UVUV--VISVISSPECTROPHOTOMETERSPECTROPHOTOMETER

ภญ. ศศิดา อยูสุขสํานักยาและวัตถุเสพติด

กรมวิทยาศาสตรการแพทย

23 สิงหาคม 2549

UV-VIS Spectrophotometer

ใชในการตรวจหาชนดิและปริมาณของสารโดยใชหลักการที่วา

สารแตละชนดิจะสามารถดูดกลนืรังสีไดในชวงความยาวคลืน่ที่

แตกตางกัน และปริมาณการดูดกลนืรังสีขึ้นอยูกบัความเขมขนของ

สารนั้น

BEER’s law

A = abc = log Po/P = - log T

A = Absorbance

a = absorptivity

b = ความกวางของ cell (cm)

c = concentration (g/l)

Po = ความเขมของรังสีกอนผานตัวกลาง

P = ความเขมของรังสีหลังผานตวักลาง T = Transmittance

การเบี่ยงเบนไปจาก BEER’s law

1. การเบี่ยงเบนเนือ่งจากความเขมขนของสาร

BEER’s law ใชไดผลดกีับการวัดสารละลายที่เจอืจางเทานั้น

2. การเบี่ยงเบนเนือ่งจากเครื่องมือ

- polychromatic radiation

- stray light

- slit width

3. การเบี่ยงเบนเนือ่งจากการเปลี่ยนแปลงทางเคมี

สวนประกอบของเครื่อง UV-VIS Spectrophotometer

1. แหลงกําเนดิรังสี : deuterium lamp & tungsten lamp

2. Monochromator : แยกคลืน่รังสีใหเหลือเปนความยาว

คลืน่เดียว

3. เซลลที่ใชบรรจุสารละลายตัวอยาง

4. Detector : วัดความเขมของรังสีที่ถูกดดูกลนื โดยการแปลง

พลังงานคลืน่รังสีเปนพลังงานไฟฟา

5. เครื่องแสดงคา : เปลี่ยนสัญญาณที่มาจาก detector เปน

คาที่ใชงาน

การสอบเทยีบ UV-VIS Spectrophotometer

1. Wavelength accuracy/repeatability

2. Photometric accuracy/repeatability

3. Photometric linearity

4. Stray light

5. Baseline stability

6. Baseline flatness

Wavelength accuracy/repeatability

Wavelength accuracy :

ตรวจสอบความแมนของความยาวคลืน่ที่อานไดจากเครื่องวา

เบี่ยงเบนไปจากความยาวคลื่นจริงเทาใด

(ตรวจสอบ wavelength scale)

Wavelength repeatability :

ตรวจสอบความเที่ยง (precision) ของความยาวคลื่นที่อานไดจาก

เครื่อง เมื่อ scan ซ้าํ ๆ

ความสาํคัญของ Wavelength accuracy/repeatability

ในการวิเคราะหแบบ qualitative จะมีผลตอ maximum

absorption wavelength ของสาร ในกรณีทํา Identification

สําหรับการวิเคราะหแบบ quantitative มีผลตอคาความถูกตอง

และความไวในการตรวจวัด โดยเฉพาะเมื่อเลอืก wavelength ที่

ไมใกลกับ maximum absorption wavelength เนื่องจาก

wavelength ที่คลาดเคลือ่นไป จะทําใหคา absorbance

เปลี่ยนไปมาก

สารมาตรฐานที่ใชในทดสอบ wavelength accuracy

1. Deuterium lamp – emission lines ที่ 486.0, 656.1 nm

2. Mercury lamp – emission lines ที่ 253.7, 302.25, 313.6,334.15, 365.48, 404.66, 435.83, 546.07, 576.96, 579.07 nm

3. Holmium oxide solution (quartz) glass filter (4%Ho2O3 in 10%perchloric acid) ที่ 241.15, 278.7,287.1,361.5, 416.3, 450.8, 485.8 nm

