Jg. 42, ~Ief~ 12 g . DECKER, H. E. FnAXZ u. M. FRAS"Z : Wirkung yon Puromycin und Aminonueleosid auf die Proteinsynthese 583 15. Juni 1964

jeweilige Organ bzw. den Tumor bei behandelten wie bei unbehandel ten Tieren aui. Eine strenge Paralteli- t/it war bei einem in vivo-Versueh nicht zu erwarten. Anders als in kurzen Zeitri~umen ~, f/ir die sieh eine Wir- kung des anabolen Steroids auf die spezifisehe Akt ivi ta t des TumoreiweiBes nicht naehweisen lieg, sind naeh 6 und 24 Std Untersehiede in den Kurven der spezifisehen Akt iv i t£ ten des Tumorproteins yon behandetten und unbehandel ten Tieren abzulesen. Der raschere E inbau des Glycins in das Tumorprote in bei den mit Met.he- nolon-behandelten Tieren gegen(iber den Kontrollen, der im 3. Versuch (C3H-5{guse mit Careinom) sta- tistiseh signifikant ist, muB Ms das dureh anabole Steroid bedingter Effekt gewertet werden. Der sehnelteren Aufnahme yon Glyein folgt ein Abfal[ der spezifischen Ak~ivit/it des TumoreiweiBes ~ron der ~. bis zur 24. Std, also in einem Zeitraum, in dem die Glyeinaufnahme in das Tumorprote in bei den unbe- handel ten Tieren noeh nieht abgesehlossen ist. Often- bar be~drkt Methenolon einen beschleunigten Aus- tauseh yon markier tem Glyein im Tumorprotein. Ob diese erhShte Austausehgesehwindigkeit als isoliertes biologisches Ph~nomen betraehtet werden mug, oder ob man darin den Ausdruek einer gesteigerten Protein- synthese sehen darf, kann zur Zeit nieht entsehieden werden, obwohl ffir das Sarkom 180 mit anderen Methoden ein anaboler Effekt des Methenolons naeh- zuweisen war.

I n allen drei Versuchen steigt die spezifisehe Akt iv i tg t des Tumoreiweil~es yon der 6. bis zur 24. Std gegenI~ufig zu der Aktiviti~t des Leber- and Nieren- proteins welter an. Dieser Eintr i t t yon Aktivit~t in das Tumorprote in kann nur dureh Aufnahme freJ- gewordenen Glyeins aus anderen Organen erfolgen. Der Tumor fungiert also als Eiweigfalle, Me LE PAGE

U. Mitarb. S-~ besehrieben haben. Es w/~re wichtig, in einem spgteren Versuch festzustetlen, wann aueh hier eine Abnahme der spezifisehen Akt ivi tg t dos Tumor- proteins beginnt.

Zu~'ammen/assung. Gaben yon ~{ethenolon fiihren bei N~'ii%I-5~usen mi t Sarkom 180 und bei CsH- M~usen mit Careinom zu einem raseheren E inbau radioakt iv markier ten Glycins in das Tumorpro te in 6 Std naeh Gabe der Aminosiiure, der bei den CatL Tieren statistisch signifik~nt ist.

Die spezifisehe Aktivi t~t des Tumorproteins der Kontroll t iere steigt noeh bis zur 2~. Std an. Wahr- seheinlich kommt hierin eine Funkt ion des Tumors als EiweigfMte dos Organismus zum Ausdruek.

Summary. Small doses of methenolone enhance incorpora- tion of 1-C~-gtycine into tumor protein 6 hours after intra- peritoneal injection of the radioactive amino acid, according to observations made with NMt~I mice bearing sarcoma 180 and with C3I{ mice bearing a transplantable carcinoma. In C3H mice this enhancement is statistically significant com- pared with controls.

In control mice specific activity of tumor protein still increases until 24 hours after i.p. application of glyeine-l-CZL This may be due to the tumor's functioning as a nitrogen trap.

