Ovaj doktorski rad izrađen je u Zavodu za animalnu fiziologiju Biološkog odsjeka

Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, pod vodstvom izv. prof. dr. sc.

Domagoja Đikića, u sklopu Sveučilišnog poslijediplomskog doktorskog studija Biologije pri

Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.

ZAHVALA:

Ovaj rad nastao je u, za mene, jako zahtjevnom i bogatom profesionalnom i privatnom razdoblju

života. Završila sam specijalističko usavršavanje, te postala majka dva sina. Zbog toga ovo

istraživanje i rad ne bih mogla završiti bez određenih osoba kojima ovim putem želim zahvaliti.

Veliku zahvalnost izražavam svom mentoru, izv. prof. dr. sc. Domagoju Đikiću (Prirodoslovno-

matematički fakultet, Zagreb) koji mi je nesebično davao svoje vrijeme, znanje i savjete. Hvala

mu za pomoć pri odabiru teme, motivaciji i usmjeravanju tijekom cijelog istraživanja i pisanja

ovog doktorskog rada.

Svim zaposlenicima Zavoda za animalnu fiziologiju PMF-a u Zagrebu zahvaljujem na

nesebičnoj tehničkoj i stručnoj pomoći, posebno gđi. Mariji Potočić. Zahvaljujem prof.dr.sc.

Nadi Oršolić na pojašnjavanju teorijskih spoznaja, korisnim savjetima i razumijevanju u bitnim

trenucima pisanja rada. Zahvaljujem studentima Barbari, Nikolini, Marini, Ivanu i Juri na

pomoći prilikom provođenja istraživanja.

Nadalje zahvaljujem Hrvatskom zavodu za transfuzijsku medicinu, djelatnicima Odjela za

trombocitnu i leukocitnu dijagnostiku i hemostazu i dr.sc. Maji Tomičić za pomoć pri testiranju

kompletne krvne slike i agregacije trombocita.

Zahvaljujem se i KBC-u Sestre Milosrdnice, djelatnicima Službe za transfuzijsku medicinu i

hemostazu na Klinici za tumore na pomoći pri provođenju testova hemostaze. Zahvaljujem

Snježani Ramić i dr. Meliti Perić Balja na pomoći kod histopatološke analize organa.

Veliko hvala mojoj kolegici dr.sc. Tihi Vučemilo na stručnoj pomoći i prijateljskoj podršci koju

mi je pružala tijekom cijelog poslijediplomskog obrazovanja.

Na koncu bih se željela zahvaliti mužu Martinu i sinovima na ljubavi i strpljenju koje su mi

pružali tijekom izrade ovog rada. Zahvaljujem se braći i tati Kreši na materijalnoj podršci,

nesebičnoj ljubavi i ponosu na sve moje uspjehe.

Mojoj majci Marici...

Sveučilište u Zagrebu Doktorski rad

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

TOKSIČNOST I OKSIDATIVNI UČINCI PRIPRAVKA GINKA I

ANTIHEMOSTATSKIH LIJKOVA U ŠTAKORA

MARIJA SKOKO

Zavod za animalnu fiziologiju, Biološki odsjek,

Prirodoslovno-matematički fakultet, Sveučilište u Zagrebu

Sažetak: Cilj ovog istraživanja je prikazati učinke i razlike u toksičnosti te prooksidativne i antihemostatske mehanizme triju biljnih formulacija namijenjenih ljudskoj uporabi, a koja sadrže pripravak biljke Ginkgo biloba, dostupne na području Republike Hrvatske. Istražen je i njihov učinak u kombinaciji s antihemostatskim lijekovima, acetilsalicilnom kiselinom i varfarinom. Istraživanje je provedeno na životinjskom modelu štakora. Testovima agregacije i koagulacije dokazano je da svi korišteni biljni pripravci produžuju vrijeme agregacije trombocita dok na koagulaciju nemaju statistički značajan učinak. Dokazano je da korištenje biljnih pripravaka u kombinaciji s lijekovima mijenja vrijednosti mjerenih biljega oksidativnog stresa, aktivnost enzima katalaze i SOD te koncentraciju GSH i MDA u krvi i tkivima mozga, jetre, slezene i bubrega. Dobiveni rezultati ukazuju na potrebu veće pozornosti prilikom upotrebe pripravka ginka i različitih antihemostatskih lijekova u svakodnevnoj kliničkoj praksi.

( 138 stranica / 46 slika / 24 tablice / 228 literaturnih navoda / jezik izvornika hrvatski)

Ključne riječi: ginko, agregacija trombocita, hemostaza, antioksidativni sustav, varfarin, acetilsalicilna kiselina

Mentor: izv. prof. dr. sc. Domagoj Đikić

Ocjenjivači: prof. dr. sc. Nada Oršolić izv. prof. dr. sc. Marijana Zovko Končić doc. dr. sc. Petar Gaćina

University of Zagreb Doctoral thesis

Faculty of Science

Division of Biology

THE TOXICITY AND OXIDATIVE EFFECTS OF GINKGO FORMULATION AND

ANTIHEMOSTATIC DRUGS IN RATS

MARIJA SKOKO

Division of Animal Physiology, Department of Biology,

Faculty of science, University of Zagreb

Summary: The aim of this study was to demonstrate the effects and the differences in toxicity and prooxidant and antihemostatic mechanisms of three herbal products for human use, containing extract of Ginkgo biloba, that are available on Croatian market. The goal was also to investigate their efect in combination with antihemostatic drugs, acetylsalicylic acid and warfarin. The study was conducted on animal model. Aggregation and coagulation tests proved that all used herbal products prolong platelet aggregation, while on coagulation they had no statistically significant effect. It has been shown that the use of herbal remedies in combination with medicaments changes the value of the measured biomarkers of oxidative stress, the enzyme activity of catalase and SOD and GSH and MDA contretation in blood and tissues of the brain, liver, spleen and kidney. The results suggested that the greater attention should be paid on using these products in clinical practice.

(138 pages / 46 figures / 24 tables /228 references / original in Croatian)

Key words: ginko, platelt agregation, hemostasis, antioxidant system, warfarin, acetilsalycilic

acid

Supervisor: Domagoj Đikić, PhD, Associate Professor

Rewiewers: Nada Oršolić, PhD, Full Professor Marijana Zovko Končić, PhD, Associate Professor Petar Gaćina,MD, PhD, Assistant Professor

Sadržaj

1 UVOD......................................................................................................................................1

1.1 CILJ I SVRHA ISTRAŽIVANJA..............................................................................................2

2 LITERATURNI PREGLED.................................................................................................3

2.1 HEMOSTAZA......................................................................................................................3

2.1.1 Primarna hemostaza......................................................................................................3

2.1.2 Sekundarna hemostaza..................................................................................................5

2.1.2.1 Vanjski put koagulacije..........................................................................................5

2.1.2.2 Unutarnji put koagulacije.......................................................................................5

2.1.2.3 Zajednički put koagulacije.....................................................................................6

2.1.2.4 Fibrinoliza..............................................................................................................7

2.2 OKSIDATIVNI STRES I ANTIOKSIDATIVNI SUSTAV..............................................................8

2.2.1 Superoksid dismutaza (SOD)......................................................................................10

2.2.2 Katalaza (CAT)...........................................................................................................12

2.2.3 Glutation peroksidaza (GPx).......................................................................................13

2.2.4 Biotransformacijski sustav jetre..................................................................................14

2.2.5 Antioksidativni sustav bubrega...................................................................................15

2.2.6 Antioksidativni sustav slezene....................................................................................16

2.2.7 Antioksidativni sustav mozga.....................................................................................17

2.2.8 Antioksidativni sustav krvnih stanica i plazme...........................................................18

2.3 REGULACIJA BILJNIH PRIPRAVAKA NA TRŽIŠTU..............................................................20

2.3.1 Stanje na tržištu pripravaka koji sadrže ekstrakt ginka...............................................21

2.4 GINKO..............................................................................................................................21

2.4.1 Aktivni spojevi u ekstraktu ginka................................................................................22

2.4.1.1 Flavonoidi prisutni u ekstraktu ginka...................................................................22

2.4.1.2 Terpeni prisutni u ekstraktu ginka.......................................................................26

2.4.2 Metabolizam ginka i aktivnih spojeva iz ginka...........................................................28

2.4.3 Utjecaj ginka na primarnu hemostazu.........................................................................28

2.4.4 Utjecaj ginka na koagulaciju.......................................................................................29

2.4.5 Fiziološki i antioksidativni učinci pripravaka ginka na organizam.............................29

2.4.6 Učinak pripravaka biljke Ginkgo biloba na endotel...................................................31

2.4.7 Učinak pripravka biljke ginkgo biloba na citokrom P450 sustav...............................32

2.5 ANTIHEMOSTATSKI LIJEKOVI...........................................................................................33

2.5.1 Acetilsalicilna kiselina................................................................................................33

2.5.2 Varfarin.......................................................................................................................34

3 MATERIJALI I METODE.................................................................................................36

3.1 ETIČKA NAČELA..............................................................................................................36

3.2 POKUSNE ŽIVOTINJE........................................................................................................36

3.3 MATERIJALI POKUSA.......................................................................................................37

3.3.1 Sastav pripravaka korištenih u radu prema priloženoj deklaraciji..............................37

3.3.2 Određivanje aktivnih spojeva u istraživanim biljnim pripravcima.............................38

3.3.2.1 Spektrofotometrijsko određivanje ukupnih fenola u pripravcima ginka.............38

3.3.2.2 Spektrofotometrijsko određivanje ukupnih flavonoida u pripravcima ginka......39

3.3.2.3 Određivanje ukupnih antocijanina u pripravcima ginka......................................40

3.3.3 Određivanje antioksidativnog djelovanja biljnih pripravaka ginka............................40

3.3.3.1 FRAP (engl. Ferring Reducing Antioxidant Power) metoda...............................40

3.3.3.2 DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil radikal) metoda.............................................41

3.3.4 Određivanje polifenolnih spojeva primjenom visokodjelotvorne tekućinske

kromatografije........................................................................................................................43

3.3.4.1 Priprema otopina standarda..................................................................................44

3.3.4.2 Identifikacija i kvantifikacija polifenolnih spojeva.............................................44

3.4 PROTOKOL ISTRAŽIVANJA...............................................................................................46

3.5 HEMATOLOŠKI PARAMETRI I PARAMETRI HEMOSTAZE....................................................47

3.5.1 Mjerenje agregacije trombocita...................................................................................47

3.5.2 Mjerenje testova koagulacije.......................................................................................48

3.5.3 Određivanje kompletne krvne slike.............................................................................50

3.5.4 Izračun viskoznosti krvi..............................................................................................50

3.6 HISTOPATOLOŠKA ANALIZA............................................................................................50

3.7 BIOMARKERI OKSIDATIVNOG STRESA..............................................................................50

3.7.1 Određivanje proteina metodom po Lowery-u.............................................................50

3.7.2 Mjerenje hemoglobina (Hgb) u eritrocitima...............................................................51

3.7.3 Mjerenje enzimske aktivnosti superoksid dismutaze (SOD)......................................52

3.7.4 Mjerenje enzimatske aktivnosti katalaze.....................................................................52

3.7.5 Mjerenje količine lipidne peroksidacije......................................................................53

3.7.6 Mjerenje koncentracije ukupnog glutationa (GSH)....................................................53

3.8 MJERENJE ENZIMA ARGINAZE I NITRITA U TKIVU AORTE................................................55

3.8.1 Mjerenje arginaze........................................................................................................55

3.8.2 Mjerenje nitrita............................................................................................................56

3.9 STATISTIČKA OBRADA.....................................................................................................57

4 REZULTATI........................................................................................................................60

4.1 ANALIZA SASTOJAKA U KOMERCIJALNIM PRIPRAVCIMA.................................................60

4.1.1 Flavonoli i fenolne kiseline prisutne u pripravcima ginka..........................................61

4.2 AGREGACIJA TROMBOCITA..............................................................................................67

4.3 KOAGULACIJA I HEMATOLOŠKI PARAMETRI KOD POKUSNIH ŽIVOTINJA.........................68

4.3.1 Protrombinsko vrijeme (PV) i Aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme

(APTV)...................................................................................................................................68

4.3.2 Trombinsko vrijeme (TV) i koncentracija fibrinogen.................................................69

4.3.3 Broj leukocita (L) i trombocita (Tr) u punoj krvi........................................................70

4.3.4 Broj eritrocita u punoj krvi..........................................................................................71

4.3.5 Hematokrit (Htc) i procjena viskoznosti pune krvi (VPK).........................................72

4.4 PATOHISTOLOŠKE PROMJENE U ORGANIMA OBRAĐENIH ŽIVOTINJA I KONTROLE...........73

4.5 PROCJENA OKSIDATIVNOG STRESA U ORGANIMA I KRVI.................................................74

4.5.1 Aktivnost superoksid dismutaze (SOD)......................................................................74

4.5.1.1 Aktivnost SOD u jetri..........................................................................................74

4.5.1.2 Aktivnost SOD u bubrezima................................................................................75

4.5.1.3 Aktivnost SOD u slezeni......................................................................................76

4.5.1.4 Aktivnost SOD u mozgu......................................................................................77

4.5.1.5 Aktivnost SOD u eritrocitima..............................................................................79

4.5.1.6 Aktivnost SOD u plazmi......................................................................................80

4.5.1.7 Aktivnost SOD u plazmi bogatoj trombocitima..................................................81

4.5.2 Aktivnost katalaze u organima i krvi..........................................................................82

4.5.2.1 Aktivnost katalaze u jetri.....................................................................................82

4.5.2.2 Aktivnost katalaze u bubrezima...........................................................................83

4.5.2.3 Aktivnost katalaze u slezeni.................................................................................84

4.5.2.4 Aktivnost katalaze u različitim regijama mozga..................................................85

4.5.2.5 Aktivnost katalaze u eritrocitima.........................................................................87

4.5.2.6 Aktivnost katalaze u plazmi siromašnoj trombocitima........................................88

4.5.2.7 Aktivnost katalaze u plazmi bogatoj trombocitima (PRP)...................................89

4.5.3 Koncentracija malondialdehida (MDA) u organima i krvi.........................................90

4.5.3.1 Koncentracija MDA u jetri..................................................................................90

4.5.3.2 Koncentracija MDA u bubrezima........................................................................91

4.5.3.3 Koncentracija MDA u slezeni..............................................................................92

4.5.3.4 Koncentracija MDA u različitim regijama mozga...............................................93

4.5.3.5 Koncentracija MDA u eritrocitima......................................................................95

4.5.4 Koncentracija GSH u organima i krvi.........................................................................96

4.5.4.1 Koncentracija GSH u jetri....................................................................................96

4.5.4.2 Koncentracija GSH u različitim regijama mozga................................................97

4.5.4.3 Koncentracija GSH u eritrocitima........................................................................99

4.5.4.4 Koncentracija GSH u plazmi siromašnoj trombocitima....................................100

4.5.4.5 Koncentracija GSH u plazmi bogatoj trombocitima..........................................101

4.6 AKTIVNOST ARGINAZE U KRVNIM ŽILAMA....................................................................102

4.7 KONCENTRACIJA NITRITA (NO2-) U TRBUŠNOJ AORTI...................................................103

5 RASPRAVA........................................................................................................................104

6 ZAKLJUČCI:.....................................................................................................................113

7 LITERATURA...................................................................................................................115

8 ŽIVOTOPIS........................................................................................................................136

1 UVOD

Popularnost i uporaba biljnih pripravaka, u obliku dodataka prehrani i pripravaka s

pretpostavljenim zdravstvenim učincima, u stalnom je porastu. Biljni pripravci registrirani kao

dodaci prehrani, kupuju se u slobodnoj prodaji bez liječničkog recepta i sve više su zastupljeni

zbog marketinških izjava o „neštetnosti“.

Europska komisija uvela je direktivu da ujednači korištenje i licenciranje biljnih pripravaka na

cijelom području EU kako bi svi proizvodi bili označeni kao dodaci prehrani ili biljni lijekovi

(Direktiva, 2004). Biljni lijekovi sadrže opise sigurnosti, kvalitete i efikasnosti kao i ostali

konvencionalni lijekovi za razliku od dodataka prehrani za koje to nije uvjetovano.

Negativne posljedice biljnih pripravaka, koji su registrirani kao dodaci prehrani, na ljudski

organizam mogu nastati zbog prirodne toksičnosti biljke, biološkog ili kemijskog onečišćenja

sirovine ili namjernog patvorenja jeftinim sirovinama, te krivotvorenja dodatkom nedeklariranih

sintetskih farmakološki aktivnih tvari. Također, malo se zna kako unos prirodnih dodataka s

farmakološki aktivnim tvarima lijekova kod potrošača može prouzročiti štetne posljedice

(nuspojave) (Ulbricht i sur, 2008).

U 2014. zabilježeno je da su preparati ginka (Ginkgo biloba) među 30 najprodavanijih lijekova u

Hrvatskoj koji se koriste u izvanbolničkoj upotrebi (Halmed, 2014). Zbog toga se Europska

komisija zalaže za poticanje istraživanja usmjerenih na analizu štetnosti i toksičnosti dodataka

prehrani, pa tako i pripravaka ginka i njihovog mogućeg prooksidativnog djelovanja (He i sur,

2008).

Biljni pripravci pa tako i pripravci ginka imaju mnogo komponenti koje mogu djelovati na

metabolizam same stanice (He i sur, 2008). Na tržištu dostupni biljni pripravci ginka koriste se u

svrhu poboljšanja cirkulacije i kognitivnih funkcija (Pittler i sur, 2000; Sierpina i sur, 2003).

Najčešće ih koriste osobe koje imaju kardiovaskularna oboljenja. Obzirom da se radi o

najčešćem oboljenju i uzroku smrtnosti (Nichols i sur, 2014), često takvi bolesnici uzimaju

navedene biljne pripravke u kombinaciji s antihemostatskim lijekovima (acetilsalicilna kiselina i

varfarin).

1

Acetilsalicilna kiselina i varfarin svrstani su među 30 najzastupljenijih lijekova u izvanbolničkoj

praksi pa smo u ovom radu istražili moguće sinergističke učinke ginka s ovim lijekovima i

njihovu potencijalnu toksičnost u kombinaciji (Halmed, 2014).

1.1 Cilj i svrha istraživanja

Cilj istraživanja je usporediti biološke učinke, razlike u toksičnosti, potencijalne prooksidativne i

antikoagulacijske mehanizme tri pripravka koja po deklaraciji sadrže ekstrakt biljke Ginkgo

biloba. Dva su registrirana u Repubici Hrvatskoj (RH) kao dodaci prehrani, a jedan je dostupan

putem internet prodaje. Sadrže pripravak biljke Ginkgo biloba zasebno ili u formulaciji s drugim

biljkama. Poseban cilj je istražiti mogući sinergistički toksični i antihemostatski učinak

navedenih biljnih pripravaka, jer postoje literaturni prikazi slučajeva kada su pripravci ekstrakta

ginka uzrokovali krvarenja (Ang-Lee i sur, 2001; Ernst, 2002). Nadalje, obzirom da su pripravci

i formulacije ginka dostupne bez liječničkog recepta i nadzora, željelo se istražiti moguće

biološke učinke koji nastaju uzimanjem pripravaka ginka u kombinaciji s najzastupljenijim

antihemostatskim lijekovima, acetilsalicilnom kiselinom i varfarinom. Željelo se utvrditi bi li

kombinacija antikoagulacijskih lijekova i pripravaka ginka mogla imati sinergistički

potencirajući učinak na hemostazu, je li izraženiji nego ako se navedene formulacije uzimaju

zasebno. Istraživanje je provedeno na animalnom modelu.

Specifični ciljevi istraživanja su:

- utvrditi učinak ginka na primarnu i sekundarnu hemostazu te međureakciju biljnih

pripravaka i hemostatskih lijekova

- utvrditi patohistološke promjene u organima obrađenih životinja

- utvrditi razinu oksidativnog stresa u tkivima kao mogućeg pokazatelja toksičnosti

istraživanih pripravaka

- istražiti utjecaj primjenjenih pripravaka na arginazu u krvnim žilama, te koncentraciju

dušik oksida u krvnim žilama

Svrha istraživanja je doprinos u spoznajama o mogućnosti boljeg korištenja pripravaka ginka u

kardiovaskularnih bolesnika.

2

2 LITERATURNI PREGLED

2.1 Hemostaza

Hemostaza označava proces zaustavljanja krvarenja iz oštećene krvne žile. Procesi hemostaze

obuhvaćaju primarnu i sekundarnu hemostazu. Primarna hemostaza vezana je uz stvaranje

trombocitnog, a sekundarna uz stvaranje fibrinskog ugruška.

2.1.1 Primarna hemostaza

Nakon ozljede endotela krvne žile započinje formiranje trombocitnog plaka. Cirkulirajući

trombociti adheriraju na subendotelni kolagen preko von Willebrand faktora (vWF) ili izravno

preko glikoproteina na površini stanice. Aktivacijom glikoproteinskih receptora započinje

fosfolipaza C (PLC) kaskadni put – stvaranje inozitol trifosfata (IP3) koji dovodi do mobilizacije

kalcija iz gustih granula unutar trombocita. Ioni kalcija potrebni su za aktivaciju kinaze za

miozinske lake lance (MLC) potrebne za promjenu morfologije samog trombocita, za sekreciju

sadržaja trombocitnih granula, aktivaciju glikoproteina i fosfolipaze A2 (PLA2). Aktivirana

PLA2 cijepa arahidonsku kiselinu iz membrane koja je prekursor tromboksana A2 (TBXA2).

Ovaj proces dovodi do lokalne akumulacije trombina, TBXA2 i ADP-a koji su važni za daljnju

aktivaciju trombocita. Navedeni agonisti aktiviraju G proteinske receptore: trombin receptor,

tromboksan A2 receptor i ADP receptor (P2RY1 i P2RY12) (McKenzie, 2003).

Adhezija trombocita (Slika 1), promjena oblika trombocita i sekrecija su nužni koraci za

stvaranje trombocitnog plaka i agregaciju trombocita na trombocit preko fibrinogenskih

receptora. Inhibicijom receptora za fibrinogen, GPIIb/GPIIIa inhibitorima, blokira se agregacija

trombocita potaknuta agonistima (Slika 1)(Sangkuhl i sur, 2010).

3

Slika 1. Prikaz puta agregacije trombocita (engl. Platelet aggregation pathway). 1 – adhezija

trombocita na subendotelni kolagen preko glikoproteina i von Willebrand faktora (vWf); 2 –

fofolipaza C kaskadni put stvaranja inozitol 3 fosfata (IP3); 3 – sinteza tromboksana A2

(TBXA2) iz arahidonske kiseline (AA) putem ciklooksigenaze 1 (COX1); 4 – vezanje agonista

TBXA2 i ADP na receptore na površini trombocitai; 5 – povezivanje trombocita fibrinogenom.

Izvor: Sangkuhl i sur, 2011.

4

Tienopiridin

Kolagen

Inhibitori glikoproteina

IIb/IIIa

1

2

3

4

COX1

5

2.1.2 Sekundarna hemostaza

Koagulacija, kao sekundarna hemostaza, dovodi do stvaranja stabilnog fibrinskog ugruška na

mjestu ozljede krvne žile. Fibrinski ugrušak nastaje pokretanjem enzimatskih reakcija kroz

vanjski i unutarnji put koagulacije. Vanjski put koagulacije ili put preko tkivnog faktora i

unutarnji ili kontaktni put koagulacije. Teoretski se objašnjavaju odvojeno, dok su in vivo ta dva

puta isprepletena i ovise jedan o drugom.

Put koagulacije nastaje nizom enzimatskih reakcija kojima se zimogeni (inaktivni enzimski

prekursori) serinskih proteaza aktiviraju i kataliziraju slijedeću reakciju u nizu. Osim enzima za

koagulaciju su značajni i glikoproteini koji služe kao koenzimi u reakcijama. Oba puta

završavaju zajedničkim putem koagulacije (Hoffbrand i sur, 2002) (Slika 2).

2.1.2.1 Vanjski put koagulacije

Glavna uloga vanjskog puta je stvoriti, odnosno potaknuti brzo otpuštanje trombina na mjestu

stvaranja ugruška. Po ozljedi krvne žile FVII (faktor sedam) koji je do tada cirkulirao u krvi

dolazi u kontakt s tkivnim faktorom (TF) koji se nalazi na stanicama strome i leukocitima.

Kompleks FVII-TF aktivira FIX (faktor devet) i FX (faktor deset). Na aktivaciju FX u FXa

(aktivirani faktor deset) putem tkivnog faktora istovremeno djeluju i inhibitori koagulacije,

inhibitor puta tkivnog faktora (engl. Tissue factor pathway inhibiror, TFPI). FXa i kofaktor FVa

(aktivirani faktor pet) tvore protrombinaza kompleks koji aktivira protrombin u trombin.

Trombin aktivira FV i FVIII (isprepletanje unutarnjeg i vanjskog puta koagulacije) (McKenzie,

2003).

2.1.2.2 Unutarnji put koagulacije

Unutarnji ili kontaktni put aktivacije počinje formiranjem kompleksa na kolagenu,

visokomolekularni kininogen (engl. high molecular weight kininogen, HMWK), prekalikrein i

FXII (faktor dvanaest ili Hagemanov faktor). Prekalikrein se konvertira u kalikrein i FXII u

FXIIa. FXIIa aktivira FXI u FXIa. Faktor XIa aktivira FIX koji s kofaktorom FVIIIa tvori tenaza

kompleks koji aktivira FX u FXa. Unutarnji put aktivacije značajniju ulogu ima u upali nego u

stvaranju ugruška na mjestu ozljede krvne žile (Pallister i sur, 2010).

5

2.1.2.3 Zajednički put koagulacije

Znanstvena podjela na dva puta aktivacije i stvaranja fibrinskog ugruška stvorena je kako bi se

lakše objasnili testovi koji se koriste za procjenu stanja koagulacije, dok stvarna podjela in vivo

ne postoji. Stvoreni trombin cijepa fibrinogen u fibrin i značajan je aktivator samih trombocita,

FVIII (faktor osam) i V (faktor pet) i inhibitora koagulacije proteina C. Aktivira i FXIII (faktor

trinaest) koji stvara kovalentne veze između fibrinskih polimera (Pallister i sur, 2010).

Slika 2. Sekundarna hemostaza, kaskada koagulacije (engl. Coagulation cascade). Prikaz

vanjskog puta koagulacije preko tkivnog faktora (TF), unutarnjeg puta preko faktora XI, kojeg

aktivira faktor XII i IIa (trombin) i zajedničkog puta koji započinje aktivacijom faktora X. Izvor:

MSD priručnik, 2014.

6

2.1.2.4 Fibrinoliza

Da bi sustav zgrušavanja krvi bio u ravnoteži mora postojati proces u organizmu koji zaustavlja i

razgrađuje ugruške. Plazmin je protein koji se stvara u jetri kao inaktivan oblik plazminogen.

Tkivni aktivator plazminogena (t-PA) i urokinaza su tvari koje konvertiraju plazminogen u

aktivni plazmin i time počinje proces fibrinolize. t-PA se otpušta u cirkulaciju polagano kako bi

nakon nekoliko dana razgradio novostvoreni ugrušak. Inhibitor aktivacije plazminogena 1 i 2

(PAI-1 i PAI-2) inhibiraju t-PA i urokinazu i na taj način djeluju prokoagulantno (Cesarman-

Maus i sur, 2005) (Slika 3).

Slika 3. Shematski prikaz fibrinolize. Izvor: MSD priručnik, 2014.

7

2.2 Oksidativni stres i antioksidativni sustav

Oksidativni stres je neravnoteža između oksidativnog i antioksidativnog sustava u organizmu i

može dovesti do oštećenja stanica, tkiva i organa. Oksidativnim stresom nastaju oksidansi u

suvišku (visoko reaktivne molekule, atomi i ioni) koji oksidiraju supstrat i time mogu dovesti do

promjene strukture i funkcije proteina, lipida i ribonukleinskih kiselina. Oksidansi i oksidativni

stres povezani su s različitim procesima u oragnizmu, starenjem, kroničnim bolestima (dijabetes,

ateroskleroza, kronični upalni procesi) i malignim oboljenjima.

U oksidanse ubrajamo reaktivne kisikove radikale (engl. Reactive oxygen species, ROS),

dušikove radikale (engl. Reactive nitrogen species, RNS). ROS nastaju u svim aerobinim

stanicama, a najznačajniji izvor su enzimi NADPH - oksidaza (Nikotinamid adenin dinukleotid

phosphat), mieloperoksidaza (MPO) i ksantin oksidoreduktaza (XOR) (Lovrić i sur, 2008).

ROS imaju važnu ulogu u enzimskim reakcijama, mitohondrijskom transportu elektrona,

provođenju signala u stanici, aktivaciji transkripcijskih faktora, genskoj ekspresiji,

antimikrobnom djelovanju neutrofila i makrofaga (Bayr 2005), dok su RNS važni u održavanju

homeostaze u procesima neurotransmisije, peristaltike, krvnog tlaka te citotoksičnosti makrofaga

u procesu poznatom kao „oksidativni prasak“ (Dedon i Tannenbaum, 2004).

Različite bolesti, zračenje i starenje dovode do povećanog stvaranja oksidansa i oksidativnog

stresa. Kako bi održali ravnotežu, organizmi su stvorili različite mehanizme antioksidacije,

antioksidativni sustav. Organizmi su evolucijski stekli razne mehanizme u svrhu zaštite od

njihovog štetnog djelovanja.

Antioksidansi iz hrane kao što su polifenoli, vitamin C i karotenoidi ili endogeni kao što su

glutation (GSH) i metalotionein (Tomás-Zapico i Coto-Montes, 2005), vežu nastale slobodne

radikale i deaktiviraju ih. Feritin, transferitin, ceruloplazmin, metalotionein i drugi metal-

vezujući proteini vežu ione željeza i bakra koji u slobodnom obliku iniciraju lančanu reakciju

lipidne peroksidacije i DNA fragmentacije. Glutation-S-transferaze su važna skupina enzima koji

lančane reakcije preveniraju katalizirajući stvaranje S-konjugata, odnosno tioetera iz tiola i

glutationa nastalih uglavnom djelovanjem citokroma P450, ali i drugim metaboličkim putevima.

Glavni antioksidativni enzimi koji održavaju redoks stanje stanice u ravnoteži su SOD

8

(superoskid dismutaza), CAT (katalaza) i GPx (glutation peroksidaza) (Slika 4) (Tomás-Zapico i

Coto-Montes, 2005).

Slika 4. Održavanje redoks ravnoteže. Reaktivni oblici kisika (ROS) – najznačajniji izvor:

transport elektrona u mitohondriju (engl. electron-tranport chain, ETC), membranski vezana

NADPH oksidaza (NOX) i endolazmatski retikul (ER). Superoksid dismutaza (SOD) pretvara

superoksid (O2-) u vodikov peroksid (H2O2). Ako dođe do spajanja s dušikovim oksidom (NO)

nastaje peroksinitrit (ONOO-). U prisutnosti iona Fe2+ ili Cu2+, H2O2 se pretvara u vodu (H2O)

ili kisik (O2) uz enzime katalazu, glutation peroksidazu (GPx) ili peroksiredoksine (Prx). NOS,

sintaza dušikovog (II) oksida; GR, glutation reduktaza; GSH, reducirani glutation; GSSH,

oksidirani glutation. Izvor: Wang i sur, 2013.

9

2.2.1 Superoksid dismutaza (SOD)

SOD je važan antioksidativni enzim koji katalizira dismutaciju ranih superoksidnih radikala (O2-)

nastalih aerobnim metabolizmom u manje reaktivne vrste, odnosno, u kisik (O2) i vodikov

peroksid (H2O2) kojeg dalje reduciraju CAT i GPx (MatEs i sur, 1999). Izoforme enzima

razlikuju se po metalu koji koriste kao kofaktor (bakar, cink, željezo, mangan ili nikal). Kod ljudi

i ostalih sisavaca do sada su opisane tri izoforme SOD enzima. SOD1 i SOD3 kao kofaktor

koristi bakar (Cu) i cink (Zn) (Slika 5). SOD2 koristi mangan (Mn) (Slika 6). SOD1 je prisutna u

citoplazmi, jezgri i lizosomima, SOD2 u matriksu mitohondrija, a SOD3 u izvanstaničnim

tekućinama (plazma, limfa, ascites i cerebrospinalna tekućina). SOD1 i SOD2 nalaze se u

različitim stanicama dok se SOD3 nalazi samo u nekoliko vrsta stanica (alveolarne stanice tip II,

stanice proksimalnom bubrežnog kanalića, vaskularne glatke mišićne stanice, alveolarni

markofagi i fibroblasti) (Zelko i sur, 2002).

a) b)

Slika 5. a) Kristalna struktura SOD1 enzima s bakrom (narančasta kuglica) i cinkom kao

kofaktorom (siva kuglica); b) Struktura SOD3, tetramer s bakrom i cinkom kao kofaktorima

(narančaste i sive kuglice). Izvor: Cao i sur, 2008; Antonyuk i sur, 2009.

10

Slika 6. Aktivno mjesto SOD2, mangan kao kofaktor enzima. Izovr: Borgstahl i sur, 1996.

11

2.2.2 Katalaza (CAT)

Katalaza je antioskidativni hemoprotein koji katalizira redukciju dvije molekule H2O2 u H2O i

kisik kako bi smanjile visoku razinu peroksida u stanicama (Slika 7). Sastoji se od četiri hem

grupe (Putnam i sur, 2000). Pri većim koncentracijama peroksida aktivira se katalaza, važna je u

adaptaciji i preživljenju stanca u stanjima oksidativnog stresa (MatEs i sur, 1999). CAT ima

važnu ulogu u procesima upale, mutagenezi, sprječavanju apoptoze, poticanju rasta tumora, a u

mozgu je važan izvor acetaldehida (Putnam i sur, 2000).

Slika 7. Antioksidativni enzimi u reakcijama kataliziranja slobodnih kisikovih radikala. SOD –

superoksid dismutaza. Izvor: http://www.hindawi.com/journals/omcl/2011/467180.fig.001.jpg

12

Glutation peroksidaza

KatalazaSOD

2.2.3 Glutation peroksidaza (GPx)

GPx su selenoproteini koji su prisutni u svim eukariotskim stanicama (Slika 8). Kataliziraju

redukcije H2O2 ili organskih hidroperoksida u prisutnosti reduciranoga glutationa (GSSH).

