96561834 Penentuan Kadar Protein Secara Biuret

I. Nomor Percobaan : VI

II. Nama Percobaan : Penentuan Kadar Protein Secara Biuret

III. Tujuan Percobaan : Untuk mengetahui kadar protein dalam suatu

sampel berdasarkan serapan cahaya melalui uji

biuret.

IV. Landasan Teori

Protein adalah salah satu biomolekul raksasa yang berperan sebagai

komponen utama penyusun makhluk hidup. Protein membawa kode-kode genetik

berupa DNA dan RNA. Beberapa makanan yang dapat menjadi sumber protein

adalah: daging, telur, ikan, susu, biji-bijian, kentang, kacang, dan polong-

polongan. Protein merupakan polimer alam yang tersusun dari asam-asam aminomelaluiikatan

peptida, sehingga protein juga disebut sebagai polipeptida.Di dalam tubuh kitaprotein berfungsi

sebagai zat pembangun, pengatur pertahanan, dan sebagai sumber energi setelah karbohidrat dan

lemak.Protein dapat digolongkan berdasarkanstrukturnya, bentuknya, dan fungsinya.

Protein Menunjukkan Berbagai Fungsi Biologi

Deret asam amino dari berjenis-jenis protein memungkinkan molekul ini

menjalankan berbagai fungsi, antara lain :

1. Enzim

Protein yang paling bervariasi dan mempunyai kekhususan tinggi adalah

protein yang mempunyai aktivitas katalisa, yakni enzim. Hampir semua reaksi

kimia biomolekul organic didalam sel dikatalisa oleh enzim. Lebih dari 2000 jenis

enzim, masing-masing dapat mengkatalisa reaksi kimia yang berbeda, telah

ditemukan didalam berbagai bentuk kehidupan.

2. Protein Transport

Protein transport didalam plasma darah mengikat dan membawa molekul

atau ion spesifik dari satu organ ke organ lain. Hemoglobin pada sel darah merah

mengikat oksigen ketika darah melalui paru-paru, dan membawa oksigen ini ke

jaringan periferi. Disini oksigen dilepaskan untuk melangsungkan oksidas nutrien

yang menghasilkan energi. Plasma darah mengandung lipoprotein, yang

membawa lipid dari hati ke ogan lain. Protein tranport lain terdapat didalam

membran sel dan menyesuaikan strukturnya untuk mengikat dan membawa

glukosa, asam amino, dan nutrien lain melalui membran menuju kedalam sel.

3. Protein Nutrien dan Penyimpan

Biji berbagai tumbuhan menyimpan protein nutrien yang dibutuhkan untuk

perumbuhan embrio tanaman. Terutama, contoh yang telah dikenal adalah protein

biji dari gandum, jagung, dan beras. Ovalbumin protein utama putih telur, dan

kasein, protein utama susu merupakan contoh lain dari protein nutrien. Ferritin

jaringan hewan merupakan protein penyimpan besi.

4. Protein Kontraktil atau Motil

Beberapa protein memberikan kemampuan kepada sel dan organisme untuk

berkontraksi, mengubah bentuk atau bergerak. Aktin dan miosin adalah protein

filamen yang berfungsi didalam sistem kontraktil otot kerangka dan juga didalam

banyak sel bukan otot. Contoh lain adalah tubulin, protein pembentuk mikrotubul.

Mikrotubul merupakan komponen penting dari fagela dan silia, yang dapat

menggerakkan sel.

5. Protein Struktural

Banyak protein sebagai filamen, kabel, atau lembaran penyanggah untuk

memberikan struktur biologi kekuatan atau proteksi. Komponen utama dari urat

dan tulang rawan adalah protein serabut kolagen, yang mempunyai daya tenggang

yang amat tinggi. Hampir semua komponen kulit adalah kolagen murni.

Persendian menganmdung elastin, suatu protein struktural yang mampu meregang

ke dua dimensi. Rambut, kuku, dan bulu burung/ayam terdiri terutama dari protein

tidak larut, yang liat, keratin. Komponen utama dari serat sutra dan jaring labah-

labah adalah protein fibroin.

