Transmisión de cepas atenuadas de Babesia bigemina y Babesia bovis por garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus

267

TRANSMISIN DE CEPAS ATENUADAS DE Babesia bigemina y Babesia bovisRev Mex Cienc Pecu 2011;2(3):267-281

Transmisin de cepas atenuadas de Babesia bigemina yBabesia bovis por garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Transmissibility of Babesia bigemina and Babesia bovis attenuatedstrains by Rhipicephalus (Boophilus) microplus ticks

Edmundo E. Rojas Ramreza, Juan J. Mosqueda Gualitob, Jess A. lvarez Martneza,Rubn Hernndez Ortza, Juan A. Ramos Aragna, Carmen Rojas Martneza, Germinal J.

Cant Alarcnb, Carlos A. Vega y Murguaa, Julio V. Figueroa Millna

RESUMEN

Para evaluar la transmisin por garrapatas Rhipicephalus microplus (R. microplus) de una clona atenuada de Babesia bovis(BOR) y una cepa atenuada de Babesia bigemina (BIS), doce bovinos se dividieron en cuatro grupos e infestados de formaescalonada con larvas de R. microplus libres de Babesia spp. Un becerro de cada grupo se inocul con 1x108 eritrocitosinfectados (EI) con BIS, BOR, y cepas virulentas de B. bigemina y B. bovis, respectivamente. Se realizaron dos inoculacionesseriadas adicionales (pases/jeringa) y se colectaron hembras R. microplus cuya replecin coincidi con presencia de EI en losbovinos inoculados, y cuya progenie fue utilizada para infestar un grupo de bovinos receptores (pases/garrapata). Los tres pasessucesivos por jeringa evidenciaron EI en los bovinos que recibieron las cepas atenuadas y virulentas de B. bigemina y B. bovis.Se identificaron quinetos de Babesia en garrapatas alimentadas sobre bovinos infectados con cepas virulentas de B. bigeminay B. bovis. No se identificaron quinetos en garrapatas alimentadas sobre bovinos inoculados con cepas atenuadas. Todos losreceptores infestados con progenie de garrapatas alimentadas sobre bovinos infectados con cepas virulentas, resultaron positivosa Babesia. Contrariamente, los receptores de garrapatas derivadas de bovinos inoculados con cepas atenuadas resultaronnegativos, excepto por los infestados con garrapatas derivadas del tercer pase realizado con BIS y BOR. Las cepas atenuadaspodran conferir un margen de seguridad mayor como inmungenos, al no ser transmitidas por R. microplus y no revertir ala virulencia al menos despus de dos pases sucesivos en bovinos.

PALABRAS CLAVE: Babesia bigemina, Babesia bovis, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, Transmisin, Virulencia.

ABSTRACT

To assess transmissibility of attenuated Babesia bigemina (BIS) and Babesia bovis (BOR) strains by Rhipicephalus microplus (R.microplus), 12 steers from a tick-free area were divided in four groups and infested at different intervals with R. micropluslarvae. One animal from each group was inoculated with 1x108 infected erythrocytes (IE) of attenuated BIS, BOR, virulent B.bigemina, or B. bovis field strains. Two additional serial passages were performed (syringe passages), and engorged female tickswere collected coincident with presence of IE in blood of infected steers. The offspring larvae were utilized to feed upon anadditional group of recipient steers (tick passages). All needle passages were successful for inducing infection in steers thatreceived both, the attenuated and field strains. Kinetes were detected in hemolymph of engorged female ticks fed on steersinfected with virulent B. bigemina and B. bovis field strains. However, kinetes were not detected in hemolymph samples fromticks collected from the steers inoculated with the attenuated strains. All recipient steers infested with larvae from ticks thatfed on steers infected with virulent strains became Babesia positive. By contrast, steers infested with larvae from ticks that fedon animals inoculated with attenuated strains were negative, except for the recipient steer receiving larvae from the thirdsyringe passage of BIS and BOR. These strains could be safer to use as live immunogens in animals, as their virulence andability to be transmitted by the tick is impaired at least after two blood passages in cattle.

KEYWORDS: Babesia bigemina, Babesia bovis, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, Transmissibility, Virulence.

Recibido el 3 de diciembre de 2009. Aceptado el 25 de enero de 2011.a Centro Nacional de Investigacin Disciplinaria en Parasitologa Veterinaria, INIFAP. Jiutepec, Mor., Apartado Postal 206 CIVAC, Morelos, 62500. Tel: 777/3192850 ext. 139.

[email protected]. Correspondencia al ltimo autor.b Universidad Autnoma de Quertaro. Campus juriquilla.

268

Edmundo Enrique Rojas Ramrez, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2011;2(3):267-281

INTRODUCCION

La babesiosis bovina causada por B. bovis y B.bigemina se encuentra distribuida en reas tropicalesy subtropicales del mundo, y es considerada comouna de las enfermedades ms importantestransmitidas por garrapatas R. microplus y R.annulatus(1). Para el control de la babesiosis, sehan recomendado diferentes procedimientos queincluyen: inmunizacin, quimioterapia, control dedesplazamiento del ganado de reas infectadas ycontrol del vector(2). Se han descrito diferentesmtodos para disminuir la virulencia de las especiespatgenas en bovinos, tales como la realizacin depases rpidos por inoculacin parenteral en becerrosesplenectomizados(3), pases lentos por inoculacinparenteral en becerros intactos(4), la irradiacindel parsito(5,6) y la atenuacin del parsito pormantenimiento continuo en cultivo in vitro(7,8).

Trabajos previos de investigacin en Mxico hanpermitido demostrar que se cuenta con una cepa deB. bigemina (denominada BIS) atenuada por pasesen cultivo continuo en condiciones in vitro(9), quese ha comportado como poblacin atenuada al noafectar en forma importante los valoreshematolgicos en animales inoculados(8). Al serutilizada como vacuna ha inducido proteccin aldesafo heterlogo con sangre infectada, as comopor garrapatas infectadas en condiciones controladasy en condiciones de campo(10,11,12). Por otro lado,la irradiacin reduce la virulencia sin afectar lacapacidad inmunognica de las cepas vacunales porla eliminacin de la mayora de la poblacin depatgenos; de este modo se selecciona por parsitosde baja virulencia pero con una alta capacidadinmunognica(6,13). De igual forma, una clona deBabesia bovis irradiada (denominada BOR) ycultivada in vitro(14) se ha utilizado comocomponente de una vacuna viva en ganadosusceptible, y ha demostrado capacidad protectoracuando los animales son desafiados con cepasvirulentas(15,16), contando adems con la granventaja conferida por su produccin in vitro: unbajo riesgo de contaminacin con otros agentesinfecciosos(17); es una suspensin de glbulos rojosaltamente parasitada, y ofrece la posibilidad deproduccin de la vacuna de B. bovis en pases que

INTRODUCTION

Bovine babesiosis caused by B. bovis and B.bigemina is distributed in tropical and subtropicalareas of the world, and it is considered as one ofthe most important diseases transmitted by R.microplus and R. annulatus(1). Different procedureshave been recommended for the control of babesiosisthat include: immunization, chemotherapy, cattlemovement control from infected areas and vectorcontrol(2). Different methods have been described todecrease virulence of pathogenic species in bovines,such as: rapid passage by parenteral inoculation insplenectomized calves(3), slow passage by parenteralinoculation in intact calves(4) parasite irradiation(5,6)and parasite attenuation by continuous maintenancein in vitro culture(7,8).