Nastali GSSH u reakciji reducira glutation reduktaza uz NADPH kao donor elektrona natrag u

GSH koji je jako bitan neenzimatski antioksidans. Do sada je poznato šest izoenzima: citosolna

GPx (GPx1), gastrointestinalna (GPx2), plazmatska (GPx3), fosfolipid hidroksidna (GPx4), te

dva enzima čija funkcija nije u potpunosti razjašnjena (GPx5 i GPx6) (Jurkovič i sur, 2008).

Izoenzimi se razlikuju po strukturi i raspodjeli u različitim tkivima. GPx1 se nalazi u

eritrocitima, ali i stanicama jetre i bubrega. GPx2 antioksidativni enzim u gastrointestinalnom

sustavu, štiti od toksičnog djelovanja lipidnih peroksida unesenih hranom. GPx3 luče različita

tkiva u izvanstaničnu tekućinu. GPx3 je najprije otkriven u plazmi no njegova mRNA je nađena

u epitelnim stanicama proksimalnih tubula bubrega. Bolesnici s bubrežnim bolestima imali su

vrlo malu aktivnost GPx3, uključujući i bolesnike podvrgnute dijalizi (Avissar i sur, 1996;

Whitin i sur, 1998). GPx4 reducira lipidne perokside u lipoproteine i tako sprječava lipidnu

peroksidaciju. Posebno su eksprimirani u brzodiferencirajućim stanicama, spermalnim i

embrionalnim (Brown i Arthur, 2001).

Slika 8. Kristalna struktura glutation peroksidaze (GPx). Izvor: Epp i sur, 1983.

13

2.2.4 Biotransformacijski sustav jetre

Jetra je visceralni organ čija građa omogućuje obradu i protok velike količine krvi. Budući da

kroz jetru prolazi krv sa apsorbiranim tvarima iz probavnog sustava, uključujući i oralno uzete

lijekove i dodatke prehrani, ona je prvi organ „na udaru“ potencijalno štetnih tvari. Prilikom

protoka krvi kroz sinusoide, Kupfferove stanice, kao dio retikuloendotelnog sustava,

fagocitozom uklanjaju patogene mikroorganizme, dok hepatociti imaju glavnu ulogu u

metaboliziranju tvari iz probavnog sustava. Funkcije jetre su: proizvodnja proteina krvne plazme,

sinteza, metaboliziranje i pohrana masti i kolesterola, metaboliziranje i pohrana ugljikohidrata,

stvaranje i sekrecija žuči, metaboliziranje (detoksifikacija) i sekrecija nepotrebnih i štetnih

endogenih i egzogenih kemijskih spojeva.

Metabolizam tvari u jetri prolazi kroz dvije faze. U prvoj fazi sudjeluju citokromski enzimi i

necitokromski enzimi za hidrolizu, redukciju i oksidaciju. Citokromski enzimi su grupa enzima

smještenih u endoplazmatskom retikulumu jetrenih stanica i pripadaju obitelji citokrom P450

enzima (CYP 450). Ovaj enzimski sustav se naziva citokrom P450, zbog osobine da u

reduciranom stanju apsorbira svjetlost valne dužine od 450 nm. Da bi imali katalitičku aktivnost

neprestano se opskrbljuju elektronima od NADPH oksidoreduktaze (Smith i sur, 1994). Po građi

su hemoproteini s oksidaznom funkcijom. Postoje različiti CYP enzimi od kojih neki

metaboliziraju samo jednu vrstu supstrata, dok drugi mogu imati više različitih endogenih ili

egzogenih supstrata. U jetri su najzastupljeniji CYP3A4, CYP2C, CYP1A2, CYP2E1. Pokazano

je i da povećana aktivnost ovih enzima može uzrokovati proizvodnju reaktivnih kisikovih

radikala te time dovesti do oksidacijskog stesa i stanične smrti. CYP2E1 je jedan od najaktivnijih

CYP enzima u stvaranju slobodnih radikala (Gonzales, 2005). Jetra sadrži niz antioksidativnih

enzima, citosolnu superoksid dismutazu (SOD1, Cu/Zn-SOD), mitohindrijsku SOD (SOD2, Mn-

SOD) i katalazu (Barja de Quiroga i sur, 1990; Weydert i Cullen, 2010). Također sadrži i enzime

vezane za sintezu i transformaciju glutationa (GSH), glutation peroksidazu (GPx) i glutation

reduktazu (GR) koji su odgovorni za detoksifikaciju ROS-a i održavanje homeostaze glutationa

(Zhu i sur, 2006).

Druga faza metabolizma ksenobiotika temelji se na konjugaciji s glukuronskom kiselinom,

aminokiselinama i peptidima, aktiviranim sulfatom i octenom kiselinom i time se povećava

njihova topljivost i izlučivanje.

14

2.2.5 Antioksidativni sustav bubrega

Bubrezi su parni organi kroz koje protječe velika količina krvi (20% minutnog volumena krvi).

Krv se filtrira u nefronima, a produkt je oko 2 L urina dnevno. Zbog velikog protoka krvi,

bubrezi su pojačano izloženi toksičnim tvarima iz krvi i posljedično su vrlo osjetljivi na različite

korištene spojeve i lijekove. Nefroni su građeni od Malphigijevog tjelešca, proksimalnog i

distalnog kanalića, Henleove petlje te sabirnih cjevčica. Malphigijevo tjelešce smješteno je u

području kore bubrega, a građeno je od Bowmanove čahure i kapilarnog klupka (glomerula) koje

potječe iz aferentne arteriole. Iz glomerula filtracijom krvi nastaje primarna mokraća, prolazi

kroz dijelove srži - proksimalni kanalić, Henleovu petlju i distalni kanalić gdje se odvija

reapsorpcija svih bitnih sastojaka krvne plazme. Višak vode, iona, produkti metabolizma i

toksične tvari koje se trebaju izlučiti putuju dalje do sabirnih kanalića i bubrežne nakapnice te

kao sekundarna mokraća odlaze u mokraćni mjehur. Bubreg regulira acidobazni status, održava

koncentraciju elektrolita, volumen izvanstanične tekućine i krvni tlak. Endokrina funkcija se

sastoji od izlučivanja renina, angiotenzina i drugih hormona.

Neregulirana hipertenzija, stenoza bubrežnih arterija, neregulirani dijabetes, različiti lijekovi i

toksini mogu potaknuti oksidativni stres u bubrezima. Raznim istraživanjima već je dokazano

kako lokalizirani oksdativni stres ima glavnu ulogu u razvoju dijabetičke nefropatije (Forbes i

sur, 2008). Stenoza renalne arterije je česti uzrok sekundarne hipertenzije koji može dovesti i do

propadanje bubrežne funkcije i ishemijske nefropatije. Chade i sur (2002) pokazali su

povezanost hipoperfuzije, ateroskleroze i porasta ROS u bubregu sa stenozom.

Antibiotici su nefrotoksični lijekovi, induciraju oksidativni stres i inhibiraju antioksidativne

enzime (Ozbek i sur, 2009). Ovo sve pokazuje da su bubrezi jako osjetljivi na oštećenja

slobodnim radikalima koja su posljedica različitih bolesti, zračenja, antibiotika, alkohola, pušenja

i toksina.

U eksperimentalno izazvanom imunološki posredovanom glomerulonefritisu ROS se stvaraju

putem polimorfonuklearnih leukocita i monocita iz krvi i putem glomerularnih, mezangijskih

stanica. Stvoreni ROS dovode do morfoloških oštećenja i promjene glomerularne propusnosti za

proteine i smanjenja glomerularnog protoka krvi i glomerularne filtracije putem otpuštanja

vazokonstrikcijskih spojeva (prostaglandina, tromboksana i aktivirajućeg faktora trombocita), a

15

moguće i putem inaktivacije dušičnog oksida koji djeluje vazodilatatorno (Baud i Ardaillou,

1993).

2.2.6 Antioksidativni sustav slezene

Slezena ima vrlo važnu ulogu u održavanju homeostaze tjelesnih tekućina, te sudjeluje u važnim

imunološkim reakcijama i obrani organizma od patogena. Naziva se još i organ „čistač krvi“.

Prilikom prolaska krvi kroz usku mrežu kapilara stari i oštećeni eritrociti se odstranjuju aktivnom

fagocitozom makrofaga crvene pulpe koji onda u svojoj citoplazmi skladište ione željeza u

obliku hemosiderina i feritina. Oko 20% željeza u tijelu uskladišteno je u jetri, slezeni, sluznici

crijeva i koštanoj srži u obliku feritina (Cesta, 2006).

Željezo katalizira reakciju nastajanja hidroksilnih radikala iz H2O2, poznatu kao Fentonova

reakcija pri čemu se povećava oksidativni stres i koncentracija slobodnog željeza. Općenito,

aktivnost SOD i ostalih antioksidativnih enzima zbog toga je najveća u tkivima sa velikim

protokom krvi i potrošnjom kisika kao što su pluća, bubrezi, jetra i slezena (Đokić i Bilandžić,

2012).

Slezena je najveći periferni limfoidni organ koji sadrži oko četvrtinu ukupnog broja limfocita. Tu

funkciju ima histološka regija nazvana bijela pulpa. Grade ju limfociti, makrofagi, dendritične

stanice, plazma stanice, arteriole i kapilare koje čine mrežu sličnu onoj crvene pulpe, a tvore

nakupine u obliku čvorića ili Malpigijevih tjelešaca. Patogeni i strani antigeni koji dospiju

krvotokom u slezenu fagocitiraju stanice nespecifične imunosti, predočne stanice i makrofazi i

predočavaju ih drugim imunološkim stanicama (Cesta, 2006). Kao odgovor na patogeni

organizam granulociti izlučuju enzim mijeloperoksidazu koja katalizira reakciju u kojoj se stvara

značajna koncentracija hipoklorne kiseline (HOCl) i uništava patogeni organizam. Tijekom

fagocitoze odvija se tzv. respiratorni prasak karakteriziran povećanom potrošnjom kisika i

stvaranjem ROS za čije je stvaranje direktno odgovoran membranski sustav NADPH oksidaze

(van Eeden i sur, 1999).

16

2.2.7 Antioksidativni sustav mozga

Reaktivni oblici kisika imaju značajnu  ulogu  u nekim  patološkim  stanjima  središnjeg

živčanog sustava, bilo da direktno oštećuju tkiva bilo da je njihovo stvaranje posljedica

oštećenja  tkiva. Najčešće su prisutni hidroksilni radikal (OH-), superoksidni radikal (O2-) i dušik

monoksid (NO-).  Istraživanjima s genetskom eliminacijom pokazano je kako utišavanje CuZn SOD u miševa

dovodi do veće razine oštećenja neurona i njihove smrti. Eliminacija mitohondrijskog SOD-a je

pokazala drastičnije učinke, koji su letalni u neonatalnom razdoblju. Miševi bez ekspresije Mn-

SOD, uz zatajenje srca, pate od poremećaja u CNS-u poput mitohondrijske vakuolizacije i

oksidacije lipidnih zaliha. Miševi s niskim razinama glutation peroksidaze su osjetljiviji na

ishemiju i neurotoksine. Miševi deficijentni u transportnom proteinu vitamina E razvijaju

ataksiju i neurodegenerativne bolesti, dok je povećan unos vitamina E pokazao da usporava

progresiju Alzheimerove bolesti (Browne i sur, 1999).

Toksični faktori su i ioni metala bakra, cinka, željeza i aluminija. Održavanje   ravnoteže

metalnih  iona  značajno  je  za  prevenciju  oksidativnog stresa,  jer  sprječava  modifikaciju  proteina  i  smanjuje njihovu sklonost ka agregaciji (Zerovnik, 2010). Oksidativna fosforilacija u

mitohondrijima je glavni izvor ROS-a, tako da postoji jasna veza između poremećaja

mitohondrija i oksidativnog stresa kod neurodegenerativnih oboljenja. Međutim,  u  određenim  patološkim stanjima (npr. mutacije gena za antioksidativne enzime) obrambeni  mehanizmi  postaju  slabiji  ili  se  povećava proizvodnja  slobodnih  radikala  u  mitohondrijama  što

uzrokuje oksidativni stres. Kod Alzheimerove i Parkinsonove  bolesti  postoje dokazi o

poremećajima mitohondirija, metaboličkoj neravnoteži i oskidacijskom stresu (Halliwell, 2006). Kod  neurodegenerativnih oboljenja  povećano  je  oslobađanje  glutamata  i drugih  ekscitatornih  aminokiselina  koje  povećavaju količinu  unutarstaničnog  kalcija, koje prati

povećana aktivacija unutarstaničnih proteaza, fosfolipaza i endonukleaza i oštećenje stanične

membrane.  Poremećaj energetskog metabolizma i pojava promjena u mitohondrijima smanjuju

koncentraciju reduciranog glutationa (GSH) i slabe antioksidacijsku zaštitu.

Genetski inducirana povećana ekspresija Zn-SOD-a (cink SOD) djeluje zaštitno na mitohondrije

i stanice od oksidativnog stresa. Povećana ekspresija izvanstaničnog SOD-a ili glutation

17

peroksidaze pokazala je zaštitan učinak od raznih neurotoksina na CNS. Istraživanja na

mušicama i gujavicama pokazale su da povećana ekspresija SOD-a i katalaze značajno produžuje

njihov životni vijek (Ischiropoulos i Beckman, 2003).

Slobodne radikale mogu proizvesti sve stanice mozga, npr. NADPH oksidazu (enzim koji

katalizira produkciju superoksida kod fagocita) eksprimiraju mikroglija stanice, neuroni i

astroglija. Dva su moguća puta povećanja toksičnosti djelomično reduciranih kisikovih radikala.

Upalne stanice uvelike povećavaju toksičnost vodikovog peroksida lučenjem peroksida i

produkcijom hipoklorne kiseline i drugih hipohalogenih kiselina. Stanice mogu povećati

toksičnost superoksida produkcijom dušikovog monoksida, koji zajedno tvore peroksinitrite. U

prisutnosti ugljikovog dioksida, peroksinitrit modificira proteine u nitrotirozine. Doprinos

dušikovog monoksida neuralnim oštećenjima je pokazan uporabom inhibitora sintaze dušikovog

monoksida (NOS) na sojevima miševa deficijentnim za neuralnu izoformu NOS-a (nNOS).

Miševi deficijentni za nNOS imali su manju učestalost moždanog udara, veću otpornost na

neurotoksičnost N-metil-D-aspartatom i 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridinom. Uz nNOS,

istraživanja su pokazala i učinak iNOS (inducibilna forma NOS-a, primarno nađena u glija

stanicama) na neuralna oštećenja. Plakovi pacijenata oboljelih od multiple skleroze su pokazali

povećanu imunoreaktivnost na iNOS i nitrotirozin. Nitracija je povezana s kompromitiranjem

cjelovitosti krvno moždane barijere kod multiple skleroze. Kod životinjskih modela multiple

skleroze i moždanog udara, urična kiselina se pokazala inhibitorom nitracije tirozina i pokazala

je zaštitan učinak na krvno moždanu barijeru. Blokada aktivacije iNOS pokazala je

neuroprotektivan učinak kod Parkinsonove i Alzheimerove bolesti. Aktivacija mikroglija stanica

(koja dovodi do formiranja peroksinitrita) je povezana s neurotoksičnosti uzrokovanom Aβ

peptidom (Ischiropoulos i Beckman, 2003).

2.2.8 Antioksidativni sustav krvnih stanica i plazme

Eritrociti. Eritrociti su zrele crvene krvne stanice koje dominiraju u krvi, prilagođene su

prijenosu kisika i ugljičnog dioksida. Energiju u obliku ATP priskrbljuju anaerbonom

glikolizacijom gdje se stvara NADH i pentoza ciklusom NADPH koji su nužni za redukciju

methemoglobina i oksidiranog glutationa (Di Simplicio i sur, 1998; Sivilotti, 2004).

Deoksigenirani hemoglobin (methemoglobin i nitrozohemoglobin) ima važnu ulogu u

18

oksidativnim procesima u eritrocitu. ROS i RNS koji se stvaraju u eritrocitima inaktiviraju se

antioksidativnim enzimima i neenzimatskim antioksidansima. Antioksidativni sustav održava

methemoglobin u ravnoteži, u koncentracijama do 1,8% od ukupnog hemoglobina. U stanju

oksidativnog stresa koncentracija methemoglobina se poveća nekoliko puta (Arbos i sur, 2008).

Enzimi koji djeluju antioksidativno su: 3 vrste reduktaza koje reduciraju trovalentno Fe

methemoglobina (Hultquist i sur, 1993), CuZn – SOD katalizira dismutaciju superoksid aniona

u H2O2 i kisik (Concetti i sur, 1976), katalza stvara od H2O2 vodu i kisik (Gaetani i sur, 1996).

Hemoglobin djeluje kao neenzimatski antioksidans (Gabbianelli i sur, 1998). Glutation također

ima važnu antioksidativnu ulogu u eritrocitima (Di Simplicio i sur, 1998; Wu i sur, 2004).

Trombociti. Promjene u redoks sustavu događaju se tijekom normalne stimulacije trombocita.

Agregacija je povezana s velikom potrošnjom kisika (Bressler i sur, 1979) i povećanjem

glutation disulfida (Burch i Services, 1990). ROS mijenjaju odgovor trombocita na različite

agoniste (Freedman i sur, 2000). Trombocitni agonisti (kolagen i ADP) potiču proizvodnju O2−

pomoću NADPH oksidaze i otpuštanje arahidonske kiseline pomoću PLA2. Pomoću dismutaze

nastaje H2O2 i OH-. Uz arahidonsku kiselinu i OH- nastaju peroksidni radikali koji mogu

aktivirati ciklooksigenazu (Violi i Pignateli, 2012). Niska koncentracija peroksida inhibira

trombocitnu funkciju, tako neutralizatori ROS-a i inhibitori O2-, kao što je katalaza, inhibiraju

aktivaciju trombocita (Stuart i Holmsen, 1977; Pignatelli i sur, 2011). Trombociti imaju brojne

antioksidativne mehanizme od kojih značajnu ulogu ima SOD. CuZn SOD i u manjoj mjeri

MnSOD (Meng i sur, 1995). Ti enzimi imaju ulogu u normalnoj funkciji trombocita i prevenciji

trombotskih patoloških stanja. Smanjenje antioksidativnih mehanizama povezano je s pojačanom

aktivacijom trombocita (Johnson i sur, 1975). Smanjenje glutationa u trombocitima dovodi do

pojačanja lipidne peroksidacije (Vericel i sur, 1992).

Plazma. U plazmi cirkuliraju važni endogeni antioksidansi od kojih su najbitniji askorbat

(Bendich i sur, 1986), urati (Ames i sur, 1981) i albumini (Halliwell,1988). Uz antioksidativne

molekule bitni su i enzimi antioksidativnog sustava u plazmi, izvanstanična superoksid

dismutaza (EC SOD) (Karlsson i Marklund, 1987; Landis i Tower, 2005) i GPx, te proteini

prenosnici metala transferin i ceruloplazmin (Aruoma i Halliwell, 1987).

19

2.3 Regulacija biljnih pripravaka na tržištu

Europska direktiva o tradicionalnim medicinskim biljnim pripravcima, ranije prozvana Direktiva

2004/24/EC o tradicionalnim biljnim pripravcima, Direktiva 2001/83/EC o zajedničkom

obilježju medicinskih proizvoda za ljudsku upotrebu, osnovana je u Europskom vijeću 31. 3.

2004. kako bi definirali procese odobrenja biljnih lijekova u Europskoj Uniji (Directive

2004/24/EC, 2004). Ranije nije postojala službena autorizacijska procedura već je svaka država

donosila odluke na nacionalnoj razini (MHRA, 2012 – Unlicensed herbal remedies).

Prema ovoj regulativi, svi medicinski biljni pripravci moraju imati autorizaciju za tržište u EU.

Jedni biljni lijekovi izuzeti od odredbe Direktive su neregistrirani pripravci koje bolesnik koristi

po preporuci homeopata.

Biljni lijekovi moraju se proizvoditi po pravilima Dobre proizvođačke prakse (engl. Good

Manufacturing Practice, GMP) kako bi se osigurala kvaliteta i sigurnost završnog proizvoda

(MHRA, 2012 – Tradicional Herbal Medicines Registration).

Po Direktivi biljni lijek mora biti korišten u EU najmanje 30 godina ili se učinkovitost temelji na

znanstvenim istraživanjima.

Za razliku od biljnih lijkova, biljni pripravci kao dodaci prehrani dospiju na tržište bez prethodne

kontrole od strane države i njihova registracija podliježe Pravilniku o dodacima prehrani koji je u

skladu s  Europskom direktivom o dodacima prehrani (Directive 2002/46/EC). Za određene

biljne dodatke prehrani potrebna je ocjena Povjerenstva kojeg imenuje ministarstvo nadležno za

zdravlje. U tu skupinu prema Pravilniku spadaju i pripravci s ekstraktom biljke Ginkgo biloba.

Povjerenstvo može na temelju općeprihvaćenih znanstvenih i stručnih podataka o pripravcima s

biljnim vrstama koje se ne nalaze u Priloga III. Pravilnika o dodacima prehrani donijeti oduku o

dodjeli notifikacijskog broja za stavljanje proizvoda na tržište. Isto tako prema određenom

znanstvenim spoznajama riješenje o notifikaciji se može i mijenjati (NN 46/11 i 41/13).

20

2.3.1 Stanje na tržištu pripravaka koji sadrže ekstrakt ginka

Jedna od najpopularnijih biljaka koja se koristi u medicinske svrhe u EU je list ginka (Reuter,

1996; Schulz i sur, 1996; Loew i sur, 1999). Smatra se da je ginko u EU poznat od davnina, ali je

njegova primjena ponovno povećana u 18.st. kada je povećan uvoz ginka iz Istočne Azije gdje se

list ginka tradicionalno koristio kao lijek za bronhijalnu astmu i cijeljene rana. Postoje brojni

podaci i istraživanja kvalitete, učinkovitosti i sigurnosti standardiziranih pripravaka ginka,

poznatih koncentracija aktivnih tvari. Međutim, nema dovoljno podataka o pripravcima ginka u

kombinaciji s drugim biljkama koje sadrže aktivne komponente, tj. njihove nuspojave. Obzirom

da se biljni pripravak ili dodatak prehrani ne kontrolira od strane liječnika, česta je pojava

zajedničkog korištenja pripravaka koji sadrže ekstrakt biljke Ginkgo biloba, dostupnih na tržištu

i klasičnih lijekova kao što su acetilsalicilna kiselina i inhibitori vitamina K. Upravo te pojave

nameću postavljanje znanstvenih istraživanja o učincima istovremenog korištenja tih sastojaka

na metabolizam čovjeka kao i posljedice na liječenje pojedinih tegoba, odnosno na zdravlje ljudi.

2.4 Ginko

Ginkgo biloba je član porodice Ginkgophyta, trenutno jedni živući član te porodice. Istraživanja

ukazuju na postojanje ove biljke unatrag 250 milijuna godina (Glimn-Lacy i sur, 2006). Ekstrakt

biljke Ginkgo biloba se u današnje vrijeme najčešće koristi u liječenju demencije i za

poboljšanje memorije, u liječenju cerebrovaskularne i arterijske insuficijencije, tinitusa, vertiga,

astme, alergija i nekih drugih zdravstvenih poremećaja.

Pripravak ginka preporuča se u dozama od 120 mg 2x dnevno do maksimalne doze 240 mg

dnevno. Generalno mišljenje je da se pripravci ginka dobro podnose (Klepser i Klepser, 1999;

Diamond i Bailey, 2013) iako je zabilježeno niz neželjenih nuspojava: glavobolje, vrtoglavica,

krvarenje i gastrointestinalne smetnje (Sierpina i sur, 2003; Ulbricht i sur, 2008; Diamond i

Bailey, 2013). Pripravak biljke Ginkgo biloba četvrti je najprodavaniji biljni pripravak koji se

koristi u svrhu liječenja u SAD-u.

21

2.4.1 Aktivni spojevi u ekstraktu ginka

Glavni sastojci ginka su flavonidi, terpenoidi i proantocianidi (He i sur, 2008). Glavnu frakciju

flavonoida čine kvercetin, kemferol, izorhamnetin i njihovi glikozidi. Ovi glavni sastojci

odgovorni su za farmakološku učinkovitost same biljke Ginkgo biloba.

Polifenoli su biljni kemijski spojevi koje karakterizira fenolna jedinica. Produkti su sekundarnog

metabolizma biljaka i dijele se na tanine, lignane i flavonoide. Fenolni spojevi imaju sposobnost

bioaktivnosti, a između ostalog odgovorni su za kemopreventivno djelovanje (antioksidacijsko,

antikancerogeno, antimutageno i protuupalno). Ima preko 8000 strukturnih varijanti ovih

spojeva, a općenito se kategoriziraju kao fenolne kiseline i analozi, tanini, flavonoidi, stilbeni,

kurkumonoidi, kumarini, lignani, kinoni i ostali, ovisno o broju aromatskih prstenova i

strukturnih elemenata koji povezuju te prstene (Huang i sur, 2010).

Ekstrakt biljke Ginkgo biloba (EGb 761) je kompleksna mješavina različitih kemijskih spojeva

od kojih 25% čine flavonoidi. Najzastupljeniji su kemferol, kvercetin, izorhamnetin i

proantocijanidi. Uz njih nalazimo i heterozide terpena (ginkgolidi, bilobalidi) te neke organske

kiseline (Ebadi, 2002). Ovisno o procesu proizvodnje ekstrakta, kvaliteta i kvantiteta pripravka

jako varira (Kressmann i sur, 2002; Ude i sur, 2013). Flavonoidi, kvercetin i kemferol

hidrolizirani su u crijevima u aglikone, a terpeni se apsorbiraju nepromjenjeni (Fourtillan i sur,

1995; Rangel-Ordóñez i sur, 2010).

2.4.1.1 Flavonoidi prisutni u ekstraktu ginka

Flavonoidi su polifenolni spojevi koji se nalaze u različitim biljkama pa tako i u biljci Ginkgo

biloba. Flavonoidi se dijele na flavone, flavonole, flavanole, izoflavone i antocijane. Osnovnu

kemijsku strukturu favonoida čini 15 ugljikovih atoma povezanih u tri prstena. Razlike među

flavonoidima rezultat su različitih kemijskih reakcija: hidrogenacije, hidroksilacije, O-metilacije

hidroksilnih grupa, dimerizacije, vezanja neorganskog sulfata i glikolizacije hidroksilnih grupa

(O-glikozidi) ili flavonoidne jezgre (C-glikozidi) (Swain i sur, 1979).

Najrašireniji flavonoli u ginku su kvercetin, kemferol i izorhamnetin. Flavanoni i flavoni često se

nalaze zajedno u različitim biljkama, dok su antocijanini odsutni u biljkama bogatim

flavononima (Kazazić, 2004). Flavanoli se mogu naći u obliku monomera kao katehini i

22

polimera kao proantocijanidini. Izoflavoni su flavonoidi strukturno slični estrogenima.

Zahvaljujući ovoj sličnosti, izoflavoni se vežu za estrogenske receptore (Manach i sur, 2008).

Tanini su fenolni polimeri, a mogu biti hidrolizabilni i kondenzirani.

Kvercetin je flavon kemijske formule C15H10O7, prisutan u različitim zelenim biljkama (Slika 9).

Kao flavonoid ima različita farmakološka svojstva i učinke na organizam: opuštanje glatkih

mišića, protuupalno djelovanje i diuretsko, slično kao i inhibitori cAMP (ciklički adenozin

monofosfat) fosfodiesteraze (Beretz i sur, 1978). Kvercetin također inhibira aktivnost brojnih

enzima: alkoholnu dehidrogenazu, aldehid reduktazu, lipooksigenazu, kazein kinazu, protein

kinazu C, tirozin kinaze I, II, IIA, IIB i III i piruvat kinazu (Zollner, 1993).

Objavljeno je da kvercetin ima estrogensku aktivnost tako što aktivira estrogenske receptore, alfa

(ERα) i beta (ERβ) (Moutsatsou, 2007). Iako se kvercetin koristio u kliničkim istraživanjima

različitih oboljenja (Gross, 2009; Miles i sur, 2014), do sada nije dokazan niti objašnjen utjecaj

na popravak DNA, jetru, bubrege, neurološki i kardiovaskularni sustav (EFSA, 2011).

Slika 9. Struktura kvercetina.

Kemferol je prirodni flavonol, vrsta flavonoida, koji se nalazi u različitim biljkama, kemijske

formule C15H10O6 (Slika 10). Spoj je topiv u etanolu, eteru i DMSO (dimetil sulfoksid), a slabo u

vodi. Djeluje kao antioksidans.

23

Kemferol se primjenjuje kao glikozid, apsorbira se u tankom crijevu difuzijom. U crijevima se

metabolizira u glukuronide i sulfokonjugate pomoću crijevnih enzima. Također ga može

metabolizirati i crijevna flora koja hidrolizira glikozide do aglikana ili jednostavnih fenolnih

spojeva. U jetri se konjugira u glukurono i sulfo – kemferol. Ovako obrađeni, izlučuju se

bubrezima. U plazmi su prisutni u nanomolarnim koncentracijama (Calderon-Montaño i sur,

2011).

Istraživanjima na ljudima pokazano je da hrana bogata flavonoidima smanjuje rizik od koronarne

bolesti. Pokazano je i da kemferol ima zaštitni utjecaj na smrt stanica miokarda kod stanja

nedostatne perfuzije (Khalil i Sulaiman, 2010). Kemferol djeluje i kao antioksidans. U niskim

koncentracijama hvata slobodne kisikove radikale, a u visokim koncentracijama djeluje na

aktivnost antioksidativnih enzima kao što su superoksid dismutaza (SOD), katalaza i

hemoksigenaza – 1 (HO-1). Također može spriječiti lipidnu peroksidaciju i tako djelovati

protektivno u aterosklerozi (Calderon-Montaño i sur, 2011).

Slika 10. Struktura kemferola.

Izorhamnetin je flavonoid koji se prirodno nalazi u biljkama, ali je i metabolit kvercetina.

Strukturno je metilirani kvercetin kemijske formule C16H12O7 (Slika 11). Do sada je pokazano da

je antioksidant i da inhibira ksantin oksidazu (Nagao i sur, 1999). Pokazano je da izorhamnetin

24

inducira ekspresiju neurofilamenata tako što potiče aktivnost živčanog faktora rasta (engl. Nerve

Growth Factor, NGF) (Xu i sur, 2012).

Slika 11. Struktura izorhamnetina.

Proantocijanidini su flavonoidi kemijske formule C31H28O12 (Slika 12). Kao i ostali flavonoidi

imaju antioksidativna svojstva. Tri glavna mehanizma antioksidativnog djelovanja su hvatanje

slobodnih radikala, kelacija metala i inhibicija enzima (Cos i sur, 2004).

Slika 12. Struktura proantocijanidina.

25

2.4.1.2 Terpeni prisutni u ekstraktu ginka

Terpeni su hlapljivi nezasićeni ugljikovodici ugodna mirisa. Dijele se prema broju izoprenskih

jedinica na mono (dvije), seskvi (tri) i diterpene (četiri). Znanstveno su i tehnički vrlo važni, jer

su sastojci većine prirodnih i umjetnih mirisnih tvari, a mnogi su važni i u medicini (npr.

borneol, geraniol, kamfor, linalol, mentol, limonen, pinen), te se uvelike rabe u parfemima, te

kao dodaci hrani (začini) (HE, 2008).

Bilobalidi su seskviterpeni prisutni u biljci Ginkgo biloba, kemijske formule C15H18O8 (Slika 13)

(van Beek i Montoro, 2009). Odgovoran je za različite učinke ginka (De Feudis, 2002; Kiewert i

sur, 2008). Inducira enzime CYP3A1 i 1A2 koji su odgovorni za međureakciju između ginka i

drugih biljnih ili konvencionalnih lijekova (Deng i sur, 2008). Pokazano je da djeluje i na GABA

receptore (Kiewert i sur, 2008).

Slika 13. Struktura bilobalida.

26

Ginkolidi su biološki aktivni terpenski laktoni prisutni u ginku. Spadaju u diterpenoide s 20

ugljikovih atoma u skeletu (Slika 14) (Andersen i sur, 2010).

Ginkolid A, B i C izolirani su iz ginka 1967. godine (Maruyama, 1967), kemijske formule

C20H24O9, C20H24O10 i C20H24O11. Istraživanja su pokazala da postoji značajna promjena u mRNA i

ekspresije proteina NADPH oksidaze, koja je odgovorna za stvaranje slobodnih kisikovih

radikala u neuronima, odnosno da ginkolid B smanjuje ekspresiju i aktivnost NADPH oksidaze.

Na taj način etanolom uzrokovana neurotoksičnost može biti ublažena GB (Zhang i sur, 2011).

Ginkolid B inhibira ekspresiju trombocitnog faktora 4 (PF4) i CD40L (CD40 molekula koja se

veže na receptor na površini trombocita) na aktiviranim trombocitima. Djelomično smanjuje

otpuštanje ATP-a i Ca2+. Mogući mehanizam je inhibicija Syk i p38 MAPK signalnih puteva u

stanici (Liu i sur, 2014).

Ginkolid C (GC) može povećati unutarstaničnu proizvodnju cAMP i cGMP, te aktivnost MMP-

9, inhibirati unutarstaničnu pokretljivost i nakupljanje Ca2+ i proizvodnju tromboksana A2.

Rezultat je inhibicija agregacije trombocita (Cho i sur, 2007).

a) b)

c)

Slika 14. Struktura ginkolida a) Ginkolid A, b) Ginkolid B, c) Ginkolid C.

27

2.4.2 Metabolizam ginka i aktivnih spojeva iz ginka

Oralna bioraspoloživost terpena iz ginka, ginkgolid A i B, te bilobalida je 98 - 100%, 79 - 93% i

70%. Absorpcija se odvija u tankom crijevu. Poluvrijeme ginkgolida A i B i bilobalida je 4,5;

10,6 i 3,2 h. Maksimalna koncentracija u plazmi postiže se za 2 - 3 h. Oko 70% ginkgolida A,

50% ginkgolida B i 30% bilobalida izlučuje se nepromijenjeno u urinu (Pietta i sur, 1997).

Kvercetin i kemferol se izlučuju urinom uglavnom kao glukuronidi (Wang i sur, 2003). Glavni

metaboliti ova dva flavonoida su 4-hidroksibenzoati, hipurinska kiselina, 4-hidroksihipurinska

kiselina, 3-metoksi-4-hidroksihipurinska kiselina, 3,4-dihidroksibenzoinska kiselina, vanilinska

kiselina (Biber, 2003).

2.4.3 Utjecaj ginka na primarnu hemostazu

Pripravak ginka sadrži aktivne tvari koje imaju utjecaj na hemostazu (Boullata i Nace, 2000).

