Upload
others
View
4
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA FARMACIJO
ALEŠ ŠKET
UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI PROTEINOV AKR1B1 IN AKR1B10 PRI RAKU ENDOMETRIJA
DETECTION OF PROTEINS AKR1B1 AND AKR1B10 IN ENDOMETRIAL CANCER
DIPLOMSKA NALOGA
UNIVERZITETNI ŠTUDIJ FARMACIJE
Ljubljana, 2013
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
2
Diplomsko delo sem opravil na Inštitutu za biokemijo Medicinske fakultete Univerze v
Ljubljani, pod mentorstvom prof. dr. Janka Kosa, univ. dipl. kem. in somentorstvom prof.
dr. Tee Lanišnik Rižner, univ. dipl. kem.
Zahvaljujem se mentorju prof. dr. Janku Kosu in somentorici prof. Tei Lanišnik Rižner za
pomoč pri diplomskem delu. Velika zahvala gre tudi asist. dr. Neli Hevir za pomoč in
nasvete pri delu v laboratoriju.
Iskrena hvala moji družini za potrpežljivost in podporo skozi ves čas študija. Hvala tudi
vsem prijateljem, ki so mi kakorkoli pomagali na poti do diplome.
IZJAVA
Izjavljam, da sem diplomsko nalogo samostojno izdelal pod mentorstvom prof. dr. Janka
Kosa, univ. dipl. kem. in somentorstvom prof. dr. Tee Lanišnik Rižner, univ. dipl. kem.
ALEŠ ŠKET
KOMISIJA ZA ZAGOVOR:
predsednik: prof. dr. Albin Kristl, mag. farm.
član: doc. dr. Jožko Cesar, mag. farm.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
3
KAZALO VSEBINE KAZALO SLIK .............................................................................................................................4
KAZALO GRAFOV ......................................................................................................................4
KAZALO TABEL .........................................................................................................................4
POVZETEK ..................................................................................................................................5
ABSTRACT ..................................................................................................................................6
SEZNAM UPORABLJENIH KRATIC ..........................................................................................7
1. UVOD .......................................................................................................................................8
1.1 RAK ENDOMETRIJA .........................................................................................................8
1.1.2 Dejavniki tveganja in zaščite..........................................................................................9
1.1.3 Klinična slika in diagnoza ..............................................................................................9
1.1.4. Zdravljenje ................................................................................................................. 11
1.1.5 Vloga hormonov .......................................................................................................... 11
1.2. VNETNI PROCESI IN RAK ENDOMETRIJA ................................................................. 12
1.3. RETINOJSKA KISLINA IN RAK ENDOMETRIJA ........................................................ 12
1.4 ENCIMI IZ NADDRUŽINE ALDO-KETO REDUKTAZ .................................................. 13
1.4.1 Poddružina AKR1B ..................................................................................................... 13
2. NAMEN DELA ....................................................................................................................... 17
3. MATERIALI IN METODE ..................................................................................................... 18
3.1.POLIAKRILAMIDNA GELSKA ELEKTROFOREZA ..................................................... 18
3.1.1 Reagenti ...................................................................................................................... 18
3.1.2 Postopek ...................................................................................................................... 19
3.2 PRENOS WESTERN ......................................................................................................... 20
3.2.1 Reagenti ...................................................................................................................... 20
3.2.2 Postopek ...................................................................................................................... 20
Slika 4: Prenos proteinov z gela na membrano (prenos western) ............................................... 21
3.3 DETEKCIJA Z OJAČANO KEMILUMINISCENCO (ECL) ............................................. 21
3.4 BARVANJE MEMBRANE................................................................................................ 22
3.5 BARVANJE GELA ........................................................................................................... 22
3.6 IMUNOHISTOKEMIJA .................................................................................................... 23
3.6.1 Reagenti ...................................................................................................................... 23
3.6.2 Postopek ...................................................................................................................... 23
4. REZULTATI IN RAZPRAVA ................................................................................................. 25
4.1 DETEKCIJA PROTEINOV ............................................................................................... 25
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
4
4.2 IMUNOHISTOKEMIJSKO BARVANJE PROTEINOV .................................................... 30
5. SKLEP..................................................................................................................................... 38
6. LITERATURA ........................................................................................................................ 39
KAZALO SLIK
Slika 1: Vloga encima AKR1B1 pri biosintezi prostaglandinov in aktivaciji NF-κB ..................... 15 Slika 2: Vloga encima AKR1B10 pri biosintezi retinojske kisline................................................. 16 Slika 3: Aparatura za elektroforezo (Mini-Protean II Bio-Rad) ..................................................... 19 Slika 4: Prenos proteinov z gela na membrano (prenos western) ................................................... 21 Slika 5: Reakcija detekcije z ojačano kemiluminiscenco ............................................................... 22 Slika 6: Detekcija proteinov AKR1B1 in AKR1B10 .................................................................... 26 Slika 7: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 7, 8, 10 in 13 ........................................................ 32 Slika 8: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 18, 19, 20 in 21 .................................................... 33 Slika 9: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 22, 23, 24 in 25 .................................................... 34 Slika 10: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 26, 27, 30 in 31 .................................................. 35 Slika 11: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 32, 33, 34 in 35 .................................................. 36 Slika 12: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 38, 40, 42 in 44 .................................................. 37
KAZALO GRAFOV
Graf 1: Prikaz količine proteinov AKR1B1 v kontrolnem in tumorskem tkivu ............................. 28 Graf 2: Prikaz razmerja proteinov AKR1B1 v tumorskem in kontrolnem tkivu ............................. 28 Graf 3: Prikaz količine proteinov AKR1B10 v kontrolnem in tumorskem tkivu ............................ 29 Graf 4: Prikaz razmerja proteinov AKR1B10 v tumorskem in kontrolnem tkivu ........................... 29
KAZALO TABEL Tabela I: Rezultati imunohistokemijskega barvanja vzorcev raka endometrija .............................. 31
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
5
POVZETEK Rak endometrija (rak maternične sluznice) je četrta najpogostejša oblika raka pri ženskah v
Zahodni Evropi in ZDA. Pojavlja se predvsem pri ženskah v obdobju po menopavzi.
Nekontrolirano vnetje, povezano s povišano koncentracijo prostaglandinov (PG) v
endometrijskem tkivu, lahko vodi do razvoja raka endometrija. Prostaglandini stimulirajo
celično proliferacijo, celično adhezijo, migracijo in angiogenezo ter s tem pospešijo rast
tumorjev. Retinojska kislina ima zaščitno vlogo, saj preko receptorjev RAR in RXR
pomaga pri diferenciaciji celic.