Previous research studies in Mexico have allowedto demonstrate that there is a B. bigemina strain(called BIS) attenuated by continuous in vitroculture passage conditions, which has behaved asattenuated population not affecting, in an importantway, hematological values in inoculated animals(8).Being used as a vaccine, it has induced protectionto heterologous challenge with infected blood, aswell as by infected ticks under controlled and fieldconditions(10-12). On the other hand, irradiationdecreases virulence without affect ing theimmunogenic capacity of the vaccinal strains byeliminating the majority of the pathogenicpopulation; in this way, low virulence parasitesbut with high immunogenic capacity areselected(6,13). Likewise, an irradiated Babesia bovisclone (called BOR) cultivated in vitro has beenused as live vaccine component in susceptible cattle,and it has demonstrated protective capacity whenthe animals are challenged with virulentstrains(15,16), also having great conferred advantagefor its in vitro production: a low contaminationrisk with other infectious agents(17), it is asuspension of highly parasitized erythrocytes, andoffers the possibility of producing B. bovis vaccinein countries with adequate laboratoryinfrastructure(1,17). However, up to date, it isunknown if continuous passages from cattle to cattlerevert the irradiated clone to be once againtransmitted by ticks.

269

TRANSMISIN DE CEPAS ATENUADAS DE Babesia bigemina y Babesia bovis

disponen con una adecuada infraestructura delaboratorio(1,17). Sin embargo, a la fecha sedesconoce si el continuo paso de ganado a ganadorevierte la clona irradiada para ser transmitida denuevo por garrapatas.

Se ha descrito que los animales vacunados conorganismos vivos permanecen como portadores, loque conduce a la aparicin de casos clnicos, debidoa la reversin a la virulencia de las cepas cuandoellas son pasadas a travs de animales intactos ocuando son transmitidos por garrapatas(18). Lascepas vacunales han sido desarrolladas para conferiruna adecuada proteccin sin ser transmitidas porgarrapatas, un rasgo considerado ecolgicamentedeseable, ya que previene la aparicin de casosclnicos debido a la transmisin de la cepa vacunalpor garrapatas(19). Sin embargo, esta capacidadsolamente ha sido demostrada despus de un paseen ganado susceptible(8,18-20).

El objetivo de este estudio fue evaluar si las cepasvacunales BIS y BOR son transmitidas porgarrapatas despus de tres pases en bovinossusceptibles, y determinar si existe reversin a lavirulencia de estas cepas despus de los pasessucesivos por bovinos sin su regreso al cultivo invitro de donde se originaron.

MATERIALES Y MTODOS

Experimento 1

La cepa inmunizante de B. bigemina denominadaBIS es originaria de Mxico, fue obtenida de uncaso clnico mediante aislamiento, adaptacin ypropagacin continua en cultivo in vitro(9). Desdeentonces, se ha mantenido alternadamente, ya seaen cultivo in vitro o en nitrgeno lquido comoestabilizado criopreservado(16,21). Esta cepa ha sidoevaluada como vacuna viva atenuada en estudiosprevios(10,11,12) y present un comportamientosemejante al descrito para cepas atenuadas. La cepavirulenta de B. bigemina (C) fue donada por el Dr.Lucious Chieves (USD-APH1S-NVSL, Ames,lowa, EE.UU.). Inicialmente fue aislada de un casoclnico y ha sido mantenida por pases a travs deganado susceptible, garrapatas y nitrgenolquido(10,11). Se utiliz una colonia de garrapatas

It has been reported that animals vaccinated withlive organisms stay as carriers, which leads to theappearance of clinical cases, due to virulencereversion of the strains when they are passagethrough intact animals or transmitted by ticks(18).Vaccinal strains have been developed to conferadequate protection without being transmitted by ticks,a trait considered ecologically desirable, since itprevents the appearance of clinical cases due to thevaccinal strain transmission by ticks(19). Nevertheless,this capacity has only been demonstrated after onepassage in susceptible cattle(8,18-20).

The aim of this study was to evaluate if BIS andBOR vaccinal strains are transmitted by ticks afterthird passage in susceptible bovines, and determineif there is reversion to virulence of these strains aftersuccessive passages by bovines without its return toin vitro culture where they originated from.

MATERIALS AND METHODS

Experiment 1

The B. bigemina immunized strain called BIS, isoriginated from Mexico, it was obtained from aclinical case by isolation, adaptation and continuousin vitro propagation culture(9). Since then, it hasalternatively kept, either by in vitro culture or asa cryopreserved stabilate in liquid nitrogen(16,21).On previous studies, this strain has been evaluatedas attenuated live vaccine(10-12) and showed abehavior similar to the described for attenuatedstrains. The B. bigemina (C) virulent strain wasdonated by Dr. Lucious Chieves (USD-APH1S-NVSL, Ames, Iowa, EE.UU). It was initiallyisolated from a clinical case and it has been keptby passages through susceptible cattle, ticks andliquid nitrogen(10,11). A colony of Babesia spp-free R. microplus ticks was used, kept in vitro andanimals under controlled conditions(8).

Eleven, one year old, Bos taurus cattle comingfrom a tick- free zone and without immunologicalresponse against Babesia spp by the IndirectFluorescent Antibody test (IFAT) were used asfollowed: one animal was used for the reactivationof B. bigemina virulent field strain, the otheranimals were randomly divided in two groups, one