Nekoliko preglednih članaka (Ang-Lee i sur, 2001; Ernst, 2002) opisali su povećan rizik od

krvarenja kod uzimanja preparata ginka. Pripravak ginka u kombinaciji s tiklopidinom

(antiagregacijski lijek) u odnosu na sam tiklopidin pokazao je veću učinkovitost kod miševa u

zaštiti od tromboembolijskih zbivanja (Kim i sur, 1998).

Ranija istraživanja navode moguće mehanizme utjecaja na hemostazu preko međudjelovanja s

trombocitnim faktorom 4 (PF4) i kolagenom što dovodi do poremećaja u agregaciji trombocita

(Chung i sur, 1987; Kudolo i sur, 2002). Istraživanja ukazuju da aktivne tvari iz ginka inhibiraju

agregaciju trombocita povećanjem koncentracije endotelnih trombolitika, kao što su dušični

oksid (NO) i prostaciklini (Diamond i sur, 2000; Lesk i sur, 2008).

Ginkgolid B također direktno inhibira vezanje trombocitnog faktora 4 (PF4) za receptore na

trombocitnoj membrani (Chung i sur, 1987). Drugi istraživači smatraju da ginko primarno utječe

na međureakciju između trombocita i kolagena, a ne na faktor aktivacije trombocita (Kudolo i

sur, 2002). Cho i Nam (2007) u istraživanju su utvrdili da ginko djeluje inhibitorno na agregaciju

trombocita preko ginkgolida B (GB). Utvrdili su da različite koncentracije GB značajno

smanjuju agregaciju trombocita stimuliranu kolagenom, uz to djelovanje potiču aktivaciju

metaloproteinaze-9 (MMP-9) koja inhibira agregaciju trombocita stimuliranu kolagenom.

Također su utvrdili da GB direktno djeluje na aktivnost adenilat ciklaza i cAMP-ovisne

28

fosfodiesteraze (PDE) kao i gvanilat ciklaza i cGMP ovisne PDE. Povećana razina cAMP i

cGMP posredno dovode do aktivacije enzima protein kinaze A i protein kinaze G koji

fosforiliraju svoje ciljne proteine što dovodi do negativne regulacije agregacije trombocita.

2.4.4 Utjecaj ginka na koagulaciju

Opisano je da ginko, ali ne i sam kvercetin, povećavaju ekspresiju trombomodulina na endotelu

umbilikalne vene ovisno o dozi i vremenu korištenja pripravka. Suprimira formiranje trombina

povećanjem ekspresije trombomodulina. Trombomodulin - protein C je glavni antitrombotski

kompleks na endotelnim stanicama (Esmon i Fukudome, 1995). Višak trombina u

međudjelovanju s trombomodulinom katalizira aktivaciju proteina C. Aktivirani protein C s

proteinom S na endotelu ili trombocitima proteolitički inaktivira kofaktor Va (aktivirani faktor

pet), važan koagulacijski faktor. Kad se trombin veže na trombomodulin postaje inaktivan, ne

stvara fibrinski ugrušak, niti aktivira trombocite.

Inkubacija stanica s ginkom i kvercetinom u staničnoj kulturi povećava sekreciju t-PA (tkivnog

aktivatora plazminogena) i utječe na fibrinolizu (Lan i Zheng, 2006).

2.4.5 Fiziološki i antioksidativni učinci pripravaka ginka na organizam

Precizni mehanizmi djelovanja ekstrakta biljke Ginkgo biloba još nisu u potpunosti razjašnjeni.

Vjeruje se da pripravak ginka poboljšava cerebralni i periferni krvotok preko vazodilatacije

inducirane dušikovim oksidom (NO). Uz vazodilatacijska svojstva opisana su i antioksidativna

svojstva koja sprječavaju stanična oštećenja, te antihemostatska svojstva inhibicijom aktivacije

trombocita tako što djeluje na faktor aktivacije trombocita (Bent i sur, 2005). Također su opisani

i drugi farmakološki učinci: utjecaj na propusnost stanične membrane i inhibicija sinteze

glukokortikoida (Diamond i Bailey, 2013; Pereira i sur, 2013).

Ekstrakt lista ginka može vezati kisikove radikale poput hidroksilnih radikala, peroksidne

radikale, superoksidne anione, NO-, vodikov peroksid i željezne ione (Mahady, 2002; De Feudis

i sur, 2003). Također može pojačati aktivnost antioksidativnih enzima poput superoksid

dismutaze, glutation peroksidaze, katalaze i hem-oksigenaze-1 i tako indirektno djelovati kao

antioksidans (Song i sur, 2000; De Feudis i sur, 2003). Pojedina istraživanja pokazala su da

29

pripravci ginka povećavaju i ekspresiju mitohondrijskih enzima (NADH dehidrogenaze)

(Janssens i sur, 1995; Tendi i sur, 2002). Flavonoidi iz ginka inhibiraju enzim ciklookigenaza 2

(COX2) koji je bitan u sintezi prostaglandina, a terpenoidi povećavaju aktivnost antioksidativnih

enzima (SOD-a i katalaze). Proantocijanidini, koji su također prisutni u ekstraktu biljke ginka,

vežući se na proteine mogu inaktivirati ezime kao što su katalaza, glutation peroskidaza i laktat

dehidrogenaza te tako smanjiti antioksidativni učinak (Pietri i sur, 1997).

Ekstrakt ginka EGb 761 štiti stanice hipokampusa od toksičnosti inducirane dušičnim oksidom

(NO). NO je glasnička molekula u neuronima čija prekomijerna proizvodnja može dovesti do

pojave neurotoksičnosti. Proizvodnja superoksidnih aniona jedan je od glavnih faktora

uključenih u NO toksičnost, zbog njegovog međudjelovanja s NO i stvaranja izrazito toksičnog

slobodnog radikala peroksinitrita. Ključna značajka superoksidnog aniona u NO-povezanim

inzultima je pokazana rezultatima istraživanja u kojem su transgenični miševi s prekomjernom

ekspresijom SOD-a otporni na moždanu ishemiju. Vezanje superoksidnog aniona od strane EGb

761 djelomično može razjasniti njegovu sposobnost sprječavanja stanične smrti i smanjenje

porasta akumulacije reaktivnih kisikovih radikala. EGb 761 također može direktno vezati

peroksinitrite i time inhibirati lipidnu peroksidaciju, što se može razjasniti njegovom

sposobnošću da blokira citotoksičnost induciranu peroksinitritom kao i njegovom inhibitornom

djelovanju na peroksidaciju induciranu ciklosporinom-A (Ebadi, 2002). Također se smatra da je

jedno od neuroprotektivnih djelovanja Ginkga bilobe povezano sa inhibitornim djelovanje EGb

761 na monoamin oksidaze (MAO) koje kataliziraju oksidaciju monoamina u mitohondrijima

stanica mozga (Ebadi, 2002). Suprotno tome Fowler i sur (2000) dokazali su da primjena EGb

761 nije dovela do značajnijih promjena u aktivnosti MAO A i MAO B u mozgu što ukazuje na

to da je drugi mehanizam odgovoran za neuroprotektivno djelovanje ginka, a ne inhibicija MAO.

30

2.4.6 Učinak pripravaka biljke Ginkgo biloba na endotel

Arginaza je u organizmu prisutna u 2 izoforme, I i II. Arginaza I je jetreni oblik, II se nalazi u

različitim tkivima smještena u mitohondrijima. Oba oblika kataliziraju reakciju hidrolize L-

arginina u L-ornitin i ureu, završni korak urea ciklusa (Brandes, 2006). Iako arginaza I može

doprinijeti endotelnoj disfunkciji kod starenja i dijabetesu kod štakora (Ming i sur, 2004;

Romero i sur, 2008), kultura ljudskih endotelnih stanica ne eksprimira ovaj oblik arginaze, već je

u patologiju endotelne disfunkcije obično uključena arginaza II (Ryoo i sur, 2008).

Obzirom da arginaza II ima zajednički supstrat s enzimom eNOS, aktivnost jednog enzima tako

utječe na aktivnost drugog. Pojačana aktivnost arginaze II i potrošnja L-arginina može dovesti do

smanjene proizvodnje NO i pojačane proizvodnje superoksidnih aniona (Ryoo i sur, 2006,

2008). Inhibitori arginaze imaju nespecifičan antioksidativni učinak (Ryoo i sur, 2008).

Ne postoje dosadašnja istraživanja o utjecaju sastojaka ginka i biljnih pripravaka s ginkom na

aktivnost arginaze II u endotelu aorte, tj. njihov mogući inhibitorni učinak i na taj način

neposredno antioksidativni učinak.

Dušični oksid (NO) proizveden pomoću endotelne NO sintetaze (eNOS) u endotelu ima važnu

ulogu u regulaciji tonusa krvnih žila, stanične proliferacije, leukocitne adhezije i trombocitne

agregacije (Förstermann i Münzel, 2006). Zbog toga je funkcionalna eNOS nužna za zdrav

kardiovaskularni sustav.

eNOS je dimer koji se sastoji od dva identična monomera s reduktaza domenom koja ima vezno

mjesto za NADPH, flavin mononukleotid (FMN), flavin adenin dinukleotid (FAD) i oksidaza

domenom s veznim mjestom za hem grupu, cink i kofaktor tetrahidrobipterin (BH4) i L-arginin

(Qian i Fulton, 2013). U endotelu NO se sintetizira pomoću eNOS iz L-arginina i molekularnog

kisika (Fleming i Busse, 1999). Vezanje kofaktora BH4 nužno je za funkciju eNOS u stvaranju

NO (Dudzinski i sur, 2006). U nedostatku ovog kofaktora eNOS postaje monomer (Maron i

Michel, 2012). U takvoj formi ne sintetizira NO već superoksid anione, slobodne radikale (Luo i

sur, 2014).  

31

Ginko i kvercetin (favonoid koji se nalazi u ginku) mogu pojačati i koncentraciju iona kalcija

(Ca2+) u kulturi endotelnih stanica štakora i aktivirati sintezu dušikovog oksida (Kubota i sur,

2001).

EGb 761 kao standardiziran ekstrakt ginka in vitro cijepa NO (Marcocci i sur, 1994). Nedavno

istraživanje pokazalo je da bilobalid kao sastavna tvar ginka ima neuroprotektivni učinak.

Pokazano je da povećava aktivnost SOD i koncentraciju GSH, a snižava aktivnost NOS i MDA

(Li i sur, 2013).

2.4.7 Učinak pripravka biljke ginkgo biloba na citokrom P450 sustav

Utvrđeno je da EGb 761 znatno inhibira glavne ljudske citokrom P450 enzime CYP2C9,

CYP1A2, CYP2E1 i CYP3A4 (Samuels, 2005). Umegaki i sur (2007) pokazali su da pripravak

ginka inducira enzime CYP 1A1, CYP 1A2, CYP 2B, CYP 2C9, CYP 2E1 i CYP 3A u jetri

miševa nakon oralne primjene ginka. Glavna inducibilna komponenta je biolobalid. Nedavna

istraživanja su potvrdila da je bilobalid odgovoran za indukciju CYP enzima (Taki i sur, 2012).

Pripravak ginka ima značajan utjecaj na jetreni biotransformacijski sustav kod štakora. Značajan

porast vidljiv je kod aktivnosti GSH-transferaze te enzima CYP1A1, CYP1A2, CYP2B,

CYP2C9, CYP2E1 i CYP 3A4 (Sugiyama i sur, 2004). Također je zapažen i porast težine jetre.

Nakon prekida primjene pripravka došlo je do normalizacije težine i aktivnosti enzima. Kod ljudi

su zabilježeni kontradiktorni podaci o utjecaju na biotransformacijske enzime (Hellum i sur,

2007). Pokazali su da pripravak ginka i inducira i inhibira CYP1A2 i 2D6 u hepatocitima. In

vivo istraživanja pokazala su da kod ljudi ne dolazi do promjene u aktivnosti enzima jetre (Duche

i sur, 1989).

32

2.5 Antihemostatski lijekovi

2.5.1 Acetilsalicilna kiselina

Acetilsalicilna kiselina, poznata pod nazivom aspirin, je nesteroidni protuupalni lijek koji se

koristi ovisno o dozi kao analgetik i antipiretik ili kod kardiovaskularnih oboljenja kao

antiagregacijski lijek. I korisni i štetni učinci acetilsalicilne kiseline nastaju prvenstveno zbog

inhibicije biosinteze prostanoida, tromboksana A2 (TXA2) i prostaglandina (PGE2, PGI2).

Acetilsalicina kiselina ireverzibilno inhibira enzim ciklooksigenazu 1 (COX1) putem acetilacije

Ser529 i na taj način sprječava pristup katalitičkog mjesta arahidonskoj kiselini. Time se

sprječava nastanak i učinak prostaglandina odgovornih za stvaranje upale, osjeta boli i povišene

tjelesne temperature. Zbog inhibicije COX1 u trombocitima, onemogućena je sinteza

prostaglandina H2, koji se dalje, pod normalnim okolnostima, pretvara u TXA2 pomoću

tromboksan sintaze (Campbell i sur, 2007). Stoga, acetilsalicilna kiselina ima i antitrombički

učinak jer inhibicijom proizvodnje tromboksana onemogućava agregaciju trombocita i stvaranje

tromba. Iako je u nekim slučajevima taj učinak poželjan, istodobno je i razlog za povećani oprez

pri korištenju acetilsalicilne kiseline u kombinaciji s drugim antikoagulatnim lijekovima i

prirodnim dodacima prehrani poput ginka.

Acetilsalicilna kiselina može djelovati i antioksidativno neovisno o metabolizmu COX i

prostaglandina smanjujući glikaciju proteina koja nastaje uslijed povećanog oksidativnog stresa u

stanicama. Ovaj učinak ostvaruje se sposobnošću salicilne kiseline da neutralizira hidroksilne

radikale, modulira aktivnost NF-kB i MAPK, metabolizma ATP-a te inhibira inducibilnu NOS.

Pokazano je da acetilsalicilna kiselina smanjuje replikaciju virusa hepatitisa C u stanicama jetre

povećanjem ekspresije SOD u inficiranim i zdravim stanicama ovisno o dozi. Na taj način se

smanjuje kronična upala izazvana infekcijom i odgađaju kasnije komplikacije kao što su fibroza i

pojava karcinoma (Rivas-Estilla i sur, 2012).

Acetilsalicilna kiselina u organizmu se deacetilira u salicilnu kiselinu koja se dalje metabolizira

glukuronidacijom i hidroksilacijom, gdje glavnu ulogu ima enzim CYP2C9 (Palikhe i sur, 2011).

Lijekovi koji se metaboliziraju tim istim enzimom ulaze u kompeticiju s acetilsalicilnom

kiselinom, te je uslijed njihovog sporijeg metaboliziranja moguć neželjeni pojačani učinak. U tim

33

slučajevima ili kada se acetilsalicilna kiselina koristi u punoj dozi može doći do nekontroliranog

krvarenja ili razvoja hepatotoksičnosti (O'Connor i sur, 2003).

Unatoč brojnim povoljnim djelovanjima acetilsalicilne kiseline, potreban je poseban oprez pri

korištenju kod ljudi s preosjetljivošću na proteine u hrani jer se pokazalo da pospješuje

paracelularnu apsorpciju alergena neovisno o njihovoj veličini i naboju dok nema utjecaja na

čvrste spojeve i endocitozu ovisnu o klatrinima (Yokooji i sur, 2014). Također, kod starije

populacije kod koje je korištenje acetilsalicilne kiseline i najraširenije, osim što imaju najveći

rizik od razvoja neželjenih nuspojava zbog korištenja nerijetko i više od jednog lijeka, treba

obratiti pozornost na štetne učinke koje ima na fukciju bubrega. Većina starije populacije ima

prvi ili drugi stupanj kronične bolesti bubrega, često uz hipertenziju i/ili dijabetes, a neke studije

su pokazale da korištenje acetilsalicilne kiseline može značajno smanjiti klirens kreatina i

mokraćne kiseline te uzrokovati povećanje koncentracije lijeka u serumu. Iako se parametri

nakon 3 tjedna od prestanka dvotjednog unosa acetilsalicilne kiseline poboljšaju, zadržava se

smanjena glomerularna filtracija (Akinwusi i sur, 2013).

2.5.2 Varfarin

Varfarin je najčešće korišteni oralni antikoagulans od njegovog odobrenja za korištenje (1954).

Izrazito je učinkovit u prevenciji i liječenju dubokih venskih tromboza te može prevenirati

posljedice kod pacijenata s fibrilacijom atrija, umjetnim srčanim zaliscima, s trajnim centralnim

venskim kateterom i kod pacijenata s infarktom miokarda. Bitna značajka varfarina je njegov

uski terapijski raspon koji u subterapisjkim dozama nema antikoagulativnog djelovanja dok u

supraterapijskim dozama izaziva povećani rizik od krvarenja. U kliničkoj upotrebi varfarin se

koristi kao racemična otopina S- i R- enantiomera. S-varfarin je 3 - 5 puta potentniji

antikoagulans od njegovog R-enantiomera. Enantiomerska konfiguracija varfarina utječe na

način na koji se varfarin metabolizira. S-varfarin se predominantno metabolizira u S-7

hidroksivarfarin pomoću CYP2C9, dok se R-varfarin djelomično metabolizira u 6- i 8-

hidroksivarfarin pomoću CYP1A2, te u 10-hidroksivarfarin pomoću CYP3A4. Smatra se da

varfarin svoje glavno antikoagulantno djelovanje ostvaruje tako da prekida ciklus vitamina K u

jetri koji je bitan u koagulacijskoj kaskadi za normalno funkcioniranje faktora zgrušavanja

ovisnih o vitaminu K. Ovim mehanizmom varfarin djeluje inhibitorno na plazmatske proteine C i

34

S te na koagulacijske faktore II, VII, IX i X (Lewis i sur, 1974; Jiang i sur, 2004; Ge i sur, 2014;

Scott i sur, 2014). Međudjelovanje biljnih lijekova s varfarinom značajno je u kliničkim

okvirima pa je stoga bitno ustvrditi biljne preparate koji utječu na djelovanje varfarina.

Mogući mehanizmi međudjelovanja varfarina i biljnih pripravaka podijeljeni su u dvije

kategorije: međudjelovanja koja uključuju farmakokinetiku varfarina i međudjelovanja koja

uključuju farmakodinamiku varfarina. Do promjene u djelovanju varfarina može doći prilikom

međudjelovanja biljnih pripravaka tijekom apsorpcije varfarina, međudjelovanja biljnih

pripravaka s enzimima koji metaboliziraju varfarin, međudjelovanja s varfarin - vezujućim

proteinima, promjenama u sintezi i ciklusu vitamina K kao i smetnjama u koagulacijskoj kaskadi

(Slika 2) (Ge i sur, 2014). Do sada je pokazano da na varfarin djeluju različiti biljni preparati,

kao što su preparati goji-a (Lycium barbarum), češnjaka (Allium sativum), ginka (Ginkgo biloba)

i mnogih drugih. Prema nekim istraživanjima utvrđeno je da spojevi biljke Ginkgo biloba ne

povećavaju antikoagulantno djelovanje varfarina kod zdravih ljudi i kod pacijenata sa stabilnim

INR-om. Suprotno tome in vitro istraživanje pokazalo je da ekstrakt ginka EGb 761 inhibira

glavne ljudske enzime citokrom P450, među kojima i CYP2C9, enzim koji je povezan s

metaboliziranjem varfarina. Inhibitorno djelovanje na CYP2C9 može rezultirati povećanom

razinom varfarina što dovodi do povećane antikoagulantne aktivnosti (Taki i sur, 2012).

35

3 MATERIJALI I METODE

3.1 Etička načela

Istraživanje na laboratorijskim životinjama provelo se u skladu s etičkim principima, koji vrijede

u Republici Hrvatskoj, Zakonom o zaštiti životinja i Pravilnikom o uvjetima držanja pokusnih

životinja, posebnim uvjetima za nastambe i vrstama pokusa (NN 135/06, NN 37/13, NN 55/13,

NN 125/13), prema direktivi EU 2010/63/EU, te prema Vodiču za držanje i korištenje

laboratorijskih životinja (DHHS, 2011).

Pokus na laboratorijskim životinjama odobren je od Bioetičkog povjerenstva Prirodoslovno-

matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.

3.2 Pokusne životinje

Istraživanje je provedeno na 60 muških štakora soja Y59, podijeljenih u 10 skupina starosti 4 - 6

mjeseci, mase 350 - 450 g iz uzgoja Zavoda za animalnu fiziologiju Prirodoslovno-

matematičkog fakulteta u Zagrebu (Slika 15). Pokus je proveden u istoj ustanovi u Jedinici za

pokuse na laboratorijskim životinjama. Ustanova je licencirana za navedenu djelatnost prema

važećem Zakonu o dobrobiti životinja i pravilniku za provođenje pokusa na laboratorijskim

životinjama (NN 55/2013). Životinje su držane u kavezima; najviše do 6 životinja po kavezu,

pod standardnim uvjetima (24 °C, ciklus 12 sati svjetla i 12 sati mraka). Sve životinje imale su

slobodan pristup vodi i hrani (standardna hrana za laboratorijske životinje (4RF 21 Mucedola

S.R.L., Italija)).

36

Slika 15. Pokusne životinje, štakori soja Y59 za vrijeme obrade. Izvorna fotografija životinja

korištenih u istraživanju.

3.3 Materijali pokusa

3.3.1 Sastav pripravaka korištenih u radu prema priloženoj deklaraciji

Ginkocel je komercijalni pripravak biljke Ginkgo biloba, registriran u RH kao dodatak prehrani.

Preporučena dnevna doza sadrži 120 mg ekstrakta ginka. Sastav: fenolne kiseline,

proantocijanidi, flavonoidi (miricetin, kemferol, isorhamnetin, kvercetin), terpene, ginkgolide i

bilobalide.

Vulkan je komercijalni pripravak mješavine ginka, hmelja, matičnjaka i origana, nije registriran

u RH, ali je dostupan putem internetske prodaji iz država u regiji. Preporučena dnevna doza

pripravka sadrži 150 mg ekstrakta ginka. Po deklaraciji pripravak je mješavina hmelja (Humulus

lupulus) - osigurava tanine, flavonoide, biljne hormone (fitoestrogen 8-prenilnaringenin);

matičnjaka - eugenol, tanini i terpeni, kafeinska kiselina, katehini, klorogenična kiselina, cis-3-

37

heksenol, geranial acetat, luteolin-7-glukozid, metil heptenon, neral, nerol, oktil benzoat,

oleanolna kiseina, jantarna kiselina; ginka (Ginkgo biloba); origana (Origanum vulgare).

GinkAlert je komercijalni pripravak, po deklaraciji mješavina ginka, borovnice i gotu kole,

registriran u RH kao dodatak prehrani. Preporučena dnevna doza pripravka sadrži 120 mg

ekstrakta ginka. Ova mješavina garantira aktivne tvari osiguravajući 10% triterpena iz

nadzemnog dijela gotu kole (Cantella asiatica), 24% ginko flavonoglikozida i 6% terpena

laktona iz ekstrakta lista ginka te 36% antocijanozida iz ekstrakta ploda borovnice (Vaccinium

myrtilus).

3.3.2 Određivanje aktivnih spojeva u istraživanim biljnim pripravcima

Ukupni fenoli, flavonoidi, neflavonoidi i antocijanini određeni su spektrofotometrijskim

metodama u homogenatu istraživanih biljnih pripravaka.

3.3.2.1 Spektrofotometrijsko određivanje ukupnih fenola u pripravcima ginka

Metoda se bazira na obojenoj reakciji fenola s Folin-Ciocalteu reagensom. Folin-Ciocalteu

reagens je smjesa fosfovolframove i fosfomolibdenske kiseline, a pri oksidaciji fenolnih spojeva

ove kiseline se reduciraju u volfram-oksid i molibden-oksid koji su plavo obojeni i obojenje se

mjeri spektrofotometrijski (Ough i Amerine, 1988).

Reakcijska smjesa se priredila miješanjem 200 μL ekstrakta razrijeđenog 50 × u ekstrakcijskom

sredstvu, 1,35 mL destilirane vode te 150 μL Folin-Ciocalteu reagensa (Sigma-Aldrich,

Njemačka) i vorteksirala se 10 sekundi. Nakon 5 minuta dodan je 1,5 mL 6%-tne otopine

Na2CO3 (Kemika, Hrvatska) i vorteksirano je 10 sekundi. Reakcijske smjese inkubirale su se 30

minuta na 50 °C nakon čega se apsorbancija svake otopine mjerila na 725 nm na UV-VIS

spektrofotometru Agilent 8453 E (Hewlett Packard, Njemačka). Pomoću baždarnog dijagrama za

galnu kiselinu (Slika 16) izračunata je koncentracija polifenola u uzorku i izražena kao mg

ekvivalenata galne kiseline/g uzorka. Kao slijepa proba koristilo se ekstrakcijsko sredstvo (voda

ili metanol; A je cca 0,050).

38

0.000 100.000 200.000 300.000 400.000 500.000 600.0000

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

f(x) = 0.000817230335982176 x − 0.000329288025889996R² = 0.999712256889838

A

koncentracija galne kiseline (mg/L)

Ap

sorb

an

cija

(7

65

nm

)

Slika 16. Baždarni dijagram galne kiseline za izračunavanje koncentracije ukupnih fenola.

3.3.2.2 Spektrofotometrijsko određivanje ukupnih flavonoida u pripravcima ginka

Količina ukupnih flavonoida u istraživanim pripravcima određena je spektrofotometrijskom

metodom prema Christu i Mülleru (Christ i Müller, 1960). Postupak uključuje hidrolizu

glikozida, ekstrakciju aglikona ukupnih flavonoida etil acetatom i mjerenje apsorbancije otopine

na 425 nm nakon stvaranja kompleksa s aluminijevim kloridom.

Iz praha pripravaka napravljen je hidrolizat, 30 minuta s 20 mL acetona (Kemika), 2 mL 25%-

tne kloridne kiseline (Kemika) i 1 mL 0,5%-tne otopine heksametilentetramina (Kemika),

zagrijavanjem do vrenja na vodenoj kupelji uz povratno hladilo. Hidrolizat je propušten kroz

vatu, a ostaci na vati ponovo su ekstrahirani s 20 mL acetona grijanjem do vrenja 10 minuta.

Dobivena otopina je također propuštena kroz vatu, a prethodno opisana ekstrakcija acetonom

ponovljena je tri puta. Sjedinjeni filtrati razrijeđeni su acetonom do 100 mL. Dvadeset mL

hidrolizata pomiješano je s 20 mL vode, a zatim ekstrahirano najprije s 15 mL, te tri puta s po 10

mL etil acetata (Kemika). Sjedinjene etil acetatne faze isprane su dva puta s po 40 mL vode,

propuštene kroz vatu i razrijeđene etil acetatom do 50 mL. Po 10 mL te otopine preneseno je u

dvije odmjerne tikvice od 25 mL. U svaku je tikvicu dodano 0,5 mL 0,5%-tne vodene otopine

natrijeva citrata (Kemika). U jednu tikvicu dodano je još 2 mL otopine aluminijeva klorida (2 g

aluminijeva klorida heksahidrata (Kemika) otopljeno je u 100 mL 5%-tne metanolne otopine

octene kiseline (Merck, Njemačka)). Potom su obje tikvice dopunjene do 25 mL 5%-tnom

39

metanolnom otopinom octene kiseline. Nakon 45 minuta, izmjerene su apsorbancije ((UV-VIS

spektrofotometar Agilent 8453 E (Hewlett Packard, Njemačka)) otopina s aluminijevim

kloridom, u sloju debljine 1 cm, na 425 nm. Slijepa proba bila je prethodno pripremljena otopina

bez aluminijeva klorida. Maseni udio flavonoida izražen je kao udio kvercetina (Sigma-Aldrich),

prema izrazu: % = A × 0,772 / b (A – apsorbancija; b – masa pripravka izražena u gramima).

3.3.2.3 Određivanje ukupnih antocijanina u pripravcima ginka

Ukupan sadržaj određen je spektrofotometrijski na 510 nm te izražen kao mg cijanidin-3-

glukozid klorida (CGE) u kg svježe mase biljnog tkiva. Metoda se temelji na strukturalnoj razlici

antocijanina pri različitoj pH vrijednosti medija (pri pH 1,0 su obojeni, pri pH 4,5 bezbojni),

uslijed čega pokazuju različitu apsorpciju svjetlosti valne duljine 510 nm (Lee i sur, 2005).

Nekoliko grama biljnog pripravka (3-5 g) macerirano je tekućim dušikom do finog praha, nakon

toga odvagano je po 0,5 g praha u posebno označene dvije plastične epruvete od 15 mL. U jednu

je dodano 10 mL pufera I (pH 1,0: 10 mL po uzorku; 125 mL 0,2 M KCl i 375 mL 0,2 M HCl), a

u drugu isti volumen pufera II (pH 4,5 (10 mL po uzorku; 400 mL 1 M CH 3COONa, 240 mL 1

M HCl i 360 ml deionizirane H2O). Nakon homogenizacije vorteksiranjem (10-tak sekundi), obje

suspenzije centrifugirane su dva puta po 15 minuta na 5000 G pri 4 oC. Supernatanti su korišteni

za mjerenje apsorpcije na 510 nm, a čisti puferi su korišteni kao slijepe probe. Ukupni

antocijanini izračunati su prema formuli: ANT (mg/kg svježe mase) = (ApH 1,0 - ApH 4,5) x

(484,8/24 825) x 20 000.

3.3.3 Određivanje antioksidativnog djelovanja biljnih pripravaka ginka

3.3.3.1 FRAP (engl. Ferring Reducing Antioxidant Power) metoda

Osnovna metoda je bazirana na antioksidacijskoj sposobnosti plazme da reducira željezo. Biološki

antioksidansi su definirani kao tvari prisutne u malim koncentracijama, a sposobni su odgoditi

oksidaciju supstrata, točnije nastanak ROS-ova (Halliwell i Gutteridge, 1995). Metoda se temelji

na redukciji Fe (III)-tripiridiltriazin kompleksa (žute boje) u njegov reducirani Fe (II) oblik

(plave boje) u prisutnosti antioksidansa. Redukcija se prati porastom apsorbancije (λ = 593 nm).

40

Mjerna veličina za ovu vrijednost je EC50, što nam govori o tome kada je 50% Fe3+ prešlo u Fe2+

pod utjecajem ispitivane tvari.

Reakcijska smjesa izrađena je miješanjem 2,7 mL FRAP reagensa (0,3 M acetatni pufer, 20 mM

FeCl3 (Kemika) i 20 mM TPTZ (2,4,6-tri(2-piridil)-s-triazin) (Fluka, Švicarska)), 270 µL

destilirane vode i 150 µL ekstrakta (ekstrahirano je 0,5 g uzorka u 10 mL ekstrakcijskog sredstva

za fenole). Smjesa je inkubirana na 37 °C, a apsorbancija smjese mjerena je nakon 40 minuta na

593 nm. Apsorbancija se odredi prema baždarnom dijagramu (Slika 17).

0.00000 0.50000 1.00000 1.50000 2.00000 2.500000.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

1.400

1.600

f(x) = 0.745706835846154 x − 0.0077916666666672R² = 0.998541442978792

koncentracija FeSO4 x 7H2O (mmol/L)

Ap

sorb

an

cija

(5

95

nm

)

Slika 17. Baždarni dijagram za određivanje antioksidativne sposobnosti pripravaka.

3.3.3.2 DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil radikal) metoda

Ova se metoda zasniva na stabilnom slobodnom radikalu DPPH- (difenilpikrilhidrazil) koji ima

jedan slobodni elektron koji kruži oko kompleksa DPPH dajući mu ljubičastu boju. Za tu

ljubičastu boju karakteristična je apsorpcijska grupa na valnoj duljini od 520 nm u etanolnoj

otopini. Kada se otopina DPPH- miješa s ispitivanom tvari (antioksidansom) koja može donirati

vodikov atom, DPPH- prelazi u reducirani oblik pri čemu gubi svoju ljubičastu boju (iako može

ostati žuta boja zbog prisutne pikrilne grupe) (Molyneux, 2004, Ashgar i sur, 2008).

Rezultati se izražavaju kao EC50 vrijednost koja nam govori kada je 50% reagensa reducirano s

ispitivanom tvari poznate koncentracije.

41

Po 100 µL svakog od testiranih uzorka pomiješano je u jednoj kiveti i razrijeđeno 50 puta na

način da je 200 µL sjedinjenog ekstrakta otpipetirano u odmjernu tikvicu od 10 mL i

nadopunjeno metanolom do oznake. Zatim je priređen koncentracijski niz svakog uzorka. U

devet kiveta pipetiran je određeni volumen razrijeđenog uzorka (550 µL, 450 µL, 350 µL, 300

µL, 250 µL, 200 µL, 150 µL, 100 µL i 30 µL) i dopunjen metanolom do 2 mL. Nakon toga je u

svaku kivetu dodano 1,5 mL otopine DPPH (1,8 mg DPPH (Sigma-Aldrich) je otopljeno u 25

mL metanola (Kemika)) i dobro se promućkalo.

Sposobnost vezanja radikala pratila se mjerenjem smanjenja apsorbancije na 528 nm za

koncentracijski niz otopina uzorka. Mjerena je početna apsorbancija (A0 – samo metanol) i

apsorbancija nakon inkubacije od 30 minuta (A30min). Rezultat je izražen kao parametar

učinkovite koncentracije (EC50). EC50 je koncentracija antioksidansa, odnosno u ovom slučaju

koncentracija pripravaka ginka, koja je uzrokovala 50%-tno smanjenje početne koncentracije

DPPH-. Sposobnost vezanja radikala uzorka bila je obrnuto proporcionalna parametru učinkovite

koncentracije. Sva mjerenja provedena su u duplikatu, koncentracija je određena prema

baždarnom dijagramu (Slika 18).

0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.5000.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

1.400

f(x) = − 0.625252173913043 x + 1.33117391304348R² = 0.981710521566811

ekvivalent Troloxa (mmol/L)

apso

rban

cija

(5

17

nm

)

Slika 18. Baždarni dijagram za učinkovitu koncentraciju ispitivanih pripravka DPPH metodom.

42

3.3.4 Određivanje polifenolnih spojeva primjenom visokodjelotvorne tekućinske

kromatografije

Određivanje sastava i udjela pojedinih flavonola i fenolnih kiselina u ispitivanim uzorcima,

provedeno je primjenom visoko djelotvorne tekućinske kromatografije (HPLC, engl. High

Performance Liquid Chromatography) metodom opisanom u Europskoj farmakopeji (Eur. Ph.