Literatur. ~D~Ews, J., E. FSLSC~ u. H. C~v~zE: U'ber die }Virkung yon 1-1Vfethyl-A-l-anch'ostenolonacetat auf das V~raehstum mMigner transplantabler Tumoren der h{aus. Verh. dtsch. Ges. irm. Ned. 69, 464 (1963). - - l DRaws, J., E. F6LSOK u. I-I. GgV~ZE: Zur anabolen Wirkung yon i-Methyl- A-t-androstenolonaeetat auf das Sarkom 180 and die Wir~s- gewebe der Maus. Noch unver6ifentlichte Versuche 1963. - - s LE PAGE, G.A., V. POTTEI¢, 1{. Bvse~, C. I-IEIDELBEI~GER, and 1%. ttU~LSE~T: Growth of carcinoma imp]ants in fed and fasted rats. Cancer Res. 12, 135 (1952). --- abysses , A.: Some tumor-host relationships with regard to nitrogen. Cancer tles. 14, 89 (1954). - - ~ BABsoN, A., and T. WI~IOK: Protein transfer in tile tumor beating rat. Cancer Res. 14~ 606 (I95g).

Vergleichende Untersuehungen fiber die Wirkung yon Puromycin und Aminonucleosid auf die Proteinsynthese*

Von K. D ~ c ~ , H. E. F~A~z and M. F ~ N Z

Aus dem Biochelnischen Institu~ (Direktor: Prof. Dr. ]~E~UT HOISZER) und der 5Iedizinischen PolikIinik (Direktor: Prof. Dr. tIANS S~aE) der Universit~t Freiburg L Br.

I n der experimentelten Nierenforsehung n immt das Aminonueleosid (6-Dimethylamino-9-[3'-desoxy.. 3 '-amino-~-D-ribofuranosyl-] purin eine hervorragende Stellung ein, da es die M6gliehkeit bietet, an i%atten ein nephrotLsehes Syndrom mit einer ehemiseh deft- nierten Substanz zu erzeugen (FR~NKetal . 1955). Trotz zahlreicher Untersuehungen ist der Angriffs- punk t dieser Substanz im Stoffwechsel noeh nicht e rkannt worden. Das Antibiot icum Puromycin, aus dem dutch Abspal tung der Methoxyphenylalanin- gruppe Amiuonucleosid ents teht (BAKE~ et al. 1955), hemmt die EiweiBsynthese in r ive (Go,sKI et al. 1961) und in vitro (~'A~OLIS~S~;I and DE L~( HAB_a 1959) ; es ruff bei l%atten generalisierte StoffwechselstSrungen, ]edoch kein nephrotisehes Syndrom hervor (SHE~51AS- et al. 1954).

Bei der nahen strukt~irellen Verwandtsehaft mi t dem Puromycin war es angebracht , die M6gliehkeit eines direkten Einflusses yon Axninonueleosid auf die Proteinsynthese zu prfifen. Es wurde deshalb ein Ver-

* Mit Unterstiitzung der Deutsehen Forschungsgemein- sehaft, Bad Godesberg.

gleieh der VJirkung yon Puromyc in ur~d Aminonucleo- sid auf die Eiweigbildtmg in Geweben versehiedener I I e rkunf t in r i ve und in vitro durchgef~hrt , sowie die Verteiluug yon murkier tem Aminonucleosid fin 0rga- nismus der Ra t t e gemessen**.

Methodil~ 1. Darstellur~g vou tritiiertem Amino~ucleosid. 122 mg Pla-

tinoxyd wurde~ in 0,5 ml 90%igem Eisessig in einem dick- wandigen l%Shrchen hydriert, nach Ersatz der Wasserstoff- atmosphere dutch Nl wurden 247 mg Aminonueleosid, in 0,5 mI 90%iger Essigs~ure ge15st, zugegeben und dazu an der Kochvakuumapparatur 2 ml tritiiertes Wasser (1,5 C) sub- timier~. Das ]¢Shrehen wurde abgesehmotzen nnd 24 Std in einem 01bad yon 109 ° geschiittelt. Naeh dem Abkfihlen und 0ffnen wurde an der Hochv~,kuum~pparamr die Fliissigkeit abdestil]iert and der Rfiekstand seehsmal in 200 ml Wasser gelSst und im V~kuum zur Trockne ehlgedampft. Der braune t~iiekstand wurde in 50 % item Dioxan gelSst and dutch wieder- holte Chromatographie in ]~utanol/Ameisens~ure/Wasser 77 : 10:13 zu konstanter spezi~iseher t~adioaktiviti~ (12,6 mC/ mMo]) gereinigt.