270


R. microplus libre de Babesia spp., mantenida invitro y en animales en condiciones controladas(8).

Once bovinos Bos taurus de 1 ao de edad,procedentes de una zona libre de garrapatas y sinrespuesta inmunolgica contra Babesia spp por laprueba de Inmunofluorescencia indirecta (IFI), seutilizaron como sigue: un animal se us para lareactivacin de la cepa virulenta de campo de B.bigemina, los otros animales se dividieron al azaren dos grupos, un grupo de seis bovinos para elexperimento con la cepa BIS y los restantes parael experimento con la cepa de B. bigemina decampo virulenta (Grupo testigo). Los animales querecibieron la inoculacin de la cepa BIS fuerondesignados A1, A2 y A3 (tres pases consecutivospor sub-inoculacin va intramuscular con jeringa);mientras que los bovinos B1, B2 y B3 recibieronlas larvas de R. microplus procedentes de hembrasrepletas alimentadas en los bovinos A1, A2 y A3,respectivamente. Los bovinos del grupo testigo (C1,C2 y C3) se inocularon por va intramuscular conjeringa con eritrocitos infectados (EI) con cepa decampo de B. bigemina, mientras que el bovino D1recibi las larvas de R. microplus procedentes dehembras repletas alimentadas en el bovino C1(Figura 1). El bovino A1 se inocul con 1x108 EIinfectados con cepa BIS, y una vez que resultpositivo a B. bigemina mediante examenmicroscpico de frotis teido con colorante deGiemsa, se tom sangre de ste y se realiz elsegundo pase inoculando al bovino A2. El tercerpase se realiz cuando el bovino A2 result positivoa la infeccin mediante sub-inoculacin del bovinoA3 (Figura 1). Todos los pases se realizaron durantela fase de parasitemia y a una dosis equivalente a1x108 EI. Los bovinos A1, A2, A3 y C1 fueroninfestados, en cinco ocasiones, con 4,000 larvas deR. microplus libres de infeccin por Babesia spplos das -14, -12, -10, -8 y -6 (con respecto a lainoculacin con EI, considerado como da 0). Unavez transcurrido el perodo de alimentacin en elbovino (21 das), las garrapatas hembra repletas selimpiaron y colocaron en cajas individuales y seincubaron en una estufa a 27 C con 85 % dehumedad relativa. Diariamente y durante ocho dasse realiz la prueba de hemolinfa y se procedi arealizar la observacin de quinetos por microscopa.

group of six bovines for BIS strain trial and therest for the trials with B. bigemina virulent fieldstrain (control group). The animals that receivedBIS strain inoculation were assigned as A1, A2,and A3 (three consecutive passages by subinoculationvia intramuscular injection); while B1, B2 and B3received R. microplus larvae from fully engorgedfemale ticks from bovines A1, A2 and A3,respectively. Bovines from control group (C1, C2and C3) were intramuscularly inoculated by syringewith infected erythrocytes (IE) with B. bigeminafield strain, while bovine D1 received R. micropluslarvae from fully engorged females from bovineC1 (Figure 1). Bovine A1 was inoculated with 1 108 IE with BIS strain, and once it was positiveto B. bigemina by microscopic examination ofGiemsa-stained smears, a sample of blood was takenand the second passage was carried out byinoculating bovine A2. The third passage was donewhen bovine A2 was positive to infection by subinoculation of bovine A3 (Figure 1). All passageswere carried out during the parasitemic phase at adose equivalent to 1 108 IE. Bovines A1, A2,A3 and C1 were infested, in five occasions, with4,000 Babesia spp-free R. microplus larvae at d -14,-12, -10, -8 and -6 (in regard to IE inoculation,considered as day zero). Once the feeding periodon bovine had taken place (21 d), the engorgedfemale ticks were cleaned and placed on individualdishes and were incubated in a stove at 27 C with

Figura 1. Inoculacin de bovinos con cepas atenuada yvirulenta de B. bigemina e infestacin con R. microplus.Experimento 1Figure 1. Bovine inoculation with B. bigemina attenuatedor virulent strains and R. microplus infestation. Experiment 1

Drawings, figure 1 and 2: Inoculation, 1st passage, 2ndpassage, 3rd passage

D1 C1

C2

C3 B3

B2

B1

A3

A2

A1

271


Se seleccionaron las hembras repletas de R.microplus colectadas de los bovinos A1, A2, A3 yC1 que resultaron positivos a quinetos de Babesiaen la prueba de hemolinfa(22). Cuando no sepudieron detectar como positivas por esta prueba,se seleccionaron las que se desprendieronnaturalmente de los animales en das coincidentescon la presencia de EI con B. bigemina detectablesen el bovino. Los animales B1, B2, B3 y D1fueron infestados en una sola ocasin con 20,000larvas, progenie de las garrapatas hembrasseleccionadas de los animales A1, A2, A3 y C1,respectivamente.

El monitoreo de infeccin en los bovinos inoculadoscon EI o infestados con larvas de R. microplus serealiz mediante la determinacin de temperaturarectal (TR), y la coleccin de sangre paraelaboracin de frotis sanguneos a teirse concolorante de Giemsa y observacin al microscopiocompuesto, as como para la determinacin delvolumen celular aglomerado (VCA). Muestras desangre procedentes de los animales utilizados en elexperimento de transmisin de la cepa atenuada deB. bigemina se criopreservaron en nitrgeno liquidoa -196 C(21) y procesadas posteriormente mediantela amplificacin de ADN por la prueba de PCRanidada, procedimiento que permite obtener unamplicn de 172 pares de bases, esencialmentecomo se describi previamente(23), utilizando losoligonucletidos especficos para B. bigemina(24),y los cuales alinean con secuencias de un genortlogo de VESA-1 (Antgeno Variable de laSuperficie del Eritrocito, por sus siglas en ingls)de B. bovis (datos no publicados).

Experimento 2

La clona irradiada de B. bovis (BOR) fue obtenidade la cepa KBb(21). La cepa original es nativa deMxico, aislada de un caso clnico y adaptada alcultivo in vitro(7). Fue clonada por dilucin crticae irradiada en una fuente de Co60 a 187 Grays(14).Desde entonces, se ha mantenido alternadamenteya sea en cultivo in vitro o en nitrgeno lquidocomo estabilizado criopreservado(15). La cepavirulenta (V) fue igualmente donada por el Dr.Lucious Chieves; inicialmente fue aislada de un

85 % of relative humidity. Daily and during 8 d,the hemolymph test was carried out and kinetesobserved by microscopy. R. microplus engorgedfemales collected from bovines A1, A2, A3 andC1 that were positive to Babesia in the hemolymphtest were selected(22). When they could not bedetected as positive by this test, the ones thatnaturally detached from the animals in coincidentdays with the presence of B. bigemina-IE detectablein the bovine were selected. Animals B1, B2, B3and D1 were infested in only one occasion with20,000 larvae, progeny of female ticks selectedfrom animals A1, A2, A3 and C1, respectively.

The monitoring of infection in inoculated bovineswith IE or infested with R. microplus larvae wascarried out by rectal temperature determination (RT),and blood collection for elaboration of blood smearsstained with Giemsa and observed in a compoundmicroscope, as well as for determination of thePacked Cell Volume (PCV). Blood samples fromanimals used in the experiment of B. bigeminaattenuated strain transmission were cryopreservedin liquid nitrogen at -196 C(21) and processed byDNA amplification by nested-PCR, procedure whichallows to obtain an amplicon of 172 base pairs;basically, as previously described(23), and usingspecific oligonucleotides for B.bigemina(24), whichalign with sequences of the VESA-1 (varianterythrocyte surface antigen 1) ortholog gen of B.bovis (unpublished data).