Protein AKR1B1 je udeležen v reakcijah nastanka vnetnih mediatorjev, saj deluje kot
prostaglandin sintaza, ki pretvarja PGH2 v PGF2α. Z redukcijo aldehida 4-
hidroksinonenala, ki nastane s peroksidacijo lipidov, AKR1B1 posredno stimulira NF-κB,
kar lahko vodi v aktivacijo citokinov in vnetnih mediatorjev, kot je ciklooksigenaza-2
(COX-2). Protein AKR1B10 katalizira redukcijo retinala v retinol in tako posredno
preprečuje nastanek retinojske kisline, ki je vključena v uravnavanje celične proliferacije in
diferenciacije. AKR1B10 katalizira tudi redukcijo izoprenil aldehidov. S tem uravnava
prenilacijo GTP-az ter tako vpliva na proliferacijo in apoptozo celic. V okviru diplomske
naloge smo proučili prisotnost AKR1B1 in AKR1B10 v tumorskem in kontrolnem
endometriju.
V 30 parih vzorcev proteinov, izoliranih iz tumorskega in kontrolnega tkiva endometrija
smo z metodami poliakrilamidne gelske elektroforeze, prenosa western in z detekcijo s
specifičnimi protitelesi ugotavljali prisotnost proteinov AKR1B1 in AKR1B10. Zaznali
smo statistično značilno nižjo količino obeh proteinov v tumorskih vzorcih. Z
imunohistokemijskim barvanjem smo prisotnost obeh proteinov potrdili tudi na celični
ravni. AKR1B1 in AKR1B10 se nahajata v citoplazmi epitelijskih celic rakavega
endometrija.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
6
ABSTRACT Endometrial cancer is the fourth-most-common cancer in women in western Europe and
USA. The majority of cases occur in post-manopausal women. Uncontrolled inflammation,
associated with increased production of prostaglandins (PG) in endometrial tissue, can lead
to development of endometrial cancer. The prostaglandins stimulate cell proliferation, cell
adhesion, cell migration and angiogenesis and therefore accelerate tumor growth. Retinoid
acid by binding to the retinoic acid receptor (RAR) and the retinoid X receptor (RXR)
stimulates cell differentiation, and thus has protective role.
Enzyme AKR1B1is involved in synthesis of inflammatory mediators and it acts as a PG
synthase that convert PGH2 to PGF2α. AKR1B1 catalyzes the reduction of lipid
peroxidation products, such as 4-hydroxynonenal (HNE) and indirectly stimulates
transcription factor NF-κB, which then stimulates expression of cytokines and
inflammatory mediators, such as cyclooxygenease-2 (COX-2). Enzyme AKR1B10
catalyzes the reduction of retinals to retinols and indirectly prevents synthesis of retinoid
acid, which is involved in cell proliferation and cell diferentiation. AKR1B10 catalyzes
also reduction of isoprenyl aldehydes and is involved in prenylation of small GTPases,
which regulate cell proliferation and apoptosis. In this research we analyzed presence of
AKR1B1 and AKR1B10 in samples of cancerous and adjacent noncancerous endometrial
tissues.
We investigated the AKR1B1 and AKR1B10 protein levels in 30 paired samples by SDS –
PAGE electrophoresis, western blot analysis and chemiluminiscence detection. Both
protein levels were significantly decreased in tumorous tissues, compared to controls. We
confirmed presence of both proteins in endometrial cancer also at the cellular level with
immunohistochemical staining. AKR1B1 and AKR1B10 were located predominantly in
the cytoplasm of the epithelial cells of cancerous endometrial tissue.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
7
SEZNAM UPORABLJENIH KRATIC AKR aldo-keto reduktaze
COX-2 ciklooksigenaza-2
FIGO International Federation of Gynecology and Obstetrics
GTP gvanozin trifosfat
HER-2/neu »Human Epidermal Growth Factor Receptor 2«
HRP hrenova peroksidaza
HSD hidroksisteroid-dehidrogenaza
NADPH reducirana oblika nikotinamid adenin dinukleotid fosfata
PBS fosfatni pufer (phosphate buffered saline)
PG prostaglandin
PPIA peptidil prolil izomeraza A (ciklofilin A)
PTGS prostaglandin endoperoksid sintaza
PVDF poliviniliden difluorid
NaDS natrijev dodecil sulfat (sodium dodecyl sulfate)
TEMED N, N, N', N'-tetrametiletilendiamin
TBS Tris pufer
TRIS trihidroksietilaminoetan
TTBS Tween Tris pufer
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
8
1. UVOD
1.1 RAK ENDOMETRIJA
Rak endometrija (rak maternične sluznice) je četrta najpogostejša oblika raka pri ženskah v
Zahodni Evropi in ZDA. Najpogosteje se pojavlja pri ženskah v obdobju po menopavzi
(1). Približno 10 % primerov raka endometrija je dedno pogojenih in so pogosto povezani
z dedno obliko nepolipoznega raka debelega črevesa. Za to obliko najpogosteje zbolijo
ženske v mlajši dobi. Okrog 90 % primerov raka endometrija pa je sporadičnih. Te lahko
na osnovi klinično-patoloških lastnosti razdelimo v dve skupini (1,2).
V prvo skupino uvrščamo od estrogenov odvisne primere raka endometrija (tip I), ki
predstavljajo približno 80 % vseh sporadičnih primerov raka. Pojavljajo se pri ženskah v
obdobju pred in po menopavzi in imajo dobro napoved preživetja (1,2). Pogosto so
povezani s hiperplazijo endometrija in z izražanjem receptorjev za estrogene in
progesteron. Ta oblika raka se najpogosteje razvije v povezavi z debelostjo, s policističnim
ovarijskim sindromom ali z nadomestno estrogensko terapijo brez progestinov. Histološko
je večina tumorjev tipa I endometrioidnih ter mucinoznih adenokarcinomov in so dobro
diferencirani (3,4,5).
V drugo skupino uvrščamo ostalih 20% sporadičnih primerov raka, ki niso povezani z
estrogeni in se razvijejo v atrofičnem endometriju kot intraepitelijski adenokarcinomi (tip
II). So slabo diferencirani in se pojavljajo kot serozni papilarni in svetlocelični
adenokarcinomi. Tip II se pojavlja povprečno 5-10 let pozneje kot tip I, zaradi infiltracije v
miometrij ima slabšo napoved preživetja in je zelo agresiven (3, 5, 6).
Pri tipu I se pogosto pojavljajo mutacije in metilacije promotorske regije genov, ki so
odgovorni za popravljanje napak pri prepisovanju DNA, mutacije onkogena K-RAS, tumor
zavirajočega gena PTEN in gena β-katenina, ki vzdržuje normalno adhezijo celic. Pri tipu
II pa se pojavlja anevploidnost, mutacije tumor zavirajočega gena P53 ter pomnoževanje in
prekomerno izražanje onkogena HER-2/neu (5).
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
9
1.1.2 Dejavniki tveganja in zaščite
Dejavniki tveganja:
- nadomestna hormonska terapija brez progestinov,
- zgodnja prva menstruacija,
- pozna menopavza,
- neplodnost,
- debelost (po menopavzi se androstendion v maščevju pretvarja v estron),
- diabetes,
- nepravilno delovanje jajčnikov,
- zdravila (tamoksifen) (5, 7, 8).
