist-sidestava antiseerumi kohalolekul kalduvad ED50 väärtused dramaatiliselt
kõrgema efektiivsuse poole vähemalt kahe suurusjärgu võrra are. Lisaks 5
võimaldab rist-sidestaja kohalolu kõrgemaid apoptoosi tasemeid väga kõrgetel
antikeha kontsentratsioonidel, isegi kuni 80%, kusjuures rist-sidestaja puudumine
võimaldab üksnes kuni 50% apoptoosi. Rist-sidestaja kohalolekul on kõverad
(antikeha kontsentratsioon/apoptoosi %) bimodaalsed kahe platooga: esimene
platoo saavutatakse madalatel antikeha kontsentratsioonidel (~ 5nM), kus 10
apoptoosi tase vastab maksimaalsele tasemele, mis saadakse rist-sidestaja
puudumisel. Teine platoo saavutatakse kõrgetel antikeha kontsentratsioonidel (~
500 nM) ja apoptoosi täheldatakse 70-80% T-rakkudest.
Mõlemad CD45R0/RB siduvad humaniseeritud antikehad on võrselt efektiivsed
ning paremad või võrdsed CD45R0/RB siduva kimäärse antikehaga võrreldes, mis 15
puudutab nende võiet indutseerida apoptoosi inimese primaarsetes T-rakkudes.
Kombineeritud lümfotsüüdi reaktsiooni testid
1 x 105 PBMC või 5 x 104 CD4+ rakke segatakse 1x 105 või 5 x104 T-rakkude
depleteeritud kiiritatud (50 Gy) PBMC rakkudes igas augus 96-augulistel plaatidel
erinevatel kontsentratsioonidel monokloonse antikeha kohalolekul või puudumisel. 20
Neid segatud rakke kasvatatakse viis päeva ja proliferatsioon määratakse,
pulseerides rakke 3H-tümidiiniga kasvatamise viimase 16-20 tunni vältel. MLR
inhibeerimine väljendatakse iga antikeha kontsentratsiooni kohta protsentuaalse
inhibitsioonina, nagu kirjeldatud näites 2.
VHE/humV1 ja VHQ/humV1 tõstetud kontsentratsioonide toimet MLRile 25
hinnatakse kolmes responder:stimulaatori kombinatsioonis. Kõik antikeha
inhibeerivad MLR doosist sõltuval moel. IC50 väärtused (vt eelnevat) on sarnased
humaniseeritud antikehade VHE/humV1 (7 ± 7 nM) ja VHQ/humV1 (39 ± 54 nM)
puhul. Mõlemad humaniseeritud antikeha on inhibeerimisel MLR potentsemad kui
EE - EP1664122 B1 109
parentaalne kimäärne antikeha (IC50 347 ± 434 nM). Nagu tavaliselt MLR katsete
puhul nähtud on doonorite varieeruvus nendes katsetes kõrge.
VHE-N73D/humV1
Et uurida VHE-N73D/humV1 bioloogilist toimet apoptoosi indutseerimisel inimese
perifeerse vere mononukleaarsetes rakkudes (PBMC), inkubeeritakse PBMC 5
rakke üle öö erinevates kontsentratsioonides VHE-N73D/humV1 kohalolekul ning
seejärel analüüsitakse apoptoosi markeri AnnexinV seostumist
voolutsütomeetrias. Inimese PBMC rakke inkubeeritakse üle öö 1 ml koekultuuri
söötmes, mis sisaldab erinevates kontsnetratsioonides kas VHE-N73D/humV1 või
teist humaniseeritud CD45RO/RB siduva molekuli varianti, VHE/humV1 või 10
kimäärset anti-CD45RO/RB monokloonset antikeha või isotüüp IgG1
monokloonset kontrollantikeha. Lisatakse kitse anti-inimese Ig Fc rist-sidestavad
F(ab’)2 fragmendid iga monokloonse antikeha kahekordses massisuhtes,
kopeerides CD45RO/RB humaniseeritud antikeha ristsidestamist Fc-
retseptoritega, mis võib esineda vivo. Järgmisel päeval pestakse rakke 15