Experiment 2

B. bovis irradiated clone (BOR) was obtained fromKBb strain(21). The original strain comes fromMexico, isolated from a clinical case and adaptedto in vitro culture(7). It was cloned by criticaldilution and irradiated in a Co-60 source at 187Grays(14). Since then, it has been alternately kepteither in in vitro culture or as cryopreserved stabilatein liquid nitrogen(15). The virulent strain (V) wasalso donated by Dr. Lucious Chieves; it was initiallyisolated from a clinical case and it has been keptby passages through susceptible cattle, ticks andliquid nitrogen(15). A colony of Babesia spp-freeR. microplus ticks was used. The colony iscontinuously reproduced in the laboratory according

272


caso clnico y ha sido mantenida por pases a travsde ganado susceptible, garrapatas y nitrgenolquido(15). Se utiliz una colonia de garrapatas R.microplus libres de Babesia spp. La colonia sereproduce continuamente en el laboratorio deacuerdo a metodologa previamente descrita(8). Seemplearon 12 bovinos B. taurus de 18 meses deedad procedentes de una zona libre de garrapatasy libres de anticuerpos contra Babesia spp mediantela prueba de IFI, los cuales fueron alojados encorrales en confinamiento y fueron alimentados adlibitum. Se formaron dos grupos de seis animales.Los seis bovinos de cada grupo fueron denominadoscon nmeros del uno al seis precedido por la letramayscula de la cepa usada.

Los animales B1 y V1 fueron inoculados al dacero con 1x108 EI con una de las dos poblacionesde parsitos; el bovino B1 fue inoculado con laclona BOR, mientras que el bovino V1 fue inoculadocon sangre infectada con la cepa virulenta de B.bovis. Estas inoculaciones correspondieron al primerpase a travs de bovino susceptible intacto. Unavez que los bovinos B1 y V1 se detectaron positivosa B. bovis por la observacin de laminillas defrotis sanguneos teidos con colorante Giemsa,los animales se sangraron y el segundo pase serealiz mediante la inoculacin de sangre a losanimales B2 y V2. El tercer pase se llev a cabocuando la sangre de estos bovinos mostr EI y seinocul a los bovinos B3 y V3, respectivamente.Todos los pases fueron realizados durante el picode parasitemia a una dosis equivalente a 1x108 EI(Figura 2). Los animales (pase 1) B1, y V1, seinfestaron en cinco ocasiones, con 4,000 larvas R.microplus libres de Babesia spp los das -7, -5, -3,-1 y 3; los animales B2 y V2 se infestaron los das0, 2, 4, 6, 8 y 10; mientras que los B3 y V3 seinfestaron los das 7, 9, 11, 13, 15 y 17;considerando el da cero como el da en el cual losnovillos B1 y V1 fueron primeramente inoculados.Se seleccionaron hembras repletas de R. microplusalimentadas en los animales 1, 2 y 3 (pases 1 al3, respectivamente) que resultaron positivos almicroscopio a la prueba de hemolinfa(22), o que sedesprendieron naturalmente de los animales en dascoincidentes con parasitemia detectables en elbovino. Las hembras repletas se limpiaron y se

to the aforementioned methodology(8). Twelve, 18mo old, B. taurus cattle were used, coming froma tick-free area and free from antibodies againstBabesia spp by the IFA test, were housed inconfinement pens and were fed ad libitum. Twogroups of six animals were formed. The six bovinesfrom each group were identified with numbers fromone to six preceded by the capital letter of thestrain used.

Animals B1 and V1 were inoculated at day zerowith 1 108 IE with each one of two parasitepopulations; bovine B1 was inoculated with BORclone, while bovine V1 was inoculated with infectedblood from B. bovis virulent strain. Theseinoculations corresponded to the first passagethrough intact susceptible bovine. Once bovines B1and V1 were detected positive to B. bovis byGiemsa-stained blood smear observation, the animalswere bled and the second passage was done byblood inoculation to animals B2 and V2. Thirdpassage was carried out when blood from thesebovines showed IE and it was inoculated to bovinesB3 and V3, respectively. All passages were doneduring parasitemia peak at an equivalent dose of 1 108 IE (Figure 2). The animals (first passage)B1 and V1 were infested in five occasions with4,000 Babesia spp-free R. microplus larvae at d -7,-5, -3, -1 and 3; animals B2 and V2 were infestedon d 0, 2, 4, 6, 8 and 10; while B3 and V3 were

Figura 2. Inoculacin de bovinos con cepas atenuada yvirulenta de B. bovis e infestacin con R. microplus.Experimento 2Figure 2. Bovine inoculation with B. bovis attenuated andvirulent strains and R. microplus infestation. Experiment 2

Drawings, figure 1 and 2: Inoculation, 1st passage, 2ndpassage, 3rd passage

B4

B5

B6

V1

V2

V3

273


colocaron en cajas individuales y se incubaron enuna estufa a 27 C, 30 % de humedad relativapara permitir su ovoposicin. Despus de laincubacin, la progenie procedente de cada hembrase utiliz para infestar a los bovinos 4, 5 y 6 enel orden siguiente: la progenie de garrapatasdesprendidas de los animales B1 y V1, se colocaronen los novillos B4 y V4, respectivamente; Laslarvas provenientes de las garrapatas desprendidasde los bovinos B2 y V2, se depositaron en losanimales B5 y V5, respectivamente, y aqullasprovenientes de los bovinos B3 y V3, se utilizaronpara infestar a los novillos B6 y V6. Lasinfestaciones se realizaron, en una ocasin,utilizando 20,000 larvas por animal. Diariamentedurante ocho das se les realiz la prueba dehemolinfa y se procedi a realizar la observacinde quinetos por microscopa. Diariamente sellevaron registros de TR, VCA y tambin se registrla presencia de B. bovis en los EI en todos losanimales experimentales. Muestras de sangreprocedentes de los animales utilizados en elexperimento de transmisin de la clona irradiadade B. bovis se criopreservaron en nitrgeno lquidoa -196 C(21) y procesadas posteriormente mediantela amplificacin de ADN por la prueba de PCRanidada, procedimiento que permite obtener unamplicn de 280 pares de bases, esencialmentecomo se ha descrito previamente(23), y utilizandolos oligonucletidos especficos para B. bovis(24),los cuales se alinean con secuencias internas delgen RAP-1 de B. bovis(25).

RESULTADOS

Experimento 1

Los resultados obtenidos despus de realizar trespases a travs de bovinos susceptibles mediante lainoculacin de B. bigemina cepa BIS se presentanen el Cuadro 1. El bovino A1 present parasitemia,aunque con porcentaje de EI baj (

274


En el tercer pase (Bovino A3) y a pesar de que nose encontr evidencia clara de parsitos en frotissanguneo, se observ aumento en TR (39.7 C) ydisminucin del VCA (20 %) el da 12 PI. Conrespecto a los animales B1 y B2, infestados con laprogenie de garrapatas obtenidas de los bovinosA1 y A2, respectivamente, durante el periodoprepatente todos los frotis revisados resultaronnegativos a B. bigemina. De forma similar, alrevisar la hemolinfa de las garrapatas alimentadasen los bovinos A1, A2 y A3, ninguna muestraresult positiva; en contraste, el bovino receptorB3 mostr un eritrocito con forma sugestiva delestadio de trofozoito de B. bigemina durante losdas 6 y 7 PI. Sin embargo, tanto la TR como elvalor de VCA no presentaron cambios relevantes.