** Eine kurze ~bersicht fiber diese Axbeiten ~urde an- l~Blich des II. Symposions der Gesellschaft ffir Nephrologie am 22. Sept. 1962 in Bern gegeben.

584 K. DEeKm¢, H. E. FlCA~,IZ u. M. FI~A~Z: Wirkung yon Puromycin und Amino nueleosid auf die Proteinsynthese Klinische Wochenschrift

Die Bestimmung des tritiierten Aminonucleosids in den Geweben erfolg4e dureh erschSpfende Extraktion der homo- genisierten Gewebe mit w~l~rigem Dioxan. Die Analyse des TritiumgehMts er~olgte stets, ~uch bei den Chromatogrammen, in einem Fliissigkeitsseintillationsspektrometer (Tricarb).

2. _Nachweis der Proteinsynthese yon ~attenleber und -niere in vivo. 15 mg Aminonucleosid bzw. Puromycin, in 0,5 mt gepufferter SMzlSsung (0,04 M Natriumphosph&tpuffer pH 7,4 in 0,9 % NaC1), warden c~. 200 g schweren weiblichen Sprague- Inzuchtratten in vier Portionen im Abstand yon 1 Std intr~- peritoneal injiziert. Die Kontrolltiere bekamen nur die ge- pufferte Kochsalzl6sung. Je 0,1 mg 1-1~C-Glycin (6,4tic) in 0,5 ml gepufferter Kochsa]zlSsung wurden zweimal im Ab- stand yon 2 Std ebenfalls intraperitoneaI in]izier~. 2 Std nach der letzten Injektion wurden die Tiere dureh Nackenschlag getStet, Leber und Nieren entnommen und getrennt wie folgt ~ufgearbeitet: Das Gewebe warde sofort in 5% Trich]oressig- s~ure im Potter-Elvehjem-Homogenisator zerkleinert und so- dann zentrifugiert. Das Prgcipitut wurde dreimal mit 5% Trichloressigs~ure gewusehen, um die s~arelSsliche P~adio- aktivit~t zu entfernen. Lipide wurden dureh uufeinanderfot- gendes Waschen mit 80%igem Alkohol, absolutem Alkoho], ~bsolutem Alkohol-Chloroform 1:2 und J~ther extrahiert. Zur Ausz~hlung wurden die l~tickst~nde in diinner Schieht ~uf Aluminiumsch~lchen aufgetragen und im Meth~ndarchflulL z~hler gemessen. Die Resultate sind, unter Berficksichtigung der Selbstabsorption, als IpM/mg Protein-Nucleinsi~ureriick- stund uusgedrfickt.

3. Bestimmung der Eiweiflsynthese in Leber- und Nieren- sehnitten der Ratte in vitro. :Nach Dekapitation wurden volt 200 g schweren Spr~gue-Inzuchtratten (weiblich) Leber und Nieren rasch entnommen und in ca. 300/* starke Scheiben geschnitten. Bis zur Inkubation wurden die Schnitte in ge- pufferter SalzlSsung (0,122 M NaC1, 1,3.10 -~ M KC1, 1,8.10 -* M CaC4, 6,5"10 -~ M MgSO~, 0,01 M Nutriumphosphatpuffer pH 7,2) bei 20 aufbew~hrt. 0,5 g Leber- bzw. Nierenschnitte warden in dersetben Ringer-Phosphatl6sung 5 min bei 220 vorinkubiert, sod~nn 0,04 #Mol U-~aC-Leucin (1,1.10 s IpM) nnd Puromyein bzw. Aminonueleosid, in Puffer gelSst, zugesetzt. Die Ansi~tze wurden bei 220 in einer Luft~tmosph~re im W,~r- burg-Apparat 30 rain geschfittelt (Frequenz 125 min-~), sodann auf 0 ° abgekiihlg und das ribosomale mid 16sliehe Eiweig zu- sammen bestimmt. Die Isoliermig des Proteins erfolgte wie unter 2. besehrieben, jedoch warde durch Erw~irmen auf 800 die l~ibonueleinsi~ure mit Triehloressigsaure ausgewasehen. Die l~esultate sind als IpM/mg Protein ausgedriiekt.