6. Protein Pertahanan

Banyak protein mempertahankan organism dalam melawan serangan oleh

spesies lain atau melindungi organisme tersebut dari luka. Imunoglobulin atau

antibody pada vertebrata adalah protein khusus yang dibuat oleh limposit yang

dapat mengenali dan mengendapkan atau menetralkan serangan bakteri, virus,

atau protein asing dari spesies lain. Fibrinogen dan trombin merupakan protein

penggumpal darah yang menjaga kehilangan darah jika system pembuluh terluka.

Bisa ular, toksin bakteri, dan protein tumbuhan beracun, seperti risin, juga

tampaknya berfungsi didalam pertahanan tubuh.

7. Protein Pengatur

Beberapa protein membantu mengatur aktivitas seluler atu fisiologi.

Diantara jenis ini terdapat sejumlah hormon, seperti insulin, yang mengatur

metabolisme gula, dan kekurangannya, menyebabkan penyakit diabetes, hormon

pertumbuhan dari pituitary dan hormon paratiroid, yang mengatur transport Ca2+

dan fosfat. Protein pengatur lain, yang disebut repressor mengatur biosintesa

enzim oleh sel bakteri.

8. Protein Lain

Terdapat banyak protein lain yang fungsinya agak eksotik dan tidak mudah

diklasifikasikan. Monelin, suatu protein tanaman dari afrka mempunyai rasa yang

amat manis. Protein ini sedang dipelajari sebagai pemanis makanan yang tidak

menggemukkan dan tidak beracun, untuk manusia. Plasma darah beberapa kan

Antartika mengandung protein antibeku yang melindungi darah ikan dari

pembekuan. Persendian sayap beberapa insekta dibuat dari protein resilin, yang

bersifat sempurna elastis.

Struktur Protein

Protein merupakan polipeptida yaitu hasil dari kondensasi dua molekul

asam α amino. Asam amino mengandung gugus amino (-NH2) dan karboksil (-

COOH). Gugus karboksil bersifat asam karena dapat melepas proton (H+),

sedangkan gugus amino bersifat basa karena dapat mengikat proton (H+)

membentuk –NH3+.

Oleh karena itu, asam amino bersifat amfoter. Dalam larutan asam amino

membentuk ion zwitter (bermuatan ganda).

Denaturasi Protein

Denaturasi protein merupakan perubahan struktur protein akibat pengaruh

dari perubahan suhu, perubahan pH, radiasi, deterjen, dan perubahan jenis pelarut.

Protein yang terdenaturasi hamper selalu mengalami kehilangan fungsi biologis.

Hal ini paling mudah diperlihatkan oleh sifat protein. Jika larutan protein secara

perlahan-lahan dipanaskan sampai kira-kira 60 atau 70oC, larutan tersebut lambat

laun akan menjadi keruh dan membentuk koagulasi berbentuk seperti tali. Produk

yang terjadi tidak akan melarut lagi dengan pendinginan dan tidak membentuk

larutan jernih seperti semula sebelum dipanaskan. Pengaruh panas terjadi pada

semua protein globular, tanpa memandang ukuran atau fungsi biologinya,

walaupun suhu yang tepat bagi fenomena ini mungkin bervariasi . Protein dalam

keadaan alamiahnya disebut protein asli (natif); setelah perubahan menjadi protein

terdenaturasi.

Denaturasi protein dapat diakibatkan bukan hanya oleh panas, tetapi juga

pH ekstrim; oleh beberapa pelarut organic seperti alcohol atau aseton; oleh zat

terlarut tertentu seperti urea; oleh detergen; atau hanya dengan pengguncangan

intensif larutan protein dan bersingungan dengan udara sehingga berbentuk busa.

Protein Homolog dari Berbagai Spesies Mengandung Deret Homolog

Protein homolog adalah protein yang menjalankan fungsi yang sama pada

berbagai spesies; contohnya hemoglobin yang berfungsi melangsungkan transport

oksigen pada berbagai jenis vertebrat. Protein homolog dari berbagai spesies

biasanya mempunyai rantai polipeptida yang identik atau hamper identik

panjangnya.