Sangre colectada del bovino B3 y procesadamediante la prueba de PCR-anidada confirm lapresencia de material gentico de B. bigemina, aldetectarse un fragmento del tamao esperado de172 pb especifico para B. bigemina (ver resultadorepresentativo en Figura 3).

Al evaluar el comportamiento de la cepa de campode B. bigemina (Cuadro 2) se encontr que elbovino C1 se detect positivo al frotis sanguneoel da 6 PI (39.5 C 0 1 1 1 1 0Prepatent period* 2 10 11 ___ ___ 6PCV maximum reduction, % 25 25 20 24 38.5 15.6Parasitemia (days) 2 2 0 0 0 2

* Post-inoculation day in which parasites were observed in smear or amplified DNA by PCR.RT= rectal temperature; PCV= packed cell volume (hematocrit).

Figura 3. Anlisis en gel de agarosa de productosamplificados por PCR anidado (B. bigemina) a partir deADN purificado de sangre colectada de bovinosFigure 3. Agarose gel analysis of amplified products bynested-PCR (B. bigemina) from purified blood DNAcollected from bovines

Lanes: 1) Size marker, 100 bp ladder; 2) Positive control,infected erythrocytes ; 3) PCR control (water); 4) Negativecontrol, non-infected erythrocytes; 5) Bovine B1; 6) BovineB2; 7) Bovine B3 .

275


A1, A2 and A3, no sample resulted positive; incontrast, the receptor bovine B3 showed an erythrocytewith suggestive form of a B. bigemina trophozoitestage during d 6 and 7 PI. However, RT as wellas PCV value did not show relevant changes.

Blood collected from bovine B3 and processed bynested-PCR test, confirmed the presence of B.bigemina genetic material, when a fragment of theexpected size of 172 bp specific for B. bigeminawas detected (see representative result in Figure 3).

When B. bigemina field strain behavior wasevaluated (Table 2), it was found that bovine C1was positive to blood smear on d 6 PI (< 0.01 %),being positive for 5 d, with high RT (up to 40 C)and with slight reduction of PCV (16 %). Thebovine that received the second passage (bovineC2) showed parasitemia since d 21 PI with IEpercentages of 0.13, 0.01, 0.08 and 0.13 on d 2,3, 4 and 5 PI, respectively; with fever higher than41 C after parasitemia onset and high reductionof PCV (45 %) on d 5 PI, and therefore it wasnecessary to treat it with babesiacide on d 6 PI.The bovine that received third passage by syringe(C3) showed parasitemia from d 3 up to 12 PI (39.5 C 2 4 1 1Prepatent period* 6 2 3 4PCV maximum reduction, % 16 45 29 66Parasitemia, days 5 4 10 6Required treatment NO Yes Yes Yes* Post-inoculation day in which presence of parasites are observed in smear.RT= rectal temperature; PCV= packed cell volume (hematocrit).

276


C1 and analyzed by hemolymph test resultedpositive showing presence of Babesia kinetics.Bovine D1, infested with hemolymph-positive tickprogeny from bovine C1 (Table 2), showed severeclinical babesiosis, since it was positive to thesmear from d 4 to 9 PI (0.04 %), showing fever(> 40 C) on d 6 PI and a drastic drop of PCV(66 %) from d 5 to 8 PI. Taking into considerationthat bovine D1 was detected positive to smearsince the first passage by ticks, it confirms thetransmission of B. bigemina virulent field strain.

Experiment 2

The obtained results after the third passage throughsusceptible bovines by syringe inoculation of B.bovis BOR clone are shown in Table 3. Calves B1,B2 and B3 showed moderate to mild clinical signsas passage was performed: incubation periodincreased; fever days decreased; prepatent periodincreased and PCV reduction only decreased 5 %in the third passage. There was no presence ofclinical signs in calves B4, B5 and B6 infestedwith R. microplus tick progeny from bovines B1,B2 and B3, respectively. On the other hand,parasites were not found in Giemsa- stained slidesduring the experiment on receptor animals B4 andB5; however, IE in bovine B6 (receptor of the R.microplus tick progeny fed on the inoculated animalwith third passage) were observed, which showedpositive on d 13 PI. Calves did not show clinical

Los novillos no mostraron signos clnicos y laparasi temia fue demasiado baja para sercuantificada. Este experimento demostr la falta detransmisin a travs de garrapatas de la clona BORdespus de uno y dos pases en ganado susceptible.La poblacin fue transmitida despus del tercerpase en animales intactos. Sin embargo, no existeriesgo aparente de que la enfermedad se presente,debido a que los parsitos no revirtieron a lavirulencia por lo menos despus de tres pases enbovinos. Ninguno de los animales de este gruporequiri ser tratado con medicamentos babesicidas.Todas las garrapatas colectadas de los animalesinoculados con la clona BOR fueron negativas a laprueba de hemolinfa, incluyendo aqullas quetransmitieron el parsito a su progenie despus deltercer pase.

En contraste, y como se muestra en el Cuadro 4,el monitoreo de los animales inoculados con elaislado de campo de B. bovis mostr novillos convalores de temperatura rectal de 40 C o superioren cada uno de los tres pases (animales VI, V2 yV3). Tambin, los valores del VCA se vierondramticamente afectados, alcanzando decrementosde 42 a 50 % en los animales en que se realizaronlos tres pases. En forma similar, los animalesreceptores infestados con larvas derivadas degarrapatas alimentadas sobre los bovinos antesmencionados, mostraron signos clnicos severostales como TR mayor a 40 C y una reduccin del

Cuadro 3. Monitoreo de bovinos inoculados con clona BOR de B. bovisTable 3. Monitoring of inoculated bovines with B. bovis BOR clone

B1 B2 B3 B4 B5 B6

Incubation period*, days 3 6 8 - - -Maximum RT, C 40.0 40.4 39.7 39.1 39.2 39.4RT >39.5 C, days 5 5 4 - - -Prepatent period**, days 3 10 13 - - 13PCV maximum reduction, % 33 26 5 13 14 10Parasitemia, days 3 2 1 - - 1Required treatment No No No No No No

* Post-inoculation day with RT >39.5 C.** Post-inoculation day with parasite presence.RT= rectal temperature; PCV= packed cell volume.