8.0).

Metoda za određivanje flavonola i fenolnih spojeva primjenom visoko djelotvorne tekućinske

kromatografije temelji se na ekstrakciji polifenolnih spojeva primjenom otapala različite

polarnosti s ciljem povećanja ekstrakcijskog kapaciteta te razdvajanjem i elucijom fenolnih

spojeva na kromatografskoj koloni u nizu padajuće polarnosti.

Tablica 1. Gradijent za HPLC analizu flavonola i fenolnih kiselina.

t (min) Mobilna faza A

(0,3 g/L fosforna kiselina, pH=2)

Mobilna faza B

(metanol)

0,0 60 40

1,0 60 40

20,0 45 55

25,0 45 55

26,0 0 100

31,0 0 100

31,5 60 40

40,0 60 40

Analize su izvedene na HPLC analitičkom sustavu Agilent 1100 (Agilent Technologies,

Njemačka). Separacija polifenolih spojeva izvedena je na Hypersil Gold C18 koloni (unutrašnjeg

promjera 4,6 x 250 mm, veličina čestica 5 μm, Thermo Scientific, MA, USA) pri brzini protoka

mobilne faze 1 mL/minuta. Temperatura kolone je bila 25 ºC, a volumen injektiranja 10 µL.

43

3.3.4.1 Priprema otopina standarda

Prilikom izrade kalibracijskih krivulja za određivanje flavonola i fenolnih kiselina primjenom

HPLC-a uz DAD detekciju korištene su izvorne otopine sljedećih standarda:

Klorogenska kiselina, γ=0,41 mg/mL

Kafeinska kiselina, γ=0,40 mg/mL

p-kumarinska kiselina, γ=0,48 mg/mL

Kvercetin dihidrat, γ=1,02 mg/mL

Navedeni standardi fenolnih kiselina i flavonola otopljeni su u zakiseljenom metanolu

(metanol/2% HCl, 60/40 v/v). Za pojedini standard injektirano je ukupno 3 različite

koncentracija; kafeinska kiselina 0,027-0,202 mg/mL, klorogenska kiselina 0,026-0,206 mg/mL,

p-kumarinska kiselina 0,030-0,239 mg/mL te kvercetin dihidrat 0,025-0,205 mg/mL.

3.3.4.2 Identifikacija i kvantifikacija polifenolnih spojeva

Klorogenska i neoklorogenska kiselina identificirana je na valnoj duljini 328 nm, kafeinska

kiselina na 324 nm, p-kumarinska kiselina na 310 nm, a kvercetin, kamferol i izorhamnetin na

370 nm.

Identifikacija flavonola i fenolnih kiselina provedena je usporedbom spektara polifenolnih

komponenti iz uzorka sa spektrima standarda te usporedbom retencijskih vremena.

Kvantifikacija je provedena na osnovu izračunatog faktora odgovora detektora (RF, engl.

Response Factor) standardnih spojeva. Faktori odgovora pojedinih standarda izračunati su prema

jednadžbi:

RF=CA

gdje je C koncentracija pojedinog standarda u baždarnoj otopini, uzevši u obzir čistoću

referencijske tvari (mg/mL); A površina pika pojedinog standarda iz kromatograma baždarne

otopine.

44

Izračunati su prosječni faktori odgovora detektora za kvercetin dihidrat, kafeinsku, klorogensku i

p-kumarinsku kiselinu te njihove relativne standardne devijacije (RSD, engl. Relative Standard

Deviation (Tablica 2).

Tablica 2. Faktori odgovora detektora standardnih spojeva.

Kvercetin

dihidrat

Kafeinska

kiselina

Klorogenska

kiselina

p-kumarinska

kiselina

RF 2.50x10-5 3.14x10-4 6.22x10-5 1.29x10-5

RSD% 0,01% 0,34% 0,88% 0,18%

Sadržaji pojedinih polifenolnih komponenti u uzorku izračunati su prema jednadžbi:

S (mg /100 g )=RF × A ×V ×100m

gdje je RF-faktor odgovora detektora standarda, A-površina pika iz kromatograma otopine

uzorka, V-volumen odmjerne tikvice za uzorak (mL), m-odvaga uzorka (mg).

Neoklorogenska kiselina je identificirana i kvantificirana pomoću standarda klorogenske

kiseline, a kamferol i izorhamnetin pomoću standarda kvercetin dihidrata.

45

3.4 Protokol istraživanja

Životinje su jednom dnevno intragastrično dobivale dnevne preporučene doze pripravaka u mg

suhe tvari pripravaka i lijekova na kg tjelesne težine životinja, prema istaknutoj deklaraciji

proizvođača. Pokus je proveden na 10 skupina životinja razvrstanih prema vrstama istraživanih

pripravaka u čistom obliku ili kombinacijama, od kojih je jedna bila kontrolna. Skupine su

označene abecednim redom kako slijedi:

skupina a - fiziološka otopina

skupina b - komercijalni pripravak ginka (Ginkocel) – primjenjeno 5,71 mg suhe tvari pripravka

na kg tjelesne težine.

skupina c - komercijalni pripravak mješavine ginka, hemelj, matičnjaka i origana (Vulkan) –

primijenjeno 23,5 mg suhe tvari na kg tjelesne težine

skupina d - acetilsalicilna kiselina – primijenjeno 4,2 mg acetilsalicilne kiseline na kg tjelesne

težine

skupina e - kroz 12 dana fiziološka otopina, zadnja 3 dana varfarin (kumarinski pripravak u

tabeti) – primjenjeno 2 mg suhe tvari na kg tjelesne težine

skupina f - kombinacija pripravka primijenjenog u skupini c i varfarina (varfarin uključen

13.dan pokusa)

skupina g - kombinacija pripravka primijenjenog u skupini c i acetilsalicilne kiseline

skupina h - kombinacija pripravka primijenjnog kod skupine b i varfarina (varfarin uključen

13.dan pokusa)

skupina i - kombinacija pripravka primijenjenog kod skupine b i acetilsalicilne kiseline

skupina j - komercijalni pripravak mješavine ginka, borovnice i gotu kole (Ginkalert) –

primijenjeno 10,2 mg suhe tvari po kg tjelesne težine.

46

Žrtvovanje životinja izvršeno je 24 h nakon primijenjene zadnje doze. Anestezirane su

mješavinom Ksilapana i Narketana (intraperitonealno 25 mg/kg). Krv je uzimana iz abdominalne

aorte, potom su izolirani jetra, bubrezi, slezena i mozak.

Iz abdominalne aorte uzeti su uzorci pune krvi: a) uzorak pune krvi koji je pomješan s EDTA

(etilendiaminotetraoctena kiselina) antikoagulansom i b) uzorak pune krvi koji je pomiješan s

3,8% Na-citratom kao antikoagulansom. Uzorci krvi s Na-citratom kao antikoagulansom

korišteni su za testove koagulacije, agregacije i za mjerenje oksidativnog statusa u krvi.

Plazma siromašna trombocitima (engl. Platelet poor plasma , PPP) dobivena je centrifujgiranjem

pune krvi na 3500 rpm/15 min (engl. rounds per minute, rpm). Plazma bogata trombocitima

(engl. Platelet rich plasma, PRP) dobivena je centrifugiranjem uzoraka pune krvi na 1500

rpm/10 min. Nakon odvajanja plazme i sloja trombocita i leukocita dobili smo koncentrat

eritrocita.

3.5 Hematološki parametri i parametri hemostaze

3.5.1 Mjerenje agregacije trombocita

Agregacija trombocita određena je na Mutiplate anlizatoru, impedancijskom agregometru.

Impedancijska agregometrija bazira se na principu da trombociti nisu trombogeni u stanju

mirovanja, no aktivacijom se na površini eksprimiraju receptori koji omogućuju pričvršćivanje

na oštećeni endotel ili umjetnu površinu. Trombociti se lijepe na senzorske elektrode i time

pojačavaju električni otpor između njih. Taj otpor se mjeri. Svaka Multiplate mjerna posudica

ima ugrađene dvije nezavisne senzorske jedinice koje se sastoje od dvije bakrene elektrode.

Instrument otkriva impedancijsku promjenu svakog senzora zasebno. Promjena impedancije

izražava se u jedinicama AU (engl. aggregation units). Automatski se izračunava koeficijent

korelacije između 2 mjerenja. U istraživanju smo krostili dva testa za procjenu funkcije

trombocita, COL test (test s kolagenom) i ADP test (test s adenozindifosfatom) (Roche

Diagnostics reagensi, prema uputama proizvođača). Kolagen aktivira kolagen receptor, a ADP

stimulira aktivaciju trombocita preko ADP receptora. U mjernu posudu dodano je 300 µL 0,9%

fiziološke otopine zagrijane na 37 °C. Nakon toga dodano je 300 µL pune krvi inkubirnao 3 min.

Nakon inkubacije dodano je 20 µL odgovarajućeg reagensa (kolagen ili ADP). Mjerenje traje 6

47

minuta te se rezultat dobije izračunavanjem površine ispod krivulje (Slika 19). Na površinu

utječe nagib i visina agregacijske krivulje.

Slika 19. Prikaz agregacijske krivulje kod mjerenja impendacijskom metodom na Multiplate

agregometru.

3.5.2 Mjerenje testova koagulacije

Osnovni koagulacijski testovi određeni su pomoću automatiziranog koagulacijskog analizatora iz

plazme siromašne trombocitima. Određeni su protrombinsko vrijeme (PV), aktivirano parcijalno

tromboplastinsko vrijeme (APTV), trombinsko vrijeme (TT) i fibrinogen.

Protrombinsko vrijeme je osjetljiv test pretraživanja za poremećaje koagulacije vanjskog puta.

Koristi se liofilizirani humani placentalni tromboplastin. Reagens je rastopljen s destiliranom

vodom i zagrijan na 37 °C. Krv prikupljena u epruvete s 3,8% Na citratom u omjeru 1:9

iscentrifugirana je na 3500 rpm/15 min. Odvojena plazma postavljena je u aparat koji automatski

otpipetira 100 µL plazme, inkubira minutu na 37 °C, doda 200 µL Simens Thromborel S

reagensa (liofilizirani humani placentalni tromboplastin (<60 g/L, kalcij klorid (oko 1,5 g/L) te

48

Vrijeme (min)Polje ispod

krivulje (U)

kao prezervansi gentamicin (0,1 g/L), klorometilizotiazolon i metilizotiazolon (<15 mg/L)) te se

mjeri vrijeme nastanka ugruška.Vrijeme nastanka ugruška izražava se u sekundama ili postotku

od normale, te u obliku INR-a (engl. Internacatioanl Normalized Ratio), omjer vrijednosti

izmjerenog PV-a prema standarnoj vrijednosti PV-a korigiran s ISI (engl. internatioan

sensytivity index) propisan od strane WHO (engl. World health organisation), prema formuli:

INR=[ PV uzorkaPV referentne plazme ]

ISI

. ISI se dobije kalibracijom tromboplastina koji koristi određeni

laboratorij prema standardnom tromboplastinu. Na taj način lakše se prati antikoagulacijska

terapija putem PV-a određenog u različitim laboratorijima.

Aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme (APTV) je test za pretraživanje koagulacijskih

poremećaja ovisnih o faktorima unutrašnjeg puta koagulacije. Korišten je Simens Pathromtin SL

reagens (silicon dioxide čestice, biljni fosfolipidi, natrij klorid, HEPES, pH otopine 7,6). Aparat

odpipetira 100 µL citratne plazme, doda 100 µL Pathromtin SL reagensa i inkubira 2 min. Nakon

toga doda seb 100 µL otopine kalcij klorida. Nakon dodavanja kalcij klorida mjereno je vrijeme

nastanka ugruška. Rezultat se izražava u sekundama (s).

Trombinsko vrijeme – test za mjerenje nastanka fibrinskog ugruška. Koristili smo Simens BC

Thrombin reagens (liofilizirani goveđi thrombin, goveđi albumini pH otopine 7,4). U 100 µL

citratne plazme doda se 250 µL BC Thrombina i mjeri se vrijeme nastanka fibrinskog ugruška.

Rezultat se izražava u sekundama (s).

Fibrinogen je određen na automatskom analizatoru pomoću Simens Multifibren U reagensa

(goveđi trombin, kalcij klorid, heksadimetrin bromid, polietilen glikol, natrij klorid, goveđi

albumin i natrij azid kao konzervns). Aparat ispipetira 100 µL citratne plazme, inkubira na 37 °C

kroz jednu minutu, doda se 200 uL Multifibren reagensa. Koncentracija se izražava u g/L.

Izmjerena vrijednost izračunava se prema kalibracijskoj krivulji unesenoj za određeni LOT

(serijski broj) reagensa.

Sva testiranja primarne i sekundarne hemostaze provedena su unutar 4 h od uzimanja uzoraka.

49

3.5.3 Određivanje kompletne krvne slike

Hematološki parametri (kompletna krvna slika) određena je na automatskom brojaču (Coulter) iz

uzorka pune krvi uzetog u epruvetu s EDTA antikoagulansom. Coulter brojač je aparat koji mjeri

promjenu impendance koja ovisi o veličini stanica koje prolaze kroz otvor s električnom strujom.

Odredili smo hematološke parametre: broj eritrocita (Er), hematokrit (Htc), hemoglobin (Hgb),

prosječni sadržaj hemoglobina u volumenu eritrocita (MCH), prosječna koncentracija

hemoglobina u volumenu eritrocita (MCHC), prosječni volumen eritrocita (MCV), raspodjela

eritrocita po volumenu (RDW), broj leukocita (L), broj trombocita (Tr), prosječni volumen

trombocita (MPV).

3.5.4 Izračun viskoznosti krvi

Viskoznost pune krvi (engl. Whole blood viscosity, WBV) na 208 /sekundi smicanja izračunata

je prema ranije validiranoj formuli (de Simone, 1990) koja koristi hematokrit i proteine u plazmi:

WBV (208 sekundi-1)= (0,12 x h) + (0,17 x (p - 2,07)), gdje je h hematokrit u %, a p proteini u

plazmi (g/dL). Jedinica za viskoznost je centipuaz (cP) koja odgovara omjeru tlačnog smicanja

krvi prema tlačnom smicanju vode.

3.6 Histopatološka analiza

Nakon izolacije jetre, bubrega i slezene uslijedila je patohistološka obrada materijala. Obrada

uključuje fiksaciju resekcijskog materijala u 10% formalinu, uklapanje tkiva u parafin, rezanje

tkiva u rezove debljine 5 µm i bojenje hemalaun eozinom. Takav preparat je pregledan

svjetlosnim mikroskopom.

3.7 Biomarkeri oksidativnog stresa

3.7.1 Određivanje proteina metodom po Lowery-u

Količina proteina u plazmi i tkivima određena je metodom po Lowryju i sur (1951). Ova metoda

kombinira biuretsku reakciju te oksidaciju aromatskih bočnih ogranaka. Biuretska reakcija

temelji se na redukciji bakra u reakciji s peptidnom vezom u lužnatim uvjetima. Mehanizam

50

reakcije u kojoj dolazi do oksidacije aromatskih bočnih ogranaka je nepoznat, ali pri tome se

reducira fenolni reagens.

Metodom po Lowryju određeni su proteini u uzorcima plazme i homogenatima organa štakora.

Uzorci su razrijeđeni 100 puta u PBS-u (engl. Phosphate-buffered saline). U epruvete je dodano

po 100 μL razrijeđenog uzorka i 2 mL otopine D (Tablica 3) i inkubirano je 10 min na sobnoj

temperaturi. Sve je rađeno u duplikatima. Nakon toga dodano je 200 μL otopine E (Tablica 1)

nakon čega se snažno vorteksira i inkubira 30 min na sobnoj temperaturi. Količina proteina

određena je na spektrofotometru mjerenjem apsorbancije na valnoj duljini od 600 nm. Kao

standard upotrijebljen je albumin goveđeg seruma (engl. Bovine serum albumin, BSA) u

koncentracijama od 6 mg/mL prema manjim koncentracijama (6; 3; 1,5; 1; 0,6; 0,3; 0,15; 0,1 i 0

mg/mL). Iz standardne krivulje ovisnosti apsorbancije i koncentracije BSA određen je nagib

pravca. Preko nagiba pravca izračunata je koncentracija proteina u uzorcima prema sljedećoj

formuli: C=A (uzorka )−b(st . krivulje)nagib pravcast . krivulje X razrijeđenje. Koncentracija proteina izražena je kao

mg/mL.

Proteini su određeni jer je aktivnost enzima ili koncentracija mjerenih spojeva izražena po mg

proteina u krvi, tkivu jetre, bubrega, slezene ili mozga.

3.7.2 Mjerenje hemoglobina (Hgb) u eritrocitima

Količina hemoglobina (Hgb) u eritrocitima (Er) određivana je pomoću metode s cijanidnim

reagensom. Reakcija se temelji na litičkom djelovanju cijanidnog reagensa koji oslobađa

hemoglobin iz eritrocita, nakon čega dolazi do oksidacije hemoglobina s cijanidom te se stvara

stabilan obojeni kompleks cijanomethemoglobin.

Koncentracija ukupnog hemoglobina u eritrocitima mjeri se na spektrofotometru na valnoj

duljini od 560 nm. U epruvetu se dodaje 20 μL uzoraka eritrocita i 5 mL radne otopine

cijanidnog reagensa (Tablica 3). Nakon dodavanja cijanidnog reagensa uzorak se inkubira 5

minuta na sobnoj temperaturi nakon čega isti centrifugiramo na 2700 rpm kroz 10 minuta. U

drugu epruvetu se nalije 5 mL standarda s poznatom koncentracijom hemoglobina od 150 g/L.

Nakon centrifugiranja mjere se vrijednosti apsorbancije uzorka i standarda. Koncentraciju

51

hemoglobina u uzorku izračunavamo prema formuli:

ƴ (hemoglobina uuzorku )= A (uzorka)A(standarda)

x ƴ (hemoglobinau standardu), te se izražava kao g/L.

3.7.3 Mjerenje enzimske aktivnosti superoksid dismutaze (SOD)

Aktivnost SOD određena je prema metodi po Flohé i Ötting (1984). Metoda je posredna i temelji

se na inhibiciji redukcije citokroma c u sustavu ksantin/ksantin oksidaza.

U ovoj metodi korištene su dvije slijepe probe. Prva slijepa proba sastojala se samo od otopine A

(Tablica 1) te je apsorbancija u spektrofotometru mjerena na 550 nm tijekom 3 min. Druga

slijepa proba služila je za namještanje aktivnosti ksantin oksidaze. U eppendorf-epruvetu je

stavljeno 1,45 mL otopine A, 25 μL dH2O i 15-30 μL ksantin oksidaze (XOD) (0,8 U/mL)

(Tablica 1). Odmah nakon dodavanja enzima i brzog miješanja reakcijska smjesa prelivena je u

kivetu i mjerena je promjena apsorbancije, odnosno aktivnost enzima ksantin oksidaze tijekom 3

min na 550 nm. Aktivnost ksantin oksidaze mora biti oko 0,025 U/min. U ovom slučaju volumen

XOD koji je odgovarao bio je 25 μL. Nakon što se postigla optimalna aktivnost SOD, analizirani

su uzorci. U svaku reakcijsku smjesu umjesto dH2O dodano je 25 μL uzorka te odgovarajući

volumen ksantin oksidaze i odmah nakon toga mjerena je apsorbancija u spektrofotometru.

Enzimska aktivnost mjerena je kao postotak inhibicije aktivnosti ksantin oksidaze koja se računa

prema formuli:

% inhibicije XOD=100− ΔA (uzorka)Δ(slijepa proba)

×100.

Enzimatska aktivnost superoksid dismutaze (SOD) računa se prema formuli:

Aktivnost SOD=10 exp((% inhibicijeXOD+12,757)/30,932).

Aktivnost SOD izražena je kao U/mg proteina jetre, bubrega, slezene i mozga, U/mg

hemoglobina za RBC, U/mg proteina za PPP i PRP.

3.7.4 Mjerenje enzimatske aktivnosti katalaze

Aktivnost katalaze određena je spektrofotometrijskom metodom po Aebiju (1984.). U toj metodi

aktivnost katalaze određuje se kao količina potrošenog H2O2. U reakcijsku smjesu u kiveti

ukupnog volumena 1 mL dodano je 985 μL 10 mM H2O2 za PPP uzorak, a za PRP i eritrocite

995 μL 10 mM H2O2, a ostatak do ukupnog volumena od 1 mL bio je nerazrijeđeni uzorak.

52

Nakon toga je na spektrofotometru mjereno smanjenje količine H2O2 pri 240 nm tijekom jedne

minute. Aktivnost katalaze izražena je preko ekstinkcijskog koeficijenta H2O2 (= 39,4 mM–1 cm–

1) prema formuli proizvođača. Rezultat je izražen kao U/mg proteina za jetru, bubreg, slezenu i

mozak, odnosno U/mg hemoglobina za eritrocite, te U/mg proteina PPP i PRP što odgovara

μmol razgrađenog H2O2 po minuti po miligramu proteina.

3.7.5 Mjerenje količine lipidne peroksidacije

Količina lipidne peroksidacije u homogenatu tkiva jetre, bubrega, slezene i mozga, te

eritrocitima određivana je modificiranom metodom koju su opisali Jayakumar i sur (2007).

Metodom se mjeri koncentracija malondialdehida (MDA), jednog od glavnih produkata lipidne

peroksidacije. Temelji se na reakciji MDA s tiobarbiturnom kiselinom i pri čemu se stvara

kromogen koji je moguće mjeriti spektrofotometrijski.

U eppendorf-epruvetu je dodano 100 μL 8,1%-tni SDS, 750 μL 20%-tne octene kiseline

(pH=3,5), 750 μL 0,8%-tne TBA (pripremljeni prema: Tablica 3) i 100 μL homogenog uzorka.

Otopina je zatim stavljena u vodenu kupelj na 100 °C na 60 minuta. Nakon toga je naglo

ohlađena na ledu i zatim centrifugirana 15 min na 5000 rpm pri temperaturi 4–6 °C. Supernatant

je odvojen i izmjerena je apsorbancija pri 532 nm. Putem Beer-Lambertovog zakona izračunata

je ukupna koncentracija MDA, izražena kao nmol MDA po mg proteina.

3.7.6 Mjerenje koncentracije ukupnog glutationa (GSH)

Koncentracija ukupnog glutationa u jetri, bubregu, slezeni, mozgu, eritrocitima, PPP i PRP

štakora određena je prema modificiranoj metodi koju je opisao Tietze (1969). Metoda se temelji

na reakciji tiolnog reagensa 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoične kiseline (DTNB, Ellmanov reagens) s

GSH pri čemu se stvara kromofor 5-tionitrobenzoična kiselina (TNB) koja se fotometrijski

očitava na 412 nm. Osim TNB, stvara se i GS-TNB koji se reducira pomoću GSH reduktaze i

NADPH pri čemu se otpušta druga molekula TNB i reciklira GSH. Brzina nastanak TNB

proporcionalna je recirkulirajućoj reakciji koja je proporcionalna koncentraciji glutationa u

uzorku. Pri ovoj metodi sav oksidirani GSH (disulfid GSSG) prisutan u reakcijskoj smjesi ili

nastao iz miješanog disulfida GSH s GS-TNB brzo se reducira do GSH. Konačan rezultat koji se

dobije odgovara ukupnoj koncentraciji reduciranog i oksidiranog GSH u uzorku.

53

Koncentracija ukupnog GSH mjeri se u mikrotitarskoj pločici. U jednu jažicu dodaje se 20 μL

uzorka, 40 μL 0,035 M HCl i 40 μL 10 mM DTNB te se mjeri apsorbancija na valnoj duljini od

415 nm. Zatim se dodaje 100 μL otopine glutation reduktaze i NADPH te se mjeri apsorbancija

tijekom 5 min. Priprema navedenih otopina prikazana je u Tablici 3. Kao slijepa proba korišten

je PBS u reakcijskoj smjesi. Za standard korištene su koncentracije reduciranog GSH (5-100

μM). Nacrtani su pravci za sve standarde kao promjena apsorbancije u vremenu. Očitani su

nagibi pravaca, nacrtan je pravac kao ovisnost nagiba pravca o koncentraciji GSH. Konačno, taj

dobiveni pravac korišten je za dobivanje koncentracije ukupnog GSH u uzorku prema formulni

proizvođača. Koncentracija ukupnog GSH prikazana je kao µmol/mg proteina tkiva za organe,

μmol GSH po mL proteina za PPP i PRP uzorak, odnosno kao μmol GSH po mg hemoglobina za

uzorak eritrocita.

54

3.8 Mjerenje enzima arginaze i nitrita u tkivu aorte

3.8.1 Mjerenje arginaze

Mjerenje arginaze izvršeno je u tkivu aorte po metodi koju je opisao Hagan 1968. Dodano je 25

μL uzorka u ependorf epruvete od 2 mL (prethodno otopiti na RT), dodano je 100 μL 0,1%

Triton-X 100, miješano na vorteks. Nakon toga inkubiran 30 min na sobnoj temperaturi i

treskalici. Dodano je 100 μL 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 100 μL 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5),

inkubacija uzorka 10 min, na 55 oC u vodenoj kupelji. Dodano 100 μL 0,5 M L-Arginina

(pH=9,7), kratko vorteks, te 100 μL 0,5 M L-Arginina (pH=9,7), inkubacija zatim 60 min, na 37 oC u vodenoj kupelji. Dodano je 800 μL H2SO4 (96%): H3PO4 (85%): H2O = 1:3:7, 50 μL 9% α-

ISPF (otopljen u 100% EtOH), Inkubacija uzoraka 30 min, na 95 oC (100 oC) u vodenoj kupelji.

Ohlađen je uzorak oko 10 minuta zaštićen od svjetla. Uzorci tkiva, standardna i slijepa probe

mjereni su na 540 nm u kivetama, uz zaštitu uzoraka od svjetla (nakon zadnje inkubacije dolazi

do promjene boje uzorka u ružičastu boju) (Tablica 4).

Standardna urea: 100 μL ureje određene koncentracije/jažici, 800 μL H2SO4 (96%):H3PO4

(85%): dH2O = 1:3:7, 50 μL 9% α-ISPF ( u 100% EtOH).

Baždarni graf ureje: STOCK OTOPINA UREJE 360 μg/mL (6 mM): otopiti 36 mg ureje + 100

mL dH2O (Slika 20).

0 1 2 3 4 5 60

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

f(x) = 0.245941770459512 x − 0.00383889306641191R² = 0.993104593515266

BAŽDARNI UREJA

koncentracija ureje (mM)

apso

rban

cija

(5

40

nm

)

Slika 20. Baždarni graf ureje za određivanje aktivnosti arginaze.

55

3.8.2 Mjerenje nitrita

Dušični oksid (NO) važan je fiziološki glasnik i molekula biološkog sustava, imunološkog, neuro

i kardiovaskularnog (Bredt i Snyder, 1994; Dawson i Dawson, 1995). Jedan od načina za

određivanje dušik oksida je mjerenje nitrita koji je jedan od dva primarna, stabilna razgradna

produkta NO. Nitriti u homogenatu tkiva aorte mjereni su metodom po Griessu (1879).

Određivanje referentne krivulje – pripremljeno je 1 mL 100 μM otopine nitrita razrjeđivanjem

standardne otopie nitrita 1:1000 u matrici. Određeno je 3 kolone (24 jažice) na pločici za

referentnu krivulju nitrit standarda. Dodano 50 μL odgovarajućeg pufera ili matrice u jažice u

redovima od B-H, a u 3 A jažice po 100 μL 100 μM otopine nitrita, a prema niže u jažice 6

serijskih razrjeđenja (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,13; 1,56), zadnji red bez otopine nitrita.

Mjerenje nitrita – u svaku jažicu dodano je 50 μL svakog eksperimentalnog uzorka u jažice u

duplikatu ili triplikatu. Višekanalnom pipetom rastočeno je po 50 μL otopine sulfanilamida na

sve pokusne uzorke i jažice za standardnu krivulju. Inkubirali 5-10 min na sobnoj temperaturi,

zaštićen od svjetla. Pipetirano je po 50 μL otopine NED u sve jažice (Tablica 5). Inkubacija na

sobnoj temperaturi tijekom 5-10 min. Potom se mjerila apsorbancija u roku od 30 minuta na

čitaču ploča s filterom između 520 nm i 550 nm. Izrađena je baždarna krivulja, nitrit standard na

Y os, koncentracija na X os (Slika 21).

0 20 40 60 80 100 1200

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

f(x) = 0.00706419715454453 x + 0.0253975895815229R² = 0.990931759213976

BAŽDARNI PBS

koncentracija NO2- (µM)

Ap

sorb

an

cija

(5

40

nm

)

Slika 21. Baždarni graf za određivanje koncentracije nitrita.

56

3.9 Statistička obrada

Za statističku obradu podataka korišten je računalni program ''Statistica''. Pomoću računalnog

programa proveli smo analizu varijance (Anova). Pomoću podataka dobivenih iz analize

varijance dobili smo uvid o podudarnosti i razlikama mjerenih parametara između pokusnih

skupina. Razlike između skupina potvrđene su LSD post hoc testom. Dalje smo pomoću istoga

programa došli do srednje vrijednost, standardne devijacije, medijana, minimuma i maksimuma

mjerenih parametara pokusnih životinja po skupinama.

57

Tablica 3. Priprema pokusnih otopina za određivanje katalaze, SOD, GSH i MDA u plazmi,

eritocitima, trombocitima, tkivu jetre, bubrega, slezene i mozga. Otopine za određivanje proteina

u plazmi i tkivu te hemoglobina u eritrocitima.

Otopina Priprema otopineOtopina D (određivanje proteina prema Lowryu)

Pomiješati otopine u omjeru A:B:C=48:1:1A: 2% (w/v) Na2CO3 u 0,1 mM NaOHB: 1% (w/v) natrij-kalij tartarat u dH2OC: 0,5% (w/v) CuSO4 × 5H2O u dH2O

Otopina E (određivanje proteina prema Lowryu)

Pomiješati Folin & Ciocalteu's phenol reagent i dH2O u omjeru 2:1

Radna otopina cijanidnog reagensa (određivanje Hemoglobina)

Pomiješati 20 mL cijanidnog reagensa, iz kita za određivanje hemoglobina, sa 980 mL dH2O

0,81% TBA (određivanje MDA) Otopiti 0,8 g TBA u 40 mL dH2O uz lagano zagrijavanje. Dodati 500 μL 5M NaOH te nadopuniti s dH2O do 100 mL.

Reagens A (određivanje MDA) Pomiješati 100 μL 8,1% SDS sa 750 μL 20% octene kiseline namještene na pH=3,5 i 750 μL 0,81% TBA

0,5 M pufer PBS (određivanje GSH) Pomiješati 17 mL 1 M Na2HPO4 × 2 H2O (otopiti 3 g Na2HPO4

× 2H2O u dH2O i nadoliti dH2O do 17 mL) i 183 mL 1 M Na2HPO4 × 12 H2O (otopiti 65,5 g Na2HPO4 ×12 H2O u dH2O i nadoliti dH2O do 183 mL)

0,5 M EDTA (određivanje GSH) Otopiti 37,2 g EDTA u dH2O i nadoliti dH2O do 200 mL0,5 M pufer PBS s 0,25 M EDTA (određivanje GSH)

Pomiješati 200 mL 0,5 M pufer PBS i 200 mL 0,5 M EDTA

0,035 M HCl (određivanje GSH) Pomiješati 7 mL 0,1 HCl s 193 mL dH2O Ellmanov reagens (određivanje GSH) Otopiti 20 mg DTNB u 5 mL 0,5M pufer PBS s 0,25 M EDTA 0,8 mM NADPH (određivanje GSH) Otopiti 6,67 mg NADPH s 10 mL 0,5 M pufer PBS s 0,25 M

EDTA 50 mM PBS (određivanje SOD) Pomiješati 17 mL (otopiti 1,56 g NaH2PO4 × 2H2O u 50 mL

dH2O) i 183 mL ( otopiti 5,678 g Na2HPO4 u 200 mL dH2O), namjestiti pH=7,8 te nadopuniti do 800 mL s d H2O

50 mM PBS s 0,1 mM EDTA (određivanje SOD)

Otopiti 3,72 mg EDTA u 100 mL 50 mM PBS

Reakcijska otopina A (određivanje SOD) Pomiješati 190 mL 0,05 mM citokroma c (otopiti 29 mg citokroma c u 190 mL 50 mM PBS s 0,1 mM EDTA ) i 19 mL 1 mM ksantina ( uz lagano zagrijavanje otopiti 3 mg ksantina u 19,74 mL 1 mM NaOH)

Otopina B enzima ksantin oksidaze (aktivnost 0,8 U/mL) (SOD)

Pomiješati 40 μL ksantin oksidaze i 960 μL dH2O

58

Tablica 4. Priprema otopina za određivanje aktivnosti arginaze u tkivu aorte.

Otopina Priprema otopine

TRITON X-100 100 μL + 99,9 mL dH₂OTRIS 0,2 M STOCK 2,42 g + 100 mL dH₂O0,2 M HCl 1,642 mL HCl (37%) + do 10 mL dH₂OTris-HCl 50 mM 50 mL Tris 0,2 M + CCA 40 mL HCl 0,2 M, pH=7,5 +

do 200 mL H₂OMnCl₂ 50 mM 49,38 mg MnCl₂ x 4H₂O + do 5 mL dH₂OL-arginin 0,5 M, pH=9,7 871 mg + dio HCl 0,2 M, pH=9,7 + do 10 mL dH₂O

za 100 mjerenja

H₂SO₄ (96%): H₃PO₄ (85%): dH₂O 10 mL:30 mL:70 mL (1:3:7)

9% alfa-ISPF (100% EtoH za otopine) 0,335 g + 5 mL 100% EtOH za 100 mjerenja

STOCK OTOPINA UREJE 360 mg/mL (6 mM) 36 mg ureje + 100 mL dH₂O

Tablica 5. Otopine za određivanje dušik oksida u tkivu aorte

Otopina Priprema otopine

NED 0,1% N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride u

vodi

Sulfanilamid otopina 1% sulfanilamid u 5% fosfornoj kiselini

Nitrit standard 0,1 M sodium nitrita u vodi

59

4 REZULTATI

4.1 Analiza sastojaka u komercijalnim pripravcima

Analizom sastavnica u gotovom obliku komercijalno dostupnih pripravka, korištenih u

istraživanju, izmjeren je znatno viši udio polifenola, flavonoida, neflavonoida u pripravku

vulkan, te antocijanina u pripravku ginkalerta (Tablica 6). Sposobnost svladavanja oksidacijskog

stresa u stanicama mjerena je određivanjem antioksidativnog djelovanja biljnih pripravaka ginka.