Banyak posisi di dalam deret asam amino dari protein homolog yang

ditempati oleh asam amino yang sama pada semua spesies, dan karenanya di sebut

residu tetap. Pada posisi lain, terdapat variasi asam amino yang cukup besar dari

spesies satu ke yang lain; asam amino ini disebut residu tak tetap. Serangkaian

persamaan di dalam deret asam amino pada protein homolog seperti itu disebut

homologi deret; hal ini menunjukkan bahwa hewan yang mengandung protein

homolog tersebut mungkin mempunyai asal usul yang sama, tetapi mengalami

perubahan pada saat spesies berkembang selama evolusi.

Kesimpulan yang serupa diperoleh dari hasil penelitian spesifisitas antibody

terhadap antigen dari spesies homolog.

Protein Globular

Dalam protein globular, rantai polipeptida berlipat menjadi suatu bentuk

globular yang kompak. Konformasi globular lebih kompleks dibandingkan

dengan golongan protein serat, fungsi biologinya lebih beragam, dan aktivitasnya

pun tidak statis, tetapi bersifat dinamis. Hampir semua dari 2000 atau lebih enzim

merupakan protein globular. Protein globular yang lain berfungsi di dalam

transport oksigen, sari makanan dan ion inorganic di dalam darah; beberapa

protein globular bekerja sebagai antibody, yang lain merupakan hormone dan

yang lain lagi sebagai komponen membrane dan ribosom.

Terdapat dua bukti penting yang menunjukkan bahwa rantai polipeptida

protein globular berlipat-lipat dengan erat dan bahwa konformasi yang berlipat-

lipat itu penting bagi fungsi biologinya, yaitu:

1. Bahwa protein natif mengalami denaturasi dengan pemanasan, di dalam

lingkungan pH yang ekstrim, atau dengan penambahan urea.

Jika suatu protein globular mengalami denaturasi, struktur kerangka kovalen

tetap utuh, tetapi rantai polipeptidanya membuka membentuk acak, tidak

teratur, dan mengalami perubahan konformasi dalam ruang.

2. Berlipatnya protein globular dating dari perbandingan panjang rantai

polipeptida dengan ukuran makromolekular sebenarnya seperti diperlihatkan

oleh pengukuran fisiokimia.

Pada penentuan kadar protein secara biuret ini menggunakan dasar

pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks yang ungu warnanya.

Pengukuran serapan cahaya tersebut dengan menggunakan metode spektroskopi.

Spektroskopi adalah studi mengenai cahaya dengan atom dan molekul. Radiasi

cahaya atau lektromagnet dapat dianggap menyerupai gelombang atau

korpuskular. Beberapa sifat fisika cahaya paling baik diterangkan dengan sifat

partikel. Jadi, cahaya dapat dikatakan bersifat ganda. Warna-warna yang nampak

dan fakta bahwa orang bisa melihat, adalah akibat-akibat absorbsi energi oleh

senyawaan organik maupun organik. Penangkapan energi matahari oleh tumbuhan

dalam proses fotosintesis adalah suatu aspek lain dari antaraksi senyawaan

organik dengan energi cahaya. Yang merupakan perhatian primer bagi ahli kimia

organik ialah fakta bahwa panjang gelombang pada mana suatu senyawaan

organik menyerap energi cahaya, bergantung pada struktur senyawaan itu. Oleh

karena itu, teknik-teknik spektroskopi dapat digunakan untuk menentukan struktur

senyawaan yang tak diketahui dan untuk mempelajari karakteristik ikatan (dari)

senyawaan yang diketahui.

Radiasi Elektromagnetik

Radiasi elektromagnetik adalah energi yang dipancarkan menembus ruang dalam

bentuk gelombang-gelombang. Energi radiasi dapat dibayangkan sebagai medan-

medan listrik dan magnet yang berosilasi (bergoyang bolak-balik secara berirama)

secara tegak lurus pada arah rambatan. Cahaya nampak merupakan salah satu dari

beberapa jenis energi radiasi. Panjang gelombang cahaya nampak berkisar antara

400 sampai 750 nm (1nm = 10-9 m).