277


signs and parasitemia was too low to be quantified.This experiment showed lack of transmissionthrough ticks after the first and second BOR clonepassage in susceptible cattle. The population wastransmitted after the third passage in intact animals.However, there is no evident risk of disease, sinceparasites did not revert to virulence at least afterthe third passage in bovines. No animal from this

VCA del 43 al 53 %. Todos los animalespresentaron EI los das 3-6,7-9, 5-8,10-12, 7-10 y6-8 PI para los animales V1 al V6, respectivamente.Fue necesario administrar medicamentos babesicidaa los seis bovinos. Las garrapatas ingurgitadascolectadas de los seis animales inoculados oinfestados con progenie larval infectada con elaislado de B. bovis de campo resultaron todaspositivas a la prueba de hemolinfa. Los resultadosaqu obtenidos probaron que la clona BOR no estransmitida por garrapatas en el primer y segundopase en ganado susceptible, pero s al tercer pase,como fue determinado por microscopia ptica. Sinembargo, sangre colectada del bovino B6 yprocesada mediante la prueba de PCR-anidada nologr confirmar la presencia de material genticode B. bovis, al no detectarse un fragmento detamao esperado de 280 pb especifico para B.bovis (ver resultado representativo en Figura 4).

DISCUSION

Los resultados encontrados en este estudio respectoa la transmisin por garrapatas y virulencia de unacepa de campo coinciden con los hallazgosreportados previamente, en donde se utiliza unacepa de procedencia distinta (Texcoco) como cepade campo de B. bigemina, pero se demuestra lacapacidad de multiplicarse en el vector, lo cual seconfirma por la presencia de quinetos en hemolinfade las hembras repletas, la transmisin trans-ovrica

Cuadro 4. Monitoreo de bovinos inoculados con cepa virulenta de B. bovisTable 4. Monitoring of inoculated bovines with B. bovis virulent strain

V1 V2 V3 V4 V5 V6

Incubation period*, days 3 6 3 5 7 7Maximum RT, C 40.0 41.0 41.2 40.2 40.4 40.7RT >39.5 C, days 6 4 5 6 5 2Prepatent period**, days 5 6 5 10 7 6PCV maximum reduction, % 50 42 44 43 53 53Parasitemia, days 5 3 5 3 6 4Requiered treatment Yes Yes Yes Yes Yes Yes

* Post-inoculation day with RT >39.5 C.** Post-inoculation day with parasite presence.RT= rectal temperature; PCV= packed cell volume.

Figura 4. Anlisis en gel de agarosa de productosamplificados por PCR anidado (B. bovis) a partir de ADNpurificado de sangre colectada de bovinosFigure 4. Agarose gel analysis of amplified products bynested-PCR (B. bovis) from purified blood DNA collectedfrom bovines

Lanes: 1) Size marker, 100 bp ladder; 2); PCR control(water); 3) Positive control, infected erythrocytes; 4)Bovine B4; 5) Bovine B5; 6) Bovine B6; 7) Bovine V4.

278


group needed treatment with babesiacide. All tickscollected from inoculated animals with BOR clonewere negative to hemolymph test, including thosewhich transmitted the parasite to its progeny afterthe third passage.

In contrast, and as it is shown in Table 4, themonitoring of inoculated animals with B. bovis fieldisolate showed calves with RT of 40 C or higher infirst, second and third passage (animals V1, V2 andV3). Also, PCV values were dramatically affected,reaching a drop of 42 to 50 % in animals gonethrough the third passage. Likewise, the infestedreceptor animals with larvae from ticks fed on bovinesaforementioned, showed severe clinical signs, suchas: RT higher than 40 C and a PCV reduction of43 to 53 %. All animals showed IE on d 3-6, 7-9,5-8, 10-12, 7-10 and 6-8 PI for animals V1 to V6,respectively. It was necessary to administerbabesiacide to the six bovines. The engorged tickscollected from the six inoculated animals or infestedwith infected larval progeny of the B.bovis fieldisolate resulted positive to the hemolymph test.The results here obtained proved that BOR cloneis not transmitted by ticks on first and secondpassage in susceptible cattle, but indeed at thirdpassage, as was determined by optical microscopy.Nevertheless, collected blood from bovine B6 andprocessed by nested-PCR test did not confirm thepresence of B. bovis genetic material, given that afragment of the expected size of 280 bp specificfor B. bovis was not detected (see representativeresult in Figure 4).

DISCUSSION

Results found in this study in regard to ticktransmission and field strain virulence, correspondto the findings previously reported, where a differentfield strain (Texcoco) of B. bigemina is used, butthe propagation capacity in the vector isdemonstrated, which is confirmed by the presenceof kinetes in engorged female hemolymph, the trans-ovarian transmission and strain virulence in receptoranimals. Likewise, it is confirmed that BIS strainis not transmitted by R. microplus after the firstpassage, as it has been previously reported(8).

y la virulencia de la cepa en los animales receptores.De forma similar, se confirma que la cepa BIS noes transmitida por R. microplus despus de unpase, como ha sido reportado previamente(8).

En este estudio se confirma que los parsitosmantenidos en cultivo in vitro perdieron la capacidadpara multiplicarse en la garrapata vector duranteun segundo pase por sub-inoculacin en bovinossusceptibles. Esto, evidenciado por la ausencia dequinetos en la hemolinfa de garrapatas alimentadasen bovinos con parasitemia patente. Adems, sedemuestra que an cuando sujeta a tres pasessucesivos en bovinos altamente susceptibles, lapoblacin de parsitos mantiene su caractersticabiolgica de reducida virulencia manifestada porlos valores de TR y VCA determinados en losbovinos sub-inoculados, los cuales no mostraroncambios relevantes. Sin embargo, y an cuando lasgarrapatas alimentadas en el bovino que recibi eltercer pase de la cepa BIS resultaron negativas enla prueba de hemolinfa, la progenie derivada deestas garrapatas tuvo la capacidad de transmitirla albovino receptor. Si bien este bovino no manifestsignologa clsica de babesiosis bovina por B.bigemina, el frotis sanguneo de este bovino mostrformas intra-eritrocticas sugestivas de B. bigemina,las que indicaban que el bovino receptor estabarealmente infectado, lo que se demostr medianteel anlisis por PCR anidado, en el que se detectun fragmento especfico de B. bigemina del tamaoesperado. Dado que se requiere de una fase sexualde Babesia para que se lleve a cabo la infeccin delas clulas epiteliales del intestino de la garrapatavector, y consecuentemente llevarse a cabo latransmisin trans-ovrica(22,26), es probable que lapoblacin de parsitos de la cepa Seed requierende por lo menos tres pases en bovinos infestadoscon R. microplus para que se induzca la formacinde formas infectantes para la garrapata vector. Sinembargo se requiere de estudios adicionales paraprobar esta hiptesis.