4. Holmium oxide (quartz) glass filter ที่ 241.5, 279.4, 287.5, 360.9, 418.4, 453.2 nm

5. Didymium filter ที่ 441.9, 476.2, 528.7, 584.4, 684.7, 744.2 nm

ตารางแสดงการเปรียบเทยีบ wavelength standards

Wavelength standard Advantage Disadvantage

Emission lines from

deuterium lamp

Sharp spectral lines

UV light source

Limited to VIS wavelength

Emission lines from

mercury lamp

Sharp spectral lines, cover

both UV & VIS regions

Not commonly built into the

instrument

Holmium oxide &

Didymium filter

Easy to use

NIST SRM available

Limited to VIS wavelength

Broad spectral lines

4% Holmium oxide in

10% perchloric acid

Easy to use, NIST SRM

availble, cover both UV &

VIS regions

Dependency on the

resolution power of the

instrument

Wavelength accuracy/repeatability

วิธีที ่1 การตรวจสอบดวยหลอดดิวเทอเรียม

อุปกรณและสารเคมี : หลอดดิวเทอเรียมที่ตดิตั้งอยูภายในเครื่อง

วิธีการ :

เลือกใชหลอดดิวเทอเรียมและปดหลอดทังสเตน

เลือกใช ordinate mode เปน %T

กรณีที่เปนเครื่องชนดิ double beam ใหปด reference beam

กอนดวย shutter หรือเลอืกเปน single beam

Wavelength accuracy/repeatability

วิธีที ่1 การตรวจสอบดวยหลอดดิวเทอเรียม (ตอ)

Scan spectrum ดวยความเร็วต่ําจากความยาวคลื่น 660-650 nm

หาความยาวคลื่นที่ใหคา %T สูงสุดจาก spectrum ที่อานได

scanซ้ํา 10 ครั้ง

หาคาเฉลี่ยและคาเบี่ยงเบนมาตรฐานของคาความยาวคลื่นที่อานได

Wavelength accuracy/repeatability

วิธีที ่1 การตรวจสอบดวยหลอดดิวเทอเรียม (ตอ)

การประเมินผล

คาเฉลี่ยของความยาวคลืน่ที่อานไดเปนไปตามขอกําหนดของ

เครื่อง หรือ อยูในชวง 656.1 ± 0.3 nm

คาเบี่ยงเบนมาตรฐาน (Standard deviation) ของความยาวคลื่น

ที่อานไดเปนไปตามขอกําหนดของเครื่องหรือตามความ

เหมาะสมของการใชงาน

Spectrum from deuterium lamp

Wavelength accuracy/repeatability

วิธีที ่2 การตรวจสอบดวย Holmium oxide

อุปกรณและสารเคมี : Holmium oxide solution glass filter

(SRM 2034)

วิธีการ :

เปดหลอดดวิเทอเรียมและหลอดทังสเตน

ใช slit width ใหแคบที่สุด เพื่อใหแสงผานนอยที่สุด

ใส Holmium oxide solution glass filter ในชองใสตวัอยางโดย

เทียบกับอากาศ

Scan spectrum ดวยความเร็วต่ําจากความยาวคลื่น 200-680 nm

Wavelength accuracy/repeatability

วิธีที ่2 การตรวจสอบดวย Holmium oxide (ตอ)

ใหอานคา wavelength ที่ใหคา %T นอยที่สุด (ซึ่งควรอยูที่ 279.3,

360.9, 460.2, 536.4 nm)

Scan ซ้ํา 10 ครั้ง

หาคาเฉลี่ยและคาเบี่ยงเบนมาตรฐานของความยาวคลืน่ที่อานไดที่

ใหการสองผานของแสงนอยที่สุดเปรียบเทียบกับความยาวคลื่น

จากในใบรับรอง Holmium oxide solution glass filter ที่ใช

Wavelength accuracy/repeatability

วิธีที ่2 การตรวจสอบดวย Holmium oxide (ตอ)