Dejavniki zaščite:
- nosečnost (povišana sinteza progesterona),
- kombinirani peroralni kontraceptivi s progestini,
- kajenje (8, 9).
1.1.3 Klinična slika in diagnoza
Približno 80 % primerov raka endometrija se pojavi pri ženskah v obdobju po menopavzi,
ostalih 20 % pa pri ženskah pred menopavzo. Najpomembnejši simptom je krvavitev. Pri
10-20 % žensk, ki imajo po menopavzi težave s krvavitvijo, diagnosticirajo rak
endometrija. Standardni diagnostični postopek pri krvavitvah je frakcionirana kiretaža, ki
je invaziven kirurški poseg (3). Pri nejasnih primerih se opravita histeroskopija in ciljana
biopsija sprememb na endometriju.
FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics) je leta 1988 sprejel pravila
za kirurškopatološko določanje stadija endometrijskega karcinoma. Najpomembnejša
prognostična dejavnika sta stopnja diferenciacije in globina invazije v miometrij.
Stadij I (malignom je omejen na telo maternice)
- Ia G1,2,3 tumor omejen na endometrij
- Ib G1,2,3 tumor zajema manj kot polovico miometrija
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
10
- Ic G1,2,3 tumor zajema več kot polovico miometrija
Stadij II (malignom zajema telo maternice in vrat)
- IIa G1,2,3 zajema cervikalne žleze
- IIb G1,2,3 prodira v cervikalno stromo
Stadij III (tumor je razširjen zunaj maternice, znotraj medenice in/ali
retroperitonealno)
- IIIa G1,2,3 zajema serozo uterusa in/ali adnekse in/ali je pozitivna
peritonealna citologija
- IIIb G1,2,3 metastazira v nožnico
- IIIc G1,2,3 metastaze v medeničnih in/ali paraaortnih bezgavkah
Stadij IV (oddaljeno metastaziranje)
- IVa 1,2,3 invazija v sluznico mehurja ali rektuma
- IVb oddaljene metastaze in/ali razširitev bolezni zunaj male
medenice in/ali v ingvinalne bezgavke
Na podlagi prognostičnih dejavnikov lahko bolnice z endometrijskim karcinomom
razdelimo v manj in bolj ogroženo skupino. V prvi je (stadij Ia, Ib) je nevarnost ponovitve
bolezni manjša in preživetje boljše kot v drugi (stadij II) (10).
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
11
1.1.4. Zdravljenje
Način zdravljenja raka endometrija izbiramo glede na stadij bolezni, histološki tip in
diferenciranost tumorskih celic. Glede na klinično-patološke karakteristike razdelimo rak
endometrija v dve skupini. V prvi skupini so primeri z nizkim tveganjem (stadij I, brez
invazije v miometrij), v drugi skupini pa primeri z visokim tveganjem (kasnejši stadiji). Na
podlagi te delitve določimo tudi strategijo zdravljenja (3, 10).
Pri primerih, ki spadajo v prvo skupino, se najpogosteje izvede kirurški poseg
(abdominalna histerektomija). Standardna je kirurška odstranitev maternice z adneksi, z
odstranitvijo medeničnih bezgavk in z odvzemom vzorca za citološko analizo. Ta način
zdravljenja se lahko opravi pri približno 80 % rakavih bolnic (3, 10).
Pri primerih z visokim tveganjem je najbolj uveljavljen kirurški poseg abdominalne
histerektomije s postoperativno kemoterapijo in obsevanjem (3, 10).
1.1.5 Vloga hormonov
Rak endometrija je povezan s prekomernim delovanjem estrogenov ob zmanjšanem
delovanju progesterona. Pri tem lahko pride do napak pri podvajanju DNA in nadalje do
hiperplazije endometrija. Pomen estrogenov potrjujejo primeri raka endometrija pri
ženskah, pri katerih je hormonsko nadomestno zdravljenje potekalo z zdravili z estrogeni
brez dodatka progestagenov ali pri bolnicah z rakom dojk, ki so jih zdravili z agonisti
receptorjev za estrogene. Estrogeni imajo namreč mitogeno delovanje, progesteron pa
delovanju estrogenov nasprotuje in usmerja celice v diferenciacijo (5).
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
12
1.2. VNETNI PROCESI IN RAK ENDOMETRIJA
Nekontrolirano vnetje lahko vodi do razvoja raka endometrija, ki je povezan s povišano
koncentracijo prostaglandinov v endometrijskem tkivu. Prostaglandini stimulirajo celično
proliferacijo, celično adhezijo, migracijo in angiogenezo ter s tem pospešijo razvoj
tumorjev endometrija (1, 11). Prostaglandini nastanejo iz arahidonske kisline, ki se sprošča
iz celičnih fosfolipidov s pomočjo encima fosfolipaze A2. Naprej se ob prisotnosti
encimov PTGS1 in PTGS2 pretvori v PGG2, ta pa se reducira v PGH2, ki je nestabilen
intermediat in se pretvori s pomočjo različnih encimov v prostaglandine PGD2, PGE2 in
PGF2α. Eden od encimov, ki katalizira redukcijo PGH2 v PGF2α, je tudi AKR1B1 (12).
Pri raku endometrija so zaznali prisotnost prostaglandina E in F (PGE2 in PGF2α) (13).
PGF2α preko FP receptorja s protein-kinazno aktivnostjo stimulira transkripcijski faktor
NF-κB, ki nadalje stimulira izločanje citokinov in vnetnih mediatorjev. AKR1B1 stimulira
transkripcijski faktor NF-κB tudi posredno, saj katalizira sintezo konjugata aldehida 4-
hidroksinonenala (HNE), ki nastane s peroksidacijo lipidov, z glutationom (GS-HNE) v
njegovo reducirano obliko (GS-DHN). Med vnetnimi mediatorji je tudi ciklooksigenaza-2
(COX-2), ki sodeluje pri sintezi prostaglandinov iz arahidonske kisline (14). S
protivnetnimi zdravili (NSAID) inhibiramo ciklooksigenazo-2 in s tem zmanjšamo vnetje
(15). Encim AKR1B1 je tako vpleten v sintezo PGF2α in vnetni proces, njegove vloge pri
razvoju raka endometrija pa še niso proučevali (1).
1.3. RETINOJSKA KISLINA IN RAK ENDOMETRIJA Do razvoja rakavih celic lahko pride tudi zaradi pomanjkanje retinojske kisline (16).
Retinojska kislina ima zaščitno vlogo, saj preko receptorjev RAR (receptor retinojske
kisline) in RXR (retinoidni X receptor) pomaga pri diferenciaciji celic. AKR1B10
katalizira redukcijo all-trans retinala in 9-cis retinala v retinol. Reakcijo v obratno smer
katalizira encim alkohol dehidrogenaza (ADH). Retinal se z aldehid dehidrogenazo
(ALDH) oksidira v retinojsko kislino, ki preko receptorjev RAR in RXR stimulira
diferenciacijo celic. Retinojska kislina se nadalje z encimom CYP26A metabolizira v 4-
OH-retinojsko kislino. Prisotnost proteina AKR1B10 je povezana s pomanjkanjem
retinojske kisline, z zmanjšano zasedenostjo obeh receptorjev pa se zmanjša tudi
diferenciacija celic. Zaščitno vlogo retinojske kisline v tkivu endometrija kažejo študije,
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
13
pri katerih retinojska kislina in agonisti receptorja RAR inhibirajo rast endometrijske
celične linije Ishikawa, retinojska kislina pa tudi stimulira diferenciacijo slabo
diferencirane CAC-1 tumorske celične linije endometrija. Tudi inhibitorji CYP26A
delujejo antitumorsko, kar nadalje potrjuje zaščitno vlogo retinojske kisline. Encim
AKR1B10 je tako povezan z zmanjšanim zaščitnim delovanjem retinojske kisline, vendar
pa njegove vloge pri razvoju raka endometrija zaenkrat še niso proučevali (1).
1.4 ENCIMI IZ NADDRUŽINE ALDO-KETO REDUKTAZ
Aldo-keto reduktaze (AKR) uvrščamo v naddružino monomernih encimov, ki katalizirajo
redukcijo aldehidov in ketonov v različnih fizioloških substratih kot so lipidi, steroidi,
prostaglandini in retinoidi. Ob prisotnosti NAD(P)H katalizirajo redukcijo aldehidov in
ketonov v primarne in sekundarne alkohole. Razdelimo jih v petnajst družin, ki imajo med
seboj manj kot 40 % identičnih aminokislin. Družine pa nato razdelimo v poddružine,
predstavniki le-teh morajo imeti med seboj več kot 60 % identičnih aminokislin. Družine
označimo z arabsko številko za kratico (AKR1-15), poddružine pa s črko za to številko
(AKR1B, AKR1C…) (17, 18).
1.4.1 Poddružina AKR1B
Predstavniki te poddružine so aldoza-reduktaze in katalizirajo redukcijo aldehidov v
alkohole. Najbolj raziskana med njimi sta encima AKR1B1 in AKR1B10.
Encim AKR1B1 sodeluje pri redukciji glukoze med hiperglikemijo in je povezan s
poškodbami tkiv pri diabetesu. Zato za preprečevanje težav z diabetesom razvijajo več
inhibitorjev tega encima. Rekombinantni encim AKR1B1 deluje tudi kot prostaglandin-
sintaza, ki pretvarja PGH2 v PGF2α. V zadnjih letih se pogosto poroča o vpletenosti
AKR1B1 v vnetne procese. Z redukcijo GS-HNE v GS-DHN, AKR1B1 posredno stimulira
NF-κB, kar lahko vodi v aktivacijo citokinov in vnetnih mediatorjev, kot je COX-2. Prav
tako je encim AKR1B1 vpleten v razvoj raka jeter, dojk, jajčnikov in materničnega vratu.
Močno je izražen v normalnem endometriju, v miometriju maternice in materničnem vratu.
AKR1B1 ima visoko katalitično učinkovitost kot PGF2α sintaza in naj bi bil odgovoren za
povečano sintezo PGF2α v sekretorni fazi menstruacijskega ciklusa, ko je bila zaznana
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
14
najvišja koncentracija PGF2α. Povečana sinteza PGF2α in PGE2 ima pomemben vpliv na
menstruacijo. Prvi deluje kot vazokonstriktor in povzroča kontrakcije miometrija, drugi pa
kot vazodilatator. Zmanjšano razmerje PGF2α/PGE2 se opazi pri ženskah z močnimi
menstrualnimi krvavitvami, kar je lahko povezano z nižjo aktivnostjo AKR1B1 ali z
znižano aktivnostjo PGE2 sintaze. AKR1B1 tako katalizira reakcije, ki vodijo do povišanih
koncentracij vnetnih mediatorjev. Ti pa povzročajo proliferacijo celic, njihovo migracijo in
angiogenezo, kar vodi v hitrejšo rast in razvoj rakavih celic (1, 19).
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
15
Slika 1: Vloga encima AKR1B1 pri biosintezi prostaglandinov in aktivaciji NF-κB. AKR1B1 sodeluje pri redukciji GS-HNE v GS-DHN, ki aktivira fosfolipazo C (PLC) in protein kinazo C (PKC), s tem pa aktivira transkripcijski faktor NF-κB in tako stimulira izločanje vnetnih mediatorjev. AKR1B1 sodeluje tudi pri pretvorbi PGH v PGF2α, ki aktivira FP receptor, ta pa nadalje aktivira z mitogenom aktivirano protein kinazo (MAPK), ki stimulira delovanje transkripcijskega faktorja NF-κB (prirejeno po 1).
Encim AKR1B10 ima v primerjavi z AKR1B1 71 % identičnih aminokislin. AKR1B10 je
prisoten v tankem in debelem črevesu ter v rakavih celicah pljuč, jeter, dojk, debelega
črevesa, materničnega vratu in endometrija (1). Ker je njegova koncentracija povišana pri
različnih vrstah raka, naj bi se protein AKR1B10 uporabljal tudi kot tumorski označevalec,
najpogosteje pri raku jeter in pljuč (16). Predvsem pri kadilcih je lahko njegova povišana
koncentracija zgodnji znak za odkrivanje raka na pljučih. AKR1B10 so zaznali tudi v
serumu, kar kaže na možnost njegove uporabe za neinvazivno diagnostiko (20).
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
16
Encim AKR1B10 katalizira redukcijo izoprenil aldehidov in s tem preko prenilacije GTP-
az vpliva na proliferacijo in apoptozo celic Prav tako encim AKR1B10 zelo učinkovito
katalizira redukcijo retinala v retinol. Tako preprečuje nastanek retinojske kisline, ki preko
receptorjev RAR in RXR uravnava celično proliferacijo in deferenciacijo. Ob pomanjkanju
retinojske kisline, primanjkuje ligandov, ki bi se vezali na oba receptorja, zato je
diferenciacija celic ustavljena (1).
Slika 2: Vloga encima AKR1B10 pri biosintezi retinojske kisline. AKR1B10 katalizira redukcijo all-trans retinala in 9-cis retinala v retinol. Reakcijo v obratno smer katalizira encim alkohol dehidrogenaza (ADH). Retinal se z aldehid dehidrogenazo (ALDH) oksidira v retinojsko kislino, ki preko receptorjev RAR in RXR stimulira diferenciacijo celic. Retinojska kislina se nadalje s CYP26A metabolizira v 4-OH-retinojsko kislino. Visoka koncentracija encima AKR1B10 je povezana s pomanjkanjem retinojske kisline, z zmanjšano zasedenostjo obeh receptorjev pa se zmanjša tudi diferenciacija celic (prirejeno po 1).
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
17
2. NAMEN DELA Namen diplomske naloge je ugotoviti prisotnost proteinov AKR1B1 in AKR1B10 v
rakavem tkivu endometrija. Primerjali bomo njuno prisotnost v rakavem in kontrolnem
tkivu bolnic z rakom endometrija z metodo prenosa western in imunohistokemijskim
barvanjem. Rak endometrija je povezan s povečano celično proliferacijo zaradi povišane
koncentracije estrogenov in z zmanjšano celično diferenciacijo zaradi znižane
koncentracije progesterona ter retinojske kisline. Povezujemo ga tudi z vnetnim odzivom
in s povišano koncentracijo prostaglandinov. Encima AKR1B1 in AKR1B10 sodelujeta pri
sintezi prostaglandinov ter retinojske kisline in sta potencialno vpletena v razvoj raka
endometrija.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
18
3. MATERIALI IN METODE
3.1.POLIAKRILAMIDNA GELSKA ELEKTROFOREZA
3.1.1 Reagenti
§ 10 % ločilni gel
• 8,1 ml destilirane H2O
• 5,0 ml 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8
• 6,7 ml 30 % akrilamid/bis akrilamid
• 200 µl 10 % SDS vzorčni pufer
• 10 µl TEMED
• 200 µl amonijev persulfat (APS)
§ koncentrirni gel
• 6,1 ml destilirane H2O
• 2,5 ml 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8
• 1,3 ml 30 % akrilamid/bis akrilamid
• 100 µl 10 % NaDS
• 10 µl TEMED
• 100 µl amonijev persulfat (APS)
Poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti NaDS vzorčnega pufra je analitska
metoda za ločevanje proteinov na osnovi njihove molekulske mase. Natrijev dodecilsulfat
(NaDS) je anionska površinsko aktivna molekula, ki se veže na proteine in jih denaturira.
V prisotnosti NaDS dobijo proteini negativen naboj. Naboj je odvisen od njihove
molekulske mase, saj se veže povprečno ena molekula NaDS na dva aminokislinska
ostanka. Razmerje naboj/masa pa je tako enako pri vseh proteinih. S polimerizacijo
akrilamida in bisakrilamida nastane zamrežen gel, v katerem nato poteka ločitev proteinov.
Njihova hitrost potovanja je obratno sorazmerna z njihovo velikostjo.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
19
3.1.2 Postopek
Za elektroforezo smo uporabili Mini-Protean II elektrofotezno aparaturo proizvajalca Bio-
Rad. Aparaturo smo sestavili po navodilih proizvajalca.
Najprej smo pripravili 10 % ločilni gel in ga vlili med stekelca. Preko njega smo nalili 20
% etanol, ki prepreči izsušitev gela med njegovim strjevanjem, ki je trajalo približno 35
min. S filter papirjem smo odstranili etanol in na strjeni ločilni gel nalili 4 % koncentrirni
gel, ki smo ga pripravili medtem. Vstavili smo glavniček in spet počakali približno 35 min,
da se je gel strdil. Odstranili smo glavniček, nosilec z gelom prenesli v kadičko in prelili z
elektroforeznim pufrom.
Vzorce smo pripravili tako, da smo volumnom vzorcev, ki so vsebovali 30 µg proteinov,
dodali vodo do 10 µl in 6 µl SDS vzorčnega pufra. Nato smo jih centrifugirali in inkubirali
pri sobni temperaturi 10 min. Vzorec Ishikawe smo segrevali v termobloku pri 95°C 15
min, da so se proteini denaturirali. Vse vzorce in proteinske standarde (BioRad in
ABCAM) smo nanesli na gel. Elektroforeza je potekala približno 40 minut pri napetosti
200 V.
Slika 3: Aparatura za elektroforezo (Mini-Protean II Bio-Rad) (21)
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
20
3.2 PRENOS WESTERN
S to metodo smo prenesli proteine z gela na PVDF membrano. Najprej smo pripravili pufer
za prenos in ga ohladili. Koncentrirni gel smo odstranili, ločilnega pa dali v pufer za
prenos. Nato smo izrezali membrano. Membrano smo aktivirali tako, da smo jo 15 sekund
namakali v MeOH, 2 minuti v bidestilirani vodi in na koncu vsaj 5 minut v pufru za
prenos. V ta pufer smo namočili tudi krpice, ki so priložene aparaturi. Pripravili smo »gel
sendvič«. S črne proti beli strani smo položili krpico, kartonček, gel, aktivirano membrano
in krpico. Kaseto smo položili v Mini Trans-Blot aparaturo, ki smo jo imeli v kadički in jo
hladili z ledom. Preko kasete smo nalili ohlajen pufer za prenos. Prenos je potekal 1 h pri
108 V.
3.2.1 Reagenti
- pufer za prenos (3,03 g Tris, 14,4 g glicin, 200 ml metanol (20 %), do 1 l mili Q)
- 100 % MeOH
- bidestilirana voda
- 10 x TBS (24,2 g Tris, 292,2 g NaCl, do 1 l destilirana voda)
- 0,1 % TTBS (100 ml 10 x TBS, 1 ml Tween 20, do 1 l destilirana voda)
- 5 % mleko
- PVDF membrana (Millipore Corporation, Billerica, MA,USA)
- primarna protitelesa: kunčja poliklonska primarna protitelesa: proti AKR1B1
(ab62795, 1:5000) in proti AKR1B10 (ab96417, 1:5000)
- sekundarna protitelesa: kozja proti kunčja IgG+IgM (1:10 000) konjugirana s
hrenovo peroksidazo (HRP)
3.2.2 Postopek
Membrano smo med rahlim stresanjem blokirali 1 h v 5 % mleku. Nato smo jo 4 krat
spirali po 5 minut z 0,1 % pufrom TTBS. Čez noč smo membrano pri 4°C inkubirali s
primarnimi protitelesi.
Naslednji dan smo membrano spirali 4-krat po 5 minut z 0,1 % pufrom TTBS in jo 2 uri
inkubirali s sekundarnimi protitelesi. Nato pa smo jo spet 4-krat sprali po 5 minut z 0,1 %
pufrom TTBS.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
21
Slika 4: Prenos proteinov z gela na membrano (prenos western) (22)
3.3 DETEKCIJA Z OJAČANO KEMILUMINISCENCO (ECL)
Reagent: The RapidStepTM ECL Reagent (Calbiochem, Millipore Corporation, USA)
Membrano smo postavili v petrijevko, jo enakomerno orosili z reagentom in počakali 1
minuto. Reagent je vseboval vodikov peroksid in luminol. Reakcija oksidacije luminola
poteče v prisotnosti vodikovega peroksida in hrenove peroksidaze (HRP), ki je bila vezana
na sekundarnih protitelesih. Luminol je po oksidaciji razpadel in oddal svetlobo, ki smo jo
na filmu zaznali kot temno liso. S kemiluminiscenco poimenujemo kemijsko reakcijo, pri
kateri se energija sprosti v obliki svetlobe.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
22
Slika 5: Reakcija detekcije z ojačano kemiluminiscenco. Po oksidaciji luminola, v prisotnosti vodikovega peroksida in hrenove peroksidaze, nastane svetloba (23).
3.4 BARVANJE MEMBRANE
Membrano smo za 5 minut potopili v raztopino Ponceau (12,5 ml 100 % ocetne kisline,
225 ml dd H2O, 12,5 mg ponceau S) in stresali. Nato smo jo sprali z destilirano vodo in jo
skenirali (kvantifikacija). Na koncu smo jo še 2-krat po 5 min sprali z 0,1 % pufrom TTBS.
3.5 BARVANJE GELA
Gel smo za 5 minut položili v barvilo Comassie Brilliant Blue (0,1 % Coomassie Blue R-
250, 40 % metanol, 10 % ocetna kislina) in ga spirali v 7 % ocetni kislini. Nato smo ga
posneli.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
23
3.6 IMUNOHISTOKEMIJA
3.6.1 Reagenti
- ksilen
- 100 % etanol
- 96 % etanol
- 80 % etanol
- 70 % etanol
- bidestilirana voda
- T-PBS (8,2 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g NaH2PO4, 0,2 g KH2PO4, do 1 l bidestilirana
voda)
- 30 % vodikov peroksid
- 0,01 M Na-citrat, pH=6
- kozji serum 1:20
- primarna protitelesa: kunčja proti AKR1B1 1:100 in proti AKR1B10 1:200
- sekundarna protitelesa: kozja proti kunčja 1:100
- PAP (kompleks peroksidaza proti peroksidaza): kunčja PAP protitelesa 1:500
- mišja protitelesa proti ciklofilinu A (Abcam, ab58144, 1:1000),
- 0,05 TRIS/HCl , pH=7,4
- FastTM 3,3'-diaminobenzidin (DAB; Sigma-Aldrich).
- hematoksilin
- Pertex®
Vzorce parafinskih tkiv rakavega endometrija smo dobili na Ginekološki kliniki
Univerzitetnega kliničnega centra v Ljubljani.
3.6.2 Postopek
Vzorce in kontrole smo postavili v stojalo. V digestoriju smo stojalo 2-krat po 5 minut
potopili v kadički s ksilenom, da smo odstranili parafin. Potem smo vzorce po 5 minut
potapljali v padajoče koncentracije alkoholov (100 % etanol, 96 % etanol, 80 % etanol, 70
% etanol), potem še v bidestilirano vodo, na koncu pa še za 5 minut v pufer T-PBS. Vzorce
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
24
smo nato za 40 minut potopili v raztopino 0,9 % H2O2 v T-PBS. Za tem smo jih 5 minut
spirali s T-PBS. V kadičko smo nalili 0,01M Na-citrat s pH 6,00 in jo ovili s plastično
folijo, na vrhu pa naredili odprtino, skozi katero smo potem med segrevanjem dolivali Na-
citrat in skozi katero je izhajala para. Kadičko smo postavili v mikrovalovno pečico in
segrevali pri konstantnem vrenju. Sledilo je 30 minutno ohlajanje pri sobni temperaturi in 5
minutno spiranje s T-PBS.
Vsako stekelce z vzorcem smo obrisali s papirnato brisačo in jih položili v vodoraven
položaj v vlažno komoro. Na vsako stekelce smo nanesli 100 µl kozjega seruma in jih
prekrili s parafilmom, škatlo pa pokrili s pokrovom, da se vzorci ne bi posušili. Vzorce
smo inkubirali 1 uro pri sobni T. Nato smo odstranili parafilm, jih 5 minut spirali s pufrom
T-PBS in obrisali s papirnato brisačo. Sledilo je nanašanje 100 µl primarnih protiteles na
vzorce, na kontrole pa 100 µl kozjega seruma. Vzorce smo inkubirali preko noči v hladni
sobi. Naslednji dan smo vzorce 2-krat po 5 minut spirali s T-PBS, obrisali stekelca, nanesli
100 µl sekundarnih protiteles, jih pokrili s parafilmom in inkubirali eno uro pri sobni
temperaturi. Nato smo vzorce spirali 2-krat po 5 minut s T-PBS, obrisali stekelca in s
pipeto na vsak vzorec nanesli 100 µl raztopine PAP protiteles. Inkubirali smo 30 minut,
nato smo 2-krat po 5 minut spirali s T-PBS.
Sledilo je barvanje vzorcev z barvilom DAB (20 µl/1 ml substrata), ki se v prisotnosti
H2O2 in peroksidaze obarva rjavo. Počakali smo, da se je vzorec obarval, oziroma največ
15 minut in jih potem takoj položili v bidestilirano vodo, da smo prekinili reakcijo. Nato
smo jih spirali 5 minut v bidestilirani vodi, 45 sekund v hematoksilinu, 30 sekund v
navadni vodi in še 1 minuto v navadni vodi. Sledila je dehidracija. Vzorce smo potapljali v
kadičke za 5 minut v nasprotnem vrstnem redu kot pri rehidraciji. Najprej v bidestilirani
vodi, nato pa v 70 % etanolu, 80 % etanolu, 95 % etanolu, 100 % etanolu in 2-krat v
ksilenu. Vzorce smo nato posušili, na vsakega nanesli kapljico Pertex® in pokrili s
krovnim stekelcom.
Vzorce smo opazovali pod svetlobnim mikroskopom pri 100x in 400x povečavi, s pomočjo
programa Axiovision Rel 4.8, in glede na obarvanost sklepali na vsebnost AKR1B1 in
AKR1B10.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
25
4. REZULTATI IN RAZPRAVA
4.1 DETEKCIJA PROTEINOV
Na gele, ki smo jih predhodno pripravili sami, smo nanesli 30 parov vzorcev proteinov,
izoliranih iz normalnega in tumorskega endometrija (volumen, ki ustreza 30 µg proteinov).
Na vsak gel pa smo nanesli tudi vzorce proteinov, izoliranih iz placente in celične linije
Ishikawa, ki so nam služili kot kontrola ter proteinski standard, ki je vseboval proteine
znanih molekulskih mas (Abcam+Biorad).
Sledila je gelska elektroforeza in prenos na membrano. Po prenosu smo gele obarvali v
barvilu Coomassie brilliant blue, razbarvali v ocetni kislini in jih posneli. Po barvanju
gelov smo opazili, da je veliko proteinov ostalo na gelu, kar pomeni, da se niso vsi prenesli
na membrano. Pobarvali smo tudi membrane in ugotovili, da je na membranah zadostna
količina proteinov za nadaljnjo detekcijo.
Membrane smo inkubirali s primarnimi in sekundarnimi protitelesi. Detekcija AKR1B1 in
AKR1B10 na membranah je potekala z ojačano kemiluminiscenco. Detektirali smo tudi
primerjalni protein ciklofilin A, ki nam je služil za normalizacijo dobljenih rezultatov.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
26
a)
b)
c)
d)
e)
Slika 6: Detekcija proteinov AKR1B1 in AKR1B10 v proteinskih vzorcih raka endometrija in kontrolnega tkiva. (a) gel po prenosu, (b) membrana po prenosu, (c) detekcija proteina ciklofilina, (d) detekcija AKR1B1, (e) detekcija AKR1B10.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
27
Detekcijo smo opravili z napravo Fujifilm LAS4000 (Fujifilm, Japan).
Lisi proteinov AKR1B1 oz. AKR1B10 v placenti sta bili na vseh membranah najmočnejši,
sledili pa sta lisi teh proteinov v celični liniji Ishikawa. Lise na membrani smo ovrednotili s
programom Multi Gauge (Fujifilm software). Program poda rezultate kot volumen lise, ki
odraža koncentracijo merjenega proteina. Nekaj težav smo imeli s tremi membranami
(161, 162 in 163), na katerih smo najprej zaznali zelo šibke signale. Po ponovnem
inkubiranju s primarnimi in sekundarnimi protitelesi smo dobili zadovoljive rezultate.
Dobljene rezultate smo najprej obdelali v programu Microsoft Excel (Microsoft Office).
Količino merjenega proteina smo delili z interno kontrolo (IK=(Ish+P)/2).
IK= interna kontrola
Ish= volumen lise proteina AKR1B1 oz. proteina AKR1B10 v celični liniji Ishikawa
P= volumen lise proteina AKR1B1 oz. proteina AKR1B10 v placenti
Te rezultate pa smo delili z vrednostjo ciklofilina, ki je primerjalni protein in tako
normalizirali koncentracijo proteina. Nato smo koncentracijo proteina v tumorskih celicah
delili s koncentracijo proteina v kontrolnih celicah in tako dobili njuno razmerje. Te
rezultate smo obdelali v statističnem programu GraphPad Prism Software version 5.00 for
Windows.
Statistično značilno razliko med tumorskim in kontrolnim tkivom smo ocenili z Wilcoxon-
ovim neparametričnim testom za pare s stopnjo zaupanja 95 % (p = 0,05). Uporabili smo
vrednosti razmerja AKR1B1/PPIA in AKR1B10/PPIA. Stopnja zaupanja za protein
AKR1B1 je bila 0,0378, za protein AKR1B10 pa 0,0023. Razlika v količini proteinov je v
obeh primerih statistično značilna, saj je p ˂ 0,05.
Količina proteina AKR1B1 je bila v tumorskem tkivu višja kot v kontrolnem tkivu v
devetih vzorcih od tridesetih, količina proteina AKR1B10 pa le v sedmih vzorcih od
tridesetih. Naši rezultati torej kažejo, da je količina obeh proteinov v večini vzorcev
tumorskega tkiva nižja kot v vzorcih kontrolnega tkiva.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
28
AKR1B1/PPIA
K T
10- 3
10- 2
10- 1
100
101 p=0,0378 p
rote
ini
Graf 1: Prikaz količine proteinov AKR1B1 v kontrolnem in tumorskem tkivu
AKR1B1
11 14 18 20 23 25 26 27 33 44 47 49 5 50 52 53 54 55 56 57 59 61 62 63 65 66 68 7 70 7110- 2
10- 1
100
101
102
pari vzorcev
razm
erje
pro
tein
ov v
tum
orsk
em /
kont
roln
em tk
ivu
Graf 2: Prikaz razmerja proteinov AKR1B1 v tumorskem in kontrolnem tkivu
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
29
AKR1B10/PPIA
K T10- 2
10- 1
100
101 p=0,0023 p
rote
ini
Graf 3: Prikaz količine proteinov AKR1B10 v kontrolnem in tumorskem tkivu
AKR1B10
11 14 18 20 23 25 26 27 33 44 47 49 5 50 52 53 54 55 56 57 59 61 62 63 65 66 68 7 70 71
10- 2
10- 1
100
101
pari vzorcev
razm
erje
pro
tein
ov v
tum
orsk
em /
norm
alne
m tk
ivu
Graf 4: Prikaz razmerja proteinov AKR1B10 v tumorskem in kontrolnem tkivu
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
30
4.2 IMUNOHISTOKEMIJSKO BARVANJE PROTEINOV
Z imunohistokemijskim barvanjem 24 parafinskih rezin raka endometrija smo ugotavljali
prisotnost proteinov AKR1B1 in AKR1B10 še na celični ravni.
Na parafinske rezine tumorskih vzorcev smo nanašali kozji serum, primarna kunčja
protitelesa za določanje AKR1B1 in AKR1B10 ter sekundarna kozja proti kunčja
protitelesa, na kontrolne vzorce pa le kozji serum. Če bi se kontrola obarvala, bi bil to znak
nespecifičnosti, vendar do tega ni prišlo. Za barvilo smo uporabili 3,3'-diaminobenzidin
(DAB). Pod mikroskopom (Carl-Zeiss, Jena) smo si pri 100x in 400x povečavi ogledali
tudi vzorce, barvane s hematoksilinom in eozinom, pri katerih smo opazovali histologijo
rakavega tkiva.
Ocenili smo intenziteto obarvanja in naša opažanja predstavili v razpredelnici. Oba
proteina sta prisotna predvsem v citoplazmi epitelijskih celic raka endometrija.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
31
Preglednica l: Rezultati imunohistokemijskega barvanja vzorcev raka endometrija
Obarvanost žlez smo ocenili s številom plusov ( -, ni obarvanja; +, slabo obarvanje; ++,
zmerno obarvanje; +++, močno obarvanje)
Vzorec AKR1B1 AKR1B10
T7 ++ +++
T8 +++ +++
T10 ++ +++
T13 ++ +++
T18 +++ +++
T19 +++ +
T20 +++ ++
T21 ++ +++
T22 ++ +++
T23 +++ +++
T24 + -
T25 + +
T26 + +
T27 - -
T30 +++ +++
T31 + ++
T32 +++ +++
T33 +++ +++
T34 ++ ++
T35 ++ ++
T38 +++ ++
T40 + +++
T42 ++ +++
T44 +++ +++
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
32
Slika 7: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 7, 8, 10 in 13. Pri vseh štirih vzorcih smo zaznali prisotnost proteinov AKR1B1 in AKR1B10.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
33
Slika 8: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 18, 19, 20 in 21. Le v vzorcu 19 smo zaznali nekoliko slabšo prisotnost proteina AKR1B10.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
34
Slika 9: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 22, 23, 24 in 25. V vzorcih 24 in 25 smo zaznali nekoliko slabšo prisotnost obeh proteinov.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
35
Slika 10: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 26, 27, 30 in 31. Vzorec 26 se je obarval nekoliko slabše, v vzorcu 27 pa obeh proteinov nismo zaznali.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
36
Slika 11: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 32, 33, 34 in 35. Proteina AKR1B1 in AKR1B10 smo zaznali v vseh vzorcih.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
37
Slika 12: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 38, 40, 42 in 44. Le v vzorcu 40 smo zaznali nekoliko nižjo koncentracijo proteina AKR1B1.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
38
5. SKLEP Namen te diplomske naloge je bil ugotoviti prisotnost proteinov AKR1B1 in AKR1B10 v
rakavem tkivu endometrija in v kontrolnem tkivu.
Z analizo western smo v 30 parih vzorcev proteinov izoliranih iz rakavega in kontrolnega
tkiva določali koncentracijo AKR1B1 in AKR1B10. Pri statistični obdelavi smo uporabili
Wilcoxonov test in ugotovili statistično značilno znižano koncentracijo AKR1B1 in
AKR1B10 v rakavem tkivu v primerjavi z njuno koncentracijo v kontrolnem tkivu . V
obeh primerih smo dobili p ˂ 0,05. Tako smo ugotovili, da je v primerjavi z rakavim
tkivom v našem primeru koncentracija obeh proteinov višja v okolnem, kontrolnem tkivu,
v katerem se je proces kancerogeneze verjetno že začel. Predvidevamo, da bi oba proteina
lahko uporabili kot tumorska označevalca v začetni fazi razvoja raka endometrija. Naše
kontrolno tkivo je predstavljal okolni endometrij bolnic z rakom, zato bi bilo v prihodnje
zanimivo primerjati prisotnost obeh proteinov v rakavem tkivu in v tkivu oseb z benigno
boleznijo endometrija.
Prisotnost proteinov AKR1B1 in AKR1B10 smo preverili tudi na celični ravni z
imunohistokemijskim barvanjem 24 parafinskih rezin tumorskega tkiva endometrija.
Ugotovili smo, da sta proteina prisotna pretežno v citoplazmi epitelijskih celic. V prihodnje
bi bilo smiselno prisotnost proteinov AKR1B1 in AKR1B10 preveriti tudi v parafinskih
rezinah kontrolnega endometrija bolnic z rakom in parafinskih rezinah endometrija oseb z
benigno boleznijo endometrija.
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
39
6. LITERATURA 1. Lanišnik Rižner T: Enzymes of the AKR1B and AKR1C subfamilies and uterine
diseases. Front. Pharmacology 2012; 3(34): 1-13
2. Ryan A J, Susil B, Jobling T W, Oehler M K: Endometrial cancer. Cell Tissue Res.
2005; 322: 53-61.
3. Shiozawa T, Konishi I: Early endometrial carcinoma: clinicopathology, hormonal
aspects, molecular genetics, diagnosis, and treatment. Int. J. Clin. Oncol. 2006; 11:
13-21.
4. Sherman M E: Theories of endometrial carcinogenesis: a multidisciplinary
approach. Modern Pathology 2000; 13(3): 295-308.
5. Lanišnik Rižner T, Šinkovec J: Vloga hidroksisteroid-dehidrogenaz pri
uravnavanju aktivnosti estrogenov in progestagenov: primer raka endometrija in
endometrioze. Medicinski razgledi 2004; 43: 419-428.
6. Liu F S: Molecular carcinogenesis of endometrial cancer. Taiwanese Journal of
Obstetrics and Gynecology 2007; 46(1): 26-32.
7. Akhmedkhanov A, Zeleniuch-Jacquotte A, Toniolo P: Role of exogenous and
endogenous hormones in endometrial cancer. Review of the evidence and research
perspectives. Ann N Y Acad. Sci. 2001; 943: 296-315.
8. Henderson B E, Feigelson H S: Hormonal cancerogenesis. Carcinogenesis 2000;
21: 427-433.
9. Karageorgi S, Hankinson S E, Kraft P, De Vivo I: Reproductive factors and
postmenopausal hormone use in relation to endometrial cancer risk in the Nurses'
Health Study cohort 1976-2004. Int. Journal of Cancer 2010; 126:208-216.
10. Štabuc B, Primic-Žakelj M, Klemenčič M, Piškur J: Rak rodil. SEMINAR In
memoriam dr. Dušana Reje. Zveza slovenskih društev za boj proti raku 2008; 26-
33.
11. Genç S, Attar E, Gürdöl F, Kendigelen S, Bilir A, Serdaroglu A: The effect of
COX-2 inhibitor, nimesulide, on angiogenetic factors in primary endometrial
carcinoma cell culture. Cin. Exp. Med. 2007; 7: 6-10
12. Catalano R D, Wilson M R, Boddy S C, Jabbour H N: Comprehensive expression
analysis of prostanoid enzymes and receptors in the human endometrium across the
menstrual cycle. Molecular Human Reproduction 2011; 17(3): 182-192
Aleš Šket DIPLOMSKA NALOGA
40
13. Wallace A E, Sales K J, Catalano R D, Anderson R A, Williams A R W, Wilson M
R, Schwarze J, Wang H, Rossi A G, Jabbour H N: Prostaglandin F2α-F-prostanoid
receptor signaling promotes neutrophil chemotaxis via chemokine (C-X-C Motif)
ligand 1 in endometrial adenocarcinma. Cancer Res. 2009; 69(14): 5726-5733
14. Wallace A E, Gibson D A, Saunders P T K, Jabbour H N: Inflammatory events in
endometrial adenocarcinoma. Journal of Endocrinology 2010; 206: 141-157
15. Brasky T M, Moysich K B, Cohn D E, White E: Non-steroidal anti-inflammatory
drugs and endometrial cancer risk in the VITamins And Lifestyle (VITAL) cohort.
Gynecologic Oncology 2013; 128: 113-119
16. Ruiz F X, Porte S, Pares X, Farres J: Biological role of aldo-keto reductases in
retinoic acid biosynthesis and signaling. Frontiers in Pharmacology 2012; 58(3): 1-
13
17. Ruiz X F, Moro A, Gallego O, Ardevol A, Rovira C, Petrash M J, Pares X, Farres
J: Human and rodent aldo-keto reductases from AKR1B subfamily and their
specifity with retinalaldehyde. Chemico-Biological Interactions 2011; 191: 199-
205.
18. Mindnich R D, Penning T M: Aldo-ketoreductase (AKR) superfamily: Genomics
and annotation. Hum. Genomics 2009; 3(4): 362-370.
19. Bresson E, Boucher-Kovalik S, Chapdelaine P, Madore E, Harvey N, Laberge P Y,
Leboeuf M, Fortier M A: The human reductase AKR1B1 qualifies as the primary
prostaglandin F synthase in the endometrium. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2011;
96(1): 210-219.
20. Luo D, Huang M C, Ma J, Gao Z, Liao D, Cao D: Aldo-keto reductase family 1,
member B10 is secreted through a lysosome-mediated non-classical pathway.
Biochem. J. 2011; 438; 71-80
21. http://www.bio-rad.com/evportal/en/US/LSR/Solutions/LUSPQXC4S/Protein-
Blotting-Equipment-(Cells-and-Power-Supplies)
22. http://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot
23. http://www.emdmillipore.com/life-science-research/rapidstep-ecl-
reagent/EMD_BIO-345818/p_4m.b.s1L788AAAEWdWEfVhTm