Semua jenis energi radiasi merambat dengan kecepatan cahaya yang sama , c,

sebesar 3,00 x 108 m/s, tetapi frekuensi dan panjang gelombangnya berlainan.

Frekuensi, υ , didefinisikan sebagai berapa daur gelombang melewati suatu titik

dalam suatu satuan waktu.

Radiasi elektromagnetik dipancarkan dalam bentuk paket-paket energi yang

menyerupai partikel, yang disebut foton atau kuantum. Energi suatu foton

berbanding terbalik dengan panjang gelombang (secara sistematis : E = hv

λ ),

dengan h = tetapan Planck). Radiasi dengan panjang gelombang lebih pendek

mempunyai energi yang lebih tinggi; oleh karena itu sebuah foton cahaya

ultraviolet berenergi lebih tinggi daripada sebuah foton cahaya nampak dan jauh

lebih tinggi daripada sebuah foton gelombang radio.

Sebaliknya, energi sebuah foton suatu radiasi berbanding lurus dengan

frekuensinya. Molekul menyerap hanya radiasi elektromagnetik dengan panjang

gelombang yang khusus (spesifik untuk molekul itu). Adsorbsi cahaya ultraviolet

(radiasi berenergi tinggi) mengakibatkan pindahnya sebuah elektron ke orbital

dengan energi yang lebih tinggi. Sedangkan adsorbsi radiasi cahaya inframerah

hanya mengakibatkan membesarnya amplitudo getaran atom-atom yang terikat

satu sama lain.

Karena dasar dari analisis spektroskopi itu sendiri adalah interaksi radiasi

dengan spesies kimia. Maka radiasi suatu sampel dibagi menjadi : adsorbsi,

pemendaran, emisi, dan penghamburan yang cara interaksinya tergantung pada

sifat materi tersebut.

1. Adsorbsi : yaitu suatu berkas radiasi elektromagnetik, bial dilewatkan

melalui sampel kimia, sebagian akan teradsorbsi. Energi elektromagnetik

ditransfer ke atom atau molekul dalam sampel, berarti partikel

dipromosikan dari tingkat yang lebih rendah ke tingkat energi yang lebih

tinggi, yaitu tingkat terksitasi.

2. Emisi radiasi: radiasi elektromagnetik dihasilkan bila ion, atom atau

molekul terksitasi kembali ke tingkat energi lebih rendah atau energi dasar.

3. Pendar Fluor atau pendar-fosfor, merupakan salah satu jenis proses emisi.

Atom atau molekul tereksitasi dengan adsorbsi radiasi elektromagnetik

dan suatu emsisi terjadi jika spesies tereksitasi kembali ke keadaan dasar.

4. Penghamburan : seperti pada proses adsorbsi emisi dan pemendaran maka

penghamburan radiasi elektromagnetik tidak memerlukan energi transisi.

Hukum Dasar Spektroskopi Adsorbsi

Jika suatu berkas sinar melewati suatu medium homogen, sebagian dari

cahaya datang (Po) diadsorbsi sebanyak (Pa), sebagian dapat diabaikan

dipantulkan (Pr), sedangkan sisanya ditransmisikan (Pt) dengan efek intensitas

murni sebesar :

Po = Pa + Pt + Pr,

Dimana : Po = intensitas radiasi yang masuk,

Pa = intensitas cahaya yang diadsorbsi

Pr = intensitas bagian cahaya yang dipantulkan

Pt = intensitas cahaya yang ditransmisikan.

Dalam hal ini berlaku hubungan Hukum Beer-Lambert :

T =

PtPo

=10−abc

b = jarak tempuh optik, c = konsentrasi

log (T) = log ( Pt

Po )=−abc

a = tetapan absortivitas, T = transmitansi

log ( 1

T )=log( PoPt )=abc=A

A = adsorbansi

- log (T) i.e. A = abc

( 1T )=T−1

opasitas (tidak tembus cahaya)

A = abc

A = absorpsivitas (yakni tetap)

Hukum di atas dapat ditinjau sebagai berikut :

1. Jika suatu berkas radiasi monokromatik yang sejajar jatuh pada medium

pengadsorbsi pada sudut tegak lurus setiap lapisan yang sangat kecilnya

akan menurunkan intensitas berkas.