การประเมินผล

คาเฉลี่ยของความยาวคลืน่ที่อานไดเปนไปตามขอกําหนดของ

เครื่อง หรือแตกตางไมเกนิ ±1.0 nm

คาเบี่ยงเบนมาตรฐาน (Standard deviation) ของความยาวคลื่น

ที่อานไดเปนไปตามขอกําหนดของเครื่องหรือตามความ

เหมาะสมของการใชงาน

Holmium oxide solution (quartz) glass filter

Spectrum ของ holmium oxide solution filter

Photometric accuracy/repeatability

Photometric accuracy :

ตรวจสอบความแมนของคา absorbance/%Tที่อานไดจาก

เครื่องวา เบี่ยงเบนไปจากคาจริงเทาใด

Photometric repeatability :

ตรวจสอบความเที่ยง (precision) ของคา absorbance/%Tที่

อานไดเมื่อทดสอบซ้ํา โดยอานคา absorbance/%T ที่ความยาว

คลืน่ใดความยาวคลืน่หนึ่งซ้ําๆ

ความสาํคัญของ Photometric accuracy/repeatability

มีผลตองานวิเคราะหแบบ Quantitative เพราะวาความแนนอน

ในการอานคา Absorbance/%T ของเครื่องจะทําใหผลการ

ทดลองถูกตอง และมี reproducibility

Photometric accuracy/repeatability

วิธีที่ 1 การตรวจสอบดวย Glass filter (Visible region)

อุปกรณและสารเคมี : Glass filter (SRM 930e) ประกอบดวย glass

filter 4 อนั ใหคา %T ตางกัน คือ blank filter, 10, 20, 30 %T ที่

440.0, 465.0, 546.1, 590.0, 635.0 nm

วิธีการ :

ใช slit width ใหแคบที่สุด เพื่อใหแสงผานนอยที่สุด

ปรับคา “0” ดวย blank glass filter เทียบกับอากาศ

นํา blank glass filter ออก แลวใส glass filter อนัที่ 1 ลงในชองใส

ตัวอยาง

Photometric accuracy/repeatability

วิธีที่ 1 การตรวจสอบดวย Glass filter (Visible region) (ตอ)

บันทกึคา Abs./%T ทําซ้ํา 3 ครั้ง ที่ความยาวคลืน่ 440.0, 465.0,

546.1, 590.0, 635.0 nm หรือใชความยาวคลืน่จริงที่กําหนดใน

ใบรับรอง

ทําซ้ําใน glass filter อกี 2 อัน ดวยวิธีเดียวกนั

นําคาเฉลี่ยและคาเบี่ยงเบนมาตรฐานของคา Abs./%T ที่อาน

ไดเปรียบเทียบกับคา Abs./%T จากใบรับรองมาตรฐานของ

glass filter ที่ใช

Photometric accuracy/repeatability

วิธีที่ 1 การตรวจสอบดวย Glass filter (Visible region) (ตอ)

การประเมินผล

คาเฉลี่ยของคาที่อานไดเปนไปตามขอกําหนดของเครื่อง หรือ

แตกตางไมเกนิ ±1.5%

คาเบี่ยงเบนมาตรฐาน (Standard deviation) ของการอานเปนไป

ตามขอกําหนดของเครื่องหรือแตกตางกันไมเกนิ 0.01Abs.

Photometric accuracy

วิธีที่ 1 การตรวจสอบดวย Glass filter (Visible region) (ตอ)

Photometric repeatability

วิธีที่ 1 การตรวจสอบดวย Glass filter (Visible region) (ตอ)

Photometric accuracy/repeatability

วิธีที่ 2 การตรวจสอบดวย K2Cr2O7 (UV region)

อุปกรณและสารเคมี : สารละลาย Potassium dichromate

(K2Cr2O7) ความเขมขน 0.06 g/l in 0.005M H2SO4

วิธีการ :

