Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatazelllinien

Doreen Kunze

21.07.05

Institut für Biochemie

Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften

Technische Universität Dresden

Klinik und Poliklinik für Urologie

Universitätsklinikum Carl Gustav Carus

Technische Universität Dresden

Einleitung

• häufigste Krebserkrankung bei Männern

• zweithäufigste Krebs-Todesursache

• Lebenszeitrisiko:– zu erkranken: 9,6 %– zu sterben: 3,2 %

• Häufigkeitsgipfel zwischen 70. – 75. Lebensjahr

• genetisch und tumorbiologisch sehr heterogen

2

Prostatakarzinom (PCa)

Einleitung 3

Tumorentwicklung

• Überexpression von Onkogenen und/oder funktionelle Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen (TSG)

• PCa:– Onkogene: Progression– TSG: Entstehung

→ häufig Allelverluste (LOH – loss of heterozygosity) auf den

Chromosomen- abschnitten 8p und 13q

Einleitung

P38IP (C13orf19, FAM48A)

• lokalisiert auf 13q13 zwischen zwei TSG

• LOH-Ereignisse

• mRNA-Expression in primären PCa reduziert

Chromosom 13

13RB1

C 13BRCA2

• Hypothese: Tumorsuppressorfunktion in Prostatagewebe

→ verbesserte Proliferation der PCa-Zellen nach Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression ?

4

Einleitung

siRNA (small interfering RNA)

5

Zellkern

Target-mRNA

Target-Gen

polyA

polyA

polyA

Sequenzspezifisches Gensilencing

Target-mRNA- Spaltung

Aktivierter RISC

ATP

ADP + Pi

zelluläre Kinase

RISC

Bildung von RISC

siRNA-Entwindung

Anlagerung von RISCan Target-mRNA

siRNA

modifiziert nach D. Bauer

• Bestandteil der RNA-

Interferenz

• posttranskriptionelle

Geninhibierung

• 2 nt-3`-Überhänge

• antisense-Strang aktiviert

RISC (RNA induced

silencing complex)

• Hydrolyse

komplementärer mRNA

1. Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene ?

2. Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK ?

3. Androgenabhängigkeit der P38IP-mRNA-Expression ?

6Ziele

1.1 P38IP-mRNA-Inhibition

h nach TF-Start

siRNA-D1 (2245-2265 nt)

siRNA-D2 (2215-2235 nt)

siRNA-D3 (1024-1044 nt)

siRNA-D4 (440-460 nt)

siRNA-D5 (1288-1308 nt)

12 42 % 49 % 22 % 55 % 12 %

24 50 % 58 % 40 % 56 % 16 %

48 45 % 45 % 32 % 67 % 23 %

72 56 % 50 % 36 % 93 % 31 %

Aussaat(PC-3, BPH-1)

siRNA-Transfektion(125 + 250 nM, 4 h)

24 – 72 h WST-1-Test 

ZellzählungRNA-Isolierung + qPCR

ApoptosemessungZellzyklustest

Zellkoloniebildungstest

20 – 68 h

Zeitabhängige Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression in PC-3-Zellen:

effektive, langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression

P38IP-mRNA-Expression/PBGD, normiert auf ns-siRNA; Klammerausdruck: Position des sense-Stranges der siRNA auf der P38IP-mRNA (3077 nt)

7

1.1 P38IP-mRNA-Inhibition

Zellkoloniebildungstest

WST-1-Test

→ keine Kurzzeit-

proliferations-

veränderungen

0

20

40

60

ns-s

iRN

A

siR

NA-D

5

unbe

hand

elt

Kolo

niez

ahl

100 Zellen/w ell

150 Zellen/w ell

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6ns

-siR

NA

siR

NA

-D5

ns-s

iRN

A

siR

NA

-D5

unbe

hand

elt

OD

450

nm

125 nM 250 nM

8

→ keine Langzeit-

proliferations-

effekte

1.1 P38IP-mRNA-Inhibition

0%

20%

40%

60%

80%

100%

ns-s

iRN

A

siR

NA-

D5

unbe

hand

elt

ns-s

iRN

A

siR

NA-

D5

unbe

hand

elt

ns-s

iRN

A

siR

NA-

D5

unbe

hand

elt

G2-M

S-Phase

G0-G1

24 h 48 h 72 h

Zellzyklusverteilung

→ keine

Zellzyklus-

veränderungen

9

unbehandeltsiRNA-D5

5,5 %

ns-siRNA

4,9 % 4,3 %

Apoptosemessung (FACS) - 48 h

→ keine

Veränderung

der Apoptoserate

1.2 Kombinationsbehandlung mit siRNA und CT

CT (Etoposid, Docetaxel; 24 h)

Aussaat(PC-3)

siRNA-Transfektion(250 nM, 4 h)