tsentrifuugides 10 minutit 400 korda standardsel raskusjõul (g) ja sööde
eemaldatakse. Rakud resuspendeeritakse FACS puhvrisse (PBS, mis sisaldab 1
mahu% FBS, 0,1 mass/maht% EDTA ja 0,1 mass/maht% naatriumasiidi) ja
külvatakse seejärel 96-augulistele V-põhjalistele mikrotiitri plaatidele rakutihedusel
1 x 105 rakku augu kohta. Iga rakkude proovi inkubeeritakse 30 minutit 20
temperatuuril 4 °C 50 µl FACS puhvris, mis sisaldab 100 µg/ml normaalse hiire
seerumit, et blokeerida mitte-spetsiifilised sidumissaidid rakkudel, ja fükoerütriiniga
(PE)-konjugeeritud CD2, et identifitseerida inimese T-rakud. Pärast kaks korda
pesemist tsentrifuugides resuspendeeritakse rakud 100 µl kaltsiumit sisaldavas
AnnexinV määrimise puhvris (Vendor BD/Pharmingen komplekt 556419), mis 25
sisaldab 1:100 (mahusuhe) FITC-märgistatud AnnexinV. Inkubeerimisel 15 minutit
toatemperatuuril lisatakse pimedas 7-amino aktinomütsiin D (7-AAD), et saada
lõppkontsentratsiooniks 1 µg/ml, ning analüüsimiseks kasutatakse FACSCalibur
voolutsütomeetrit (Becton Dickinson). ED50 väärtused, mis näitavad antikehade
efektiivsust apoptoosi indutseerimisel, arvutatakse apoptoosi hulga analüüsist 30
(=AnnexinV-FITC fluorestsentsi intensiivsus), milline apoptoos indutseeritakse
EE - EP1664122 B1 110
antikeha kontsentratsiooni funktsioonina, kasutades tarkvara Origin 7.5
sigmoid/logistilise kõvera võrrandis.
Sellistes analüüsides täheldatakse testitud CD45RO/RB humaniseeritud antikeha
kahefaasilist efekti: antikeha madalates kontsentratsioonides tuvastatakse madal,
väiksem kui 30%, T-raku apoptoos. ED50 väärtus sellele apoptoosi tasemele 5
jõudmisel arvutatakse 0,31 ± 0,13 nM VHE-N73D/humV1 kohta. Antikeha
kõrgemates kontsentratsioonides võidakse apoptoosi indutseerida kuni 70% T-
rakkudest. ED50 väärtus sellele apoptoosi tasemele jõudsel arvutatakse 352 ± 83
nM VHE-N73D/humV1 kohta. Kokkuvõttes leitakse, et VHE-N73D/humV1
indutseerib samuti apoptoosi inimese T-rakkudes, mida on võimalik soodustada 10
rist-sidestades.
Näide 10: CD45RB/RO siduva molekuli spetsiifilisus
Kimäärne CD45RB/RO siduv molekul
CD45 molekuli ekspresseeritakse kõigis leukotsüütides. Erinevad leukotüüsid
alamhulgad ekspresseerivad aga erinevaid CD45 isovorme. Et määrata 15
CD45RB/RO siduva kimäärse antikeha molekuli leukotsüüdi alamhulga
reaktiivsust, viiakse läbi alamhulga-spetsiifiliste markeritega inimese leukotsüütide
immunofluorestsents-märgistamine ja samaaegne värviga konjugeeritud
CD45RB/RO siduva kimäärse antikeha immunofluorestsents-märgistamine, millele
järgneb voolu tsütomeetria analüüs. 20
Lühidalt identifitseeritakse teatud inimese perifeerse vere mononukleaarsete
rakkude (PBMC) värskelt isoleeritud valmistise alamhulgad, inimese vereliistakud,
inimese perifeerse vere neutrofiilid või inimese luuüdist derivatiseeritud
hematopoeetilised tüvirakud inkubeerides fükoerütriin-sidestatud antikehadega
CD2 (T-lümfotsüütide), CD14 (monotsüütide), CD19 (B-lümfotsüütide), CD34 25