ใช slit width ใหแคบที่สุด เพื่อใหแสงผานนอยที่สุด

ปรับ Abs. = 0 ดวย 0.005M H2SO4

วัดคา Abs.ของ สารละลาย K2Cr2O7 ความเขมขน 0.06 g/l ที่

ความยาวคลืน่ 235.0, 257.0, 313.0 และ 350.0 nm ทําซ้ํา 10 ครั้ง

หาคาเฉลี่ยของ Abs. และคาเบี่ยงเบนมาตรฐานของคาที่อานได

Photometric accuracy/repeatability

วิธีที ่2 การตรวจสอบดวย K2Cr2O7 (UV region) (ตอ)

คํานวณคา A (1%,1cm)

A (1%,1cm) = Ax × D

W

เมื่อ Ax = คา Absorbance เฉลี่ยจากการวัด 10 ครั้ง

W = น้ําหนกัของ K2Cr2O7 ที่นํามาเตรียมเปนสารละลาย(g)

D = dilution factor

นําคา A (1%,1cm) ที่คํานวณไดเปรียบเทียบกับคา A (1%,1cm) ของ สารละลาย K2Cr2O7 ในชวงที่กําหนดที่ความยาวคลืน่ตางๆ

Photometric accuracy/repeatability

วิธีที่ 2 การตรวจสอบดวย K2Cr2O7 (UV region) (ตอ)

การประเมินผล

คาเฉลี่ยของคาที่อานไดเปนไปตามขอกําหนดของเครื่อง หรือ

แตกตางไมเกนิ ±1.5% โดยเปรียบเทียบคา A (1%,1cm) ของคาที่

อานไดกับคาจริงของสารละลาย

คาเบี่ยงเบนมาตรฐาน (Standard deviation) ของคาที่อานได

เปนไปตามขอกําหนดของเครื่องหรือแตกตางกนัไมเกนิ 0.01Abs.

Photometric linearity

Photometric linearity :

ตรวจสอบการดูดกลนืรังสีวา linear ตลอดชวงที่ใชงานหรือไม

(คา absorbance แปรตามความเขมขนเปนเสนตรง ?)

Photometric linearity (ตอ)

อุปกรณและสารเคมี : สารละลาย Potassium dichromate (K2Cr2O7) ความเขมขน 0.02-0.2 g/l in 0.005M H2SO4 (10 concentration)

วิธีการ :

ใช slit width ใหแคบที่สุด เพื่อใหแสงผานนอยที่สุด

ปรับ Abs. = 0 ดวย 0.005M H2SO4

วัดคา Abs. สารละลาย K2Cr2O7 ที่เตรียมขึ้น ที่ความยาวคลืน่ 257.0 nm ทํา 10 ความเขมขน

สรางกราฟระหวาง absorbance กบัความเขมขน และหาคา correlation coefficient (R)

Photometric linearity (ตอ)

การประเมินผล :

กราฟที่ไดควรเปนเสนตรง และมีคา R ไมนอยกวา 0.995

Stray light

Stray light : ตรวจดูวามีแสงอื่นๆ นอกเหนอืจากความยาวคลืน่ที่ตั้งไว ผานเขา detector หรือไม

Stray light เกดิจาก

รังสีความยาวคลืน่อืน่ที่ปนออกมาจาก monochromator ผานตัวอยาง เขาสู detector หรือ

อาจเกดิจากแสงภายนอกเครื่อง เนื่องจากระบบ shutter ที่ปดบกพรอง

ปริมาณของ stray light จะไมเทากันตลอดชวง spectral range

Cut-off filter ที่ใชวัดปริมาณ stray light จะใชที่ชวงความยาว

คลืน่ที่ Cut-off filter นีไ้มควร transmit รังสี (%T< 1)

Filter with a continuous high absorbance value ไมเหมาะที่

จะนํามาใช เนือ่งจากจะไป block stray light และใหคาของ

stray light ที่ต่ํากวาความเปนจริง

คา transmittance ที่สูงของ cut-off filter เมื่อวดัที่ cut-off

wavelength เกดิจาก stray light

Stray light (ตอ)

