Techniques de microscopie lectronique en laboratoire de rechercheStage PAF-APBG15 et 16 juin 2010Universit de RouenMarie-Laure Follet-Gueye et Mat Vicr-Gibouin

GlycoMEVCe diaporama a t ralis par Odile Mottet partir de photos des stagiaires

Prparation dchantillons vgtaux (racines de pois et de lin) pour la microscopie lectronique transmission (MET)Les tapes1- Fixation chimique2- Dshydratation3- Inclusion en rsine et polymrisation4- Ultramicrotomie5- Marquage et contrasteLes racines de pois sont sectionnes en fragments de 1 2 mm de longueur

1- La fixation chimiqueIl sagit de fixer les constituants organiques des ultra structures par un produit interagissant chimiquement avec ceux-ci . (Etablissement de liaisons faibles, oxydations =>rticulation des protines les rendant insolubles, inactivation des enzymes bloquant les ractions) .Le choix du fixateur est fonction des objectifs de ltude : * Pour lobservation des ultra structures, une post-fixation losmium suit la fixation* Pour effectuer la localisation cellulaire dune molcule par immuno cytochimie, les fixateurs choisis ne doivent pas altrer les pitopes sur lesquels se fixent les anticorps.

Les fragments de racine sont placs dans des tubes Eppendorf ( droite) remplis de fixateur pour une dure dune heure.Aprs plusieurs rinages, la post-fixation losmium seffectue lobscurit.Toutes ces manipulations se font sous hotte, avec des gants et tous les produits utiliss (trs toxiques) sont rcuprs dans des rcipients particuliers.

2- La dshydratationLes chantillons sont placs dans des bains dthanol de concentration croissante. Leau doit tre limine pour permettre un bonne polymrisation de la rsine.3. Linclusion dans une rsineLes chantillons sont progressivement imprgns de rsine puis inclus dans une rsine Epoxy dispose dans des moules. La polymrisation seffectue en une nuit 60C . Pour des tudes dimmunocytochimie, lemploi de rsines de type LR White savre ncessaire pour prserver les pitopes. La polymrisation seffectue froid et sous UV pour les pitopes de nature protique. Un chantillon est positionn vers lextrmit de chaque futur bloc de rsine.

Pointe racinaire

4- LultramicrotomieLe bloc de rsine est taill afin de crer un zone en forme de pyramide tronque au ras de lchantillon. Cest au niveau de cette zone que les coupes sont ralises.

Microtome couteau de verre permettant la ralisation de coupes semi-fines (de lordre de 500 nm)

Un couteau de verre : derrire le ct tranchant, un rservoir rempli deau accueille les coupesLa surface de lchantillon enrsin doit tre oriente paralllement au couteau. Il doit tre ensuite minutieusement rapproch de celui-ci.Bloc de rsine contenant lchantillonCouteau de verreRservoir deau servant rcuprer les coupes

Les couteaux de verres sont fabriqus au laboratoire1. Des plaques de verre carres sont sectionnes sur une diagonale2. Le tranchant est vrifi la loupe 3. Un rservoir destin recueillir les coupes est confectionn laide de papier adhsif et de vernis.

La ralisation de coupes semi-fines avec le microtome1. La rsine est positionne et ensuite le bras du microtome est mis en mouvement avec la manivelle (main droite).2. La coupe juste ralise telle quelle apparat au manipulateur dans les oculaires.coupe

3. Les coupes sont rcupres avec un cil coll lextrmit dune pipette Pasteur en verre.4. Les coupes sont dposes dans une goutte de poly-L-lysine permettant une meilleure adhsion.

5. Afin dobserver ces coupes au microscope optique, la goutte est vapore sur une plaque chauffante. Les coupes sont ensuite colores au bleu de toluidine, puis rinces et sches nouveau.coupePoly-lysine

Une coupe semi fine observe au microscope optique. Ici il sagit dune coupe de caryopse de bl dont on peut reprer la couche aleurone, les tguments et lalbumen. couche aleuronealbumentguments

Les chantillons enrsins peuvent tre coups lultramicrotome pour donner des coupes ultrafines (80 nm dpaisseur).La rcupration des coupes avec une anse de platine permet de les dposer ensuite sur des grilles.Le couteau est en diamant. Lpaisseur des coupes est choisie et les coupes se font de faon automatiqueLes coupes telles que les observe le manipulateur dans les oculaires.CoupesGrilles en cuivre prsentant un maillage sur lequel est dpose la coupe ultra-fineAnse de platine

5- Marquage et contraste5A. Marquage par immunofluorescence: tape ncessaire au reprage des zones analyser ensuite lchelle subcellulaire (MET)Ces lames puits en tflon contiennent des coupes semi fines de racine de pois de 0,5m dpaisseur. Ces coupes sont successivement mises en prsence : de tampon TBST, lait 3% destin saturer les sites non spcifiques, danticorps primaires JIM5 ou JIM7. Ces anticorps sont des anticorps monoclonaux de rat dirigs contre les homogalacturonanes constituants des pectines paritales.- danticorps secondaires, anticorps de chvre anti-IgG de rat, coupls au fluorescine Iso Thio Cyanate (FITC, molcule fluorescente)Les lames puits sont recouvertes dune lamelle scelles par du vernis.

5.B. Immunomarquage lor (pour observation au MET)Ces grilles Nickel portent des coupes ultrafines de racines de pois de 80 nm dpaisseur.Les grilles sont places successivement au contact de gouttes contenant : - un srum de chvre destin saturer les sites non spcifiques danticorps primaires (les mmes que pour limmunofluorescence) danticorps secondaires porteurs dune particule dor (10nm) opaques aux lectrons. Le contraste (actate duranyle puis citrate de plomb) est ensuite ralis.

Les grilles sont les supports qui (aprs ventuellement immunomarquage) sont placs dans le microscope lectronique transmission.Grille portant les coupes place dans le support insrer dans le microscope.

Vue gnrale de cellules de racineGlycoMEV

Statolithes (grains damidon) dans une cellule de la coiffeGlycoMEV

Dtails de cellules de la coiffeGlycoMEV

Paroi vgtaleGlycoMEV

Appareil de GolgiGlycoMEV

Des polysomesGlycoMEV

Mitochondrie et paroi. Ici lorganisation fibreuse (microfibrilles de cellulose) de la paroi est visible.GlycoMEV

Un exemple dimmunomarquage avec fluorescence (avec anticorps JM5) des homogalacturonanes de la pectine paritale (observation en microscopie optique fluorescence) ( ici une prparation dans un bouton floral dArabidopsis)Source : http://www.bmb.leeds.ac.uk/staff/jpk/gal1.htm

Rsultats de limmunomarquage lor des homogalacturonanes de la pectine paritaleLes petites taches trs sombres correspondent aux particules dor fixes sur les anticorps secondaires eux-mmes fixs sur les anticorps primaires. On peut ainsi localiser les molcules entrant dans la composition de la pectine..paroiparticules dorGlycoMEV

Les molcules marques sont reprables ici surtout au niveau de la lamelle moyenneGlycoMEV

Le marquage ici situ au niveau dun saccule golgien permet dmettre lhypothse de lintervention de lappareil de golgi dans la synthse des composants de la pectine GlycoMEV