(tüvirakkude), CD42a (vereliistakute), CD56 (looduslike tapjarakkude) või CD66b
(granulotsüütide) suhtes. FITC-märgistatud kimäärse CD45RB/RO siduva molekuli
samaaegne seostumine määratakse T-lümfotsüütidel, monotsüütidel, tüvirakkudel,
looduslikel tapjarakkudel ja granulotsüütidel, aga mitte vereliistakutel või B-
lümfotsüütidel. 30
EE - EP1664122 B1 111
VHE-N73D/humV1
Et määrata VHE-N73D/humV1 leukotsüüdi alamhulga reaktiivsus, viiakse läbi
alamhulga-spetsiifiliste markeritega inimese leukotsüütide ja värviga konjugeeritud
VHEN73D samaaegne immunofluorestsents-märgistamine, millele järgneb
voolutsütomeetria analüüs. 5
Lühidalt inkubeeritakse inimese perifeerse vere mononukleaarsete rakkude
(PBMC) värskelt isoleeritud valmistise teatud alamhulgad või inimese perifeerse
vere neutrofiilid inkubeerides fükoerütriin-sidestatud antikehadega CD3, CD4, CD8
(T-lümfotsüütide), CD14 (monotsüütide), CD16 (looduslike tapjarakkude ja
monotsüütide), CD19 (B-lümfotsüütide) või CD66b (granulotsüütide) suhtes. FITC-10
märgistatud VHE-N73D/humV1 samaaegne sidestamine tuvastatakse T-
lümfotsüütidel, monotsüütidel, looduslikel tapjarakkudel ja granulotsüütidel, aga
mitte B-lümfotsüütidel. seega eri reageeri VHE-N73D/humV1 molekulid inimese B-
lümfotsüütidega.
Näide 11: T-supressorrakkude (T-regulatoorrakkude) ja funktsionaalselt 15
paralüseeritud T-rakkude in vitro induktsioon
Et näidata CD45RO/RB siduva kimäärse antikeha võimet indutseerida T-
superssorrakke, kaastatakse see antikeha erinevates kontsentratsioonides CD8+
T-rakkuliinide saamisesse, mis on reaktiivsed hemophilus influenza maatriksi
antigeeni valguga 1 (MP1). Need rakuliinid saadakse CD8+ inimese lümfotsüütide 20
korduva kasvatamisega koos CD14+ inimese monotsüütidega, mis pulseeritakse
vastava antigeeniga. Hiljem asendatakse CD14+ monotsüüdid inimese
leukotsüüdi antigeen-2 positiivse rakuliiniga kui MP1 antigeeni esitava rakuga
(APC). Kui sellised MP1-spetsiifilised CD8+ T-rakud, mis pärinevad CD45RO/RB
siduvat kimäärset antikeha sisaldavast kasvukeskkonnast, segatakse värskelt 25
isoleeritud inimese CD8+ T-rakkudega ning saadud segu stimuleeritakse MP1
antigeeniga APC-l, võib CD8+ T-rakkude lisamine, mis pärinevad
kasvukeskkonnast CD45RO/RB siduva molekuli kohalolekul, redutseerida IFN-�
tootmist antikeha doosist sõltuval moel. Selles IFN-� testsöötmes ei sisaldu
CD45RO/RB siduvat kimäärset antikeha, osutades tõigale, et eeltöötlemine 30
CD45RO/RB monokloonse antikehaga indutseeris CD8+ T-rakud, mis suudavad
EE - EP1664122 B1 112
suruda maha värskelt isoleeritud T-rakkude aktiveerimise. Selle T-
regulaatorrakkude indutseerimise tõttu CD45RO/RB siduva kimäärse antikeha
poolt, võib see antikeha olla kasulik haiguste puhul, kus düsreguleeritud ja/või
aktiveeritud T-raku populatsioon etendab arvatavalt osa patoloogias. Sääraste
haiguste näideteks on muuhulgas autoimmuunhaigused, transplantaadi 5
äratõukereaktsioon, psoriaas, dermatiit, põletikuline soolehaigus ja allergiad.