Stray light (ตอ)

ผลของ Stray light

คา absorbance ต่ํากวาความเปนจริง

Linearity range ของเครื่องลดลง

สารมาตรฐานสําหรับตรวจ Stray light

ตองเปนสารที่มีคุณสมบัติ sharp cut-off ไดแก

12 g/l KCl in H2O วัดที่ 175-200 nm (cut-off = 200 nm)

10 g/l NaI in H2O วัดที่ 210-259 nm (cut-off = 260 nm)

50 g/l NaNO2 in H2O วัดที่ 300-385 nm (cut-off = 390 nm)

Stray light (ตอ)

วิธีการ :

ตั้งความยาวคลื่นที่ 200 nm

ปรับ Abs. = 0 ดวยน้ํากลัน่ อานคา Abs. ของ KCl

ตั้งความยาวคลื่นที่ 220 nm (กรณี NaNO2 ตั้งความยาวคลืน่ที่ 340, 370 nm ตามลําดบั)

ปรับ %T = 100 ดวยอากาศ

Block sample beam ใหหมด (0%T) อานคา %T (1)

ใส cell ของ NaI หรือ NaNO2 ในชอง sample อานคา %T (2)

ปริมาณ Stray light คํานวณจากผลตาง %T = (2) - (1)

Stray light (ตอ)

การประเมินผล

คา%T และ Abs. เปนไปตามขอกําหนดของเครื่อง หรือนอยกวา

0.02%T

คา Abs. ของ KCl ตองมากกวา 2.0

คา %T ของ NaI ตองนอยกวา 0.02

คา %T ของ NaNO2 ตองนอยกวา 0.02

Stray light (ตอ)

KCl : ใชในการทดสอบวา ในสภาวะที่มี stray light เครื่องยัง

สามารถทํางานไดดีหรือไม สําหรับงานบางอยางที่เปน specific

application

NaI & NaNO2 : ใชในการวัดปริมาณ stray light ในชวง UV region

Baseline stability

Baseline stability :

การตรวจสอบความสามารถของเครื่องวา baseline คงที่

ตลอดชวงเวลาหนึง่ๆ หรือไม

Baseline stability (ตอ)

Baseline stability นี้ มีความจาํเปนสําหรับการตรวจวิเคราะหที่ตองตรวจวัดเปนเวลานานตดิตอกนัเกนิกวา 1 ชั่วโมง

Baseline stability จะเปนปญหาเมื่อคาเดมิของ Absorbance = 0 (%T = 100) มีคามากขึ้นเรื่อยๆ (drift) ในขณะที่มีการวัด absorbance อยางตอเนือ่ง

โดยจะสงผลถึงคา absorbance ของตัวอยางจะตางกนัอยางมากในแตละครั้งที่อาน

Baseline stability (ตอ)

วิธีการ

ตรวจดูวา ชอง sample และ reference วางหรือไม

ตั้งความยาวคลื่นและปรับ Abs. ตามขอกาํหนดของเครื่อง หรือ

ตั้งความยาวคลื่นที่ 700 nm ปรับ Abs. = 0

วัด baseline stability นานไมนอยกวา 2 ชั่วโมง

คํานวณ คาการเปลี่ยนแปลงของ Abs. ตอชั่วโมง

Baseline stability (ตอ)

การประเมินผล

คา baseline stability ตองไมเกนิ 0.0003 Abs./hr หรือตามขอกําหนดของเครื่อง

สาเหตุคา Baseline stabilityไมเปนไปตามขอกําหนด อาจเกดิจาก

Unbalance beam คือ คาของ sample beam กับ reference beam ไมเทากนั

Mirror สกปรก หรือตาํแหนงผิดไปจากเดมิ

Baseline stability

Baseline flatness

Baseline flatness :

การตรวจสอบเพือ่ที่จะดูระดับ baseline ในขณะที่ไมมี

ตัวอยาง

ความสาํคัญของ Baseline flatness (ตอ)