Para el estudio con la clona BOR de B. bovis, losresultados encontrados coinciden con otros hallazgosreportados, los cuales demuestran la falta detransmisin por R. microplus de una cepa atenuadade B. bovis a travs del primer pase en ganado

279


This study confirms that parasites kept in in vitrocultures lost their capacity to multiply in the vectortick during a second passage by subinoculation insusceptible bovines. This, evidenced by the absenceof kinetes in hemolymph of ticks fed on bovineswith patent parasitemia. Also, it is demonstratedthat even if it is subject to a third successive passagein highly susceptible bovines, parasite populationkeeps its biological characteristics of virulencereduction manifested by RT and PCV valuesdetermined in sub-inoculated bovines, which didnot show relevant changes. However and even whenticks fed on bovine that received BIS strain thirdpassage resulted negative to hemolymph test,progeny originating from these ticks had the capacityto transmit it to the receptor bovine. Even if thisbovine did not show classic symptoms of bovinebabesiosis by B. bigemina, its blood smear showedintra-erythrocytic forms suggestive of B. bigemina,which indicated that the receptor bovine was reallyinfected, and was demonstrated by nested-PCRanalysis, where a B. bigemina specific fragment ofthe expected size was detected. Given that a Babesiasexual phase is required for epithelial cell infection ofvector tick intestine, and consequently trans-ovariantransmission(22,26). It is probable that Seed strainparasite population requires at least third passage ininfested bovines with R. microplus, so that infectedforms are induced for the tick vector. However, furtherstudies are required to prove this hypothesis.

For B. bovis BOR clone study, the obtained resultscoincide with other reported findings, whichdemonstrate the lack of R. microplus transmissionof a B. bovis attenuated strain through first passagein susceptible cattle(16,19,20). An explanation forthis could be the loss of proteolytic enzymes, whichhave a function in invasion mechanisms of intestinalcells by parasites(16), a condition probably causedby irradiation, which causes deoxyribonucleic acid(DNA) rupture, totally inactivating genes(14). Inspite of these being highly consistent characteristics,the irradiated clone passage through more than twointact animals could revert parasite infectiousnessto ticks, as it was observed in this study during thethird passage. It is important to highlight that eventhough parasites were transmitted in the thirdpassage, there was only one parasite found in bloodsmear after two hours of observation by an expert

susceptible(16,19,20). Una explicacin a esto podraser la prdida de enzimas proteolticas, las cualestienen una funcin en los mecanismos de invasinde las clulas intestinales por los parsitos(16), unacondicin probablemente causada por irradiacin,la cual provoca la ruptura de la cadena fosfodiesterdel cido desoxiribonucleico (ADN), inactivandolos genes en su totalidad(14). No obstante de questas son caractersticas altamente consistentes, elpase de esta clona irradiada a travs de ms de dosanimales intactos podra volver al parsito infectivopara las garrapatas, como se observ en este trabajodurante el tercer pase. Es importante hacer notarque, si bien los parsitos se transmitieron en eltercer pase, solamente se encontr un parsito enel frotis sanguneo despus de dos horas deobservacin por un microscopista experto, y laprueba de PCR anidado no logr detectar materialgentico alguno. Esto puede ser resultado del umbralde sensibilidad analtica de la prueba de PCRanidado, dado que se requiere de la presencia deal menos 30 EI en una muestra de 200 l depaquete celular, para que se logre extraer la cantidadde molde suficiente que pueda dar un resultadopositivo en la prueba de PCR(24,25). No obstante,el bovino receptor de la progenie larval derivadade garrapatas colectadas del bovino tercer pasenunca mostr signos clnicos de babesiosis bovina.Se ha reportado que una cepa atenuada de B. bovisfue transmitida por garrapatas despus de 26 pasesen vacas esplenectomizadas(27). Otros experimentoshan demostrado la falta de transmisin despus delprimer pase por garrapatas R. microplus de unacepa vacunal de B. bovis(16,19,20).

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES

Las cepas atenuadas BIS de B. bigemina y BOR deB. bovis no fueron transmitidas de forma trans-ovrica por garrapatas despus de dos pases enbovinos, y no revirtieron a virulentas en pasessubsiguientes de animales inoculados a animalessusceptibles. La transmisin por garrapatas de lascepas atenuadas hasta un tercer pase por bovinos,una prctica no realizada comnmente en lasexplotaciones ganaderas, reduce el riesgo dediseminacin de los parsitos cuando estos seutilicen como vacuna viva contra la babesiosis

280


microscopist, and the nested-PCR test did not detectany genetic material. This can be the result ofanalytical sensitivity threshold of nested-PCR test,since the presence of at least 30 IE, in a sampleof 200 l of packed cells, are required, so thatsufficient template DNA quantity can be extractedto give a positive result in PCR test(24,25).Nevertheless, the receptor bovine of larval progenyderived from collected ticks from third passage inbovines, never showed overt bovine babesiosisclinical signs. It has been reported that one B.bovis attenuated strain was transmitted by ticksafter the 26th passage in splenectomized cows(27).Other experiments have demonstrated lack oftransmission of a B. bovis vaccinal strain after thefirst passage by R. microplus ticks(16,19,20).

CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS

B.bigemina BIS and B. bovis BOR attenuated strainswere not trans-ovarially transmitted by ticks afterthe second passage in bovines, and did not revertto virulence in subsequent passages from inoculatedto susceptible animals. Transmission of attenuatedstrains by ticks up to a third passage by bovines,an infrequent practice performed in cattle units,decreases risk of parasite dissemination when theseare used as live vaccine against bovine babesiosis,besides keeping the desirable characteristics that alive innocuous immunogen must have. Nevertheless,further studies are required with greater number ofsuccessive passages in susceptible animals, todetermine the molecular-genetic mechanismsinvolved in parasite development within theerythrocyte in an inoculated bovine-, and/or R.microplus intestine sexual Babesia stage- that allowthe parasite to newly acquire pathogenic capacityfor the bovine and the infective one for the tickvector, to consequently be trans-ovariallytransmitted. Genome and transcriptome studies onBabesia attenuated populations will allow identifyinggenetic changes in the genome and how theymanifest in the transcriptome of attenuated strainsderived from in vitro culture, reflected in anattenuated phenotype and with decreased capacityto be transmitted by the tick vector.

End of english version

bovina, amn de mantener las caractersticasdeseables que debe reunir un inmungeno vivo,que sea inocuo. No obstante, se requiere de estudioscon un mayor nmero de pases sucesivos enanimales susceptibles, para determinar losmecanismos gentico-moleculares involucrados enel desarrollo del parsito dentro del eritrocito -enun bovino inoculado-, o en el intestino de R.microplus -formas sexuales-, que permiten alparasito adquirir nuevamente la capacidadpatognica hacia el bovino y la infectiva hacia lagarrapata vector, para consecuentemente sertransmitidos de forma trans-ovrica. Estudios delgenoma y transcriptoma de las poblacionesatenuadas de Babesia, permitirn identificar loscambios genticos ocurridos en el genoma y cmose manifiestan en el transcriptoma de las cepasatenuadas derivadas de cultivo in vitro, que se venreflejadas en un fenotipo atenuado y con capacidaddisminuida de ser transmitidas por la garrapatavector.