2. Jika suatu cahaya monokromatis mengenai suatu medium yang transparan,

laju pengurangan intensitas dengan ketebalan medium sebanding dengan

intensitas cahaya.

3. Intensitas berkas sinar monokromatis berkurang secara eksponensial bila

Konsentarsi zat pengadsorbsi bertambah.

Hal di atas, adalah persamaan yang mendasar untuk spektroskopi adsorbsi,

dikenal dengan hukum Beer’s Lambert atau Hukum Beer Bougar.

Karena : A = abc, A α c bila ab konstan

A α b bila ac konstan

A α bc bila a konstan.

Penyimpangan Dari Hukum Beer

Jika hukum Beer diikuti, maka kita akan menmperoleh garis lurus. Hal ini

terjadi bila, digunakan sinar yang monokromatis. Bila menggunakan sinar yang

polikromatis, maka akan menyebabkan melebarnya pita radiasi sehingga akan

terjadi penyimpangan yang besar. Penyimpangan juga jelas teramati pada

konsentrasi lebih besar pada kurva absorbansi terhadap konsentrasi. Kurva akan

mulai melengkung pada konsentrasi yang tinggi. Bila kurva absorbsi yang

diperoleh pada berbagai panjang gelombang yang digunakan bersifat datar, maka

diharapkan Hukum Beer berlaku. Penyimpangan negatif dari hukum Beer

menyebabkan kesalahan relatif yang makin membesar dari konsentrasi

sebenarnya.

V. Alat dan Bahan

Alat – alat :

1. Pipet tetes

2. Beker gelas

3. Tabung reaksi

4. Rak tabung reaksi

5. Gelas ukur

6. Spektrofotometri UV

Bahan – bahan :

1. Reagen Biuret

2. Larutan standar Protein

3. Aquades

4. Larutan sampel

VI. Prosedur percobaan

Mempipetir ke dalam tabung reaksi 1 ml larutan protein yang mengandung

1 – 10 mg/ml. Menambahkan 4 ml reagen biuret. Mengocok dan mendiamkan

selama 30 menit pada suhu kamar. Membaca serapannya pada 540 nm. Untuk

blanko dipakai campuran 1 ml air dan 4 ml reagen biuret yang juga didiamkan

selama 30 menit pada suhu kamar. Untuk sampel adalah larutan putih telur dengan

perlakuan yang sama. Hukum Lambert-Beer berlaku untuk larutan-larutan protein

antara 1 – 10 mg/ml.

VII. Hasil Pengamatan

Data absorban dengan spektrometer UV dengan λ = 540 nm

Tabung Konsentrasi

(mg/ml)

Absorban

1 1 0.026

2 2 0,070

3 3 0,093

4 4 0,143

5 5 0,158

6 6 0,179

7 7 0,225

8 8 0,337

9 9 0,537

10 10 0,585

Sample 0,275

VIII. Persamaan Reaksi

O O

- C – N – CH – C – N – CH - + Cu2+ OH O = C C = O

H R H R HN NH

RCH HCR

Cu2+

O = C C = O

HN NH

RCH HCR

Kompleks Ungu

IX. Analisa Data

Membuat Kurva Standar Konsentrasi Protein Vs Absorban

Dengan : X = Konsentrasi protein (c)

Y = Absorbansi (A)

X Y XY X2

1 0,026 0,026 1

2 0,070 0,14 4

3 0,093 0,279 9

4 0,143 0,572 16

5 0,158 0,79 25

6 0,179 1,074 36

7 0,225 1,575 49

8 0,337 2,696 64

9 0,537 4,833 81

10 0,585 5,85 100

= 55 2,353 17,835 385

n . ΣXY – ΣX . ΣY 10 (17,835) – 55(2,353)

Slope (A) = =

n . ΣX2 – (ΣX)2 10 (385) – (55)2

= 178,35 - 129,415

825

= 0,059

ΣY . ΣX2 – ΣXY . ΣX 2,353 (385) – 17,835 (55)