4. Bestimmung des Proteinsynthese in ~hdieh-Ascites- Tumorzellen in vitro. Die in iiblieher Weise gewonnenen Asciteszellen warden dreimal in Phosphatpuffer gewaschen und in 2 Vol. dieses Puffers suspendiert. 12 ml der Suspension wurden nnter Zusatz yon 4 ml Puffer sowie 0,04 #Mol U-I~C- Leucin (1,1"10 ~ IpM) mid Puromycin bzw. Aminonucleosid 30 rain bei 220 unter Sehfitteln in der Luft inkubiert, dalm auf 0 ° abgekiihlt und ansehliel~end 3 rain bei 0 ° zentrifugiert. Die abgetrelmten Zellen wurden im zehnfachen Volumen Wasser lysier~. Ansebliel~end warden durch Zusstz konzen- trierter L5sungen folgende Konzentrationen eingestellt: 0,5 ]~[ NaCI, 0,005 M MgCl,, 0,01 M Trispuffer pH 7,6. Nach 10 rain Stehen wurde zentrifugieI~ (I5000× g), das im Uberstand enthMtene ribosomale und ]Ssliehe Protein wie unter 3. be- schrieben isotiert und gezahlt. Der Aminosgureneinbau ist in IpM/mg EiweiG ~usgedriickt.

5. Untersuchunff der Eiweiflsynthese in Leber und ~iere bei protrahierterAminonueleosideinwirkunffinvivo. 200g schweren weibtichen Ratten wurden tgglich 1,5 rag/100 g KSrpergewicht Aminonucleosid injizier~. Am 3., 5. mid 8. Tag wurde je drei Ratten 2 Std vor der TStung 0,04 #Mol U-xaC-Leuein (22-10 s IpM) intraperitoneal injiziert. Die Auf~rbeitung er- folgte wie miter 2.

6. Untersuchun~den der Polypeptidsynthese des ZeUkerns in vitro. Die Zellkernfraktion aus lqattenleber win'de n~ch A~,~- ~ 1 ~ (1957) gewonnen uud naeh Anf~rben mit H~malaun mikroskopisch auf ihre Reinheit geprfift. Der Einb~u yon ~C-Leuein in die Kernproteine erfolgte in Ans~tzen, die in 2,5 nil Gesamtvolumen 50 ltMol Phosphatpuffer pH 7,1, 125/tMol Sucrose, 40/~Mol Glucose, 25 #Mol NaC1, 0,33/~Mol U-~aC-Leuein (1,2.10 ~ IpM), 1 ml Zellkernsuspension and Puro- myein bzw. Aminonueleosid in Wasser gelSst, enthieIten.

Die Ansi~tze warden in 20 ml-RundkSlbehen 1 Std bei 37°C geschiittelt, dar~uf mit dem gleichen Vo]umen 20%iger Triehloressigs~iare versetzt. Die Fgllung warde mit 5%iger Trichloressigs~are bei 90 ~ zur Entfernung der Nueleins~uren

behandelt und der Proteinniederschlag nach Waschen ira Wasser suspendiert und auf Aluminiumsch~ilchen im Methan- durchfluBzahler auf seinei1 l*C-Gehalt gepriift.

Ergebnisse

U m die M6glichkei t e iner spezifischen Anre icherung des Aminonueleos ids in b e s t i m m t e n Geweben zu pri i- fen und d a m i t einen t t inweis auf den Angr i f f spunk t dieser Verb indung zu erhal ten, s tud ie r t en wir zun~ichst die Vertef lung yon T - m a r k i e r t e m Aminonucleos id im K 6 r p e r der R a t t e nach in t rape r i tonea le r I n j e k t i o n und die sich in den einzelnen Organen e ins te l lenden Kon- zen t ra t ionen . I n Ube re in s t immung m i t ALEXA~TDEt~ (1961) fanden wi t ca. 80% der appl iz ier ten Radio- akt~vit~t innerhMb 24 S td hm Ur in ~deder. Nach 24 S td wurden die Tiere ge t6 te t nnd der T -Geha l t de r einzelnen Gewebe gemessen (Tabelle 1). Das aus den

Ta.be]le 1. SH-Gehalt der Ratten-Orga:ne 24 Std nach Injektio~v yon 5 [zMolen (23 × 106 IpM) 3H-AminonucIeosid

(Bedingungen s. Methodik 1

m~Iole Organ Amino-

nucleosid/g

Leber. .