Et näidata kimäärse CD45RO/RB siduva molekuli võimet muuta T-rakud
hüporeaktiivseteks (anergiliseks) stimulatsioonile kaasa aitamiseks, s.o T-rakke
funktsionaalselt paralüseerida, kaasatakse see antikeha CD8+ T-rakuliinide
tootmisse, reageerides hemophilus influenza maatriks antigeeni valguga 1 (MP1), 10
nagu eelnevas selgitatud. Paralüüsi hinnatakse, aktiveerides T-rakud (mis on
eelnevalt puutunud kokku CD45RO/RB siduva kimäärse antikehaga) MP1
antigeeniga, mis esitab APC. Selles söötmes ei sisaldu CD45RO/RB siduvat
molekuli. CD8+ T-rakud, mis ei ole eelnevalt CD45RO/RB siduva kimäärse
antikehaga kokku puutunud, toodavad IFN-� nimetatud stiimuliga mõjutades. 15
Sellised CD8+ T-rakud, mida on aga eelnevalt töödeldud CD45RO/RB siduva
kimäärse antikehaga, näitavad oluliselt vähenenud kuni olematut sellise tsütokiini
tootmist vastuseks antigeen-stiimulile, osutades CD45RO/RB siduva kimäärse
antikeha võimele paralüseerida funktsionaalselt inimese T-rakke. Selle
CD45RO/RB siduva molekuli poolt tingitud funktsionaalse T-raku hüporeaktiivsuse 20
indutseerimise tõttu võidakse nimetatud antikeha rakendada haiguste puhul,
milleks on näiteks autoimmuunhaigused, transplantaadi äratõukereaktsioon,
psoriaas, dermatiit, põletikuline soolehaigus või allergiad, kus aktiveeritud T-raku
populatsioon etendab arvatavalt osa patoloogias.
Näide 12: In vivo uuringud SCID-hu Skin hiirtel 25
CD45RB/RO siduva kimäärse antikeha ravitoimet nahapõletikes testitakse SCID
hiirtel. Tervete inimeste nahk siirdatakse SCID hiirtele (SCID-hu Skin) ja
põletikulist protsessi kopeeritakse, siirdades hiirtele adopteeritult ka
mononukleaarsed leukotsüüdid, mis on isoleeritud inimpatsientidelt, kes pole
suguluses nahka andnud doonoritega. 30
EE - EP1664122 B1 113
Täiskasvanud inimese naha siirdamine SCID hiirtele (SCID-hu Skin hiirtele)
Kaks väikest (1 cm2) täiskasvanud inimese naha osa (saadud Lääne-Ungari
Piirkondlikust Koepangast; WHRTB, Gyor), mis koosnesid tervest epidermist,
papillaarsest pärisnahast ja osaliselt retikulaarsest pärisnahast, siirdatakse SCID
hiirte ülaosa paremasse ja vasakusse külge C.B 17 /GbmsTac-Prkdcscid Lystbg 5
mice (Taconic, Germantown, NY), asendades nii vastava hiire naha.
Transplantaatide kvaliteeti jälgitakse 5-6 nädalat pärast siirdamist ja edukalt
siirdamise läbinud hiired (SCID-hu Skin hiired, üldiselt >85%) valitakse
CD45RB/RO siduva kimäärse antikeha in vivo testideks.
Inimese mononukleaarsete rakkude pookimine SCID hiirtele 10
Mononukleaarsed leukotsüüdid (Spl) isoleeritakse täiskasvanud inimese põrna
biopsiatest (WHRTB, Gyor) pärast raku suspensiooni (kasutades raku
dissotsiatsiooni sõela, millel on suurus 50 avad) ja standardse tihedusgradiendi
protseduure. ~5 x108 Spl alikvoodid resuspendeeritakse 1,5 ml RPMI-10% FCS ja
süstitakse intraperitoneaalselt (i.p.) katsepäeval 0 SCID-hu Skin hiirtele. Need Spl 15
näitajad on eelnevate uuringute põhjal piisavad, et indutseerida letaalset kseno-
GvHD >90% hiirtest 4-6 nädalaga pärast rakkude ülekannet.
SCID-hu Skin hiirte töötlemine antikehaga
SCID-hu Skin hiiri, kellele on siirdatud inimese Spl, töödeldakse CD45RB/RO
siduva kimäärse antikehaga või anti-LPS monokloonse kontrollantikehaga päeval 20
0, vahetult pärast mononukleaarsete rakkude süstimist, 3. ja 7. päeval ning
seejärel nädalaste intervallidega. Antikehi manustatakse nahaaluselt (s.c.) doosis
100 µl PBS lõppkontsentratsioonis 1 mg kehakaalu kg kohta (b.w.).