Intersept (B) = =

n . ΣX2 – (ΣX)2 10 (385) – (55)2

= 905,905 – 980,925

825

= -0,09

Persamaan Regresi Linier :Y = 0,059X - 0,09

Kurva standar : Y = 0,059X - 0,09

X 0 2 4 6 8 10

Y -0,09 0,028 0,146 0,264 0,382 0,5

Konsentrasi protein yang sebenarnya dalam kasein :

Konsentrasi protein pada saat 1 mg/ml

Y = 0,026

0,026 = 0,059X - 0,09

X = 1,966 mg/ml


Y = 0,070

0,070 = 0,059X - 0,09

X = 2,711 mg/ml


Y = 0,093 mg/ml

0,093 = 0,059X - 0,09

X = 3,101 mg/ml


Y = 0,143

0,143 = 0,059X - 0,09

X = 3,949 mg/ml


Y = 0,158

0,158 = 0,059X - 0,09

X = 4,203 mg/ml


Y = 0,179

0,179= 0,059X - 0,09

X = 4,449 mg/ml


Y = 0,225

0,225= 0,059X - 0,09

X = 5,338 mg/ml


Y = 0,337

0,337 = 0,059X - 0,09

X = 7,237 mg/ml


Y = 0,537

0,537 = 0,059X - 0,09

X = 10,62 mg/ml

Konsentrasi protein pada saat 10mg/ml

Y = 0,585

0,585 = 0,059X - 0,09

X = 11,44 mg/ml

Konsentrasi sample

Y = 0,275

0,275 = 0,059X -0,09

X = 6,186

0 2 4 6 8 10 12 140

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Kurva Konsentrasi vs Absorbansi

Y-Values

X. Pembahasan

Percobaan kali ini berjudul penentuan kadar protein secara biuret yang

tujuannya untuk menentukan kadar protein dalam suatu larutan dengan

menggunakan pereaksi reagen biuret. Pada percobaan ini yang digunakan sampel

dan larutan standar protein. Protein yang digunakan pada percobaan ini adalah

Kasein. Pada percobaan ini digunakan larutan protein dengan konsentrasi yang

berbeda beda, yaitu dari 1-10mg/ml.

Setelah masing-masing larutan standar dimasukkan ke dalam tabung reaksi

dan ditambahkan reagen biuret dan larutan NaOH maka larutan-larutan ini

dibiarkan selama 30 menit. Ini bertujuan agar proses pembentukan senyawa

kompleks berwarna dapat berlangsung dengan benar-benar sempurna. Setelah

senyawa kompleks berwarna terbentuk, baru dilakukan pengukuran dengan

spektrometer UV. Senyawa kompleks ini terlihat segera setelah penambahan

reagen biuret dan NaOH dengan terbentuknya warna ungu pada larutan. Warna

ungu ini terbentuk akibat reaksi antara Cu2+ dalam reagen biuret dengan ikatan

peptida dari protein dalam larutan kasein tadi , tepatnya ikatan dengan –NH dari

protein dalam suasana basa (dengan adanya ion OH- dari NaOH) seperti dalam

persamaan reaksi.

Pada percobaan ini digunakan metode spektroskopi yaitu pengidentifikasi

suatu objek dengan menggunakan kriteria warna. Dalam percobaan ini, kita

menggunakan kriteria warna ungu dari protein. Untuk mendapat warna, maka

larutan protein direaksikan dengan unsur tembaga dalam reagen Biuret dalam

lingkungan alkali. Sehingga didapatkan larutan protein yang berwarna ungu pada

masing-masing konsentrasi.

Warna dari larutan protein berbeda-beda dari berbagai konsentrasi.

Semakin besar konsentrasi yang digunakan maka semakin pekat warna yang

terbentuk, dan sebaliknya. Karena kita menggunakan panjang gelombang pada

daerah 540 nm, maka raddiasi sinar yang kita pakai adalah sinar UV_Visual.