Za to su korištene metode FRAP i DPPH. Pripravak ginka, ginkalert pokazao je najbolji

antioskidativni učinak i sposobnost hvatanja radikala (Tablica 7).

Tablica 6. Analiza sastavnica u gotovom obliku.

uzorak UKUPNI

FENOLI

UKUPNI

NEFLAVONOIDI

UKUPNI

FLAVONOIDI

UKUPNI

ANTOCIJANINI

mg GAE/100g mg CGE/100 g

ginkocel 843,22 202,364 640,853 12,897

vulkan 6153,02 1700,764 4452,253 52,794

ginkalert 4951,91 1559,059 3392,853 2193,039

GAE – koncentracija galne kiseline; CGE – cijanidin glukozid klorid.

Tablica 7. Antioksidativno djelovanje pripravaka ginka određeno FRAP i DPPH metodom.

uzorak FRAP DPPH

mmol FE/100 g mmol TE/100 g

ginkocel 7,558 10,130

vulkan 110,041 12,801

ginkoalert 183,915 55,936

FRAP - engl. Ferring Reducing Antioxidant Power; DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil radikal; FE – željezo; TE –

trolox ekvivalent

60

4.1.1 Flavonoli i fenolne kiseline prisutne u pripravcima ginka

U tablicama 8 i 9 dane su količine flavonola i fenolnih kiselina u ispitivanim uzorcima. Sllika 22

prikazuje raspodjelu flavonola u pojedinim ispitivanim uzorcima. Prikazana je kao udio

pojedinog flavonola u ukupnoj količini flavonola. Raspodjela fenolnih kiselina uzorka (%)

prikazana je na Slici 23.

Tablica 8. Flavonoli prisutni u pripravcima ginka

UZORAK Flavonoli (mg/100 g)

Kverceti Kemferol Izorhamnetin Ukupno

GINKOCEL 36,68 9,37 6,73 52,79VULKAN 429,46 107,57 24,03 561,06GINKALERT 275,09 94,34 26,76 396,19

Tablica 9. Fenolne kiseline u pripravcima ginka

UZORAK Fenolne kiseline (mg/100 g)

Kafeinska kiselina

Klorogeničan kiselina

Neoklorogenična kiselina

p-kumarinska

kiselina

Ukupno

GINKOCEL n.d. n.d. n.d. 9,63 9,63VULKAN 1154,71 22,24 55,72 n.d. 1232,67GINKALERT 297,48 186,48 392,87 32,32 909,15

n.d. = nije detektirana

61

GINKOCEL

VULKAN

GINKOALERT

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

Kvercetin Kamferol Izorhamentin

Slika 22. Raspodjela (% u ukupnoj količini flavonola) pojedinih flavonola u ispitivanim

uzorcima.

GINKOCEL

VULKAN

GINKOALERT

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

p-kumarinska kiselina Kafeinska kiselinaKlorogenska kiselina Neoklorogenska kiselina

Slika 23. Raspodjela (% u ukupnoj količini fenolnih kiselina) pojedinih fenolnih kiselina u

ispitivanim uzorcima.

62

Na Slikama 24 - 27 prikazani su kromatogrami uzoraka pripravaka ginka korištenih u

istraživanju s identificiranim fenolnim kiselinama i flavonolima snimljeni na 310, 324, 328 i 370

nm.

Slika 24. HPLC kromatogrami uzoraka snimljeni na 310 nm s prikazom p-kumarinske kiseline

63

Slika 25. HPLC kromatogrami uzoraka snimljeni na 324 nm s prikazom kafeinske kiseline

64

Slika 26. HPLC kromatogrami uzoraka snimljeni na 328 nm s prikazom klorogenske i

neoklorogenske kiseline

65

Slika 27. HPLC kromatogrami uzoraka snimljeni na 370 nm s prikazom identificiranih flavonola

66

4.2 Agregacija trombocita

Izmjereno je produženo vrijeme agregacije s ADP-om kao agonistom u skupinama b ginko

(p=0,025), c vulkan (p=0,004), e varfarin (p=0,0007), j GOI (p=0,035), te skupinama h

ginko+varfarin (p=0,035) i i ginko+salicilna (p=0,0014) u odnosu na kontrolnu skupinu.

Agregacija s kolagenom produžena je samo u skupini e varfarin u odnosu na kontrolu (p=0,048)

(Slika 28).

a kontro

lab gin

ko

c vulka

n

d salici

lna kis.

e varf

arin

f vulk+

varfa

r

g vulka

n+salic

h ginko+va

rfarin

i ginko+ s

alic j GOI

0

5

10

15

20

25

30

35b,c,e,h,i,j

aa,d

c,e,i

a,d,a

a,d

ae

a

Agregacija trombocita

Agregacija s ADP Agregacija s kolagenom

Agre

gacij

a tro

mbo

cita (

U=AU

/min

)

Slika 28. Utjecaj pripravaka na agregaciju trombocita s ADP i kolagenom kao agonistima

agreacije. Slova a, b, c, d, e, f, g, h, i j iznad stupaca označavaju statistički značjane razlike

(p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za agregaciju trombocita s ADP i s kolagenom.

67

4.3 Koagulacija i hematološki parametri kod pokusnih životinja

4.3.1 Protrombinsko vrijeme (PV) i Aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme

(APTV)

Izmjereno je blaže produženo protrombinsko vrijeme u skupini obrađenoj vulkanom u odnosu na

druga dva pripravka s pripravkom ginka, ginkocel i ginkalert (p=0,025; p=0,025).

Izmjerili smo i produženo APTV u skupini e varfarin (p=0,02) i h ginko+varfarin (p=0,004) u

odnosu na kontrolu i gotovo sve obrađene skupine. Razlike nisu utvrđene između skupina

obrađenih samo varfarinom i samo ginkom (Tablica 10).

Tablica 10. Protrombinsko vrijeme (PV) izraženo u % i aktivirano parcijalno tromboplastinsko

vrijeme (APTV) u sekundama (s) kod obrađenih životinja.

Oznaka skupine X PV(%)

SD median min max P X APTV(s)

SD median min max P

a kontrola 116,47 ±2,75 117,4 112,8 119 ns 20,35 ±0,74 20,2 19,3 21,3 e,h

b ginko 119,26 ±2,84 119,6 115,4 123,1 c,f,h 20,74 ±1,22 20,5 19,4 22,0 e,h

c vulkan 112,30 ±3,00 110,9 109,7 117,1 b,d,j 20,34 ±0,68 20,3 19,5 21,2 e,h

d salicilna kis. 119,98 ±6,29 120,7 109,5 125,2 c,f,h 19,96 ±1,41 20,6 18,2 21,6 e,h

e varfarin 116,85 ±7,32 116,7 108,1 125,9 ns 21,98 ±1,10 22,0 20,7 23,3 a,c,d,g,i,j

f vulk+ varfar

112,54 ±5,42 114,9 105,9 117,8 b,d,j 20,62 ±0,62 20,4 20,1 21,7 h

g vulkan+salic 117,06 ±2,47 117 113,7 120,3 ns 19,54 ±0,89 19,5 18,5 20,7 e,h

h ginko+varfarin

112,20 ±4,91 110 108,5 120,6 b,d,j 22,24 ±0,56 22,1 21,6 23,1 a,b,c,d,f,g,i,j

i ginko+ salic

115,80 ±3,76 117,9 109,8 118,6 ns 20,46 ±1,32 20,4 18,8 22,0 e,h

j GOI 119,22 ±5,54 117,1 114,5 128,7 c,f,h 19,32 ±1,42 19,1 17,3 21,2 b,e,h

X = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; P = statistička značajnost; min= minimum; max= maksimum.a, d, e, f, g, h, i, j = statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za vrijednost PV (%) i APTV (s); ns = nije statistički značajno (p>0,05).

68

4.3.2 Trombinsko vrijeme (TV) i koncentracija fibrinogen

Izmjerena je viša koncentracija fibrinogena u skupini f vulkan+varfarin u odnosu na kontrolu

(p=0,036). Trombinsko vrijeme, vrijeme potrebno za cijepanje fibrinogena i stvaranje fibrinskog

ugruška, nije se statistički razlikovalo između skupina pa ni u skupini u kojoj je zabilježena viša

koncentracija fibrinogena (Tablica 11).

Tablica 11. Trombinsko vrijeme (TV) u sekundama (s) i koncentracija fibrinogena (fib) u

gramima po litri (g/L) kod obrađenih životinja.

Oznaka skupine X TV (s)

SD median min max P X fib(g/L)

SD median min max P

a kontrola 91,23 ±3,52 91,70 86,10 94,40 ns 1,08 ±0,04 1,1 1,0 1,1 f

b ginko 87,90 ±3,37 88,72 83,70 92,50 ns 1,14 ±0,05 1,1 1,1 1,2 ns

c vulkan 90,26 ±3,15 89,10 87,10 92,00 ns 1,10 ±0,00 1,1 1,1 1,1 ns

d salicilna kis. 88,20 ±11,09 88,70 77,00 104,50 ns 1,24 ±0,11 1,2 1,1 1,4 ns

e varfarin 81,65 ±6,54 83,80 72,40 86,60 ns 1,23 ±0,19 1,2 1,1 1,5 ns

f vulk+ varfar

86,76 ±3,54 86,45 80,80 92,00 ns 1,50 ±0,68 1,2 1,1 2,7 a

g vulkan+salic 83,74 ±2,72 84,50 80,80 86,80 ns 1,10 ±0,10 1,1 1,0 1,2 ns

h ginko+varfarin

95,31 ±4,29 93,20 90,80 101,90 ns 1,42 ±0,67 1,1 1,0 2,6 ns

i ginko+ salic

83,18 ±5,79 85,30 75,60 88,80 ns 1,12 ±0,04 1,1 1,1 1,2 ns

j GOI 79,06 ±8,60 77,10 71,10 93,20 ns 1,24 ±0,21 1,2 1,1 1,6 ns

X = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; P = statistička značajnost; min.= minimum; max= maksimum.a, d, e, f, g, h, i, j = statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za vrijednost TV (s) i fib (g/L); ns = nije statistički značajno (p>0,05).

69

4.3.3 Broj leukocita (L) i trombocita (Tr) u punoj krvi

Mjerenjem broja krvnih stanica (leukocita i trombocita) u uzorku pune krvi nismo našli

statistički značajna odstupanja (p≤0,05) u smislu leukocitoze (povećan broj leukocita) niti

leukopenije (smanjen broj leukocita). Utvrdili smo statistički značajnu trombocitozu (veći broj

trombocita) u skupini c vulkan (p=0,045) u odnosu na kontrolu (Tablica 12).

Tablica 12. Broj leukocita (L) i trombocita (Tr) (x109/L) u punoj krvi obrađenih životinja.

Oznaka skupine X L (x109/L)

SD median min max P X Tr(x109/L)

SD median min max P

a kontrola 1,50 ±0,34 1,35 1,30 2,00 ns 684,80 ±40,2 678,5 632 737 c

b ginko 2,10 ±1,23 1,70 1,20 4,20 ns 780,40 ±209,2 715 573 1121 ns

c vulkan 2,02 ±0,74 2,20 1,10 2,70 ns 801,40 ±61,6 772 744 898 a

d salicilna kis. 1,58 ±0,47 1,70 1,10 2,20 ns 693,60 ±123,6 694 500 814 ns

e varfarin 1,70 ±0,16 1,70 1,50 1,90 ns 720,30 ±66,6 737 647 777 ns

f vulk+ varfar

2,14 ±0,91 1,80 1,10 3,50 ns 730,20 ±53,7 751 659 794 ns

g vulkan+salic 2,10 ±0,90 2,10 0,80 3,20 ns 754,20 ±67,9 786 674 816 ns

h ginko+varfarin

1,40 ±0,46 1,10 1,00 1,90 ns 783,30 ±30,7 787 751 812 ns

i ginko+ salic

2,20 ±1,17 2,50 1,00 3,80 ns 750,80 ±60,1 771 665 818 ns

j GOI 2,30 ±2,19 1,50 0,70 6,10 ns 684,80 ±40,2 728 698 804 c

X = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; P = statistička značajnost; min=minimum; max=maksimum.a, d, e, f, g, h, i, j = statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za broj leukocita i trombocita (x109/L); ns = nije statistički značajno (p>0,05).

70

4.3.4 Broj eritrocita u punoj krvi

Utvrđena je statistički niža vrijednost broja eritrocita u skupini f vulkan+varfarin u odnosu na

sam vulkan (p=0,007) i vulkan u kombinaciji sa salicilnom kiselinom (p=0,042), kao i u odnosu

na skupinu obrađenu mješavinom ginka i biljaka. Statistički značajna razlika utvrđena je u

većem broju eritrocita u skupini c vulkan u odnosu na skupinu d salicina kiselina. U skupini e

varfarin izmjerena je niža vrijednost hemoglobina u odnosu na skupine obrađene varfarinom i

biljnim pripravcima, odnosno kontrolnu skupinu (p<0,001) (Tablica 13).

Tablica 13. Broj eritrocita (Er) (x1012/L) i koncentracija hemoglobina (Hgb) (g/L) u punoj krvi

obrađenih životinja.

Oznaka skupine X Er (x1012/L)

SD median min max P X Hgb (g/L)

SD median min max P

a kontrola 7,06 ±0,38 6,91 6,80 7,63 ns 130 ±4,72 128,5 127 137 e

b ginko 7,04 ±0,29 6,91 6,90 7,56 ns 131 ±3,39 130 129 137 e

c vulkan 7,22 ±0,29 7,29 6,74 7,54 d,f 131 ±3,56 132 125 134 e

d salicilna kis. 6,81 ±0,29 6,82 6,47 7,17 c 127 ±3,85 127 123 133 e

e varfarin 6,96 ±0,38 7,26 6,63 7,33 ns 91 ±43,91 127 53 131 a,b,c,d,f,g,h,i,j

f vulk+ varfar

6,67 ±0,26 6,64 6,35 7,08 c,g,h,i,j

125 ±3,67 126 119 129 e

g vulkan+salic 7,08 ±0,36 7,22 6,62 7,49 f 132 ±4,83 134 126 137 e

h ginko+varfarin

7,07 ±0,24 14,44 6,65 7,20 f 130 ±3,13 131 124 131 e

i ginko+ salic

7,07 ±0,33 7,16 6,63 7,57 f 128 ±4,76 129 121 134 e

j GOI 7,13 ±0,22 7,04 6,93 7,47 f 130 ±4,72 131 123 134 e

X = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; P=statistička značajnost; min=minimum; max=maksimum.a, d, e, f, g, h, i, j = statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja u broju eritrocita (x1012/L) i koncentraciji hemoglobina (g/L); ns = nije statistički značajno (p>0,05).

71

4.3.5 Hematokrit (Htc) i procjena viskoznosti pune krvi (VPK)

Hematokrit je u skupini c vulkan bio statistički značajno veći (p≤0,05) u odnosu na skupinu

obrađenu vulkanom i varfarinom (p=0,017). Također je značajna razlika u vrijednostima

hematokrita između skupina d salicilna kiselina i c vulkan (p=0,025).

Obzirom na razlike u hematokritu i koncentraciji proteina, izračunali smo viskoznost, ali nije

bilo statistički značajne razlike (p≤0,05) među skupinama obrađenih životinja (Tablica 14).

Tablica 14. Hematokrit (Htc) (%) i viskoznost pune krvi (VPK) (cP) obrađenih životinja.

Oznaka skupine X Htc(%)

SD median min max P X VPK(cP)

SD median min max P

a kontrola 41,32 ±1,58 40,9 40,0 43,6 ns 5,41 ±0,29 5,39 5,10 5,78 ns

b ginko 41,14 ±1,44 40,6 40,2 43,7 ns 5,68 ±0,53 5,52 5,25 6,58 ns

c vulkan 42,16 ±1,60 42,5 39,5 43,7 d,f 5,59 ±0,24 5,54 5,28 5,87 ns

d salicilna kis. 39,78 ±1,47 40,2 37,9 41,3 c 5,26 ±0,15 5,32 5,02 5,41 ns

e varfarin 40,90 ±1,52 41,9 39,6 42,5 ns 5,40 ±0,21 5,46 5,24 5,67 ns

f vulk+ varfar

39,62 ±1,21 39,6 37,7 40,8 c,g 5,29 ±0,30 5,21 4,93 5,76 ns

g vulkan+salic 41,72 ±1,89 42,2 39,3 43,9 f 5,43 ±0,17 5,36 5,24 5,64 ns

h ginko+varfarin

41,20 ±1,58 41,7 38,4 42,1 ns 5,36 ±0,15 5,40 5,21 5,50 ns

i ginko+ salic

41,16 ±1,88 41,5 38,5 43,7 ns 5,47 ±0,28 5,51 5,10 5,83 ns

j GOI 41,68 ±1,83 41,9 38,8 43,8 ns 5,60 ±0,14 5,56 5,41 5,76 ns

X = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; P=statistička značajnost; min=minimum; max=maksimum.a, d, e, f, g, h, i, j = statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja u hematokritu (Htc) (%) i viskoznosti krvi (cP); ns = nije statistički značajno (p>0,05).

72

4.4 Patohistološke promjene u organima obrađenih životinja i kontrole

Histopatološkom obradom bubrega, jetre i slezene nisu uočene razlike između organa obrađenih

i kontrolnih životinja. Glomeruli i kanalići bubrega bez bitnijih promjena kod obrađenih

životinja u odnosu na kontrolnu skupinu. U tkivu jetre nisu nađene promjene u smislu oštećenja

parenhima ili fibroze. Slezena veličinom bez razlike među skupinama. Nema žarišta nekroze

(Slika 29 i 30).

a) b)

Slika 29. Histopatološki prikaz bubrega životinja kontrolne skupine, a) prikaz bubrežnih

glomerula, b) prikaz bubrežnih kanalića.

a) b)

Slika 30. a) Histopatološki prikaz jetre životinja kontrolne skupine, b) Histopatološki prikaz

slezene životinja kontrolne skupine.

73

4.5 Procjena oksidativnog stresa u organima i krvi

4.5.1 Aktivnost superoksid dismutaze (SOD)

4.5.1.1 Aktivnost SOD u jetri

Izmjerena je veća aktivnost SOD u jetri u skupini e varfarin (770,05 U/mg proteina) u odnosu na

ostale obrađene životinje. U skupinama c vulkan, d salicilna kiselina, g vulkan+salicilna, h

ginko+varfarin, i ginko+salicilna i j GOI izmjerena je statistički značajno (p≤0,05) manja

aktivnost SOD u jetri u odnosu na kontrolnu skupinu (568,11 U/mg proteina). Statistički

značajno (p≤0,05) manja aktivnost SOD utvrđena je u skupini d salicilna kiselina u odnosu na

skupinu f vulkan+varfarin (p=0,029) (Slika 31).

a kontro

lab gin

ko

c vulka

n

d salici

lna kis.

e varf

arin

f vulk+

varfa

r

g vulka

n+salic

h ginko+va

rfarin

i ginko+ s

alic j GOI

0100200300400500600700800900

c,d,g,h,i,j

e

a,e a,e,f

b,c,d,f,g,h,i,j

d,e

a,ea,e a,e a,e

Aktivnost SOD u jetri

SOD

U/m

g pro

t jet

re

Slika 31. Aktivnost SOD (U/mg proteina) enzima u jetri. a, b, c, d, e, f, g, h, i, j slova iznad

stupaca označavaju statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za

aktivnost SOD (U/mg proteina) u jetri.

74

4.5.1.2 Aktivnost SOD u bubrezima

Aktivnost SOD u bubrezima veća je u skupinama i ginko+salicilna (20,13 U/mg proteina) i j

GOI (23,62 U/mg proteina) u odnosu na kontrolu (p=0,032 i p=0,004) i ostale skupine osim d

salicilna kiselina (Slika 32).

a kon

trola

b gink

o

c vulkan

d sali

cilna

kis.

e varf

arin

f vulk

+ varf

ar

g vulka

n+sal

ic

h gink

o+var

farin

i ginko

+ sali

cj G

OI0

5

10

15

20

25

i,j

ji,j

j

i,ji,j j

a,c,f,g

Aktivnost SOD u bubrezima

SO

D U/

mg

prot

bub

rega

Slika 32. Aktivnost SOD u bubrezima. a, b, c, e, f, g, h, i, j slova iznad stupaca označavaju

statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za aktivnost SOD (U/mg

proteina) u bubrezima.

75

4.5.1.3 Aktivnost SOD u slezeni

Aktivnost SOD u slezeni u skupinama d salicilna kiselina, e varfarin, f vulkan+varfarin, g

vulkan+salicilna, h ginko+varfarin i j GOI je manja u odnosu na kontrolu (53,24 U/mg prot).

Veća aktivnost SOD u slezeni životinja iz skupine b ginko i c vulkan u odnosu na skupine

obrađene istim pripravcima u kombinaciji s lijekovima (Slika 33).

a kontro

lab gin

ko

c vulka

n

d salici

lna kis.

e varf

arin

f vulk+

varfa

r

g vulka

n+salic

h ginko+va

rfarin

i ginko+ s

alic j GOI

0

10

20

30

40

50

60

70

80 d,e,f,g,h,i,jf,g,h,i,j

d,e,f,g,h,i,j

a,c a,ca,b,c

a,b,ca,b,c

a,b,c a,b,c

Aktivnost SOD u slezeni

SOD

U/m

g pro

t sle

zene

Slika 33. Aktivnost SOD (U/mg proteina) enzima u slezeni. a, b, c, d, e, f, g, h, i, j slova iznad

stupaca označavaju statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za

aktivnost SOD (U/mg proteina) u slezeni.

76

4.5.1.4 Aktivnost SOD u mozgu

Izmjerena je statistički značajno (p≤0,05) veća aktivnost u prefrontalnoj regiji mozga životinja iz

skupine f vulkan+varfarin u odnosu na sve ostale skupine pokusnih životinja. Pad aktivnosti

statistički je značajan (p≤0,05) u kortikalnom dijelu mozga kod životinja skupine j goi obrađenih

ginkalertom, te u regijama malog mozga kod životinja obrađenih acetilsalicilnom kiselinom

(Slika 34).

77

a kontro

lab gin

ko

c vulka

n

d salici

lna kis.

e varf

arin

f vulk+

varfa

r

g vulka

n+salic

h ginko

+varfa

rin

i ginko

+ salic j G

OI0

0.5

1

1.5

2

2.5

f f,j f,j f,j f,j

a,b,c,d,e,g,h,i,j

f,j f,j f,jb,c,d,e,f,g,h,i

j i,j j jc

a,c,f,g

d

a,g

d,j

g

Aktivnost SOD u različitim regijama mozga

Prefrontalni korteks SOD Korteks SOD Mali mozak SOD

SOD

U/m

g pro

t moz

ga

Slika 34. Aktivnost SOD u različitim regijama mozga. a ,b ,c ,d ,e ,f ,g ,h ,i ,j slova iznad stupaca označavaju statistički značajne

razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za aktivnost SOD (U/mg proteina) u različitim regijama mozga.

78

4.5.1.5 Aktivnost SOD u eritrocitima

U eritrocitima izmjerena je manja aktivnost SOD u skupinama d salicilna (0,444 U/mg Hb), e

varfarin (0,427 U/mg Hb), f vulkan+varfarin (0,253 U/mg Hb), h ginko+varfarin (0,403 U/mg

Hb), i ginko+salicilna (0,322 U/mg Hb) u odnosu na skupinu a kontrola. Statistički značajno

(p≤0,05) veća aktivnost SOD utvrđena je u skupini j GOI u odnosu na skupinu d salicilna

kiselina (p=0,046), e varfarin (p=0,036), f vulkan+varfarin (p=0,002), h ginko+varfarin

(p=0,016) i i ginko+salicilna (p=0,002) (Tablica 15).

Tablica 15. Aktivnost SOD (U/mg Hgb) u eritrocitima (Er).

Er SOD  (U/mg Hgb)      Oznaka skupine X ± SD Medijan Min. Max. P a kontrola 0,82 ± 0,08 0,84 0,70 0,89 d,e,f,g,h,ib ginko 0,57 ± 0,17 0,48 0,42 0,74 nsc vulkan 0,54 ± 0,26 0,54 0,27 0,90 ns d salicilna kis. 0,48 ± 0,08 0,44 0,40 0,58 a,je varfarin 0,45 ± 0,22 0,43 0,20 0,74 a,jf vulk+ varfar 0,31 ± 0,14 0,25 0,18 0,46 a,jg vulkan+salic 0,50 ± 0,17 0,57 0,25 0,65 a,jh ginko+varfarin 0,42 ± 0,22 0,40 0,22 0,78 a,ji ginko+ salic 0,31 ± 0,10 0,32 0,16 0,42 a,jj GOI 0,75 ± 0,39 0,59 0,31 1,19 d,e,f,h,i

X = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; P = statistička značajnosta, d, e, f, g, h, i, j = statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za aktivnost SOD (U/mg Hgb) u eritrocitima; ns = nije statistički značajno (p>0,05).

79

4.5.1.6 Aktivnost SOD u plazmi

Vrijednosti SOD u plazmi značajno se razlikuju u skupinama d salicilna kiselina (p=0,025), e

varfarin (p=0,004) i f vulkan+varfarin (p=0,000) u odnosu na a kontrolnu skupinu. U skupini c

vulkan izmjerena aktivnost SOD (1,27 U/mg prot) statistički je značajno (p≤0,05) manja od

skupine f vulkan+varfarin (2,52 U/mg prot) (p=0,000), a veća od aktivnosti SOD u skupini g

vulkan+salicilna (0,78 U/mg prot) (p=0,046). Aktivnost SOD u skupini f vulkan+varfarin (2,52

U/mg prot) značajno (p=0,000) je veća od vrijednosti svih ostalih skupina životinja (Tablica 16).

Tablica 16. Aktivnost SOD u plazmi siromašnoj trombocitima (PPP).

PPP SOD (U/mg prot plazme)

       

Oznaka skupine X ± SD Medijan Min. Max. P a kontrola 0,85 ± 2,98 0,88 0,40 1,23 d,e,fb ginko 0,83 ± 2,60 0,76 0,40 1,28 d,e,fc vulkan 1,27 ± 2,86 1,15 0,95 1,81 f,gd salicilna kis. 1,43 ± 2,46 1,36 1,08 1,96 a,b,f,g,ie varfarin 1,65 ± 2,08 1,47 1,41 2,27 a,b,f,g,h,if vulk+ varfar 2,52 ± 4,12 2,84 2,06 3,04 a,b,c,d,e,g,h,i

,jg vulkan+salic 0,78 ± 3,73 0,73 0,59 1,17 c,d,e,fh ginko+varfarin 1,05 ± 6,64 1,06 0,40 1,91 e,fi ginko+ salic 0,94 ± 4,61 1,03 0,60 1,24 d,e,fj GOI 1,22 ± 4,60 1,31 0,81 1,62 f

X = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; P = statistička značajnosta, d, e, f, g, h, i, j = statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za aktivnost SOD (U/mg proteina) u plazmi.

80

4.5.1.7 Aktivnost SOD u plazmi bogatoj trombocitima

Izmjerena je manja aktivnost SOD u plazmi bogatoj trombocitima u skupinama g

vulkan+salicilna (p=0,007), h ginko+varfarin (p=0,010), i ginko+salicilna (p=0,001) i j goi

(p=0,002) u odnosu na skupinu a kontrolu (1,6 U/mg prot). Aktivnost SOD veća je u skupini f

vulkan+varfarin u odnosu na a kontrou, b ginko (p=0,000), c vulkan (p=0,000), d salicilna

(p=0,000), e varfarin (p=0,001), g vulkan+salicilna (p=0,000), h ginko+varfarin (p=0,000), i

ginko+salicilna (p=0,000) i j GOI (p=0,000). Aktivnost SOD u trombocitima životinja iz skupine

b ginko i d salicilna kiselina veće su u odnosu na skupine h ginko+varfarin, i ginko+salicilna i j

GOI. U odnosu na skupinu c vulkan izmjerena je veća aktivnost SOD u plazmi bogatoj

trombocitima u skupini f vulkan+varfarin (p=0,000), a manja u skupinama g vulkan+salicilna

(p=0,013) (Tablica 17).

Tablica 17. Aktivnost SOD u plazmi bogatoj trombocitima (PRP).

PRP (U/mg prot) 

 SOD      

Oznaka skupine X ± SD Medijan Min. Max. P a kontrola 1,60 ± 0,38 1,61 1,21 1,98 f,g,h,i,jb ginko 1,71 ± 0,49 1,95 0,87 2,04 f,g,h,i,jc vulkan 1,49 ± 0,61 1,24 1,04 2,55 e,f,g,h,i,jd salicilna kis. 1,77 ± 0,55 1,58 1,30 2,58 f,g,h,i,je varfarin 2,24 ± 0,41 2,27 1,71 2,71 c,f,g,h,i,jf vulk+ varfar 3,31 ± 0,82 2,81 2,64 4,40 a,b,c,d,e,g,h,i

,jg vulkan+salic 0,74 ± 0,25 0,67 0,46 1,09 a,b,c,d,e,fh ginko+varfarin 0,78 ± 0,15 0,78 0,60 0,98 a,b,c,d,e,fi ginko+ salic 0,50 ± 0,10 0,52 0,33 0,60 a,b,c,d,e,fj GOI 0,57 ± 0,17 0,57 0,40 0,83 a,b,c,d,e,f

X = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; P = statistička značajnosta, d, e, f, g, h, i, j = statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za aktivnost SOD (U/mg proteina) u plazmi bogatoj trombocitima.

81

4.5.2 Aktivnost katalaze u organima i krvi

4.5.2.1 Aktivnost katalaze u jetri

Aktivnost katalaze u jetri statistički značajno (p≤0,05) je veća u skupini f vulkan+varfarin

(15733,75 U/mg prot) u odnosu na sve ostale skupine, osobito u odnosu na b ginko (p=0,001), c

vulkan (p=0,000) i j GOI (p=0,000) (Slika 35).

a kontro

lab gin

ko

c vulka

n

d salici

lna kis.

e varf

arin

f vulk+

varfa

r

g vulka

n+salic

h ginko+va

rfarin

i ginko+ s

alic j GOI

02000400060008000

1000012000140001600018000

f

f f

f

j

a,b,c,d,g,h,i,j

ff

f

e,f

Aktivnost katalaze u jetri

CAT

U/

mg p

rot j

etre

Slika 35. Aktivnost katalaze (U/mg proteina) u jetri. a, b, c, d, e, f, g, h, i, j slova iznad stupaca

označavaju statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za aktivnost

katalaze (U/mg proteina) u jetri.

82

4.5.2.2 Aktivnost katalaze u bubrezima

Za razliku od tkiva jetre, aktivnost katalaze u bubrezima je statistički manja u skupini f

vulkan+varfarin (2,31 U/mg prot) u odnosu na skupinu b ginko (p=0,003) i e varfarin (p=0,018).

Manja aktivnost katalaze u skupini j GOI je u odnosu na skupinu b ginko (p=0,009) (Slika 36).

a kontro

la

b ginko

c vulkan

d salic

ilna k

is.

e varf

arin

f vulk+ varf

ar

g vulkan+sal

ic

h ginko+varf...

i ginko+ sa

lic j GOI

0

2

4

6

8

10

12Aktivnost katalaze u bubrezima

CAT

U/m

g pr

ot b

ubre

ga

Slika 36. Aktivnost katalaze (U/mg proteina) u bubrezima. a, b,c, d, e, f, g, h, i, ,j slova iznad

stupaca označavaju statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za

aktivnost katalaze (U/mg proteina) u bubrezima.

83

4.5.2.3 Aktivnost katalaze u slezeni

U slezeni je izmjerena statistički značajno (p≤0,05) manja aktivnost katalaze u skupini b ginko

(15,15 U/mg prot) u odnosu na a kontrolu (p=0,034), c vulkan, d salicilna kiselina, f

vulkan+varfarin i j GOI. U skupini d salicilna kiselina izmjerena je veća aktivnost katalaze u

slezeni (30,40 U/mg prot) u odnosu na skupinu g vulkan+salicilna (p=0,013) i i ginko+salicilna

(p=0,016). Ginko u kombinaciji s varfarinom nije doveo do statistički značajnije (p≤0,05)

promjene aktivnosti katalaze u odnosu na skupinu tretiranu samo varfarinom dok je u skupini f

vulkan+varfarin izmjerena statistički značajno (p≤0,05) veća aktivnost katalaze u odnosu na

skupinu e varfarin (p=0,033) (Slika 37).

a kon

trola

b gink

o

c vulk

an

d sali

cilna k

is.

e varf

arin

f vulk

+ varfa

r

g vulka

n+sal

ic

h gink

o+var

f...

i gink

o+ sa

lic j GOI

0

2

4

6

8

10

12Aktivnost katalaze u slezeni

CAT

U/m

g pr

ot sl

ezen

e

Slika 37. Aktivnost katalaze (U/mg proteina) u slezeni. a, b, c, d, e, f, g, h, i, j slova iznad

stupaca označavaju statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za

aktivnost katalaze (U/mg proteina) u slezeni.

84

4.5.2.4 Aktivnost katalaze u različitim regijama mozga

Aktivnost katalaze najveća je u malom mozgu, kako u kontrolnoj skupini tako i u svim ostalim

skupinama osim kod skupine životinja obrađenih ginkom+varfarin. Statistički značajno (p≤0,05)

veća aktivnost katalaze izmjerena je u prefortalnom korteksu životinja obrađenih vulkanom u

odnosu na životinje obrađene vulkanom i salicilnom kiselinom. Veća aktivnost u malom mozgu

životinja iz skupine i ginko+salicilna kiselina je u odnosu na životinje iz skupine b ginko, h

ginko+varfarin i j GOI (Slika 38).

85

a kontro

la

b ginko

c vulka

n

d salici

lna kis.

e varf

arin

f vulk+

varfa

r

g vulka

n+salic

h ginko

+varfa

rin

i ginko

+ salic j G

OI0

0.51

1.52

2.53

3.54

ii

b,h,jig c

Aktivnost katalaze u različitim regijama mozga

Prefrontalni korteks Korteks Mali mozak

CAT

U/m

g pr

ot m

ozga

Slika 38. Aktivnost katalaze u različitim regijama mozga. a, b, c, d, e, f, g, h, i, j slova iznad stupaca označavaju statistički značajne

razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za aktivnost SOD (U/mg proteina) u različitim regijama mozga.