Nieren .

Herz . .

Serum .

Frisch- gewicht Ip)I/g

in g

3,9 31800 0,8 9000 0,5 15200 - - 1550

(pro rot)

6,9 2,0 2,9 0,3

(pro rot)

Organen, aus Serum und Ur in ex t rah ie r te r ad ioak t ive Mater ia l erwies sich in der Chromatographie und in seinem Abso rp t ions spek t rum ident iseh mi t d e m Aminonuc]eosid; da bei dem bier ve rwende ten Pri~pa- r a t (6#C/#Mol) noch 1 m#Mol chromatographiseh nachgewiesen werden kann, is t zu schlieBen, dal3 Aminonucleos id im Organismus keinen nennenswer ten Umwand lungen unter l iegt .

I n einer zweiten Versuchsreihe wurden in de r zur Erzeugung des nephro t i sehen Syndroms angewand ten ~VVeise 6 Tage lang tggtieh 2,25 mg T-Aminonucleos id in j iz ier t und die Organe 24 S td nach der le tz ten App]i- ka t ion auf ihren T-Geha l t analys ier t . Die gefundenen A k t i v i t a t e n waren hierbei noch geringer als die in der Tabel le 1 angegebenen und lagen durchwegs an der un te ren Grenze der Na,chweisbarkeit . Die Konzen t r a - t ion des Aminonucleosids s te igt auch nach p ro t r ah ie r t e r A p p l i k a t i o n in ke inem Organ an, es seheint also n ieh t spezifisch re t in ie r t zu werden.

Die verg]eiehenden Un te r suehungen fiber den FAn- fiuI3 yon P u r o m y c i n und Aminonueleos id auf die P ro te insyn these wnrden an Ehr l ieh-Asci tes -Tumor- zenen der Maus, in I~at tenleber und -niere in vivo sowie an Sehni t t en durchgef i ihr t . Die D a t e n der Abb . 1 geben eine Versuchsserie an Asciteszellen wieder. Man erkennt , dal3 mt t s te igender P u r o m y c i n k o n z e n t r a t i o n die P ro te insyn these zunehmend gehemmt wird; da- gegen beobach te t en wir n n t e r der Eim~grkung yon Aminonue leos id s te ts eine, wenn aneh nur gering- ffigige, Steigerung der EiweiBbildung.

~hn l i ehe Verh~]tnisse fanden wir bei der Unter - suchnng der P ro te insyn these in R a t t e n l e b e r und -niere in vivo, ffir d ie in Abb . 2 wiederum eine Versuehsserie wiedergegeben ist. Charakter i s t i seh erseheint hier, da~ 1. die g e m m u n g der P ro te insyn these d u t c h Puro- m y c i n in de r Leber ausgepr~gter is t als in der Niere, und 2. Aminonuc]eosid in de r Leber wiederum zu einer

Jg. 42, Heft. 12 K. DEeKEt~, H. E. FI~A~Z u. M. FI~ANZ : Wirkung yon Puromycin und Aminonueleosid ~uf die Proteins.~lthese 585 15. Juni 1964

geringfi igigen Ste igerung der EiweiBbildung fiihrt , wghrend ein solcher Ef fek t in der Niere hie beobaehte~ werden konnte .

Die Versuehe an Sehni t t en yon R a t t e n l e b e r u n d -niere (Abb. 3) ff ihrten zu gle ichar t igen Ergebnissen. Man ers ieht a.us den Versuehen an den Nierensehni t ten , dag aueh in Gegenwar t hSherer K o n z e n t m t i o n e n an P u r o m y c i n ein un te re r Grenzwer t de r P ro te insyn these e rha l ten bleibt . I n Gegenwar t yon Aminonucleos id is~ in de r Niere wiederum keine Ste igerung der Pro te in - synthese zu erkennen.

Bei p ro t r ah i e r t e r Aminonucleos idgabe in v ivo (Ta- belle 2) ~rit, t berei ts am 5. Tage ein ger inger Abfal l des

Tabelle 2.

Injiziert

Amino- nueleosid

Koehsalz

Amino- nucleosid

Koehsalz

Amino- nueleosid

Kochsalz

Protei~synthese wghrend der Entwicklung des experi-

7,12 53

6,30 79 6,55 68

7,30 99

5,30 270 4,60 208

6,60 70

60,5 34,6

IpM/mg ~2rotein

Leber Niere

55 78 75 83

60 71

102 98 98 105

96 95

50 55 50 63

60 57

SerumgesamteiweiBes bei no rma tem Serumeholes ter in ein. A m 8. Tag f inder mgn einen wei teren Abfa l l des Serumpro te ins bei deut l ieh e rhShtem Choles~erin- spiegel und beg innender Eiweigausseheidung im Urin. Der Leue ine inbau in das Leber- und Niereneiweig zeigt, abgesehen yon ger ingen methodiseh bed ing ten Sehwan- kungen, keine e indeut ige ~ n d e r u n g der Synthesera te .

I m Gegensatz zur P ro te insyn these in Leber , Niere oder Asei teszel len wird de r E inbau yon Leuein in tr i- ehloressigs~uref£llbare Po lypep t ide des Zellkerns weder du reh P u r o m y e i n noeh dureh Aminonucleos id ge- hemmt, (Abb. 4). Da bei diesen Versuehen aueh auf wesen~Iiehe Komponen#en der ey~oplasmat ischen Ei- weigsynthese (ATP, GTP) verz ich te t werden kann, l iegt die Ve rmu tung nahe, dal~ es sieh hier um einen anders gea r t e t en Meehanismus der P ro te insyn these hande l t .

I n den bier besehr iebenen Versuehen konn ten wir die hemmende W i r k u n g des Pu romye ins auf die Pro- t e insyn these in Leber , Niere und Asci tes-Tumorzet len best~#igen, wobei jedoeh die quan t i t a t i ven Unte r - schiede beziiglich des Leber- und Nierensys tems zu beach ten sind. Das s t r u k t u r v e r w a n d t e Aminonueleo- sid wirk# n ieh t auf die P ro te insyn these eh~; es is t an dieser Stelle aueh zu erw/~hnen, dal~ wi t keine Hem- mung des W a e h s t u m s yon E. coli du tch diese Ver- b indung beobaeh ten konnten . Die nephroseausl6sende W i r k u n g des Aminonueleos ids ka.nn demnach n ich t im Bereieh der P ro te insyn these liegen. Uber weitere Versuehe, die sieh mi t e inem EinfluB des Amino- nueleosids auf die Biosynthese der Pur ink6rper befas- sen, wa rden wir an andere r Stelle berieh~en.

Zu~ammen/assung. Es wurde die Wirkung yon Puromycin und seinem Aminonueleosid auf die EiweiBsyn~hese in Ehr- lieh-Asei~estumorzellen der Maus sowie in gattenleber und -niere untersucht.

3oo F 17minonucleosid

Punomfc/n 17"? ....... r ...................

o o, o5-0,1 o,5 T~N ~,0 Konzenfration

Abb. 1. Wirkung yon Aminonucleosid und Puromycin auf de]] ~C-:Leucin- Einbau in Ehrlich-Ascites-Tulnorzellen. Bedingungen siehe Methodik 4

800

5oo

~oo

IOg

Leben Nienen Abb. 2. Wirkung ~on ]?uromycin und Aminonucleosid auf die

EiweiBsynthese in vi¥o. Bedingungen siehe X~Iethodik 2 [] Kontrollen; [] Puromycin; [] Aminonucleosid

2oo ~ )

Ioo

"~ 3OO

gO0

1oo

o o,o~5 0,05 o,l~N

b)

x \

Konzenlnah'om

\ \

1 ran

Abb. 3. :Einilul~ yon Aminonucleosid und :Puromycin auf den ~C-Leucin- Einbau in Leber- und Nierenschnitte der ]latte. Bedingungen siebc.

Methodik 3. I Kontrolien; [] ]?uromycin; [] Aminonucleosid

"II o 0,7 /,o ~H /{uzzei/tnafion

Abb, 4. EinfluB yon Puromycin und Aminonuoleosid atff die Protein- synthese der Zellkerne aus t~ati,enleber. Bedingungen siehe ~Iethodik 6.

[] Kontrollen; [] Puromycin; [] Amfllonucleosid

W~hrend die Hemmung tier cytoplasm~tischen Protein- synthese bes~tigt werden konnte, zeigte das Aminonucleosid, such n~ch pro~rahierter Applikation, keinen gMchartigen Effekt. Die Polypeptidsynthese im Zellkern wird weder durch Puromyein noch durch Aminonucleosid beeinfluBt.

586 T. SI[II~AI: Zur ?~Iethode der Bestimmung der fibrinolytisehen A~ivit~t in Plasma Klinische Wochenschrift

Injiziertes, tritiummarkiertes Aminonucleosid wird im TierkSrper nut in sehr geringen Mengen retiniert; es zeigt sich keine Bevorzugung eines bestimmten Organs, vielmehr wird es, such nach 1/~ngerer Applikation, fast gteichmiiNg im K6r- per verteilt.

Summary. The effect of puromycin and its amino- nucleoside on protein synthesis has been compared in Ehrlieh ascites tumor cells of the mouse, and in rat liver and kidney.

While the blocking of cytoplasmatic protein synthesis by puromyein was confirmed, aminonucleoside haA no appreci- able effect in this regard, even after prolonged application. Nuclear protein synthesis was not interfered with by both puromycin and aminonueleoside.

Injected tritium tagged aminonucleoside was retained in the body only in small amounts and showed no prevalence for

single organ in the rat, but was distributed almost evenly over the whole body, even after prolonged application.

Literatur. ALEXANDER, C. S., V. g . HUNT, and H.T. NAGASAWA: Oi l the mechanism of aminonucleoside nephrosis in Rats. Fed. Proc. 20, 166 (1961). - - ALLI'tCEY, V. G., A. E. Mn~s~Y, and S. OSAWA: Protein synthesis in isolated cell nuclei. J. gen. Physiol. 40, 451--513 (1957). - - BA~zEn, B. R.,

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Anschri/t: Dozent Dr. K. DncKE~ Biochemisehes Institut der Universit~it, Freiburg, Hermann-Herder-Str. 7 und Drs. H. E. F~A~z und M. FnA~z, gegenwi~rtige Anschrift: Departement of Pediatric l~esearch, Michael geese Hospital and Medical Center, Chicago, Illinois, USA

Zur Methode der Bestimmung der fibrinolytischen Aktivitiit in Plasma V o n

T. SEI~AI* Aus tier H~m~ologischen Ab~eilung (Leiter: Priv.-Doz. Dr. H. GEP~tIARTZ) tier I. ~Ied. Klinik der Freien Unive~si~/i~ Berli~

(Direktor: Prof. Dr. Frhr. v. K]~ESS)

Das im Blu~ und in einigen Geweben unter patho- logischen Bedingungen auftretende Fibrinolysin (Plus- rain) besitzt die Eigensehaft eines proteolyt ischen Fermentes nnd ist in der Lage, Fibrin und Fibrinogen, Casein, Gelatine sowie einige synthet iseh hergestellte Substrate, wie TA?~{e, BAMe bis zum Pept id abzu- bauen s, 19, ~0. Seine Aktivierung erfolgt aus dem im Blur vorhandenen Profibrinolysin (Plasminogen) mi~ Hilfe eines Akt ivators fiber ein kompliziertes System, das noeh keineswegs als gekl/irt gelten kann ~s, ~2. Da Fibrinolysin neben Fibrin and Fibrinogen aber such einige andere Gerinnungsfaktoren (V, V I I I , I I ) anzu- greifen vermag, kann eine gesteigerte Fibrinolyse bis zur h/£morrhagisehen Diathese und znr nnstil lbaren Blutung ffihren 7, is, 21, ~s Beobaehtnngen yon g y p e r - fibrinolyse ~, s, ~s haben daher in den letzten Jahren eine zunehmende Beaehtung gefunden. Zngleieh ist die klinische Bedeutung einer frfihzeitigen nnd exakten Erfassung des Vorliegens einer gesteigerten fibrino- lytisehen Aktivig/~t e rkannt worden.

Zur klinisehen Bes t immung der fibrinolytisehen Aktivit/ i t dient neben der zwar teehniseh einfaehen, jedoeh wenig empfindliehen Thrombelastographie 1~ die Fibrinplat ten-Methode, wie sic yon ASTRUP 2 (1951) angegeben und sp/~ter yon AsT~ut" und MffLLE:R~Z 3 sowie yon LASSESr is verbessert wurde. Andere Me- thoden 1, s, 9,11-1a erwiesen sich als teehniseh sehwie~g und zei t raubend und haben daher nu t ffir besondere Fragestel lungen Bedeutung. Beim Fibr inpla t tentes t dient sis M a t des fibrinolytischen Potentials die GrSge des lytisehen Areals, das die auf eine Rinder- fibrinptatte aufgetropft.e Testl6snng hinterl~t3t. Dabei erlanbt die gleiehzeitige Verwendung yon nat iven (plasminogenha.ltigen) und erhitzten (plasminogen- freien) Fibr inplat ten eine gewisse Differenzierung zwisehen der Akt ivator- and der Plasmin-Aktivi t / t t a.

Da sieh jedoeh der Fibr inplat ten-Test ffir die breitere klinisehe Anwendung als wenig geeignet er-

*Med. Klinik der Toho-UniversitSit Tokio (Japan).

wies, haben wir eine in ihrer Ausf/ihrung einfaehere und relativ wenig Zeit beanspruchende Methode ent- wickelt: Anstelle der Rinderf ibr inplat ten benutzten wir als Substra t Casein 9, 10, 17, 29, das sich bei ver- gleichenden Untersuchungen als nieht weniger ge- eignet erwies sis Fibrinogen 1, 6,17 Es ist stabiler als Fibrinogen nnd im Verbrauch billiger. Da im Casein weder t in Proak t iva to r noch das Profibrinolysin (Plasminogen) enthal ten ist, erlaubt die Verwendung yon Casein eine relativ reine Bes t immnng der proteo- lytischen Aktivit / i t (aktivierten Euglobulinfibrino- lyse).

Prinzip I m zu tes tenden Plasma werden zun/ichst durch

Verdfinnung und S/iuerung die das Profibrinolysin enthal tenden Euglobuline ausgef~llt. Das so er- haltene Sediment wird nun in Veronalpuffer gel5st und naeh Zugabe einer Streptokinasel6sung einer Casein]Ssung zugesetzt. I m Brutsehrank erfolgt dann die Aktivierung des Profibrino]ysins zu Fibrinolysin, wobei es gleiehzeitig znm Abbau des Caseins bis zum Pept id kommt . Ffigt man der entspreehend dem Fibrinolysingehalt abgebauten Casein]Ssung nun eine Ninhydrinl6sung zu, so f/irbt sich das nieht abgebaute Casein schwach lila; seine Farbintensi t~t wird photo- metriseh best immt.

Reagentien Gereinigtes Casein; Streptokinasel6sung: 20000 E ,,Vari-

dase" (Lederle) werden in 2 ml physiologischer Koehsa]z- 15sung gelSst.

NinhydrinlSsung 2%ig in VeronMpuffer (pH 7,5). Veronalpuffer pH 7,5: 7,3 g NaC1 ÷ 2,76 g Barbitur-

s/iure ~-2,06g di~thylsaures Natrium, gelSst in 1000ml Aqua dest. 1~ 1/10 n Salzs~ure. Normal-Butanol.

A us/iihrung Dureh Venenpunktion gewonnenes Citratblut (]: 9) wird

nach guter Durchmischung sofort in ein Zentrifugenglas gegeben und fiber 10 rain bei 3000 U/re_in zentrifugiert. Nach Abhebung des iiberstehenden Plasmas wird 1 ml Citrat- plasma mit 7,5 mI Aqua dest. verdiinnt und mit 1/10 n Salz-