Anti-CD45 ravi hindamine
CD45RB/RO siduva kimäärse antikeha efektiivsust hinnatakse siirdamise läbinud 25
hiirte elumuse alusel, jälgides naha transplantaatide äratõukereaktsioone. Nende
tulemuste olulisust hinnatakse elumuse analüüsi statistilisel meetodil, kasutades
Log-rank testi (Manteli meetod) Systat v10 tarkvara abiga. Iga katse lõpus
võetakse ohverdatud hiirtelt histoloogilisteks uuringuteks inimnaha
EE - EP1664122 B1 114
transplantaatide ning hiire kopsu, neeru, maksu ja põrna biopsiad. Kõiki hiiri
kaalutakse katse alguses (enne rakkude siirdamist) ja kogu katse vältel (iga kahe
päeva tagant), et hinnata otse nende tervislikku seisundit. Lineaarse regressiooni
jooned saadakse, kasutades kehakaal versus päevad pärast PBMC siirdamist
väärtused, mis saadakse iga hiire kohta, ning hiljem võrreldakse nende kaldeid 5
(kontroll versus anti-CD45 töödeldud hiired), kasutades mitte-parameetrilist Mann-
Whitney testi.
Tulemused
Inimnaha transplantaate taluvad SCID hiired väga hästi. Esialgu teevad
transplantaadid läbi keratinotsüüdi hüperproliferatsiooni perioodi, mis on tingitud 10
hüperkeratootiliste kahjustuste (koorikute) tekkest. Ligikaudu 5 nädalat pärast
siirdamist kukuvad nimetatud koorikud transplantaatidelt ja paljastavad koe, mis
sisaldab normaalsele inimnahale omaseid struktuurilisi omadusi. Selle protsessi
käigus sulanduvad inimnaha transplantaadid nendega külgneva hiire nahaga,
luues värskelt kasvatatud inimese soonte võrgustiku, mis ühendab transplantaate 15
hiire aluskoega. Ringlevad inimese Spl viiakse SCID-hu Skin hiirtele (katsepäeval
0, ligikaudu 6 nädalat pärast naha siirdamist), need infiltreeruvad naha
transplantaatidesse ja pärast alloantigeeni molekulide ära tundmist, mida
ekspresseeritakse inimnahal, tingitakse põletikuline vastus, mis sarnaneb naha
põletikulise protsessiga, mis esineb psoriaatilisel nahal, ning mis teatud juhtudel 20
hävitavad transplantaadi täielikult.
Nende hiirte ravimine CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga surub maha
põletikulise protsessi ja ennetab inimnaha transplantaatide äratõukereaktsiooni.
Samas näitab proov, mis saadase kontrolliga töödeldud hiirtest, massiivset
infiltratsiooni mitmete nekroosi ja epidermi dramaatilise hävitamise märkidega. 25
Seda protsessi vaadeldakse silmaga ja dokumenteeritakse hiirte lihtsa
fotografeerimisega.
Kuus kuuest SCID-hu Skin hiirest, kellele siirdati allogeensed inimese Spl ja keda
töödeldi anti-LPS monokloonse kontrollantikehaga, näitavad tugevat põletikulist
vastust, mis on selgelt silmale nähtav 23 päev pärast mononukleaarsete rakkude 30
siirdamist. Kõigil hiirtel täheldatakse märkimisväärseid lesioone, kaasa arvatud
EE - EP1664122 B1 115
erüteemi, kestendamist ja nähtavaid mädaville. Ent naha transplantaadid kõigil
hiirtel, keda on töödeldud CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga, on tavaline
välimus. Selline dramaatiline erinevus kahe hiirte rühma vahel on tingitud
antikehaga töötlemisest, sest kõigi hiirte inimnahal on identne välimus katse
alguses. See välimus ei muutu kuni teise nädalani pärast rakkude siirdamist, millal 5
kontrollrühmal hakkavad naha lesioonid välja kujunema. Katse lõpetatakse 34.
päeval pärast mononukleaarsete rakkude siirdamist. Selleks ajaks on üks
kontrollhiirtest juba surnud (30. päev) ja neli hiirt ohverdatakse (27., 27., 27. ja 30.
päeval) tugeva kseno-GvHD tõttu. Need patoloogilised reaktsioonid, mida
täheldatakse antikeha kontrolliga töödeldud hiirtel, korreleerub samuti nende 10
loomakeste kehakaalu langusega.