ผลของการมี baseline flatness สูงเกนิที่กาํหนด

คาที่อานไดจากการวัดตัวอยางจะวิ่งไปมาไมคงที่

ไมสามารถวัดตัวอยางที่มีความเขมขนต่ําๆ ได

Baseline flatness (ตอ)

วิธีการ

ตรวจดูวา ชอง sample และ reference วางหรือไม

ตั้งความยาวคลื่นในการ scan ระหวาง 200-900 nm ในกรณีที่

สามารถวัดไดถึง 1100 nm ใหตั้งระหวาง 200-1100 nm

เลือก ordinate mode เปน Abs.

Scan ตามคาที่ตั้งไว โดยใชอากาศเปนตัวอยาง

Baseline flatness (ตอ)

การประเมินผล

Spectrum ที่ไดตองมีคาไมเกิน ± 0.001 Abs. ตลอดชวงความยาว

คลืน่ที่ scan

สาเหตุคา Baseline flatness ไมเปนไปตามขอกําหนด อาจเกดิจาก

Filter mirror grating อาจสกปรก หรือ ตําแหนงอาจผดิไปจากเดมิ

หลอดดิวเทอเรียมหรือหลอดทังสเตนไมทํางาน หรือตําแหนงผดิไป

จากเดมิ

Baseline flatness

USP 28

USP กําหนดใหมกีาร recalibrate เมื่อ wavelength ที่ไดมคีามากกวา ±1 nm จากคา wavelength กําหนดไวในแตละ monograph โดยตอง calibrate ในหัวขอ

1. Wavelength scale : hydrogen discharge lamp ที่ 486.13,656.28 nm

glass filter (didymium, holmium oxide solution)

2. Photometric scale : std. inorganic glass filter

std.solution of known transmittances

(potassium dichromate)

BP2005

BP กําหนดหัวขอ calibrate spectrophotometer ดังนี้

1. Control of wavelength : เพื่อตรวจดู wavelength scale

โดยใช Holmium perchlorate solution, deuterium lamp,

mercury discharge lamp หรือ certified reference material อืน่

เกณฑยอมรับ : ± 1 nm for UV range

± 3 nm for VIS range

BP2005 (ตอ)

Absorption maxima for control of wavelength scale

241.15 nm (Ho) 334.15 nm (Hg) 486.0 nm (Dß)

253.7 nm (Hg) 361.5 nm (Ho) 486.1 nm (Hß)

287.15 nm (Ho) 365.48 nm (Hg) 536.3 nm (Ho)

302.25 nm (Hg) 404.66 nm (Hg) 546.07 nm (Hg)

313.16 nm (Hg) 435.83 nm (Hg) 576.96 nm (Hg)

579.07 nm (Hg)

BP2005 (ตอ)

2. Control of absorbance : เพื่อตรวจดูคา absorbance ที่อาน

ได โดยใช Potassium dichromate R หรือ suitable filters อืน่

Potassium dichromate R : 57.0-63.0 mg of K2Cr2O7 in

0.005 M H2SO4 dilute to 100 ml วัด Absorbance ที่ 430 nm

เกณฑยอมรับ : ± 0.01

BP2005 (ตอ)

Wavelength Specific absorbance Maximum

(nm) A(1%,1cm) tolerance

235 124.5 122.9 to 126.2

257 144.5 142.8 to 146.2

313 48.6 47.0 to 50.3

350 107.3 105.6 to 109.0

430 15.9 15.7 to 16.1

BP2005 (ตอ)

3. Limit of stray light :

ใช 12 g/l solution of Potassium chloride R วัด Absorbance

ที่ 200-220 nm โดยใช cell 1 cm, blank = water

เกณฑยอมรับ : คา absorbance ตองมากกวา 2.0 ที่ความยาว

คลืน่ระหวาง 198-202 nm

นอกจากนี้ยังสามารถใช filters หรือสารละลายที่เหมาะสมอืน่