Di dalam spektrofotometer, larutan protein mengadsorbsi cahaya yang

diberikan kepadanya. Hal ini merupakan wujud dari interaksi suatu atom dengan

cahaya. Dimana energi elektromagnetiknya ditransfer ke atom atau molekul

sehingga partikel dalam protein dipromosikan dari tingkat energi yang lebih

rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi, yaitu tingkat tereksitasi.

Dari hasil pengidentifikasian pada spektrofotometer, didapatlah harga

absorbansi pada masing-masing konsentrasi. Semakin besar konsentrasi maka

semakin banyak protein yang diserap atau diabsorbsi, sehingga harga absorbansi

yang didapat semakin besar juga.

Dari hasil data yang diperoleh, akan didapatkan suatu kurva antara

adsorbansi larutan protein dengan konsentrasinya. Kurva tersebut membentuk

suatu garis lurus yang linear. Ini dikarenakan larutan protein yang digunakan

merupakan larutan encer dengan konsentrasi yang kecil. Penyimpangan Hukum

Beer akan berlaku jika larutan protein yang digunakan mempunyai konsentrasi

yang besar, artinya apabila konsentrasi proteinnya besar, maka garis linear akan

membelok.

Namun, pada saat perbandingan antara larutan sampel dengan larutan

standar protein, menunjukkan perbedaan, hal ini mungkin dapat disebabkan akibat

dari kesalahan pengenceran pada larutan sampelnya, atau kesalahan pada

penggunaan alat spectrometer. Sample seharusnya menunjukkan konsentrasi ~8

mg/ml , tetapi pada kurva yang didapat, sample menunjukkan konsentrasi 6,186

mg/ml.

XI. Kesimpulan

a. Semakin tinggi konsentrasi protein yang terdapat dalam larutan maka

semakin pekat pula kompleks warna ungu yang dihasilkan.

b. Adsorban suatu larutan berbanding lurus dengan konsentrasinya,

sehingga semakin besar konsentrasi yang digunakan, maka semakin

besar pula adsorban yang digunakan.

c. Jika konsentrasi larutan yang digunakan besar akan terjadi

penyimpangan Hukum Beer, dimana kurva yang terbentuk tidak lagi

linear.

XII. Daftar Pustaka

Lehninger, Albert. 1995. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga.

Wirahadikusumah, Muhammad. 1985. Biokimia Protein, Enzim, dan Asam

Nukleat. Bandung: ITB.

Fessenden dan Fessenden. 1999. Kimia Organik Edisi ketiga Jilid 2. Jakarta:

Erlangga.

XIII. Gambar Alat

Pipet Tetes

Beker gelas

Gelas Ukur

Tabung dan Rak Tabung Reaksi

Spektrofotometri UV

XIV. Pertanyaan Dan Jawaban

Pertanyaan:

1. Buatlah standar kurva dan tetapkan kadar protein larutan protein yang

diberikan?

2. Berikan penjelasan tentang hukum lambert-beer!

3. Senyawa apa yang dapat mengganggu cara biuret seperti diatas

4. Mengapa reaksi tersebut disebut reaksi biuret?

5. Senyawa kompleks apa yang sebenarnya terjadi?

6. Apakah peptide juga memberi reaksi biuret. jika memberikan, berikalah

penjelasan dan bagaimana cara menentukan kadar protein yan tercampur

dengan peptide?

Jawaban

1. Membuat Kurva Standar Konsentrasi Protein Vs Absorban

Dengan : X = Konsentrasi protein (c)

Y = Absorbansi (A)

X Y XY X2

1 0,026 0,026 1

2 0,070 0,14 4

3 0,093 0,279 9

4 0,143 0,572 16

5 0,158 0,79 25

6 0,179 1,074 36

7 0,225 1,575 49

8 0,337 2,696 64

9 0,537 4,833 81

10 0,585 5,85 100

= 55 2,353 17,835 385

n . ΣXY – ΣX . ΣY 10 (17,835) – 55(2,353)

Slope (A) = =

n . ΣX2 – (ΣX)2 10 (385) – (55)2

= 178,35 - 129,415

825

= 0,059

ΣY . ΣX2 – ΣXY . ΣX 2,353 (385) – 17,835 (55)