LITERATURA CITADA

1. Rolls PJ, Bock RE, de Vos AJ, Waldron SJ, Echaide IE.Bovine babesiosis. In: World Organization for Animal Healtheditor. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrialanimals 2010. Vol 2, [on line]. http://www.oie.int/fileadmin/H o m e / e n g / H e a l t h _ s t a n d a r d s / t a h m /2.04.02_bovine_babesiosis.pdf. Accessed Jun 30, 2010.

2. de Vos AJ. Distribution, economic importance and controlmeasures for Babesia and Anaplasma. En: Dolan TT editor.Recent developments in the control of Anaplasmosis, Babesiosisand Cowdriosis: Proc Workshop, ILRAD, Nairobi, Kenya,1991:3-12.

3. Callow LL, Mellors LT, McGregor W. Reduction in virulenceof Babesia bovis due to rapid passage in splenectomized cattle.Int J Parasitol 1979;9(4):333-338.

4. Dalgliesh RJ, Callow LL, Mellors LT, McGregor W.Development of a highly infective Babesia bigemina vaccineof reduced virulence. Aust Vet J 1981;57:8-11.

5. Bishop JP, Adams LG. Babesia bigemina: Immune response ofcattle inoculated with irradiated parasites. Exp Parasitol1974;35(1):35-43.

6. Wright IG, Goodger BV, Mahoney DF. The irradiation of Babesiabovis. The difference in pathogenicity between irradiated andnon-irradiated populations. Z Parasitenkd 1980;63:47-57.

7. Yunker CE, Kuttler KL, Johnson LW. Attenuation of Babesiabovis by in vitro cultivation. Vet Parasitol 1987;24:7-13.

8. Hernndez OR, lvarez MJA, Buening GM, Cant AGJ,Monroy BM, Ramos AJA, et al. Diferencias en la virulenciay en la induccin de proteccin de aislamientos de Babesia

281


bigemina derivados de cultivo in vitro. Tc Pecu Mx1990;28(2):51-62.

9. Vega CA, Buening GM, Green TJ, Carson CA. In vitrocultivation of Babesia bigemina. Am J Vet Res 1985;46(2):416-420.

10. Figueroa MJV, Cant AGJ, lvarez MJA, Lona GR, RamosAJA, Vega MCA. Capacidad protectora en bovinos de una cepade Babesia bigemina derivada de cultivo in vitro. Tc PecuMx 1998;36(2):95-104.

11. Cant AGJ, Figueroa MJV, Ramos AJA, lvarez MJA, MosquedaGJJ, Vega MCA. Evaluacin de la patogenicidad y capacidadprotectora de un inmungeno fresco combinado de Babesiabigemina y Babesia bovis. Rev Vet Mx 1999;30(3):215-220.

12. Cant AGJ, lvarez MJA, Rojas REE, Ramos AJA, MosquedaGJJ, Vega MCA, et al. Proteccin contra babesiosis bovina conuna vacuna mixta de Babesia bovis y Babesia bigemina derivadade cultivo in vitro bajo una confrontacin de campo.Inmunizacin en un rea libre de enfermedad. Rev Vet Mx2003;34(4):323-332.

13. Gil LA, Higuera B, Orrego J. Vacuna experimental contraBabesia bovis y Babesia bigemina producida con atenuacin delos parsitos por irradiacin. Rev Med Zoot 1987;39(1-2):49-57.

14. Rodrguez SD, Buening GM, Carson CA. Caracterizacinbioqumica preliminar de clonas de Babesia bovis irradiadascon cobalto 60. Tc Pecu Mx 1993;31(1):16-24.

15. Cant AGJ, Figueroa MJV, lvarez MJA, Ramos AJA, VegaMCA. Capacidad inmunoprotectora de una clona irradiada deBabesia bovis derivada de cultivo in vitro. Tc Pecu Mx1996;34(3):127-135.

16. lvarez JA, Ramos JA, Rojas EE, Mosqueda JJ, Vega CA,Olvera AM, et al. Field Challenge of cattle vaccinated with acombined Babesia bovis and B. bigemina frozen immunogen.Ann New York Acad Sci 2004;1026:277-283.

17. Shkap V, de Vos AJ, Zweygarth E, Jongejan F. Attenuated

vaccines for tropical theileriosis, babesiosis and heartwater:The continuing necessity. Trends Parasitol 2007;23(9):420-426.

18. Timms P, Stewart NP. Growth of Babesia bovis parasites instationary and suspension cultures and their use in experimentalvaccination of cattle. Res Vet Sci 1989;47:309-314.

19. Mangold AJ, Aguirre DH, Cafrune MM, de Echaide ST,Guglielmone AA. Evaluation of the infectivity of a vaccinaland a pathogenic Babesia bovis strain from Argentina toBoophilus microplus. Vet Parasitol 1993;51:143-148.

20. OSullivan PJ, Calllow LL. Loss of infectivity of a vaccinestrain of Babesia Argentina for Boophilus microplus. Aust VetJ 1986;42:252-254.

21. Palmer DA, Buening GM, Carson CA. Cryopreservation ofBabesia bovis for in vitro cultivation. Parasitol 1982;84:567-572.

22. Smith RD. Ciclo biolgico de Babesia en la garrapata. En:Moreno ChR editor. Ciencia Veterinaria Vol 2, UNAM, Mxico.1978:233-264.

23. lvarez JA, Alpirez F, Rojas C, Figueroa JV. Probabilidaddiaria de infeccin para Babesia spp mediante PCR anidado.Reunin Cientfica Tecnolgica Forestal y Agropecuaria.Veracruz 2007:419-425.

24. Figueroa JV, Chieves LP, Johnson GS, Buening GM. Multiplexpolymerase chain reaction based assay the detection of Babesiabigemina, Babesia bovis and Anaplasma marginale DNA inbovine blood. Vet Parasitol 1993;50:69-81.

25. Figueroa JV, Chieves LP, Johnson GS, Goff WL, BueningGM. Polymerase chain reaction-based diagnostic assay to detectcattle chronically infected with Babesia bovis. Rev Lat AmerMicrobiol 1994;36:47-55.

26. Chauvin A, Moreau E, Bonnet S, Plantard O, Malandrin L.Babesia and its hosts: adaptation to long lasting interactions asa way to achieve efficient transmission. Vet Res 2009;40(2):37-55.

27. Mafra CL, Patarroyo JH, Silva SS. Babesia bovis: Infectivityof an attenuated strain of Brazilian origin for the tick vector B.microplus. Vet Parasitol 1994;52:139-143.

Copyright of Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias is the property of Tecnica Pecuaria en Mexico and itscontent may not be copied or emailed to multiple sites or posted to a listserv without the copyright holder'sexpress written permission. However, users may print, download, or email articles for individual use.

Documents

Transmisión de cepas atenuadas de Babesia bigemina y Babesia bovis por garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus