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Microscopie électronique en biologie
Objectif de la microscopie en biologie
Imager des structures,
Co-localiser les protéines ou certaines molécules
Acquisition In vivo
A haute résolution
M Photonique
Photons
0.2 µm
Fixé ou in vivo
1 à 50 µm
Coupe ou culture
Quelques sec à qlq heures
Quelques ms en 2D
Marquage et colocalisation
Air, liquide
Lame, boite de pétri
Signal
Résolution
Fixé ou
in vivo
Epaisseur
l’échantillon
Durée de
préparation
Temps
d’acquisition
Immunomar
quages
Milieu
Support
Avantages et limites de la MO
Cheveu en MO
0.2 mm
Microsphère en MO
60 µm
En fluorescence on ne voit que ce qui est marqué
En Microscopie optique
Muscle cardiaque en coupe longitudinale
Gross . x300
En Microscopie photonique
X 1000
En Microscopie électronique
X 10000
Principe de la ME : Interaction électron-matière
LE Microscope Electronique à Transmission MET
Microscope Electronique en Transmission JEOL 100 Kv
MO
L’image MET la même culture
Immunofluorescence d’une protéine de jonction sur culture cellulaire
La Microscopie Electronique en Transmission
Applications du MET Ultrastructure sur coupe de tissu vivant ou matériaux Immunomarquage des protéines par billes d’or Diffraction électronique
Coupe MET dans une feuille d’arabidopsis
Effet de peptides microbienne sur cellules cancéreuse
Phagocytose
Bacteries dans cellules
Coloration négative • Virus, proteines, molecules
• Pas de coupes
• Résultats rapides
APT ou AcU à saturation dans l’eau ou alcool
100 nm
Phages
Immunomarquage, Echantillons
Anticorps primaire
Antigène
Epitope
Echantillon (tissus, cellules, virus, bactéries…)
Stage d'immunomarquage en M E, Toulouse le 15 mai 2010
Système révélateur billes or (1 à 15 nm)
Marquage post synaptique d’une protéine sur coupe de cellules nerveuse
LE Microscope Electronique à Balayage MEB
Interaction électron-matière
Microscope électronique à Balayage 840A de JEOL
Application du MEB
Image de surface cellulaire ou de matériau
Immunomarquage des protéines de surface par billes d’or
Imagerie en mode électrons rétrodiffusés
Spectrométrie X
La différence entre la peau humaine et la peau de souris
La surface d’un cheveu humain. Notez les plaques de kératine qui se chevauchent comme des écailles
Couchedes cellules desquamentes Poil
Chez la souris les plaques s’emboitent entre elles.
Epiderme Derme
Poil
20µm
20µm
Images de vaisseaux sanguins en MEB et MET
MEB MET
Gr
Pl N
Gr N 2µm
Culture cellulaire Fibrocytes Osteoblastes
Osteocyte Osteoclaste
200µm 500µm
200µm Œufs et larves(chenilles) du papillon blanc
500µm Charançon perçant le grain de blé
Legionella pneumophila traité aux peptides antimicrobienne
Les différents types de grain de pollen
20µm
20µm
Pomme de terre Crue
Pomme de terre cuite
200µm
Un poil de barbe coupé par la lame d’un rasoir mécanique
Un autre poil qui a été déchiqueté par un rasoir électrique
50µm
Cardiomyocite sur lame de culture
Cellule sanguine de Wolbachia
Col de chemise propre Col de chemise sale
200µm 200µm
Contraintes liées à l’échantillon
Le plus proche du vivant (Fixé) MET et MEB
Ultrafin Epaisseur de coupe comprise entre 60 et 70 nm MET
Déshydraté MET et MEB
Surface conductrice MEB
Etapes de préparations des échantillons pour la MET
MET MEB
Fixation des Lipides
Contraste
Coupes au microtome Semi-fines ~ 1 µm Ultrafines
~ 60 à 70 nm
Inclusion dans la résine
Polymérisation 60 à 70° C dans étuve (obtention de blocs)
Observation
Fixation des protéines Fixation des protéines
Métallisation
Déshydratation Acétone ou Ethanol
Déshydratation Acétone ou Ethanol
Observation
CO2 liq par purges à 10°C
CO2 liq /gaz 31°C (pt critique)
CO2 gaz 40°C Dessiccation totale
Appareil par contournement du pt critique du CO2
3 jours minimum
1 jour au mini
Culture cellulaire Tissu ou Suspensions (virus, bactéries, …)
Techniques classiques de fixation, déshydratation, inclusion et de coupes pour l’analyse ultrastructurale, Techniques immunocytochimiques avec immunomarquage à l’or colloïdal en pré ou post enrobage avec amplification à l’argent si nécessaire. Coloration négative de macromolécules et de fractions cellulaires Réalisation de coupes fines suivi du contraste
Métallisation et dessiccation par contournement du point critique. Observation aux microscopes MEB et MET. Collecte des résultats sous forme fichiers numériques
Enseignements et formations
Prise de contact : 35 36 Compétence et savoir faire : Préparation d’échantillons biologiques pour l’observation au MET et MEB
Nouvelles techniques microscopie Electronique
AMW (Automatic Microwave Tissue Processor)
Techniques à froid : cryofixation-cryocoupe- Cryo-MET –cryo-transfert pour le MEB Tomographie électronique
MEB 3 view Microscopie à balayage environnementale
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