24 – 72 h 20 h WST-1-Test 

ZellzählungApoptosemessung

Zellzyklustest

24 – 72 h

0%

4%

8%

12%

16%

20%

ns-s

iRN

A

siR

NA-

D5

Eto

posi

d

ns-s

iRN

A +

Eto

posi

d

siR

NA-

D5

+E

topo

sid

unbe

hand

elt

Apop

tose

rate

Zellzahlreduktion

infolge CT-Behandlung

keine Kombinations-

effekte

keine Apoptoseinduktion

10

0

3

6

9

12

15

1 2 3 4 5 6

Zellz

ahl (

x10

5 )

1.2 Kombinationsbehandlung mit siRNA und CT

0%

20%

40%

60%

80%

100%

ns-s

iRN

A

siR

NA

-D5

Eto

posi

d

ns-s

iRN

A +

Eto

posi

d

siR

NA

-D5

+E

topo

sid

unbe

hand

elt

G0-G1 S-Phase G2-M

125fache VergrößerungA: PC-3 siRNA-D5B: PC-3 siRNA-D5 + Etoposid

Vergrößerung der

Zellen infolge des

G2/M-Arrestes

Zellzyklusverteilung

11

CT-vermittelter

Zellzyklusarrest

effektive und langanhaltende Geninhibition durch siRNA

P38IP hat keinen Einfluss auf das Wachstum der untersuchten Prostatazelllinien

verminderte Expression nicht ursächlich mit PCa-Entstehung verbunden

möglicherweise mit Progression der Karzinome assoziiert oder Begleiterscheinung der zunehmenden genetischen Instabilität auf dem Chromosom 13q

12

Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene

Zusammenfassung 1.Teil

2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK

P38IP = p38MAPK interacting protein

• MAPK = mitogenaktivierte Proteinkinase• intrazelluläre Signalübertragung

(Proteinkinasen-Kaskaden)• stressaktiviert• 4 Isoformen (α, β, γ, δ)

• SB203580 inhibiert p38α und p38β durch Bindung an ATP-Bindestelle

Quelle: www.cellsignalingtechnology.com

13

2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK

Inhibition der p38MAPK durch SB203580

P38IP-mRNA-Expression

Inhibition der P38IP- mRNA-Expression mit siRNA-D5

Expression und Phosphorylierungsstatus der p38MAPK

14

2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK

Expression & Phosphorylierungsstatus der p38MAPK unverändert

1. Inhibition von P38IP mit siRNA-D5

15

phospho-p38MAPK

β-Actin

β-Actin

p38MAPK (gesamt)

siRNA-D

5

unbe

hand

elt

unbe

hand

elt

unbe

hand

elt

ns-si

RNA

siRNA-D

5

ns-si

RNA

siRNA-D

5

Mark

er

PC-3

Erntezeitpunkt nach Transfektion: 72 h 96 h 72 h

2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Ergebnisse)

kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK

2. Inhibition der p38MAPK mit SB203580

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

DMSO

0,5

µM S

B203

580

2 µM

SB2

0358

0

8 µM

SB2

0358

0

unbe

hand

elt

DMSO

0,5

µM S

B203

580

2 µM

SB2

0358

0

8 µM

SB2

0358

0

unbe

hand

elt

P38I

P-m

RNA-

Expr

essi

on/T

BP n

orm

iert

auf

DM

SO-

beha

ndel

te Z

elle

nBPH-1 PC-3

16

3. Androgenabhängigkeit

P38IP-mRNA-Expression ist nicht androgenabhängig

Aussaat (LNCaP)

Hormonfreies Medium

24 h 3 – 48 hAndrogen R1881(+ Bicalutamid)

24 h RNA-Isolierung + qPCR

17

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

0 10 20 30 40 50Zeit (in h)

P38I

P-m

RNA-

Expr

essi

on re

lativ

zu

TBP

1 nM R1881 1 nM R1881 + 10 µM Bicalutamid10 nM R1881 10 nM R1881 + 10 µM Bicalutamid

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40 50Zeit (in h)

PSA

-mR

NA-

Expr

essi

onre

lativ

zu

TBP

Zusammenfassung 18

1. P38IP besitzt keine Tumorsuppressor-funktion in den untersuchten Zelllinien

2. Kein Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK → Genbezeichnung: C13orf19 oder FAM48A

3. P38IP-mRNA-Expression ist androgen-unabhängig

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !

Etoposid:

Glykosidderivat des Podophyllotoxins(amerikan. Maiapfel)

Docetaxel:

Taxoid

(europ. Eibe – Taxus baccata)

Chemotherapeutika

O

OH

R1881 (Methyltrienolon) BicalutamidCN

CF3

HN C

O

C

CH3

OH

CH2

SO2

F

O

OH

Dihydrotestosteron

Androgenabhängigkeit

LOH-PCR

Epitheliale Expression

In situ Hybridisierung von Prostatagewebe mit P38IP-mRNA(Schmidt et al. 2001)

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 100 200 300 400 500 600

Konzentration der siRNA (nM)

P38I

P-m

RNA-

Expr

essi

on/P

BGD

norm

iert

auf n

s-si

RNA

siRNA-D3 siRNA-D5

Konzentrationsabhängigkeit