Samas on CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga töödeldud rühm tervet
välimust kogu katse ajal.
Näide 13: CD45RB/RO siduva kimäärse antikeha in vivo aktiivsused inimese saarerakkude siirdamise mudelis 15
Hiired
NOD/SCID emaseid hiiri (Charles River Laboratories, Calco, Itaalia) hoitakse
spetsiifilistel patogeenivabadel tingimustel. Kvantifitseeritakse glükoosi tase
venoosses sabaveres, kasutades Glucometer Elite süsteemi (Bayer, Saksamaa).
Diabeeti indutseeritakse NOD/SCID hiirtes, süstides neile intravenoosselt 180 20
mg/kg streptosototsiini (Sigma, St.Luis, MO). Diabeet diagnoositakse pärast kaht
järjestikust glükoosi mõõtmist, mis on sealjuures kõrgem kui 250 mg/dl.
Saarerakkude valmistised ja siirdamine
Saarerakud saadakse tuksleva südamega kadaveersetelt mitme elundiga
doonoritelt. Saarerakud isoleeritakse vastavalt meetodile, mida on kirjeldanud 25
Bertuzzi et al., Diabetes, 1999, 48: 1971-8. Puhastatud saarerakke kasvatatakse
steriilsetes kolbides, mis sisaldavad 25 ml M199 söödet (Seromed Biochrom,
Berliin, Saksamaa), millele lisatakse 10% FCS, 1% L-glutamiini, 100 ükskused/ml
penitsilliini ja 100 µg/ml streptomütsiini (täielik sööde). Saarerakke inkubeeritakse
temperatuuril 30 °C 5% CO2 atmosfääris ja 95% niiskusega õhus. Hiired 30
EE - EP1664122 B1 116
tuimestatakse, süstides neile intraperitoneaalselt avertiini ning 1500 IE inimese
saarerakkude alikvoodid siirdatakse diabeetiliste NOD/SCID hiirte
neerukapslitesse, nagu kirjeldanud Davalli A.M. et al., Diabetes, 1996, 45: 1161-7.
Pärast siirdamist süstitakse NOD/SCID hiirtele intraperitoneaalselt 50 x 106
värskelt isoleeritud PBMC rakke. 5
Siirdamise läbinud hiirte ravi
Hu-PBL-NOD/SCID siirdamise läbinud hiiri töödeldakse päeval 0, +3 ja +5 1 mg/kg
CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga. Kontrollhiiri töödeldakse kas
saliinilahuse või IgG puhastatud monokloonse antikehaga (Vinci. Biochem, Itaalia).
Histoloogiline analüüs 10
Neeru poolused, mis sisaldavad inimese saareraku transplantaati, külmutatakse
Tissue Tek komplektis (Miles Lab., IN) ja neid säilitatakse temperatuuril -70 °C.
Jämedate külmutatud 5 µm sektsioone määritakse biotinüülitud monokloonse
antikehaga inimese insuliini või inimese CD3 suhtes, seejärel streptavidiin-
peroksidaasi konjugaadiga. Diaminobensidiini (DAKO, Carpenteria, CA) 15
kasutatakse kromogeenina ja hematoksüliini vastuvärvina. Transplantaatide
lümfotsüüdi infiltratsiooni hinnatakse hematoküliiniga ja eosiiniga määratud
külmutatud sektsioonide alusel.
Tulemused
Normaalsed NOD/SCID hiired, kelle on siirdatud inimese saarerakke, püsivad 20
normoglütseemilistena kuni 100 päeva pärast siirdamist, kusjuures inimese
saarerakkude siirdamise läbinud hu-PBL-NOD/SCID hiirte keskmine
retentsiooniaeg on 35 ± 13 päeva. Inimese saarerakkude siirdamise läbinud hu-
PBL-NOD/SCID hiirte lühiajaline ravi leiutise monokloonse antikehaga pikendab
oluliselt inimese saarerakkude elumust määral >70% 60. päeval ja 50% 100. 25
päeval pärast siirdamist.