86

4.5.2.5 Aktivnost katalaze u eritrocitima

U uzorcima eritrocita izmjerene su različite aktivnosti katalaze za sve pokusne skupine. U

odnosu na skupinu a kontrolu statistički značajno (p≤0,05) manja aktivnost izmjerena je u

skupinama e varfarin (p=0,047), f vulkan+varfarin (p=0,009), g vulkan+salicilna (p=0,006), h

ginko+varfarin (p=0,018), i ginko+ salicilna (p=0,000) i j GOI (p=0,007). U odnosu na skupinu b

ginko izmjerena je statistički značajno (p≤0,05) manja aktivnost katalaze u skupini c vulkan

(p=0,036), d salicina kiseina (p=0,006), e varfarin (p=0,000), f vulkan+varfarin (p=0,000), g

vulkan+salicilna (p=0,000), h ginko+varfarin (p=0,000), i ginko+salicina (p=0,000) i j GOI

(p=0,000). U skupini i ginko+salicilna izmjerena je manja aktivnost katalaze u odnosu na

skupinu d salicilna (p=0,006) (Tablica 18).

Tablica 18. Aktivnost katalaze u eritrocitima

Er CAT (U/mg Hb)

       

Oznaka skupine X ± SD Medijan Min. Max. P a kontrola 16,42 ± 6,20 15,85 10,39 23,61 e,f,g,h,i,jb ginko 20,86 ± 1,92 21,45 17,92 23,04 c,d,e,f,g,h,i,jc vulkan 15,37 ± 6,04 15,63 5,72 22,25 b,f,g,h,i,jd salicilna kis. 13,44 ± 4,02 14,95 7,49 17,44 b,ie varfarin 10,63 ± 3,58 10,06 6,90 15,49 a,bf vulk+ varfar 9,08 ± 3,84 7,85 6,23 15,80 a,b,cg vulkan+salic 8,58 ± 2,67 8,24 5,98 12,11 a,b,ch ginko+varfarin 9,77 ± 3,33 9,23 6,73 15,32 a,b,ci ginko+ salic 6,01 ± 3,49 4,56 4,19 12,24 a,b,c,dj GOI 8,77 ± 3,44 7,86 4,43 12,76 a,b,c

X = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; P = statistička značajnosta, b, c, d, e, f, g, h, i, j = statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za aktivnost katalaze (U/mg Hgb) u eritrocitima.

87

4.5.2.6 Aktivnost katalaze u plazmi siromašnoj trombocitima

Aktivnost katalaze u plazmi siromašnoj trombocitima u skupini h ginko+varfarin statistički

značajno različita je u odnosu na skupine a kontrola (p=0,004), b ginko (p=0,005), c vulkan

(p=0,023), e varfarin (p=0,016), f vulkan+varfarin (p=0,003), g vulkan+salicilna (p=0,005), i

ginko+salicilna (p=0,001) i j GOI (p=0,001) (Tablica 19).

Tablica 19. Aktivnost katalaze u plazmi siromašnoj trombocitima

PPP CAT(U/mg prot)

       

Oznaka skupine X ± SD Medijan Min. Max. P a kontrola 1,89 ± 0,77 1,84 1,09 2,81 hb ginko 2,09 ± 0,37 2,25 1,67 2,53 hc vulkan 2,49 ± 1,12 2,16 1,47 4,34 hd salicilna kis. 2,90 ± 0,68 2,94 2,17 3,73 he varfarin 2,28 ± 0,58 2,19 1,72 3,01 hf vulk+ varfar 1,97 ± 0,49 1,86 1,37 2,72 hg vulkan+salic 2,09 ± 0,35 2,03 1,62 2,54 hh ginko+varfarin 4,09 ± 2,69 2,97 1,91 8,62 a,b,c,d,e,f,g,i,

ji ginko+ salic 1,56 ± 0,51 1,69 1,02 2,15 hj GOI 1,57 ± 0,68 1,51 0,72 2,47 h

X = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; P = statistička značajnosta, b, c, d, e, f, g, h, i, j = statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za aktivnost katalaze (U/mg proteina) u plazmi.

88

4.5.2.7 Aktivnost katalaze u plazmi bogatoj trombocitima (PRP)

U talogu trombocita iz PRP izmjerena je povećana aktivnost katalaze u skupini f vulkan+varfarin

u odnosu na skupine b ginko (p=0,004), c vulkan (p=0,003), d salicilna kiselina (p=0,027), e

varfarin (p=0,005), h ginko+varfarin (p=0,005), i ginko+salicilna (p=0,008) i j GOI (p=0,001).

Izmjerena je i statistički značajno veća aktivnost katalaze u skupini g vulkan+salicilna u odnosu

na skupinu b ginko (p=0,027), c vulkan (p=0,018), e varfarin (p=0,026), h ginko+varfarin

(p=0,033), i ginko+salicilna (p=0,047) i j GOI (p=0,008) (Tablica 20).

Tablica 20. Aktivnost CAT u plazmi bogatoj trombocitima.

PRP CAT (U/mg prot)

     

Oznaka skupine X ± SD Medijan Min. Max. P vrijednost

a kontrola 18,56 ± 14,67 14,80 13,20 31,42 nsb ginko 8,07 ± 3,57 7,05 4,67 12,14 f,gc vulkan 6,66 ± 2,58 6,84 3,17 9,62 f,gd salicilna kis. 13,68 ± 8,11 10,24 5,21 25,41 fe varfarin 6,81 ± 3,28 6,46 3,21 11,12 f,gf vulk+ varfar 31,06 ± 22,81 20,80 11,05 67,95 b,c,d,e,h,i,jg vulkan+salic 25,47 ± 24,65 15,18 7,87 68,71 b,c,e,h,i,jh ginko+varfarin 8,70 ± 7,86 5,40 2,62 22,13 f,gi ginko+ salic 9,90 ± 4,55 8,24 5,04 17,16 f,gj GOI 4,15 ± 2,02 2,90 2,60 7,34 f,g

X = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; P = statistička značajnosta, b, c, d, e, f, g, h, i, j = statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za aktivnost katalaze (U/mg proteina) u plazmi bogatoj trombocitima; ns = nije statistički značajno

89

4.5.3 Koncentracija malondialdehida (MDA) u organima i krvi

4.5.3.1 Koncentracija MDA u jetri

MDA kao produkt lipidne peroksidacije u jetri je izmjeren viši u skupini f vulkan+varfarin u

odnosu na skupine b ginko (p=0,011), c vulkan (p=0,012), d saicilna (p=0,029), g

vulkan+salicilna (p=0,005), h ginko+varfarin (p=0,006), i ginko+saicilna (p=0,005) i j GOI

(p=0,000) (Slika 39). Najniža koncentracija MDA u jetri izmjerena je u skupini j GOI.

a kontro

lab gin

ko

c vulka

n

d salici

lna kis.

e varf

arin

f vulk+

varfa

r

g vulka

n+salic

h ginko+va

rfarin

i ginko+ s

alic j GOI

02468

1012141618

ff

fj

b,c,d,g,h,i,j

ff

f

e,f

Koncentracija MDA u jetri

MDA

nm

ol/m

g pro

t jet

re

Slika 39. Koncentracija MDA (nmol/mg proteina) u jetri. b, c, d, e, f, g, h, i, j slova iznad

stupaca označavaju statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za

koncentraciju MDA (nmol/mg proteina) u jetri.

90

4.5.3.2 Koncentracija MDA u bubrezima

U bubregu je izmjerena niža koncentracija MDA u skupinama g vulkan+salicilna (0,63 nmol/mg

proteina) u odnosu na sve ostale skupine. Koncentracija MDA viša je u bubrezima životinja iz

skupine d salicilna kiselina u odnosu na skupine f vulkan+varfarin (p=0,005), g vulkan+salicilna

(p=0,000), h ginko+varfarin (p=0,000) i i ginko+salicilna (p=0,049). U skupini b ginko

izmjerena je statistički značajno (p≤0,05) viša koncentracija MDA u tkivu bubrega u odnosu na

životinje iz skupine f vulkan+varfarin (p=0,006), g vulkan+salicilna (p=0,000) i h ginko+varfarin

(p=0,023) (Slika 40).

a kontro

lab gin

ko

c vulka

n

d salici

lna kis.

e varf

arin

f vulk+

varfa

r

g vulka

n+salic

h ginko+va

rfarin

i ginko+ s

alic j GOI

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2g

f,g,hg

f,g,h,i

g b,d,ga,b,c,d,e,f,

h,i,j

b,d,g d,g

gKoncentracija MDA u bubrezima

MDA

nmol

/mg p

rot b

ubre

ga

Slika 40. Koncentracija MDA (nmol/mg proteina) u bubrezima. a, b, c, d, e, f, g, h, i, j slova

iznad stupaca označavaju statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih

životinja za koncentraciju MDA (nmol/mg proteina) u bubrezima.

91

4.5.3.3 Koncentracija MDA u slezeni

U slezeni je izmjerena statistički značajno (p≤0,05) niža koncentracija MDA u skupini b ginko

(p=0,018), e varfarin (p=0,002), f vulkan+varfarin (p=0,012), g vulkan+salicilna (p=0,007), h

ginko+varfarin (p=0,003) i ginko+salicilna (p=0,001) u odnosu na skupinu a kontrolu. Izmjerena

je viša koncentracija MDA u skupini c vulkan u odnosu na skupine f vulkan+varfarin (p=0,023) i

g vulkan+salicilna (p=0,013). Izmjerena je viša koncentracija MDA u skupini d salicilna u

odnosu na skupinu i ginko+salicilna (p=0,001) (Slika 41).

a kontro

lab gin

ko

c vulka

n

d salici

lna kis.

e varf

arin

f vulk+

varfa

r

g vulka

n+salic

h ginko+va

rfarin

i ginko+ s

alic j GOI

00.5

11.5

22.5

33.5

44.5

5

b,e,f,g,h,i

a,c

b,e,f,g,h,i e,h,i

a,c,d

a,c a,ca,c,d a,c,d

Koncentracija MDA u slezeni

MDA

nm

ol/m

g pro

t sle

zene

Slika 41. Koncentracija MDA (nmol/mg proteina) u slezeni. a, b, c, d, e, f, g, h, i, j slova iznad

stupaca označavaju statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za

koncentraciju MDA (nmol/mg proteina) u slezeni.

92

4.5.3.4 Koncentracija MDA u različitim regijama mozga

U prefrontalnom koreteksu izmjerena je niža koncentracija MDA u skupinama e varfarin, h

ginko+varfarin i i ginko+salicilna. U korteksu mozga izmjerene su niže koncentracije MDA u

skupinama životinja obrađenih salicilnom kiselinom i g vulkan+salicilna kiselina u odnosu na

kontrolu. U malom mozgu izmjerili smo nižu koncentraciju MDA u skupinama obrađenim

ginkom i lijekovima u odnosu na sam ginko, te niža koncentracija u skupini obrađenoj

ginkalertom (GOI) u odnosu na životinje obrađene ginkom ili vulkanom (Slika 42).

93

a kontro

la

b ginko

c vulka

n

d salici

lna kis.

e varf

arin

f vulk+

varfa

r

g vulka

n+salic

h ginko

+varfa

rin

i ginko

+ salic j G

OI0

0.20.40.60.8

11.21.41.61.8

2e,h,i e,h,i,j

e,h,i a,b,c,f e,h,i a,b,c,f

a,b,c,f

b

d,g

d,g

a,ba,b

h,i,jh,j h

b,c,fb b,c

Koncentracija MDA u različitim regijama mozga

Prefrontalni korteks MDA Srednja vrijednost Korteks MDA Srednja vrijednostMali mozak MDA Srednja vrijednost

MDA

nmol

/mg

prot

moz

ga

Slika 42. Koncentracija MDA (nmol/mg proteina) u različitim regijama mozga. a, b, c, d, e, f, g, h, i, j slova iznad stupaca označavaju

statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za koncentraciju MDA (nmol/mg prot) u različitim regijama

mozga.

94

4.5.3.5 Koncentracija MDA u eritrocitima

Statistički značajno viša koncentracija MDA u eritrocitima izmjerena je u skupini b ginko u

odnosu na skupine a kontrola (p=0,022), c vulkan (p=0,020), d salicina (p=0,003), e varfarin

(p=0,005), f vulkan+varfarin (p=0,001), g vulkan+salicilna (p=0,000), h ginko+varfarin

(p=0,001), i ginko+salicina (p=0,000) i j GOI (p=0,000) (Tablica 21).

Tablica 21. Koncentracija MDA (nmol/mg Hgb) u eritrocitima.

Er MDA (nmol/mgHgb)      

Oznaka skupine X ± SD Medijan Min. Max. P vrijednost a kontrola 0,42 ± 0,17 0,43 0,23 0,57 bb ginko 0,63 ± 0,10 0,64 0,50 0,76 a,c,d,e,f,g,h,i,

jc vulkan 0,42 ± 0,18 0,51 0,16 0,57 b,id salicilna kis. 0,37 ± 0,11 0,37 0,21 0,52 be varfarin 0,36 ± 0,17 0,32 0,21 0,61 bf vulk+ varfar 0,34 ± 0,05 0,36 0,26 0,39 bg vulkan+salic 0,31 ± 0,10 0,34 0,18 0,44 bh ginko+varfarin 0,33 ± 0,10 0,37 0,17 0,44 bi ginko+ salic 0,25 ± 0,18 0,23 0,10 0,54 b,cj GOI 0,29 ± 0,11 0,26 0,16 0,43 b

X = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; P = statistička značajnosta, b, c, d, e, f, g, h, i, j = statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za koncentraciju MDA (nmol/mg Hgb) u eritrocitima.

95

4.5.4 Koncentracija GSH u organima i krvi

4.5.4.1 Koncentracija GSH u jetri

Koncentracija GSH u jetri je viša u skupini e varfarin (125,75 µmol/mg prot) u odnosu na a

kontrolu (p=0,000) i sve ostale skupine. Niža vrijednost izmjerena je u skupinama c vulkan

(p=0,013), f vulkan+varfarin (p=0,040), g vulkan+salicilna (p=0,014), h ginko+varfarin

(p=0,018), i ginko+saicilna (p=0,010) u odnosu na skupinu a kontrolu (Slika 43).

a kontro

lab gin

ko

c vulka

n

d salici

lna kis.

e varf

arin

f vulk+

varfa

r

g vulka

n+salic

h ginko+va

rfarin

i ginko+ s

alic j GOI

0

20

40

60

80

100

120

140

c,e,f,g,h,i c,e,g,i

a,b,ee

a,b,c,d,f,g,h,i,j

a,ea,b,e a,e a,b,e

e

Koncentracija GSH u jetri

GSH

µm

ol/m

g pro

t jet

re

Slika 43. Koncentracija GSH (µmol/mg proteina) u jetri. a ,b ,c ,d ,e ,f ,g ,h ,i ,j slova iznad

stupaca označavaju statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za

koncentraciju GSH (µmol/mg proteina) u jetri.

96

4.5.4.2 Koncentracija GSH u različitim regijama mozga

U prefrontalnom korteksu koncentracija GSH izmjerena je viša u skupinama obrađenim biljnim

pripravcima u kombinaciji s lijekovima te skupini j goi obrađenoj pripravkom ginkalert u odnosu

na kontrolu. U kortikalnoj regiji izmjerena je viša koncentracija GSH u skupinama c vulkan i e

varfarin, g vulkan+salicilna kiselina, h ginko+varfarin, i ginko+salicilna kiselina te j GOI. U

skupinama obrađenim ginkom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom izmjerena je niža

koncentracija GSH u odnosu na kontrolnu skupinu. Porast koncentracije je statistički značajan

(p≤0,05) kod skupina obrađenih vulkan+varfarin, vulkan+salicilna, ginko+varfarin,

ginko+salicilna te ginkalertom. Mjerenje koncentracije GSH u regiji malog mozga pokazalo je

da grupe g vulkan+salicilna, h ginko+varfarin, i ginko+salicilna i j GOI imaju višu koncentraciju

u odnosu na kontrolu (Slika 44).

97

a kontro

la

b ginko

c vulka

n

d salici

lna kis.

e varf

arin

f vulk+

varfa

r

g vulka

n+salic

h ginko

+varfa

rin

i ginko

+ salic j G

OI0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

f,g,h,i,j f,g,h,i,j g,h,i,j f,g,h,i,j g,h,i,ja,b,d,h,i,j

a,b,c,d,e,h,i,j

a,b,c,d,e,f,g

a,b,c,d,e,f,g

a,b,c,d,e,f,gf,g,h,i,j f,g,h,i,j f,g,h,i,j f,g,h,i,j f,g,h,i,j

a,b,c,d,e a,b,c,d,e,j a,b,c,d,e a,b,c,d

e,ja,b,c,d,e

e,g,i

g,h,i,j h,i,j g,h,i,ji,j

a,d a,b,d a,b,d,ea,b,d,e

Koncentracija reduciranog glutationa u različitim regijama mozga

Prefrontalni korteksGSH Srednja vrijednost Korteks GSH Srednja vrijednostMali mozak GSH Srednja vrijednost

GSH

μmol

/mg

prot

moz

ga

Slika 44. Koncentracija GSH (µmol/mg proteina) u različitim regijama mozga. a, b, c, d, e, f, g, h, i, j slova iznad stupaca označavaju

statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za koncentraciju GSH (µmol/mg proteina) u različitim

regijama mozga.

98

4.5.4.3 Koncentracija GSH u eritrocitima

Izmjerena koncentracija GSH u eritrocitima statistički značajno (p≤0,05) je niža u skupini i

ginko+salicilna (0,033 µmol/mg Hgb) u odnosu na skupinu a kontrola (p=0,010), b ginko

(p=0,000), c vulkan (p=0,023), d salicilna (p=0,002), e varfarin (p=0,016) i h ginko+varfarin

(P=0,007). U skupini b ginko izmjerena je statistički značajno (p≤0,05) viša koncentracija GSH

u odnosu na skupine c vulkan (p=0,018), e varfarin (p=0,049), f vulkan+varfarin (p=0,004), g

vulkan+salicilna (p=0,003), i ginko+saicilna (p=0,000) i j GOI (p=0,008) (Tablica 22).

Tablica 22. Koncentracija GSH u eritrocitima (Er).

Er GSH  (µmol/mgHgb)      

Oznaka skupine X ± SD Medijan Min. Max. P vrijednost a kontrola 0,13 ± 0,03 0,13 0,10 0,16 ib ginko 0,20 ± 0,05 0,19 0,13 0,27 c,e,f,g,i,jc vulkan 0,11 ± 0,09 0,08 0,05 0,28 b,id salicilna kis. 0,14 ± 0,07 0,14 0,06 0,24 ie varfarin 0,12 ± 0,01 0,12 0,11 0,13 b,if vulk+ varfar 0,10 ± 0,03 0,08 0,06 0,15 bg vulkan+salic 0,09 ± 0,05 0,07 0,03 0,15 bh ginko+varfarin 0,13 ± 0,06 0,11 0,07 0,22 ii ginko+ salic 0,03 ± 0,02 0,02 0,02 0,07 a,b,c,d,e,hj GOI 0,10 ± 0,04 0,09 0,06 0,18 b

X = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; P = statistička značajnosta, b, c, d, e, f, g, h, i, j = statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za koncentraciju GSH (µmol/mg Hgb) u eritrocitima.

99

4.5.4.4 Koncentracija GSH u plazmi siromašnoj trombocitima

Mjerenja ukupne koncentracije GSH u uzorcima plazme pokazalo je statistički značajno (p≤0,05)

višu koncentraciju GSH u skupini h ginko+varfarin u odnosu na skupine a kontrola (p=0,029), c

vulkan (p=0,011), d salicilna kiselina (p=0,031) i e varfarin (p=0,014) (Tablica 23).

Tablica 23. Koncentracija GSH u plazmi siromašnoj trombocitima.

 PPP GSH (µmol/mLplazme)

     

Oznaka skupine X ± SD Medijan Min. Max. P vrijednost a kontrola 3,02 ± 0,61 2,86 2,47 3,88 hb ginko 4,11 ± 1,42 4,30 1,78 5,49 nsc vulkan 2,56 ± 1,02 2,22 1,59 4,08 hd salicilna kis. 3,32 ± 0,59 3,20 2,56 4,17 he varfarin 2,44 ± 0,46 2,55 1,81 2,86 hf vulk+ varfar 4,55 ± 1,69 4,22 3,17 7,44 nsg vulkan+salic 4,88 ± 1,97 4,71 2,47 7,76 ns h ginko+varfarin 7,15 ± 7,20 4,76 2,32 19,90 a,c,d,ei ginko+ salic 3,88 ± 1,32 4,03 2,61 5,81  nsj GOI 3,75 ± 2,37 2,37 1,68 7,03  ns

X = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; P = statistička značajnosta, b, c, d, e, f, g, h, i, j = statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za koncentraciju GSH (µmol/mL plazme) u plazmi siromašnoj trombocitima. ns = nije statistički značajno (p>0,05).

100

4.5.4.5 Koncentracija GSH u plazmi bogatoj trombocitima

U talogu trombocita iz PRP izmjerena je statistički značajno (p≤0,05) viša koncentracija GSH u

skupini h ginko+varfarin u odnosu na skupine a kontrola (p=0,002), b ginko (p=0,000), c vulkan

(p=0,001), d salicilna (p=0,000), e varfarin (p=0,000), f vulkan+varfarin (p=0,019) i g vulkan+

salicilna (p=0,008). U skupini d salicilna izmjerena je značajno niža koncentracija GSH u odnosu

na skupinu i ginko+salicilna (p=0,044) (Tablica 24).

Tablica 24. Koncentracija GSH u plazmi bogatoj trombocitima

 PRP GSH  (µmol/mL plazme)

     

Oznaka skupine X ± SD Medijan Min. Max. P vrijednost a kontrola 0,89 ± 18,56 2,69 2,28 4,27 hb ginko 0,78 ± 8,07 2,54 1,53 3,52 hc vulkan 0,79 ± 6,66 2,51 2,30 4,23 hd salicilna kis. 0,61 ± 13,68 2,54 1,81 3,12 h,i,je varfarin 0,45 ± 6,81 1,95 1,69 2,72 h,i,jf vulk+ varfar 2,32 ± 31,06 3,59 0,90 6,46 hg vulkan+salic 1,12 ± 25,47 3,92 2,47 5,35 hh ginko+varfarin 3,76 ± 8,70 5,26 4,32 13,26 a,b,c,d,e,f,gi ginko+ salic 0,90 ± 9,90 4,39 3,83 6,16 d,ej GOI 1,19 ± 4,15 4,41 2,96 5,77 d,e

X = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; P = statistička značajnosta, b, c, d, e, f, g, h, i, j = statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za koncentraciju GSH (µmol/mL plazme) u plazmi bogatoj trombocitima.

101

4.6 Aktivnost arginaze u krvnim žilama

Aktivnost arginaze statistički značajno (p≤0,05) je veća u skupini koja je obrađena pripravkom

vulkan, dok u drugim skupinama nije uočena statistički značajna (p≤0,05) promjena u odnosu na

kontrolnu skupinu (Slika 45).

a kontro

lab gin

ko

c vulka

n

d salici

lna

e varf

arin

f vulka

n+varf..

.

g vulka

n+sal

h ginko+va

r

i ginko+sa

lj go

i0

0.5

1

1.5

2

2.5

c

c

a,b,d,e,f,g,h,i,j

c

c

cc c

c c

Aktivnost arginaze u aorti

Argin

aza

U/m

g pro

tein

a aor

te

Slika 45. Aktivnost arginaze (U/mg proteina) u trbušnoj aorti. a, b,c, d, e, f, g, h, i, ,j slova iznad

stupaca označavaju statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za

aktivnost arginaze u tkivu aorte.

102

4.7 Koncentracija nitrita (NO2-) u trbušnoj aorti

Statistički značajno niža koncentracija nitrita izmjerena je u skupini b ginko i i ginko+salicilna u

odnosu na kontrolnu i sve ostale obrađene skupine. U ostalim obrađenim skupinama nije

zabilježena značajna razlika (Slika 46).

a kontro

lab gin

ko

c vulka

n

d salici

lna

e varf

arin

f vulka

n+varfa

rin

g vulka

n+sal

h ginko+va

r

i ginko+sa

lj go

i0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

b,i

a,c,d,e,f,g,h,j

b,i

b,i b,ib,i

b,i b,i

a,c,d,e,f,g,h,j

b,i

Koncentracija nitrita u aorti

nitr

itiµM

Slika 46. Koncentracija nitrita (µM) u trbušnoj aorti. a, b,c, d, e, f, g, h, i, ,j slova iznad stupaca

označavaju statistički značajne razlike (p≤0,05) između skupina pokusnih životinja za

koncentraciju nitrita u tkivu trbušne aorte.

103

5 RASPRAVA

Dodaci prehrani su pripravci proizvedeni iz koncentriranih izvora hranjivih tvari sa svrhom

obogaćivanja prehrane u cilju održavanja zdravlja. Sastav, označavanje i stavljanje na tržište

dodataka o prehrani u Republici Hrvatskoj regulirano je Pravilnikom o dodacima prehrani (NN

46/11 i 41/13). Navedeni Pravilnik o dodacima prehrani usklađen je s Direktivom 2002/46/EZ

Europskog parlamenta i Vijeća Europe i Uredbom Komisije (EZ) 1170/2009.

Dosadašnji postupci registracije dodataka prehrani uključuju prikaz potvrde o sigurnosti

pripravka i deklaraciju o prisutnim tvarima, ali ne podliježu obavezi dokaza o djelovanju i

kontroli od strane države. Za razliku od dodataka prehrani registracija biljnih lijekova temelje se

na dokazima primjene biljaka ili njihovih proizvoda u upotrebi više od deset godina ili u

tradicionalnoj upotrebi bez vidljivih, ali i nemjerenih štetnih učinaka. Dodaci prehrani, posebice

oni na biljnoj bazi nisu dovoljno istraženi s obzirom na njihovu toksikološku sigurnost. Posebice

je opasno potencirajuće i sinergističko djelovanje biljnih bioaktivnih tvari u pripravku i dodanih

farmakoloških tvari koje može izazvati još jače toksične učinke.

Smatra se da je ginko izvor atioksidansa koji hvataju slobodne radikale, stabilizirju membranu i

inhibiraju trombocitni faktor aktivacije putem ginkolida B. Smatra se da ima učinak i na

relaksaciju endotela pomoću GMP fosfodiesteraze, inhibira propadanje kolinergičkih i

adrenergičkih receptora, te taloženje beta amiloida (Sastre i sur, 1998; Van Beek i sur, 1998;

Watanabe i sur, 2001). U ovom istraživanju istražili smo utjecaj različitih komercijalnih biljnih

pripravaka dostupnih na tržištu i njihov utjecaj na oksidativni status krvi i organa kod štakora te

antihemostatski učinak.

Koristili smo pripravke koji sadrže ekstrakt ginka zasebno ili u kombinaciji s drugim biljkama.

Odredili smo učinak na primarnu i sekundarnu hemostazu. Pripravci koji sadrže ekstrakt ginka

(Ginkocel) i ekstrakt ginka u kombinaciji s drugim biljkama (Vulkan i Ginkalert) imali su učinak

na agregaciju trombocita. Istražili smo njihov učinak na oksidativni status u organima i krvi te

učinak na aktivnost arginaze i koncentraciju dušikovog oksida u tkivu aorte.

104

Znatno viši udio polifenola, trjeslovina, flavonoida i fenolnih kiselina nađen je u biljnoj

formulaciji Vulkan, koji je imao i statistički najznačajniji (p≤0,05) učinak na agregaciju

trombocita s ADP kao agonistom (Tablica 4, Slika 23).

Agregacija trombocita inhibirana je u skupini b ginko, c vulkan i j GOI gdje se kao agonist

koristio ADP (p=0,02, p=0,004, p=0,03). Mogući mehanizam djelovanja ginka na hemostazu

temelji se na inhibiciji čimbenika aktivacije trombocita (engl. platelet activating factor, PAF)

preko ginkolida B (Smith i sur, 1996). Moguć je i mehanizam antiagregacijskog učinka

flavonoida iz ginka na inhibiciju različitih protein kinaza što rezultira smanjenjem PLC

(fosfolipaze C) (Wright i sur, 2010). Bojić i sur (2011) pokazali su da svi analizirani flavonoidi,

među kojima su i kvercetin i izoramnetin (flavonoidi priustni u pripravcima ginka korišteni u

ovom istraživanju) pokazuju antiagregacijski učinak. U testu agregacije potaknutom ADP-om

potrabna je znatno manja koncentracija flavonoida (0,119 - 122 µM) koja inhibira agregaciju, za

razliku od agregacije potaknute kolagenom (15 – 244 µM) (Bojić i sur, 2011).

Patohistološkom analizom jetre, slezene i bubrega nisu uočene promjene na tkivu i stanicama

obrađenih životinja u odnosu na kontrolu, za razliku od podataka objavljenih 2013 od strane

Nacionalnog toksikološkog programa (NTP, 2013) gdje je zabilježeno da je obrada pripravcima

ginka uzrokovala centrolobularnu hipertrofiju hepatocita kod ženskih štakora i hiperplazija

žučnih kanala, a kod muških štakora hiperplaziju ovalnih stanica. Razlike se mogu objasniti

dozom pripravka ginka kojom su obrađene životinje. Histopatološke promjene uočene su kod

životinja obrađenih s 500, odnosno 1000 mg/kg samog pripravka ginka, što je znatno više od

preporučenih dnevnih doza koje smo koristili u ovom radu.

Primjena pripravka ginka uzrokovala je smanjenje aktivnosti SOD u jetri. Budući da pripravak

ginka sadrži mnogo sastavnica koje djeluju na različite metaboličke i biokemijsike puteve,

postoji više potencijalnih načina kako je mogao utjecati na smanjenje SOD. Jedan od mogućih

mehanizama smanjenja aktivnosti SOD je inhibicija mitohondrijske SOD putem kvercetina

(Lagoa i sur, 2011). Pokazano je da i morin, sastavnica ginka može inhibirati SOD (Jasprica i

sur, 2007). Ovakav rezultat može se objasniti i povećanim stvaranjem slobodnih radikala te

posljedičnim oštećenjem enzima pod utjecajem flavonoida kemferola. Budući da je kemferol

poznat po suprimiranju rasta različitih tumora, istraživan je njegov utjecaj na stanice

glioblastoma pri čemu su dokazali da on uzrokuje oksidativni stres i smanjuje aktivnost SOD1

105

(Sharma i sur, 2007). Dodatno stvaranje slobodnih radikala moguće je i uslijed metaboliziranja

ginka CYP enzimima (Gonzales, 2005).

Primjena acetilsalicilne kiseline uzrokovala je statistički značajno smanjenje aktivnosti SOD u

jetri i slezeni. Mogući mehanizam tog učinka je djelovanje salicilne kiseline na respiratorni lanac

u mitohindrijima koje dovodi do stvaranja vodikovog peroksida i drugih reaktivnih kisikovih

radikala (Battaglia i sur, 2005) koji potom smanjuju aktivnost enzima. Toksično i

proapoptotično djelovanje acetilaslicilne kiseline na jetru i slezenu ovisi o dozi. Intoksikacija

acetilsalicilnom kiselinom dovodi do inhibicije aktivacije NF-kB transkripcijskog faktora

(Bhattacharyya i sur, 2014). Slijed u genu za MnSOD sadrži sekvencu za NF-kB što sugerira da

je ovaj enzim reguliran transkripcijskim faktorom NF-kB, te da je smanjenje ekspresije SOD

putem inhibicije ovog transkripcijskog faktora acetilsalicilnom kiselinom jedan od važnih

mehanizama smanjenja aktivnosti (Wan i sur, 1994).

Aktivnost SOD značajno je viša u skupini obrađenoj varfarinom u odnosu na skupine obrađene

varfarinom i biljnim pripravcima, došlo je do poništavanja učinka varfarina na aktivnost SOD-a.

Kumarini su fenolni spojevi i kao takvi imaju antioksidativna svojstva: kelatori metala, cijepaju

slobodne radikale, sudjeluju u obnavljanju oštećenih enzima SOD, katalaza i glutation

peroksidaze te smanjuju aktivnost ksantin oksidaze (Liu i sur, 1999; Khan i sur, 2004). Varfarin

je također doveo do povećanja koncentracije GSH u jetri dok je učinak izostao ako se lijek

kombinirao s biljnim pripravcima.

Kombinacija ginka i acetilsalicilne kiseline pokazala se kao najpotentnija i statistički značajna u

smanjivanju aktivnosti SOD u jetri i slezeni zbog suradnje navedenih mehanizama stvaranja

slobodnih radikala te direktne inhibicije i smanjenja ekspresije enzima. U daljnjem istraživanju

potrebno je analizirati ekspresiju gena qPCR, Northern blot ili nekom drugom metodom te

količinu SOD Western blot metodom kako bi se razjasnilo smanjenje aktivnosti SOD, radi li se

o utjecaju na smanjenje ekspresije ili o inhibiciji samog enzima. Za razliku od aktivnosti SOD u

jetri i slezeni, u bubregu je ova kombinacija uzrokovala statistički značajan porast aktivnosti

SOD. Ako se u obzir uzme da bubreg ima manji protok krvi od jetre i slezene onda se ovaj

rezultat može tumačiti kao ranija faza oksidativnog stresa u kojoj nastali slobodni radikali

uzrokuju indukciju sinteze i povećanja aktivnosti enzima.

106

Aktivnost katalaze bila je statistički značajno smanjena u slezeni u slučaju primjene ginka, dok

se u slučaju primjene acetilsalicilne kiseline mogao primijetiti blagi porast što ukazuje na

njihovo potencijalno različito djelovanje na ovaj enzim. Stoga, kombinacija ova dva preparata

nije uzrokovala statistički značajne promjene aktivnosti katalaze u slezeni. U jetri i bubregu nije

došlo do statistički značajnih promjena aktivnosti katalaze, a sveukupni rezultat upućuje na

manju podložnost katalaze utjecaju ginkga i acetilsalicilne kiseline, za razliku od SOD.

Budući da se MDA kao pokazatelj lipidne peroksidacije nije znatno mijenjao u jetri i bubregu, a

u slučaju slezene je čak bio statistički značajno smanjen prilikom korištenja ginka i kombinacije

ginka i acetilsalicilne kiseline, pretpostavljamo da su ulogu u zaštiti membrane preuzeli glutation

peroksidaza 4 (GPX4) uz povećanu potrošnju GSH te neki od flavonoida ginka na periferiji

stanice kao sakupljači slobodnih radikala. Tomu u prilog ide i podatak o statistički značajno

smanjenom GSH u jetri koji je poslužio kao donor elektrona u borbi stanice protiv lipidne

peroksidacije. Smanjenju GSH mogla je pridonijeti i inhibicija glutation reduktaze putem

polifenola (Zhang i sur, 1997) iz ginka zbog mogućeg pojačanog nakupljanja uslijed kompeticije

za metaboliziranje s acetilsalicilnom kiselinom putem CYP enzima. Direktan pokazatelj

oksidativnog stresa je statistički značajno smanjenje koncentracije GSH u jetri korištenjem

kombinacije ginko+salicilna kiselna. MDA nije povećana što je moguće u slučaju veće

produkcije drugih slobodnih radikala s manjom reaktivnošću od hidrokslinog koji je glavni

odgovoran za lančanu reakciju lipidne peroksidacije čiji je MDA produkt.

Koncentracija MDA povišena je u jetri kod životinja obrađenih vulkanom i varfarinom, dok je u

bubrezima i slezeni zabilježena snižena koncentracija. GSH niži u jetri životinja iz skupine

vulkan+varfarin, a u skupini varfarin značajno viša kao i aktivnost SOD. To ukazuje na moguću

potrošnju GSH kao odgovor na povišenu koncentraciju MDA.

Sveukupni rezultati upućuju na značajno promijenjeno stanje u smjeru oksidativnog stresa

kojemu se stanica djelomično odupire pojačanom potrošnjom GSH. Ipak, ostaje pitanje

održivosti ovakve zaštite od oksidativnog stresa na dulje vrijeme i poremećaja drugih

antioksidativnih sustava uslijed dugoročnog korištenja ginka i antihemostatskih lijekova.

Naše istraživanje okazalo je da ginko i acetilsalicilna kiselina pojedinačno, a posebno njihova

kombinacija uzrokuju smanjenje aktivnosti antioksidativnog enzima SOD i koncentracije GSH u

107

jetri i slezeni. Smanjena aktivnost navedenih enzima moga bi biti i posljedica smanjene sinteze

samih antioksidativnih enzima, prilagodba organizma na priustne aktivne tvari iz pripravka koji

djeluju kao vanjski antioksidansi te smanjuju potrebu organizma za aktivnost unutarnjeg

antioksidativnog sustava.

Lipidna peroksidacija je smanjena što može biti pokazatelj protektivnog djelovanja flavonoidnih

sastavnica ginka, ali ostaje pitanje koliko bi to bilo učinkovito pri duljoj obradi. Poseban značaj

ovom istraživanju daje činjenica da velik dio populacije, a posebno starije čije je zdravlje već

narušeno, koristi kombinaciju ginka i acetilsalicilne kiseline uz ili bez liječničkog nadzora. Tsai i

sur (2013) istaknuli su rizik od neželjenih nuspojava korištenjem kombinacije ginka i

acetilsalicilne kiseline koji se pokazao realan i u našem istraživanju.

Skupina obrađena acetilsalicilnom kiselinom je pokazala smanjenu aktivnost SOD-a u regiji

malog mozga i manju koncentraciju MDA u kortikalnoj regiji mozga. Ti rezultati se poklapaju s

pretpostavljenim antioksidativnim učincima acetilsalicilne kiseline. Smanjena aktivnost SOD-a

bi mogla biti rezultat acetilsalicilnom kiselinom smanjene razine krvožilne produkcije ROS-a

inhibicijom NAD(P)H oksidazne aktivnosti (Tauseef i sur, 2008), odnosno acetilsalicilnom

kiselinom posredovane inhibicije iNOS i inhibicije COX enzima. Acetilsalicilna kiselina može

dovesti do acetilacije lizinskih ostataka proteina, koji igraju ulogu u njihovoj zaštiti od slobodnih

radikala (Awtry i Loscalzo, 2000), što bi, zajedno s manjom razinom proizvodnje slobodnih

radikala, moglo objasniti nižu koncentraciju MDA.

Kod skupina životinja obrađenih varfarinom (sam ili u kombinaciji s vulkanom i ginkocelom)

izmjerena je manja koncentracija MDA u prefrontalnoj regiji mozga. Smanjena koncentracija

MDA kod životinja obrađenih varfarinom mogla bi biti rezultat djelovanja varfarina, koji može

dovesti do smanjene pokretljivosti i veće gustoće lipidne membrane, što otežava pristup

slobodnim radikalima i smanjuje stopu lipidne peroksidacije (Amin i sur, 1986).

Skupina obrađena vulkanom i varfarinom je pokazala veću aktivnost SOD-a i koncentraciju GSH

u sve tri regije mozga. Povećana aktivnost SOD-a bi mogla biti rezultat sinergije

antikoagulacijskog djelovanja varfarina i vazodilatatorskog djelovanja ginka prisutnog u vulkanu

(Beikang i sur, 2014), što može dovesti do krvarenja i veće razine oksidativnog stresa. Kako

skupine obrađene samo varfarinom ili samo vulkanom nisu pokazale slične promjene aktivnosti,

108

čini se da je povećana aktivnost rezultat međudjelovanja. Povećana koncentracija GSH bi mogla

biti odgovor organizma na opisano krvarenje uzrokovano međureakcijom vulkana i varfarina,

potpomognuto antioksidativnim učinkom biljnih ekstrakata koji se nalaze u vulkanu (López i

sur, 2009; Aranha i Jorge, 2012; Wang i sur, 2014).

U skupini obrađenoj ginkom i varfarinom dokazana je veća koncentraciju GSH u sve tri regije

mozga i smanjena koncentracija MDA u prefrontalnoj regiji mozga. Povećana koncentracija

GSH može biti objašnjena indirektnim antioksidativnim djelovanjem pripravka ginka. Indirektan

antioksidativan učinak pripravka ginka djeluje preko terpenoida prisutnih u pripravku ginka

(Bastianetto i sur, 2000; De Feudis i sur, 2003), koji mogu povećavati aktivnost antioksidativnih

enzima i flavonoida koji inhibiraju enzim COX2 i smanjuju razinu slobodnih radikala u

organizmu. Smanjena koncentracija MDA mogla bi biti objašnjena već navedenim djelovanjem

varfarina te direktnim i indirektnim antioksidativnim učincima pripravka ginka. Spojevi prisutni

u pripravku ginka mogu vezati slobodne radikale i tako smanjiti razinu lipidne peroksidacije

(Mahadevan i Park, 2008). Moguće je međudjelovanje između inhibicije COX2, povećane

aktivnosti antioksidativnih enzima, vezanja radikala i veće gustoće lipidnih membrana.

Skupina obrađena ginkom i acetilsalicilnom kiselinom je pokazala povećanu koncentraciju GSH

u sve tri regije mozga i smanjenu koncentraciju MDA u prefrontalnoj regiji mozga. Povećana

koncentracija GSH bi mogla biti rezultat već opisanih antioksidativnih učinaka ginka, dok bi niža

koncentracija MDA mogla biti rezultat sinergističkog učinka s acetilsalicilnom kiselinom koja

acetilira lipidne proteinske ostatke i smanjuje produkciju O2- i spojeva prisutnih u pripravku

ginka koji vežu slobodne radikale.

Skupina obrađena vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom je pokazala veću koncentraciju GSH u

sve tri regije mozga i smanjenu koncentraciju MDA u kortikalnoj regiji mozga. Povećana

koncentracija GSH bi se mogla objasniti antioksidativnim učincima biljaka nađenih u vulkanu,

osobito ginka. Niža koncentracija MDA bi mogla biti objašnjena međureakcijom već navedenih

mehanizama acetilsalicilne kiseline (acetilacija lizinskih nastavaka proteina i smanjene razina

produkcije slobodnih radikala) i brojnih polifenola prisutnih u vulkanu, koji mogu vezati

slobodne radikale i tako smanjiti razinu lipidne peroksidacije (López i sur, 2009; Aranha i Jorge,

2012; Wang i sur, 2014).

109

U skupini GOI, životinje obrađene ginkalertom, izmjerena je manja aktivnost SOD-a u

kortikalnoj regiji mozga i povećana koncentracija GSH u prefrontalnoj regiji mozga i regiji

malog mozga. Smanjena aktivnost SOD-a bi mogla biti objašnjena međureakcijom pripravka

ginka, koji može vezati slobodne radikale i inhibira COX2 enzim time smanjujući produkciju

slobodnih radikala, s pripravkom gotu kole i antocijana prisutnih u pripravku borovnice koji je

dodan formulaciji, a zna se da može vezati slobodne radikale i kelirati metale te tako smanjiti

sveukupni oksidativni stres, jer skupina obrađena samo ginkom nema smanjenu razinu aktivnosti

SOD što navodi da je to rezultat međudjelovanja. Povećana koncentracija GSH se može objasniti

već navedenim antioksidativnim učinkom pripravka ginka, gotu kola također može povećati

aktivnost antioksidativnih enzima, a antocijani prisutni u pripravku borovnice mogu dovesti do

povećanja razine GSH (Chu i sur, 2011).

Dobiveni rezultati pokazuju najveće promjene kod grupa koje su uzimale kombinacije biljnih

pripravaka i klasičnih lijekova, što upućuje na zaključak da su promjene u razini oksidativnog

stresa rezultat međudjelovanja, obzirom na to da se skupine obrađene ginkom i vulkanom ne

razlikuju od kontrolne grupe, a promjene kod skupina s kombinacijama su drukčije od skupina

obrađenih acetilsalicilnom kiselinom i varfarinom. Promjene su zabilježene kod aktivnosti SOD i

koncentracija GSH i MDA, dok aktivnost katalaze nije odstupala od vrijednosti kontrole.

Najveća odstupanja koncentracije GSH, prisutna su kod grupa obrađenih kombinacijama biljnih

pripravaka i klasičnih lijekova. Zabilježen je porast koncentracije GSH u sve tri regije mozga i

smanjena koncentracija MDA. Povećana koncentracija GSH vjerojatno nije samo rezultat

antioksidativnog djelovanja biljnih dodataka jer nije zabilježena kod skupina obrađenim samo

biljnim dodacima pa je vjerojatno da dolazi do indukcije enzima kombinacijom pripravaka i

lijekova. Smanjena koncentracija MDA je zapažena i kod skupina obrađenih samo klasičnim

lijekovima i može se objasniti njihovim djelovanjem. Skupina obrađena vulkanom i varfarinom

pokazuje porast aktivnosti SOD-a i koncentracije GSH i jednaku razinu MDA kao i kontrolna

skupina, dok je skupina obrađena s varfarinom imala smanjenu koncentraciju MDA. To sugerira

da je međudjelovanje biljnih ekstrakata u vulkanu s varfarinom dovela do povećanja

oksidativnog stresa u mozgu, koji je poništio zaštitni učinak varfarina na lipidne membrane.

Suprotno tome, skupina GOI, obrađena formulacijom ginkalert, koji je mješavina biljnih

ekstrakata, pokazuje pad razine SOD-a, porast koncentracije GSH i MDA u razini kontrolne

skupine i skupina obrađenih samo biljnim dodatcima. To može upućivati na sinergistički učinak

110

antioksidansa u toj kombinaciji biljnih ekstrakata, koja bi mogla djelovati neuroprotektivno, ali

bi i mogla narušavati biološke procese regulirane slobodnim radikalima.

Povećana razina MDA u eritrocitima vjerojatno je posljedica povećanja aktivnosti HO-1 kako je

objašnjeno u radu Chen i sur (2001), pri čemu dolazi do povećanog lučenja prooksidansa koji

uzrokuju lipidnu peroksidaciju čiji je produkt MDA. HO-1 je enzim koji katalizira razgradnju

hem skupine iz hemoglobina na biliverdin, Fe2+ i CO (Chauveau i sur, 2005). Fe2+ i CO su

prooksdansi te vjerojatno direktno potiču oksidativna oštećenja katalaze u u eritrocitima. CO

pasivnom difuzijom izlaz iz eritrocita i ulazi u trombocite gdje svojim prooksidativnim

djelovanjem može dovesti do oštećenja katalaze mehanizmom karbonilacije enzima.

U plazmi životinja obrađenih acetilsalicilnom kiselinom došlo je do povećanja aktivnosti SOD

enzima, dok je SOD aktivnost u eritrocitima smanjena. To može biti posljedica povećanjem

oksidativnog stresa zbog ulaska AK u eritrocite gdje se hidrolizira pomoću acetilkolinesteraze

(Zhou i sur, 2011) pri čemu se oslobađaju kiseli radikali koji mogu oštetiti SOD.

U skupini obrađenoj varfarinom zabilježena je povećana aktivnost SOD u plazmi, moguće zbog

inhibicije vitamina K koji je potreban za aktivaciju određenih faktora koagulacije i smanjenja

koagulacijske učinkovitosti plazme koja kao posljedicu može imati povećano krvarenje

organizma što dovodi do povećane razine oksidativnog stresa i slabije reparacije stanica.

Oštećene stanice se pri tome odstranjuju iz organizma putem makrofaga pri čemu dolazi do

upalne reakcije i povećanog lučenja ROS-a. ROS oslobođen u plazmu može djelovati i na

eritrocite što može objasniti smanjenu razinu aktivnosti katalaze i SOD-a, koji djelovanjem

ROS-a mogu bit oštećeni.

U homogenatu tkiva aorte štakora obrađenih vulkanom izmjerena je statistički značajno viša

aktivnost arginaze (p≤0,05). Moguće posljedice su smanjena koncentracija L-arginina koji je

ujedno i supstrat za endotelnu NOS. Na taj način vulkan bi mogao smanjiti vazodilataciju

uzrokovanu dušikovim oksidom.

Za vazodiataciju, relaksaciju glatkih mišićnih stanica krvnih žila, potreban je dušik oksid (NO)

koji sintetizira endotelna dušik oksid sintetaza (eNOS) iz L-arginina kao supstrata. NO otpuštaju

endotelne stanice, a njihova disfunkcija dovodi do različitih kardiovaskularnih oboljenja. Zbog

toga sinteza i otpuštanje NO ovise o biodostupnosti arginina čiju koncentraciju smanjuje enzim

111

arginaza razgrađujući arginin do ornitina i ureje (Buga i sur, 1996; Zhang i sur, 2001; Chicoine i

sur, 2004). Zbog toga viša aktivnost arginaze rezultira smanjenim otpušranjem NO (Li i sur,

2001). Dosadašnja istraživanja pokazala su da povišena aktivnost arginaze blokira sintezu NO u

corpus cavernosum i dovodi do erektilne disfunkcije (Bivalacqua i sur, 2001; Kim i sur, 2001).

Johnson i sur (2005) pokazali su da postoji povećana ekspresija obje arginaze (I i II) u

arteriolama skeletnih mišića kod štakora s hipertenzijom izazvanom solju. Korištenjem inhibitora

arginaze ili L-arginina dolazi do obnove vazodilatacijskog odgovora krvnih žila životinja s

hipertenzijom.

Koncentracija nitrita izmjerena je niža u skupini obrađenoj pripravkom ginka što može biti

posljedica pojačanog vezanja nitrita, kao razgradnog produkta NO ili inhibicije inducibilne NOS

kako su do sada pokazali da djeluje ekstratk ginka (Cheung i sur, 1999). Nek flavonoidi, tanini i

lignani smanjuju koncentraciju NO pomoću ta dva mehanizma (van Acker i sur,1995; Raso i sur,

2001). Nešto viša koncentracija nitrita u ostalim skupinama mogla bi biti posljedica pojačane

sinteze NO od strane endotelne NOS za koju je pokazano da sintetizira NO u manjim

koncentracijama, a mogu ju potaknuti različiti polifenoli, npr. kvercetin (Manjeet i Gsosh, 1999).

Potrebno je provesti daljnja istraživanja na većem broju uzoraka uz dugotrajniju obradu kako bi

se razjasnili konačni učinci i molekularni mehanizmi kojima se antioksidativni učinak, te učinak

na endotel i hemostazu ostvaruje, te kroz jasne mehanizme djelovanja ukazati na potencijalni

rizik tijekom primjene.

112

6 ZAKLJUČCI:

1. Analizom pripravaka utvrđeno je značjano veća koncentracija polifenola, trijeslovina,

flavonoida i fenolnih kiselina u pripravku vulkan u odnosu na druga dva pripravka,

ginkocel i ginkalert, u preporučenim dnevnim dozama.

2. Svi pripravci koji sadrže ginko pokazali su statistički značajno (p≤0,05) produženje

agregacije s ADP-om kao agonistom.

3. U testovima sekundarne hemostaze nije bilo statistički značajnih (p>0,05) odstupanja.

Zabilježen je samo porast fibrinogena u skupini koja je obrađena biljnim pripravkom

Vulkan u kombinaciji s varfarinom.

4. Statistički značajno (p≤0,05) veći broj trombocita izmjeren je u skupini vulkan u odnosu

na kontrolu.

5. Dokazano je da korištenje biljnih pripravaka u kombinaciji s lijekovima mijenja

vrijednosti mjerenih biomarkera oksidativnog stresa jetri, slezeni i bubrezima. Značajne

su promjene aktivnosti SOD i GSH, dok na aktivnost katalaze pripravci nisu bitnije

utjecali.

6. Koncentracija GSH je bila značajno povećana u svim regijama mozga kod skupina

obrađenih kombinacijama biljnih pripravaka i klasičnih lijekova: povećanje GSH može

biti indikator antioksidativnog učinka i pojačanog detoksikacijskog obrambenog

mehanizama.

7. Koncentracija MDA je bila smanjena u slezeni životinja iz skupine ginko, varfarin te u

skupinama životinja obrađenih pripravcima i lijekovima u kombinaciji. Statistički

značajno niža koncentracija MDA (p≤0,05) nađe se u regiji prefrontalnog korteksa kod

skupina obrađenih ginkom i varfarinom te ginkom i acetilsalicilnom kiselinom, a u

kortikalnoj regiji kod skupine obrađene vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom.

8. U tkivu mogza skupine vulkan+varfarin uočena je povećana koncentracija GSH,

povećana aktivnost SOD-a i viša koncentracija MDA u odnosu na druge grupe obrađene

kombinacijama, te predstavlja najveću promjenu razina oksidativnog stresa.

9. Aktivnost arginaze povećana je u tkivu aorte životinja obrađenih Vulkanom što može

dovesti do izostanka vazodilatacijskog učinka na krvne žile zbog smanjene sinteze NO.

113

10. Koncentracija nitrita kao razgradnog produkta NO smanjena je u tkivu aorte u skupinama

ginko i ginko+salicilna.

114

7 LITERATURA

Aebi H (1984) Catalase in vitro. Method Enzymol 105: 121-126.

Akinwusi PO, Oluyombo R, Ogunro PS, Adeniji AO, Okunola OO, Ayodele OE (2013) Low

dose aspirin therapy and renal function in elderly patients. Int J Gen Med 6: 19-24.

Ames BN, Cathcart R, Schwiers E & Hochstein P (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78: 6858-

6862.

Amin TM, Sirs JA, Allen BV, Colles CM (1986) Effects of warfarin on blood rheology in

navicular disease. Res Vet Sci 40(3): 308-12.

Andersen NH, Christensen NJ, Lassen PR, Freedman TBN, Nafie L, Strømgaard K,

Hemmingsen L (2010) Structure and absolute configuration of ginkgolide B characterized by IR-

and VCD spectroscopy. Chirality 22 (2): 217–223.

Ang-Lee MK, Moss J, Yuan CS (2001) Herbal medicines and perioperative care. JAMA 286:

208–16.

Antonyuk SV, Strange RW, Marklund SL, Hasnain SS (2009) The structure of human

extracellular copper-zinc superoxide dismutase at 1.7 A resolution: insights into heparin and

collagen binding.  J Mol Biol 388 (2): 310–26.

Aranha CPM, Jorge N (2012) Antioxidant potential of oregano extract (Origanum vulgare L.).

Brit Food J 114(7): 954-965.

Arbos KA, Claro LM, Borges L, Santos CA, Weffort-Santos AM (2008) Human erythrocytes as

a system for evaluating the antioxidant capacity of vegetable extracts. Nutr Res 28: 457-63.

Aruoma OI & Halliwell B. (1987) Superoxide-dependent and ascorbate-dependent formation of

hydroxyl radicals from hydrogen peroxide in the presence of iron. Are lactoferrin and transferrin

promoters of hydroxyl-radical generation? Biochem J 241: 273-278.

Ashgar MN, Khan IU, Qureshi IZ, Mukhtar A, Ahmad F (2008) Modified 2,2’-azinobis(3-

ethylbenzo thiazoline)-6-sulphonic acid radical cation decolorization assay for antioxidant

115

activity of human plasma and extracts of traditional medicinal plants. Acta Chim Slov 55: 408–

418.

Avissar N, Finkelstein JN, Horowitz S, Willey JC, Coy E, Frampton MW (1996) Extracellular

glutathione peroxidase in human lung epithelial lining fluid and in lung cells. Am J Physiol Lung

Cell 270: L173-82.

Awtry EH, Loscalzo J (2000) Aspirin. Circulation 101: 1206–1218.

Barja de Quiroga G, Perez-Campo R, Lopez Torres M (1990) Anti-oxidant defences and

peroxidation in liver and brain of aged rats. Biochem J 272: 247-250.

Bastianetto S, Ramassamy C, Dore S, Christen Y, Poirier J, Quirion R. 2000. The Ginkgo biloba

extract (EGb 761) protects hippocampal neurons against cell death induced by beta-amyloid. Eur

J Neurosci 12: 1882–90.

Battaglia V, Salvi M, Toninello A (2005) Oxidative Stress Is Responsible for Mitochondrial

Permeability Transition Induction by Salicylate in Liver Mitochondria. Biol Chem 280: 33864-

33872.

Baud L, Ardaillou R (1993) Involvement of reactive oxygen species in kidney damage. Br Med

Bull 49: 621-9.

Bayr H. (2005) Reactive oxygen species. Crit Care Med 33: 498-501.

Beikang G, Zhen Z, Zhong Z (2014) Updates on the Clinical Evidenced Herb-Warfarin

Interactions. eCAM 2014: 18.

Bendich A, Machlin LJ, Scandurra O, Burton GW & Wayner DDM (1986) Adv Free Radical

Biol Med 2: 419- 444.

Bent S, Goldberg H, Paduka A, Avins AL (2005) Spontsneous Bleeding Associated with Ginkgo

biloba. A Case Report and Systematic Review of the Literature. J Gen Intern Med 20: 657-661.

Beretz A, Anton R, Stoclet JC (1978) Flavonoid compounds are potent inhibitors of cyclic AMP

phosphodiesterase. Experientia 34(8): 1054-1055.

116

Bhattacharyya S, Ghosh S, Sil PC (2014) Amelioration of Aspirin induced oxidative impairment

and apoptotic cell death by novel antioxidant protein molecule isolated from the herb

Phyllanthus niruri. Plos One 9(2).

Biber A (2003) Pharmacokinetics of Ginkgo biloba extracts . Pharmacopsychiatry 36(1): S32-7.

Bivalacqua TJ, Hellstrom WJG, Kadowitz PJ, Champion HC (2001) Increased expression of

arginase II in human diabetic corpus cavernosum: in diabetic-associated erectile

dysfunction. Biochem Biophys Res Commun 283: 923–927.

Bojić M, Debeljak Ž, Tomičić M, Medić-Šarić M, Tomić S (2011) Evaluation of antiaggregatory

activity of flavonoid aglycone series. Nutrition J 10: 73.

Borgstahl GE, Parge HE, Hickey MJ, Johnson MJ, Boissinot M, Hallewell RA, Lepock JR,

Cabelli DE, Tainer JA (1996) Human mitochondrial manganese superoxide dismutase

polymorphic variant Ile58Thr reduces activity by destabilizing the tetrameric interface.

Biochemistry 35(14): 4287–97.

Boullata JI, Nace AM (2000) Safety issues with herbal medicine. Pharmacotherapy 20: 257–69.

Brandes RP (2006) Roads to dysfunction: argininase II contributes to oxidized low-density

lipoprotein-induced attenuation of endothelial NO production. Circ Res 99: 918–920.

Bredt DS, Snyder SH (1994) Nitirc oxide: A physiologic messenger molecule. Annu Rev

Biochem 63: 175-95.

Bressler NM, Broekman MJ, Marcus AJ (1979) Concurrent studies of oxygen consumption and

aggregation in stimulated human platelets. Blood 53: 167–78.

Brown KM, Arthur JR (2001) Selenium, selenoproteins and human health: a review. Public

Health Nutr 4: 593-599.

Browne SE, Ferrante RJ, Beal MF (1999) Oxidative stress in Huntington’s disease. Brain Pathol

9: 147–163

117

Buga GM, Singh R, Pervin S, Rogers NE, Schmitz DA, Jenkinson CP, Cederbaum SD, Ignarro

LJ (1996) Arginase activity in endothelial cells: inhibition by hydroxy-l-arginine during high-

output NO production. Am J Physiol Heart Circ Physiol 271: H1988–H1998.

Burch JW, Services PT (1990) Glutathione disulfide production during arachidonic acid

oxygenation in human platelets. Prostaglandins 39: 123–134.

Calderon-Montaño JM, Burgos-Moron E, Perez-Guerrero C, Lopez-Lazaro M (2011) A review

on the dietary flavonoid kaempferol. Mini Rev Med Chem 11(4): 298–344.

Campbell CL, Smyth S, Montalescot G, Steinhubl SR (2007) Aspirin Dose for the Prevention of

Cardiovascular Disease: A Systematic Review. JAMA 297(18): 2018-2024.

Cao X, Antonyuk SV, Seetharaman SV, Whitson LJ, Taylor AB, Holloway SP, Strange RW,

Doucette PA, Valentine JS, Tiwari A, Hayward LJ, Padua S, Cohlberg JA, Hasnain SS, Hart PJ

(2008) Structures of the G85R variant of SOD1 in familial amyotrophic lateral sclerosis. J Bio

Chem 283(23): 16169–77. 

Cesarman-Maus G, Hajjar KA (May 2005) "Molecular mechanisms of fibrinolysis". Brit J

Haematol 129(3): 307–21.

Cesta MF (2006) Normal Structure, Function and Histology of the Spleen. Toxicol Pathol 34:

455-465.

Chade AR, Rodriguez-Porcel M, Grande JP, Krier JD, Lerman A, Romero JC (2002) Distinct

renal injury in early atherosclerosis and renovascular disease. Circulation 106: 1165–71.

Chauveau C, Remy S, Royer PJ, Hill M, Tanguy-Royer S, Hubert FX, Tesson L, Brion R, Beriou

G, Gregorie M, Joslen R, Cuturi MC, Angeon I (2005) Heme oxygenase-1 expression inhibits

dendritic cell maturation and pro-inflamantory function but conserves IL-10 expression. Blood

106: 1694-1702.

Chen JX, Zeng H, Chen X, Su CY, Lai CC (2001) Induction of heme oxygenase-1 by Ginkgo

biloba extract but not its terpenoids partially mediated its protective effect against

lysophosphatidylcholine-induced damage. Pharmacol Res 43(1): 63-9.

118

Cheung F, Siow YL, Chen WZ, O K (1999) Inhibitory effect of Ginkgo biloba extract on the

expression of inducible nitric oxide synthase in endothelial cells. Biochem Pharmacol 58(10):

1665-73.

Chicoine LG, Paffett ML, Young TL, Nelin LD (2004) Arginase inhibition increases nitric oxide

production in bovine pulmonary arterial endothelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol

Physiol 287: L60–L68.

Cho HJ, Nam and K-S (2007) Inhibitory Effect of Ginkgolide B on Platelet Aggregation in a

cAMP- and cGMP-dependent Manner by Activated MMP-9. J Biochem Mol Biol 40(5): 678-683

Cho HJ, Shon YH, Nam KS (2007) Ginkgolide C inhibits platelet aggregation in cAMP- and

cGMP-dependent manner by activating MMP-9. Biol Pharm Bull 30(12): 2340-4.

Christ B, Müller KH (1960) Zur serienmäßigen Bestimmung des Gehaltes an Flavonol-Derivaten

in Drogen. Arch Pharm (Weinheim) 293: 1033-1042.

Chu W, Cheung SCM, Raw L, et al. (2011) Bilberry (Vaccinium myrtillus) U: Benzie IFF,

Wachtel-Galor S, editors. Herbal Medicine: Biomolecular and Clinical Aspects. 2.izdanje. Boca

Raton (FL): CRC Press; Chapter 4.

Chung KF, Dent G, McCusker M, Guinot P, Page CP, Barnes PJ (1987) Effect of a ginkgolide

mixture (BN 52063) in antagonising skin and platelet responses to platelet activating factor in

man. Lancet (London, England) 1: 248-51.

Concetti A, Massei P, Rotilio G, Brunori M, Rachmilewitz EA (1976) Superoxide dismutase in

red blood cells: method of assay and enzyme content in normal subjects and in patients with

beta-thalassemia (major and intermedia). J Lab Clin Med 87: 1057-64.

Cos P, De Bruyne T, Hermans N, Apers S, Berghe DV, Vlietinck AJ (2004) Proanthocyanidins

in health care: current and new trends. Curr Med Chem 11(10): 1345-59.

Dawson TM, Dawson VL (1995) Nitric oxide: Action and pathologica roles. Neuroscientist 1: 7-

18.

De Feudis FV (2002) Bilobalide and neuroprotection. Pharmacol Res 46(6): 565–8.

119

De Feudis FV, Papadopoulos V, Drieu K (2003) Ginkgo biloba extracts and cancer: a research

area in its infancy. Fund Clin Pharmacol 17(4): 405-417.

de Simone G, Devereux RB, Chien S (1990) Relation of blood viscosity to demographic and

physiologic variables and to cardiovascular risk factors in apparently normal

adults. Circulation. 81(1): 107-117.

Dedon PC, Tannenbaum SR (2004) Reactive nitrogen species in the chemical biology of

inflammation. Biochem Biophys 423:12-22.

Deng Y, Bi HC, Zhao LZ, He F, Liu YQ, Yu JJ, Ou ZM, Ding L, Chen X, Huang ZY, Huang M,

Zhou SF (2008) Induction of cytochrome P450s by terpene trilactones and flavonoids of the

Ginkgo biloba extract EGb 761 in rats. Xenobiotica 38(5): 465-81.

DHHS Publ. (NIH) (2011) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, # 86–23 1985.;

revised eight edition.

Di Simplicio P, Cacace MG, Lusini L, Giannerini F, Giustarini D, Rossi R (1998) Role of

protein-SH groups in redox homeostasis the erythrocyte as a model system. Arch Biochem

Biophys 15;355(2): 145-52.

Diamond BJ, Bailey MR (2013) Ginkgo biloba: indications, mechanisms, and safety. Psychiatr

Clin North Am 36: 73-83.

Diamond BJ, Shiflett SC, Feiwel N, Matheis RJ, Noskin O, Richards JA (2000) Ginkgo biloba

extract: mechanisms and clinical indications. Arch Phys Med Rehabil 81: 668-78.

Directive 2001/83/EC of the European Parliament and of the Council of 6 November 2001 on the

Community code relating to medicinal products for human use.

Directive 2002/46/EC of the european parliament and of the council (2002) on the approximation

of the laws of the Member States relating to food supplements.

Directive 2004/24/EC of the European Parliament and of the Council of 31 March 2004

amending, as regards traditional herbal medicinal products.

120

Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on

the protection of animals used for scientific purposes.

Duche JC, Barre J, Guinot P, Duchier J, Cournot A, Tillement JP (1989) Effect of Ginkgo biloba

extract on microsomal enzyme induction. Int J Clin Pharmacol Res 9: 165–8.

Dudzinski DM, Igarashi J, Greif D, Michel T (2006) The regulation and pharmacology of

endothelial nitric oxide synthase. Annu Rev Pharmacol Toxicol 46: 235–76.

Đokić M, Bilandžić N (2012) Željezo - toksikološki i nutritivni aspekti u organizmu. MESO 14:

232-238.

Ebadi M (2002) Pharmacodynamic Basis of Herbal Medicine. CRC Press, Boca Raton

Epp O, Ladenstein R, Wendel A (1983) The refined structure of the selenoenzyme glutathione

peroxidase at 0.2-nm resolution. Eur J Biochem 133(1): 51-69. 

Ernst E (2002) The risk-benefit profile of commonly used herbal therapies: Ginkgo, St. John’s

Wort, Ginseng, Echinacea, Saw Palmetto, and Kava. Ann Intern Med 136: 42-53.

Esmon CT, Fukudome K (1995) Cellular regulation of the protein C pathway. Semin Cell Biol 6:

259-268.

European Food Safety Agency (EFSA) NDA Panel (Dietetic Products, Nutrition and Allergies)

(2011) Scientific Opinion on the substantiation of health claims related to quercetin and

protection of DNA, proteins and lipids from oxidative damage (ID 1647), “cardiovascular

system” (ID 1844), “mental state and performance” (ID 1845), and “liver, kidneys” (ID 1846)

pursuant to Article 13(1) of Regulation (EC) No 1924/2006. EFSA J 9(4): 2067-82.

European Pharmacopoeia. Eight Edition (Eur. Ph. 8.0), Vol.1, Council of Europe,Strasbourg

Cedex, 2013, 1257-1259.

Fleming I, Busse R (1999) Signal transduction of eNOS activation. Cardiovasc Res 43: 532-41.

Flohé L., Ötting F. (1984): Superoxide dismutase assays. Method Enzymol 105: 93-104.

121

Forbes JM, Coughlan MT, Cooper ME (2008) Oxidative Stress as a Major Culprit in Kidney

Disease in Diabetes. Diabetes 57(6): 1446-1454.

Förstermann U, Münzel T (2006) Endothelial nitric oxide synthase in vascular disease: from

marvel to menace. Circulation 113: 1708-14.

Fourtillan JB, Brisson AM, Girault J, Ingrand I, Decourt JP, Drieu K i sur (1995)

Pharmacokinetic properties of Bilobalide and Ginkgolides A and B in healthy subjects after

intravenous and oral administration of Ginkgo biloba extract (EGb 761). Therapie 50: 137-44.

Fowler JS, Wang GJ, Volkow ND, Logan J, Franceschi D, Franceschi M i sur (2000) Evidence

that gingko biloba extract does not inhibit MAO A and B in living human brain. Life Sci 66:

PL141-6.

Freedman JE, Li L, Sauter R, Keaney JF JR (2000) alpha-Tocopherol and protein kinase C

inhibition enhance platelet-derived nitric oxide release. FASEB J 14: 2377-9.

Gabbianelli R, Santroni AM, Fedeli D, Kantar A, Falcioni G (1998) Antioxidant activities of

different hemoglobin derivatives. Biochem Biophys Res Commun 242: 560-4.

Gaetani GF, Ferraris AM, Rolfo M, Mangerini R, Arena S, Kirkman HN (1996) Predominant

role of catalase in the disposal of hydrogen peroxide within human erythrocytes. Blood 87: 1595-

9.

Ge B, Zhang Z, Zuo Z (2014) Review Article: Updates on the Clinical Evidenced Herb-Warfarin

Interactions. eCAM 2014: 1-18.

Glimn-Lacy J, Kaufman PB (2006) Botany Illustrated. Springer Science+Business Media Inc.,

New York

Gonzalez FJ (2005) Review: Role of cytochromes P450 in chemical toxicity and oxidative stress:

studies with CYP2E1. Mutat Res 569: 101-110.

Griess P (1879). Ber Deutsch Chem Ges 12: 426.

Gross P (2009) New Roles for Polyphenols. A 3-Part report on Current Regulations & the State

of Science, Nutraceuticals World

122

Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, DHHS Publ. (NIH) # 86–23 1985; revised

eight edition 2011.

Hagan JJ, Dallam RD (1968) Measurement of arginase activity. Anal Biochem 22(3): 518-524.

Halliwell B (1988) Albumin - an important extracellular antioxidant? Biochem Pharmacol 37:

569-571.

Halliwell B, Gutteridge JM (1995) The definition and measurement of antioxidants in biological

systems. Free Radic Biol Med 18: 125-126.

Halliwell B (2006)Oxidative stress and neurodegeneration:where are we now? J Neurochem 97:

634-58.

Halmed: Izvješćće o prometu lijekova u Republici Hrvatskoj u 2014;

http://www.halmed.hr/Novosti-i-edukacije/Publikacije-i-izvjesca/Izvjesca-o-potrosnji-lijekova/

Izvjesce-o-prometu-lijekova-u-Republici-Hrvatskoj-u-2014

He J, Lin J, Li J, Zhang JH, Sun XM, Zeng CM (2008) Dual effects of Ginkgo biloba leaf extract

on human red blood cells. Basic Clin Pharmacol Toxicol 104: 138-144.

Hellum BH, Hu Z, Nilsen OG (2007) The induction of CYP1A2, CYP2D6 and CYP3A4 by six

trade herbal products in cultured primary human hepatocytes. Basic Clin Pharmacol Toxicol

100: 23-30.

Hoffbrand AV (2002) Essential haematology. Oxford: Blackwell Science: 241-243

Hrvatska enciklopedija (HE) (LZMK) (2008), 10 (Sl-To) 715, Leksikografski zavod Miroslav

Krleža, Zagreb, Hrvatska.

http://www.hindawi.com/journals/omcl/2011/467180.fig.001.jpg

Huang WY, Cai YZ, Zhang Y (2010) Natural phenolic compounds from medicinal herbs and

dietary plants: potential use for cancer prevention. Nutr Cancer 62: 1-20.

123

Hultquist DE, Xu F, Quandt KS, Shlafer M, Mack CP, Till GO, i sur (1993) Evidence that

NADPH-dependent methemoglobin reductase and administered riboflavin protect tissues from

oxidative injury. Am J Hematol 42: 13-8.

Ischiropoulos H, Beckman JS (2003) Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause,

effect, or association? J Clin Invest 111: 163-169

Janssens D, Michiels C, Delaive E, Eliaers F, Drieu K, Remacle J (1995) Protection of hypoxia-

induced ATP decrease in endothelial cells by Ginkgo biloba extract and bilobalide. Biochem

Pharmacol 50: 991-9.

Jasprica I, Medić-Šarić M, Šitum K, Marković S, Mornar A, Dumić J (2007) The effects of

flavonoids and phenolic acids on superoxide dismutase activity. Planta Medica 0032-0943

Jayakumar T, Thomas PA, Geraldine P (2007) Protective effect of an extract of the oyster

mushroom, Pleurotus ostreatus. On antioxidants of major organs of aged rats. Exep Gerontol 42:

183-191.

Jiang X, Williams KM, Liauw WS, Ammit AJ, Roufogalis BD, Duke CD, Day RO, McLachlan

AJ (2004) Effect of ginkgo and ginger on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of

warfarin in healthy subjects. Brit J Clin Pharmaco 59: 425-432.

Johnson FK, Johnson RA, Peyton KJ, Durante W (2005) Arginase inhibition restores arteriolar

endothelial function in Dahl rats with salt-induced hypertension. Am J Physiol 288: 1057-1062.

Johnson M, Ramey E, Ramwell PW (1975) Sex and age differences in human platelet

aggregation. Nature 253: 355-7.

Jurkovič S, Osredkar J, Marc J (2008) Molekularni utjecaj glutation-peroksidaza u

antioksidacijskim procesima. Biochem Medica 18:162-174.

Karlsson K, Marklund L (1987) Heparin-induced release of extracellular superoxide dismutase to

human blood plasma. Bioche J 242: 55-59.

Kazazić SP (2004) Antioksidacijska i antiradikalska aktivnost flavonoida. Arh Hig Rada Toxicol

55: 279-290.

124

Khalil MI, Sulaiman SA (2010) The Potential Role of Honey and its Polyphenols in Preventing

Heart Diseases: A Review. Afr J Tradit Complement Altern Med 7(4): 315-21.

Khan N, Sharma S, Sultana S (2004) Attenuation of potassium Bromid - induced nephrotoxicity

by coumarin (1,2 – benzopyrone) in Wistar rats: Chemprevention against free-radical mediated

renal oxidative stress and tumor promotion response. Redox Rep 9: 19-28.

Kiewert C, Kumar V, Hildmann O, Hartmann J, Hillert M, Klein J (2008) Role of glycine

receptors and glycine release for the neuroprotective activity of bilobalide. Brain Res 1201: 143-

50.

Kim YS, Pyo MK, Park KM, Park PH, Hahn BS, Wu SJ, i sur (1998) Antiplatelet and

antithrombotic effects of a combination of ticlopidine and ginkgo biloba ext (EGb 761). Thromb

Res 91: 33-8.

Kim NN, Cox D, Baggio RF, Emig FA, Mistry SK, Harper SL, Speicher DW, Morris SM Jr, Ash

DE, Triash A, Christianson DW (2001) Probing erectile dysfunction: S-(2-boronoethyl)-l-

cysteine binds to arginase as a transition state analogue and enhances smooth muscle cell

relaxation in human penile corpus cavernosum. Biochemistry 40: 2678–2688.

Klepser TB, Klepser ME (1999) Unsafe and potentially safe herbal therapies. Am J Health Syst

Pharm 56: 125–38.

Kressmann S, Müller WE, Blume HH (2002) Pharmaceutical quality of different Ginkgo biloba

brands. J Pharm Pharmacol 54: 661-9.

Kubota Y, Tanaka N, Umegaki K, Takenaka H, Mizuno H, Nakamura K, i sur (2001) Ginkgo

biloba extract-induced relaxation of rat aorta is associated with increase in endothelial

intracellular calcium level. Life Sci 69: 2327-36.

Kudolo GB, Dorsey S, Blodgett J (2002) Effect of the ingestion of Ginkgo biloba extract on

platelet aggregation and urinary prostanoid excretion in healthy and Type 2 diabetic subjects.

Thromb Res 108: 151-60.

125

Lagoa R, Graziani I, Lopez-Sanchez C, Garcia-Martinez V, Gutierrez-Merino (2011) Complex I

and cytochrome c are molecular targets of flavonoids that inhibit hydrogen peroxide production

by mitochondria. BBA-Bioenergetics 1807: 1562-1572.

Lan WJ, Zheng XX (2006) Activity of Ginkgo biloba extract and quercetin on thrombomodulin

expression and tissue-type plasminogen activator secretion by human umbilical vein endothelial

cells. Biomed Environ Sci 19: 249-53.

Landis GN, Tower J (2005) Superoxide dismutase evolution and life span regulation. Mech

Ageing Dev 126: 365-79.

Lee J, Durst RW, Wrolstad RE, Barnes KW, Eisele T, Giusti MM, Haché J, Hofsommer H,

Koswig S, Krueger DA, Kupina S, Martin SK, Martinsen BK, Miller TC, Paquette F, Ryabkova

A, Skrede G, Trenn U, Wightman JD (2005) Determination of total monomeric anthocyanin

pigment content of fruit juices, beverages, natural colorants, and wines by the pH differential

method. Collaborative study. J AOAC Int 88(5): 1269-1278.

Lesk MR, Wajszilber M, Deschenes MC (2008) The effect of systemic medications on ocular

blood flow. Cam J Ophthalmol 43(3): 351-355.

Lewis RJ, Trager WF, Chan KK, Breckenridge A, Orme M, Roland M, Schary W (1974)

Warfarin: Stereochemical aspects of its metabolism and interaction with phenylbutazone. The J

Clin Invest 53: 1607-1617.

Li W-Z, Wu W-Y, Huang H, Wu Y-Y, Yin Y-Y (2013) Protective effect of bilobalide on

learning and memory impairment in rats with vascular dementia. Mol Med Rep 8: 935-41.

Li H, Meininger CJ, Hawker JR Jr, Haynes TE, Kepka-Lenhart D, Mistry SK, Morris SM Jr, Wu

G (2001) Regulatory role of arginase I and II in nitric oxide, polyamine, and proline syntheses in

endothelial cells.Am J Physiol Endocrinol Metab 280: E75–E82.

Liu X, Yan Y, Bao L, Chen B, Zhao Y, Qi R (2014) Ginkgolide B inhibits platelet release by

blocking Syk and p38 MAPK phosphorylation in thrombin-stimulated platelets. Thromb Res

134(5): 1066-73.

126

Liu ZQ, Yu W, Liu ZL (1999) Antioxidative and prooxidative effects coumarin derivates on free

radical intiated and photosesitised peroxidation of human low density lipoprotein. Chem Phys

Lipids 103: 125-135.

Loew D, Habs M, Klimm HD and Trunzler G (1999) Phytopharmaka Report: Rationale Therapie

Mit Pflanzlichen ArzneiMittel, Steinkopff, 2nd edition, Darmstadt, Germany.

López V, Martín S, Gómez-Serranillos MP, Carretero ME, Jäger AK, Calvo MI (2009)

Neuroprotective and neurological properties of Melissa officinalis. Neurochem Res 11: 1955-

1961

Lovrić J, Mesić M, Macan M, Koprivanac M, Kelava M, Bradamante V (2008) Measurment of

malondialdehyde (MDA) level in rat plasma after simvastatin treatment using two different

analytical methods. Period Biol 110: 63-67.

Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (November 1951) Protein measurement with

the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193 (1): 265–75.

Luo S, Lei H, Qin H, Xia Y (2014) Molecular mechanisms of endothelial NO synthase

uncoupling. Curr Pharm Des 20: 3548-53.

Mahadevan S, Park Y (2008) Multifaceted Therapeutic Benefits of Ginkgo biloba: Chemistry,

Efficacy, Safety, and Uses. J Food Sci 73: R14-R19.

Mahady GB (2002) Ginkgo biloba for the prevention and treatment of cardiovascular disease: a

review of the literature. J Cardiovasc Nurs 16:21–32.9

Manach C, Scalbert A, Morand C, Rémésy C, Jiméenez L (2008) Polyphenols: food sources and

bioavailability. Am J Clin Nutr 79: 727-747.

Manjeet KR, Ghosh B (1999) Quercetin inhibits LPS-induced nitric oxide and tumor necrosis

factor-alpha production in murine macrophages. In. J Immunopharmaco 21: 435-43.

Marcocci L, Maguire JJ, Droy-Lefaix MT, Packer L (1994) The nitric oxide-scavenging

properties of Ginkgo biloba extract EGb 761. Biochem Biophys Res Commun 201: 748-55.

127

Maron BA, Michel T (2012) Subcellular localization of oxidants and redox modulation of

endothelial nitric oxide synthase. Circ J 76: 2497-512.

Maruyama M, Terahara A, Itagaki Y, Nakanishi K (1967) The ginkgolides. Isolation and

characterization of the various groups. Tetrahedron Letters: 299-302.

MatEs JM, Perez-Gomez C, Nunez De Castro I (1999) Antioxidant enzymes and human

diseases. Clin Biochem 32: 595-603.

McKenzie SB (2003) Clinical Laboratory Hematology. 1st edn. Prentice Hall.

Meng YY, Trachtenburg J, Ryan US, Abendschein DR (1995) Potentiation of endogenous nitric

oxide with superoxide dismutase inhibits platelet-mediated thrombosis in injured and stenotic

arteries. J Am Coll Cardiol 25: 269-75.

MHRA (2012), Traditional herbal medines registration scheme, URL:

http://www.mhra.gov.uk/Howweregulate/Medicines/Herbalmedicines/Placingaherbalmedicineon

theUKmarket/TraditionalHerbalMedicinesRegistrationScheme/Keyrequirements/index.htm

MHRA (2012), Traditional herbal medines registration scheme, URL:

http://www.mhra.gov.uk/Howweregulate/Medicines/Herbalmedicines/Placingaherbalmedicineon

theUKmarket/Unlicensedherbalremediesindividualpatients/index.htm.

Miles SL, McFarland M, Niles RM (2014) Molecular and physiological actions of quercetin:

need for clinical trials to assess its benefits in human disease. Nutr Rev 72(11): 720-34.

Ming X-F, Barandier C, Viswambharan H, Kwak BR, Mach F, Mazzolai L, i sur (2004)

Thrombin stimulates human endothelial arginase enzymatic activity via RhoA/ROCK pathway:

implications for atherosclerotic endothelial dysfunction. Circulation 110: 3708-14.

Molyneux P (2004) The use of the stable free radical diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH) for

estimating antioxidant activity. Songklanakarin J Sci Technol 26: 211-219.

Moutsatsou P (2007) The spectrum of phytoestrogens in nature: our knowledge is expanding.

(review). Hormones (Athens, Greece) 6(3): 173-93.

128

MSD priručnik dijagonstike i terapije, II. Hrvatsko izdanje, 2014. URL: http://www.msd-

prirucnici.placebo.hr/msd-prirucnik/hematologija-i-onkologija/hemostaza.

Nagao A, Seki M, Kobayashi H (1999) Inhibition of xanthine oxidase by flavonoids. Biosci

Biotechnol Biochem 63(10): 1787-1790.

Narodne novine NN 55/13 Zakonu o dobrobiti životinja i pravilniku za provođenje pokusa na

laboratorijskim životinjama .

Narodne novine NN 135/06, NN 37/13, NN 125/13 Zakonom o zaštiti životinja i Pravilnikom o

uvjetima držanja pokusnih životinja, posebnim uvjetima za nastambe i vrstama pokusa.

Narodne novine NN 46/11 i NN 41/13 Pravilnikom o dodacima prehrani.

Nichols M, Townsend N, Scarborough P, Rayner M (2014) Cardiovascular disease in Europe

2014: epidemiological update. Eur Heart J 35(42): 2950-9.

NTP, 2013. NTP technical report 578. Toxicology and carcinogenesis studies of Ginkgo biloba

extract (CAS No. 90045-46-6) in F344/N rats and B6C3F1/N mice (gavage studies). National

Toxicology program, P.O. Box 12233research Triangle Park, NC 27709.

O'Connor N, Dargan PI, Jones AL (2003) Hepatocellular damage from non-steroidalanti-

inflammatory drugs. Q J Med 96:787-791.

Ough CS, Amerine MA (1988) Methods for analysis of musts and wines, Wiley and Sons,

New York, USA, pp 196-221.

Ozbek E, Cekmen M, Ilbey YO, Simsek A, Polat EC and Somay A (2009) “Atorvastatin

prevents gentamicin-induced renal damage in rats through the inhibition of p38-MAPK and

NFkappaB pathways.” Renal Failure, 31(5): 382-392.

Palikhe NS, Kim SH, Nam YH, Ye Y, Park H (2011) Polymorphisms of Aspirin-Metabolizing

Enzymes CYP2C9, NAT2 and UGT1A6 in Aspirin-Intolerant Urticaria. Allergy Asthma Immunol

Res 3(4): 273-276.

Pallister CJ and Watson MS (2010) Haematology. Scion Publishing. pp. 336-347.

129

Pereira E, Barros L, Ferreira ICFR (2013) Chemical characterization of Ginkgo biloba L. and

antioxidant properties of its extracts and dietary supplements. Ind Crops Prod 51: 244-248.

Pietri S, Maurelli E, Drieu K, Culcasi M (1997) Cardioprotective and anti-oxidant effects of the

terpenoid constituents of Ginkgo biloba extract (EGb 761). J Mol Cell Cardiol 29:733-42.

Pietta PG, Gardana C, Mauri PL (1997) Identification of Gingko biloba flavonol metabolites

after oral administration to humans. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 693(1): 249-255. 

Pignatelli P, Carnevale R, Di Santo S, Bartimoccia S, Sanguigni V, Lenti L, Finocchi A,

Mendolicchio L, Soresina AR, Plebani A, Violiet F (2011) Inherited human gp91phox deficiency

is associated with impaired isoprostane formation and platelet dysfunction. Arterioscler Thromb

Vasc Biol 31: 423-434.

Pittler MH, Ernst E (2000) Gingko biloba extract for the treatment of intermittent claudication; a

meta-analysis of randomized trials. Am J Med 108: 276-81.

Putnam CD, Arvai AS, Bourne Y, Tainer JA (2000) Active and Inhibited Human Catalase

Structures: Ligand and NADPH Binding and Catalytic Mechanism. J Mol Biol 296: 295-309.

Qian J, Fulton D (2013) Post-translational regulation of endothelial nitric oxide synthase in

vascular endothelium. Front Physiol 4: 347.

Rangel-Ordóñez L, Nöldner M, Schubert-Zsilavecz M, Wurglics M (2010) Plasma levels and

distribution of flavonoids in rat brain after single and repeated doses of standardized Ginkgo

biloba extract EGb 761®. Planta Med 76: 1683-90.

Raso GM, Meli R, DiCarlo G, Pacilio M, DiCarlo R (2001) Inhibition of inducible nitric oxide

synthase and cyclooxygenase-2 expression by flavonoids in macrophage J774A.1. Life

Sci 68: 921-31.

Reuter HD (1996) Phytopharmaka in Der Apotheke, Gustav Fischer, Jena, Germany.

Rivas-Estilla AM, Bryan-Marrugo OL, Trujillo- Murillo K, Perez-Ibave D, Charles-Nino C,

Pedroza-Roldan C, Rios-Ibarra C, Ramirez-Valles E, Ortiz-Lopez R, Islas-Carbajal MC, Nieto

N, Rincon-Sanchez AR (2012) Cu/Zn superoxide dismutase (SOD1) induction is implicated in

130

the antioxidative and antiviral activity of acetylsalicylic acid in HCV-expressing cells. Am J

Physiol Gastrointest Liver Physiol 302(11): 1264-73.

Romero MJ, Platt DH, Tawfik HE, Labazi M, E1-Remessy AB, Bartoli M, Caldwell RB,

Caldwell RW (2008) Diabetes-induced coronary vascular dysfunction involves increased

arginase activity. Circ Res 102: 95-102.

Ryoo S, Gupta G, Benjo A, Lim HK, Camara A, Sikka G, i sur (2008) Endothelial arginase II: a

novel target for the treatment of atherosclerosis. Circ Res 102: 923-32.

Ryoo S, Lemmon CA, Soucy KG, Gupta G, White AR, Nyhan D, i sur (2006) Oxidized low-

density lipoprotein-dependent endothelial arginase II activation contributes to impaired nitric

oxide signaling. Circ Res 99: 951-60.

Samuels N (2005) Herbal remedies and anticoagulant therapy. J Thromb Haemost 93: 3-7.

Sangkuhl Katrin, Shuldiner Alan R, Klein Teri E, Altman Russ B (2011) Platelet aggregation

pathway, Pharmacogenet Genom 21(8): 516-521.

Sastre J, Millán A, García de la Asunción J, Plá R, Juan G, Pallardó, O'Connor E, Martin

JA, Droy-Lefaix MT, Viña J (1998) A Ginkgo biloba extract (EGb 761) prevents mitochondrial

aging by protecting against oxidative stress. Free Radic Biol Med 24(2): 298-304.

Schulz V, Hänsel R (1996) Rationale Phytotherapie, Springer, Heidelberg, Germany

Scott SA, Lubitz SA (2014) Warfarin pharmacogenetic trials: is there a future for

pharmacogenetic-guided dosing?. Pharmacogenomics 15: 719-722.

Sharma V, Joseph C, Ghosh S, Agarwal A, Mishra MK, Sen E (2007) Kaempferol induces

apoptosis in glioblastoma cells through oxidative stress. Mol Cancer Ther 6(9): 2544-53.

Sierpina VS, Wollschlaeger B, Blumenthal M (2003) Ginkgo Biloba. Am Fam Physician

Complement Altern Med 68: 923-926.

Sivilotti ML (2004) Oxidant stress and haemolysis of the human erythrocyte. Toxicol Rev 23:

169-88.

131

Smith GC, Tew DG, Wolf CR (1994) Dissection of NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase

into distinct functional domains. Proc Natl Acad Sci U S A 91: 8710-4.

Smith PF, Maclennan K, Darlington CL (1996) The neuroprotective properties of the Ginkgo

biloba leaf: a review of the possible relationship to platelet-activating factor (PAF). J

Ethnopharmacol 50(3): 131-9.

Song W, Guan HJ, Zhu XZ, Chen ZL, Yin ML, Cheng XF (2000) Protective effect of bilobalide

against nitric oxide-induced neurotoxicity in PC12 cells. Acta Pharmacol Sin 21: 415-20.

Stuart MJ, Holmsen H (1977) Hydrogen peroxide, an inhibitor of platelet function: effect on

adenine nucleotide metabolism, and the release reaction. Am J Hematol 2: 53-63.

Sugiyama T, Kubota Y, Shinozuka K, Yamada S, Yamada K, Umegaki K (2004) Induction and

recovary of hepatic drug metabolizing enzymes in rats treated with Ginkgo biloba extract. Food

Chem Toxicol 42(6): 953-957.

Swain T, Harborne JB, Sumere CF (1979) Biochemistry of Plant Phenolics, Recente Advances in

Phytochemistry. Plenum Press: New York, SAD.

Taki Y, Yokotani K, Yamada S, Shinozuka K, Kubota Y, Watanabe Y, Umegaki K (2012)

Ginkgo biloba extract attenuates warfarin-mediated anticoagulation through induction of hepatic

cytochrome P450 enzymes by bilobalide in mice. Phytomedicine 19: 177-182.

Tauseef M., Shahid M., Sharma K. K, Fahim M. (2008): Antioxidative action of aspirin on

endothelial function in hypercholesterolaemic rats. BCPT 4: 314–321

Tendi EA, Bosetti F, Dasgupta SF, Stella AM, Drieu K, Rapoport SI (2002) Ginkgo biloba

extracts EGb 761 and bilobalide increase NADH dehydrogenase mRNA level and mitochondrial

respiratory control ratio in PC12 cells. Neurochem Res 27: 319-23.

Tietze F (1969) Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total

and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues. Anal Biochem

27(3): 502-22.

132

Tomás-Zapico C, Coto-Montes A (2005) A proposed mechanism to explain the stimulatory

effect of melatonin on antioxidative enzymes. J Pineal Res 39: 99-104.

Tsai HH, Lin HW, Lu YH, Chen YL, Mahady GB (2013) A Review of Potential Harmful

Interactions between Anticoagulant/Antiplatelet Agents and Chinese Herbal Medicines. PLoS

ONE 8(5): e64255

Ude C, Schubert-Zsilavecz M, Wurglics M (2013) Ginkgo biloba extracts: a review of the

pharmacokinetics of the active ingredients. Clin Pharmacokinet 52: 727-49.

Ulbricht C, Chao W, Costa D, Rusie-Seamon E, Weissner W, Woods J (2008) Clinical evidence

of herb-drug interactions: a systematic review by the natural standard research collaboration.

Curr Drug Metab 9: 1063-120.

Umegaki K, Taki Y, Endoh K, Taku K, Tanabe H, Shinozuka K, Sugiyama T (2007) Bilobalide

in Gingko biloba extract is a major substance inducing hepatic CYPs. J Pharm Pharmacol 59:

871-877.

Uredba Komisije (EZ) br. 1170/2009 od 30. studenoga 2009. o izmjeni Direktive 2002/46/EZ

Europskog parlamenta i Vijeća i Uredbe (EZ) br. 1925/2006 Europskog parlamenta i Vijeća u

odnosu na popise vitamina i minerala i njihovih oblika koji se mogu dodavati hrani, uključujući

dodatke prehrani.

Van Acker SA, Tromp MN, Haenen GR, Van Der Vijgh WJ, Bast A (1995) Flavonoids as

scavengers of nitric oxide radical. Biochem Biophys Res Commun 214: 755-9.

Van Beek TA, Bombardelli E, Morazzoni P, Peterlongo F (1998) Ginkgo biloba L. Fitoterapija

69: 195-243.

Van Beek TA, Montoro P (2009) Chemical analysis and quality control of Ginkgo biloba leaves,

extracts, and phytopharmaceuticals. J Chromatogr A 1216(11): 2002-32.

Van Eeden SF, Klut ME, Walker BA, Hogg JC (1999) The use of flow cytometry to measure

neutrophil function. J Immunol Methods 232: 23-43.

133

Vericel E, Rey C, Calzada C, Haond P, Chapuy PH, Lagarde M (1992) Age-related changes in

arachidonic acid peroxidation and glutathione-peroxidase activity in human platelets.

Prostaglandins 43: 75-85.

Violi F, Pignatelli P (2012) Platelet oxidative stress and thrombosis.Thromb Res 129: 378-381.

Wan XS, Devalaraja MN, Clair DK (1994) Molecular Structure and Organization of the Human

Manganese Superoxide Dismutase Gene. DNA and Cell Biology 13: 1127-1136.

Wang FM, Yao TW, Zeng S (2003) Determination of quercetin and kaempferol in human urine

after orally administrated tablet of ginkgo biloba extract by HPLC. J Pharm Biomed Anal 33(2):

317-321. 

Wang K, Zhang T, Dong Q, Collins Nice E, Huang C, Wei Y (2013) Redox homeostasis: the

linchpin in stem cell self-renewal and differentiation. Cell Death and Disease 4: 537.

Wang X, Yang L, Yang X Tian Y (2014) In vitro and in vivo antioxidant and antimutagenic

activities of polyphenols extracted from hops (Humulus lupulus). J Sci Food Agric 94: 1693-

1700

Watanabe CM, Wolffram S, Ader P, Rimbach G, Packer L, Maguire JJ, Schultz PG, Gohil K

(2001) The in vivo neuromodulatory effects of the herbal medicine ginkgo biloba. Proc Natl

Acad Sci USA 98(12): 6577-80.

Weydert CJ, Cullen JJ (2010) Measurement of superoxide dismutase, catalase and glutathione

peroxidase in cultured cells and tissue. Nat Protoc 5: 51-66.

Whitin JC, Tham DM, Bhamre S, Ornt DB, Scandling JD, Tune BM (1998) Plasma glutathione

peroxidase and its relationship to renal proximal tubule function. Mol Genet Metab 65: 238-45

Wright B, Moraes LA, Kemp CF, Mullan W, Crozier A, Lovegrove JA, Gibbins JM (2010) A

structural basis for the inhibition of collagen – stumulated platelet function by quercetin and

structurally related flavonoids. Br J Pharmacol 159: 1312 – 25.

Wu G, Fang YZ, Yang S, Lupton JR, Turner ND (2004) Glutathione metabolism and its

implications for health. J Nutr 134: 489-92.

134

Xu SL, Choi RCY, Zhu KY, Leung KW, Gou AJY, Bi D, Xu H, Lau DTW, Dong TTX, Tsim

KWK (2012) Isorhamnetin, a flavonol aglycone from Ginkgo biloba L., induces neuronal

differentiation of cultured PC12 cells: Potentiating the effect of nerve growth factor. Evid Based

Complement Alternat Med 2012: 1-12.

Yokooji T, Nouma H, Matsuo H (2014) Characterization of Ovalbumin Absorption Pathways in

the RatIntestine, Including the Effects of Aspirin. Biol Pharm Bull 37(8): 1359-1365.

Zelko IN, Mariani TJ, Folz RJ (2002) Superoxide dismutase multigene family: a comparison of

the CuZn-SOD (SOD1), Mn-SOD (SOD2), i EC-SOD (SOD3) gene structure, evolution, and

expression. Free Radical Bio Med 33: 337-349.

Zerovnik E (2010) Protein conformational pathology in Alzheimer’s and other

neurodegenerative diseases; new targets for therapy. Curr Alzheimer Res 7: 74-83.

Zhang C, Tian X, Luo Y, Meng X (2011) Ginkgolide B attenuates ethanol-induced neurotoxicity

through regulating NADPH oxidases. Toxicology 287(1-3): 124-30.

Zhang K, Yang EB, Tang WY, Wong KP, Mack P (1997) Inhibition of glutathione reductase by

plant polyphenols. Biochem Pharmacol 54(9): 1047-1053.

Zhang C, Hein TW, Wang W, Chang C, Kuo L (2001) Constitutive expression of arginase in

microvascular endothelial cells counteracts nitric oxide mediated vasodilatory function. FASEB

J 15: 1264–1266.

Zhou G, Marathe GK, Willard B, McIntyre TM (2011) Intracellular Erythrocytes Platelet-

activating Factor Acetyllhydrolse I Inactivates Aspirin in Blood. J Biol Chem 286: 34820-34829.

Zhu Y, Carvey PM, Ling Z (2006) Age-related changes in glutathione and glutathione-related

enzymes in rat brain. Brain Res 1090: 35–44.

Zollner H (1993) Handbook of Enzyme Inhibitors, 2nd ed., New York, NY: 938.

135

8 ŽIVOTOPIS

Marija Skoko (rođ. Lovrić) rođena je 2. prosinca 1981. godine u Širokom Brijegu, Bosna i

Hercegovina gdje je završila osnovnu, opću gimnaziju i srednju glazbenu školu. Diplomirala je

na Medicinskom fakultetu u Zagrebu 2006. godine. Nakon stjecanja diplome doktora medicine

pripravnički staž odradila je u Kinici za psihijatriju Vrapče nakon čega je položila državni ispit.

Kao licencirani liječnik radni staž započela je u ambulantama obiteljske medicine gdje je provela

skoro dvije godine. Od 2009. zaposlena je u Kliničkom bolničkom centru Sestre Milosrdnice u

Zavodu za transfuzijsku medicinu. U ožujku 2014. postaje specijalist transfuzijske medicine u

Zavodu za transfuzijsku medicinu, u službi za transfuzijsku medicinu i hemostazu onkoloških

bolesnika.

Tijekom specijalističkog usavršavanja i kao mladi specijalist aktivno je sudjelovala na više

međunarodnih i nacionanih skupova te objavljivala znanstvene radove u domaćim časopisima.

U akademskoj 2010/2011 upisala je znanstveni doktorski studij na Biološkom odsjeku,

Prirodoslovno-matematičkog fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu.

Orginalni znanstveni radovi:

1. Banović M, Krajačić Karas G, Veliki Dalić I, Lovrić M, Banović M (2009) Platelet

resistance to antiaggrgating effect of acetylsalicylic acid in soid tumor patients. Libri

Onco 37(1-3): 1-5

2. Banović M, Lovrić M, Veliki Dalić I, Banović M (2009) Hemovigilance and post-

transfusion reactions to blood components in patients with solid tumors. Libri Oncol

37(1-3): 7-10

3. Culej J, Skoko M, Mihić Lasan I, Vučemilo T, Šturm D (2011) D - Dimer levels in

patients with metastatic liver cancer before and after sugery. Libri Oncol 39(1-3): 7-10

4. Skoko M, Mihić Lasan I, Culej J, Vučemilo T, Šturm D (2011) Association between

ABO blood group, Rh factor and breast cancer in patients treated at the university

Hospital for Tumors. Libri Oncol 39 (1-3): 15-19

136

5. Mihić Lasan I, Skoko M, Culej J, Vučemilo T, Šturm D (2011) Relationship between

ABO blood groups and colorectal cancer. Libri Oncol 39(1-3): 11-14

6. Skoko M, Mihić Lasan I, Culej J, Krajačić Karas G, Vučemilo T, Šturm D (2012) Serum

ferritin concentration in solid tumor patients. Libri Oncol 40(1-3): 1-5

7. Vučemilo T, Skoko M, Šarčević B, Puljiz M, Alvir I, Pavelić Turudić T, Mihaljević I

(2014) The level of serum Pro-matrix metalloproteinase-2 as a prognostic factor in

patients with invasive ductal breast cancer. Coll Antropol 39(1):135-140

Kongresna priopćenja:

1. Vučemilo T, Skoko M, Šturm D (2012) Oral contaceptives, thrombophilias and DVT in

youn women after tonsilectomy. 22. International congress on thrombosis in Nica. DOI:

10.1016/j.thromres.2012.08.141

2. Vučemilo T, Šturm D, Krajačić Karas G, Skoko M (2012) Prognostička vrijednost

inhibitora – 1 aktivatora plazminogena (PAI-1) u plazmi bolesnica s karcinomom dojke.

5. Hrvatski kongres hematooga i transfuziologa

3. Vučemilo T, Puljiz M, Alvir I, Mamić I, Skoko M (2014) Total abdominal Hysterectomy

and postoperative bleeding diathesis. 23. International congress on thrombosis in

Valencia. Thrombosis Research, 133, Suplement 3, 2014: S57

4. Skoko M, Culej J, Banovic M, Dodig J, Sovic D, Jularic A, Mihic Lasan I, Stefic A,

Vrdoljak DV, Vucemilo T (2015) Preoperative coagulation tests in patients who had

undergone liver resection and consuption of blood products during and 7 days after

surrgery. 25th Regional congress of the Internationa society of Blood Transfusion. Vox

Sanguinis 109, Supplement 1, P-746

Prikazi slučajeva:

1. Culej J, Mihić Lasan I, Skoko M, Krajačić Karas G, Vučemilo T, Šturm D (2012)

Thrombeastography in diagnosis of hypercoagulabile state in cancer patients. Libri Oncol

40(1-3): 7-9

137

2. Mihić Lasan I, Penavić I, Sorić K, Skoko M, Culej J, Vučemilo T, Šturm D (2012)

Association Between High D – Dimer plasma levels and Haematoma. Libri Oncol 40(1-

3): 17-20

3. Mihić Lasan I, Skoko M, Culej J, Vučemilo T, Krajačić Karas G, Šturm D (2012)

Recurrent Deep Venous Thrombosis in a cancer patient during coumarin therapy. Libri

Oncol 40(1-3): 21-25

4. Skoko M, Mihić Lasan I, Culej J, Vučemilo T, Šturm D (2012) Upper extremity deep

venous thrombosis in oncological patients. Libri Oncol 40(1-3): 35-38

138