Intersept (B) = =

n . ΣX2 – (ΣX)2 10 (385) – (55)2

= 905,905 – 980,925

825

= -0,09

Persamaan Regresi Linier :Y = 0,059X - 0,09

Kurva standar : Y = 0,059X - 0,09

X 0 2 4 6 8 10

Y -0,09 0,028 0,146 0,264 0,382 0,5

0 2 4 6 8 10 12

-0.2

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Kurva Standar Konsentrasi Protein Vs Absorban

Konsentrasi protein yang sebenarnya dalam kasein :


Y = 0,026

0,026 = 0,059X - 0,09

X = 1,966 mg/ml


Y = 0,070

0,070 = 0,059X - 0,09

X = 2,711 mg/ml


Y = 0,093 mg/ml

0,093 = 0,059X - 0,09

X = 3,101 mg/ml


Y = 0,143

0,143 = 0,059X - 0,09

X = 3,949 mg/ml


Y = 0,158

0,158 = 0,059X - 0,09

X = 4,203 mg/ml


Y = 0,179

0,179= 0,059X - 0,09

X = 4,449 mg/ml


Y = 0,225

0,225= 0,059X - 0,09

X = 5,338 mg/ml


Y = 0,337

0,337 = 0,059X - 0,09

X = 7,237 mg/ml


Y = 0,537

0,537 = 0,059X - 0,09

X = 10,62 mg/ml

Konsentrasi protein pada saat 10mg/ml

Y = 0,585

0,585 = 0,059X - 0,09

X = 11,44 mg/ml

2. Penjelasan Hukum Lambert – Beer :

Hukum Lambert – Beer dengan mudah digabungkan menjadi pernyataan

yang sesuai. Diketahui bahwa dalam mempelajari akibat perubahan

konsentrasi terhadap absorbsi jarak jalan lewat larutan harus dibuat tetap.

Tetapi hasil-hasil yang diukur akan tergantung pada besarnya harga

tetapan. Dengan kata lain dalam hukum Beer seperti K4 = f(b). Demikian

dalam hukum Lambert K2 = f(c). Dimana kemudian substitusi hubungan

dasar ini ke dalam hukum Lambert-Beer:

log Po/P = f(c) b dan log Po/P = f(b) c

Kedua Hukum harus diberlakukan bersamaan pada setiap titik, sehingga

f (b) = f(b) c . Atau kalau dipisahkan variabelnya f(c)/c = f(b)/b

Agar dua fungsi variabel tak bergantungan dapat menjadi sama, adalah

bahwa keduanya sama dengan suatu tetapan.

F(c) / c = f(b) b = K

Substitusi ke dalam pernyataan Lambert-Beer menghasilkan pendapat

yang sama yaitu:

log Po/P = f(c) b = K.b.c

log Po/P = f(b) c = K.b.c

3. Senyawa yang dapat mengganggu yaitu senyawa yang membentuk

endapan hitam atau merah pada reagen biuret yaitu garam Amonia.

4. Reaksi ini disebut dengan reaksi biuret karena pada penentuan kadar

protein ini digunakan reagen biuret yang mana biuret memberikan warna

violet dengan CuSO4. Dan pada reaksi ini terbentuk kompleks ungu yaitu

antara Cu2+ dengan –NH dari rantai peptida dalam suasana basa.

5. Senyawa kompleks yang terbentuk :

O O

- C – N – CH – C – N – CH - + Cu2+ OH O = C C = O

H R H R HN NH

RCH HCR

Cu2+

O = C C = O

HN NH

RCH HCR

6. Peptida juga memberi reaksi biuret karena adanya –NH pada ikatan

pepetida sehingga dapat membentuk ion kompleks seperti di atas. Dengan

menambahkan reagen Biuret pada larutan protein dan pengukuran

adsorbansi larutan tersebut dan dibandingkan dengan sampel, dicari yang

sama adsorbansinya maka akan diketahui berapa kadar proteinnya.

Documents

96561834 Penentuan Kadar Protein Secara Biuret