Inimese saarerakkude transplantaatide histoloogiline analüüs, mis viiakse hu-PBL-
NOD/SCID hiirtel läbi 100. päeval pärast siirdamist, näitab CD3+, CD4+ ja CD8+
positiivsete T-rakkude massiivset infiltratsiooni kontrollhiirtes. Samal ajal kui hiirtel,
EE - EP1664122 B1 117
keda töödeldi CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga, täheldatakse inimese
rakkude oluliselt madalamat infiltratsiooni. Positiivne määrimine insuliiniga näitab
transplantaadi funktsiooni hu-PBL-NOD/SCID hiirtel, keda on töödeldud
CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga, erinevalt kontrollhiirtest. hu-PBL-
NOD/SCID hiirtel, kellele on siirdatud saarerakke ja CD45RB/R siduvat kimäärset 5
antikeha, tuvastatakse seerumis madalamas koguses inimese IFN-� kui
kontrollhiirtel.
Need andmed näitavad, et lühiajaline ravi CD45RB/RO siduva kimäärse
antikehaga tingitud pikemaajalise inimese saareraku transplantaadi elumuse,
tõkestades transplantaadi infiltratsiooni ja inhibeerides leukotsüüdi vahendatud 10
äratõukereaktsiooni in vivo.
EE - EP1664122 B1 118
Patendinõudlus
1. Humaniseeritud antikeha, millel on sidumise spetsiifilisus nii CD45RO kui ka
CD45RB suhtes ja mis hõlmab raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 31
või 32 ja kerge ahela varieeruvad piirkonda SEQ ID nr: 7 või SEQ ID nr: 8.
2. Humaniseeritud antikeha vastavalt punktile 1, millel on sidumise spetsiifilisus nii 5
CDR45RO kui ka CD45RB suhtes, mis hõlmab:
- raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 31 ja kerge ahela varieeruvat
piirkonda SEQ ID nr: 7,
- raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 31 ja kerge ahela varieeruvat
piirkonda SEQ ID nr: 8, 10
- raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 32 ja kerge ahela varieeruvat
piirkonda SEQ ID nr: 7, või
- raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 32 ja kerge ahela varieeruvat
piirkonda SEQ ID nr: 8.
3. Isoleeritud polünukleotiidid, mis kodeerivad humaniseeritud antikeha vastavalt 15
punktile 1 või 2.
4. Ekspressioonivektor, mis hõlmab polünukleotiide vastavalt punktile 3, milline
vektor suudab toota humaniseeritud antikeha, kui nimetatud vektor sisaldub
vastavas peremeesrakus.
5. Isoleeritud peremeesrakk, mis hõlmab ekspressioonivektorit vastavalt punktile 20
4.
6. Humaniseeritud antikeha vastavalt punktile 1 või 2 kasutamiseks ravimina.
7. Antikeha vastavalt punktile 6 kasutamiseks autoimmuunhaiguste, transplantaadi
äratõukereaktsiooni, psoriaasi, dermatiidi, põletikulise soolehaiguse ja/või
allergiate raviks ja/või ennetamiseks. 25
8. Antikeha vastavalt punktile 7 transplantaat-peremehe-vastu (GvHD) haiguse
raviks ja/või ennetamiseks,
EE - EP1664122 B1 119
9. Antikeha vastavalt punktile 7 ravimi valmistamiseks pankrease saarerakkude
transplantaadi äratõukereaktsiooni raviks.
10. Ravimkoostis, mis sisaldab antikeha vastavalt punktile 1 või 2 kombineerituna
vähemalt ühe farmatseutiliselt vastuvõetava kandja või lahjendusvedelikuga.
EP 1 664 122 B1
86
EP 1 664 122 B1
87
EP 1 664 122 B1
88
EP 1 664 122 B1
89
EP 1 664 122 B1
90
EP 1 664 122 B1
91
EP 1 664 122 B1
92
EP 1 664 122 B1
93
EP 1 664 122 B1
94
EP 1 664 122 B1
95
EP 1 664 122 B1
96
EP 1 664 122 B1
97
EP 1 664 122 B1
98
EP 1 664 122 B1
99